Sviluppo clinico di inibitori del "Pathway PI3K": stato dell'arte e prospettive

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INTRODUZIONE

Il Glioblastoma (GBM; Astrocitoma di Grado IV, secondo la World Health Organization) è il tumore maligno primario più comune e più aggressivo del sistema nervoso centrale, si manifesta a livello degli emisferi cerebrali e meno frequentemente si localizza nel midollo spinale. Negli Stati Uniti sono circa 10000 le persone che ogni anno ricevono una diagnosi di GBM. Il GMB può manifestarsi a qualsiasi età, ma di preferenza si presenta negli adulti, con età compresa tra i 40 e 70 anni. Sono soprattutto i soggetti maschi ad essere maggiormente colpiti da questo tipo di tumore, la sintomatologia si sviluppa rapidamente, con sintomi come: cefalea, convulsioni, vomito, alterazioni del gusto, disturbi del linguaggio e deficit visivi. In presenza di questi sintomi, se non si inquadrano malattie di riscontro comune sono necessari approfondimenti diagnostici. La presenza del tumore cerebrale si può rivelare attraverso esami come: la Tac (Tomografia Assiale Computerizzata) e la RMN (Risonanza Magnetica Nucleare), quest’ultima è molto più sensibile rispetto alla Tac (Fig.1). Poichè i tumori come il GBM sono caratterizzati da una crescita invasiva e diffusa, il loro controllo con interventi chirurgici è difficile. Attualmente, i trattamenti terapeutici standard per i GBM comportano una resezione chirurgica massimale cui segue una radioterapia e una concomitante chemioterapia coadiuvante per combattere le porzioni infiltrative residuali del tumore. Malgrado queste modalità di trattamento aggressive, i GBM sono notoriamente resistenti al trattamento con radioterapia e chemioterapia, e, con una certa regolarità, la malattia presenta recidive. Alla luce di ciò, il GBM presenta una prognosi grave e per i pazienti si prospetta un tasso di sopravvivenza ad un anno del 34%, e a 5 anni di solamente il 5%.

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(Fig.1) Immagine di un RMN in cui si nota un anello di enhancement, parte più evidente del tumore intorno all’area centrale di necrosi.

Differentemente da altre tipologie tumorali, quali la leucemia mieloide cronica o i tumori dello Stroma Gastrointestinale, la terapia mirata ad un bersaglio specifico ha prodotto scarsi risultati sul decorso naturale e sulla gestione dei GBM. I progressi nella comprensione della patogenesi del GBM e di numerose distinte aberrazioni molecolari in questi tumori, comprese quelle che si verificano nell’ enzima fosfatasico PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog), nel recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), nel p16/p19 e p/53, hanno introdotto in una nuova era di avvincenti possibilità nella cura dei GBM. Nel 2009, ad esempio, l'anticorpo umano monoclonale anti-angiogenico “Bevacizumab” (Avastina) al fattore di crescita endoteliale ha ottenuto una rapida approvazione per i GBM, rappresentando l'unica nuova terapia ad essere approvata per i GBM in

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più di dieci anni, nonché il primo agente dal target specifico riconosciuto per la cura dei GBM. Per quanto il trattamento con Bevacizumab abbia permesso di ottenere tassi accresciuti di risposta tumorale assieme ad un protrarsi della fase clinica esente da proliferazione rispetto ai casi-controllo storici, il beneficio riscontrato nel tasso di sopravvivenza generale è stato ben più modesto. Ciononostante, questi dati offrono un incoraggiamento per una futura ulteriore ricerca di altri agenti per bersagli specifici nel trattamento dei GBM. Peraltro, lo sviluppo di terapie efficaci su target specifici per i GBM è ostacolata dalla natura complessa ed eterogenea di questa malattia e dalla difficoltà del transito (di molte molecole studiate) attraverso la barriera emato-encefalica. Affinchè lo sviluppo di nuove terapie per i GBM abbia successo, gli approcci combinati diretti ad influire su molteplici vie metaboliche permetteranno con buona probabilità di approntare cure più efficaci. Nonostante il progresso nella conoscenza delle alterazioni genetiche sottostanti alla malattia, l'identificazione di molteplici target molecolari e la disponibilità di Bevacizumab, ai GBM sono ancora associate una considerevole morbilità e mortalità, fatto che sottolinea la necessità di migliori tecniche terapeutiche. Il ruolo del meccanismo di trasmissione del segnale della fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K), essenziale nella proliferazione, nel metabolismo e nell'apoptosi cellulare, può costituire un obiettivo terapeutico potenzialmente in grado di migliorare l'esito clinico dei GBM. L'inibizione della via metabolica della PI3K, considerata da sola o in combinazione con altri meccanismi oncogenici, potrebbe determinare un effetto citostatico assieme ad un'induzione della morte cellulare e può anche indurre vari altri esiti ad ampio spettro, quali effetti antiangiogenici. In questa tesi viene descritta la via metabolica della PI3K nei GBM e le caratteristiche che fanno di questo processo un promettente target della terapia; sono inoltre riportati dati relativi a test clinici sull'inibizione della PI3K stessa assieme ai dati attualmente oggetto di ricerca nel trattamento di pazienti affetti dalla patologia in esame. Nei paragrafi successivi verrà riportata la valutazione di potenziali marcatori biologici per un'opportuna selezione di pazienti e per l'accertamento degli effetti di quegli inibitori della PI3K che vengono studiati nelle sperimentazioni cliniche in corso.

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SCOPERTA E CLASSIFICAZIONE DELLA CHINASI PI3

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La scoperta dell’ attività delle fosfatidilinositolo chinasi è avvenuta durante la purificazione del sarcoma virus Rous trasformando il gene prodotto, pp60 c-src, che ha la capacità di formare derivati mono- e di- fosforilati del fosfoinositolo, come fosforilare il diacilglicerolo per formare l’acido fosfatidico. L’attività chinasica del PI è stata anche trovata in immunoprecipitati contenenti “polyoma midde-T antigen”, dovuta all’ associazione con il pp60 c-src, l’omologo cellulare del pp60 v-src. L’attività di questa chinasi lipidica era ridotta nei mutanti difettosi del polioma nella trasformazione, suggerendo un ruolo per il metabolismo del fosfatidilinositolo nella trasformazione dal polioma virus.

Sia nei fibroblasti murini che in quelli trasformati,sono stati trovati due tipi di PIK, tipo I e tipo II. Quelli di tipo I sono associtai con il “middle-T pp60 c-src” e co- precipitati con recettori PDGF parzialmente purificati, un aumento dell’attività del PIK era comune sia alla stimolazione del fattore di crescita che alla trasformazione oncogena. Negli immunoprecipitati era inoltre presente una fosfo-proteina di 85 kDa in entrambi i tipi del PIK correlata ad un aumento dell’attività del PIK. Quelli di tipo II (classificati più avanti in tipo II e III) fosforilano la posizione 4-OH dell’anello dell’inositolo formando così il fosfatidinositol 4- monofosfato. Nonostante l’associazione di queste chinasi con i recettori dei fattori di crescita, il loro ruolo sia nelle cellule sane che in quelle tumorali è stato chiarito. In contrasto le chinasi di tipo I sono caratterizzate dal fatto che vanno a fosforilare il gruppo OH in posizione 3’ sull’anello dell’ inositolo del PIP2 per formare un nuovo fosfolipide, il PIP3. Così gli enzimi furono chiamati PI3K. PI3K, finalmente è stato trovato nel fegato del ratto ed è risultato costituito da un complesso di proteine di 85 kDa e 110 kDa con la capacità di fosforilare il fosfatidilinositol (PI), il fosfatidilinositol 4-fosfato (PIP4) e il PIP2.

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LA VIA METABOLICA DELLA PI3K NEI GLIOBLASTOMI

La famiglia “PI3K” delle chinasi lipidiche intracellulari è implicata in diversi meccanismi di trasmissione di segnale regolanti la proliferazione, la differenziazione, la migrazione, il metabolismo e il periodo di vita (ad es., il periodo di vita cellulare).

Le PI3K vengono raggruppate in 3 classi (I-II-III) in base alla loro predilezione per differenti substrati e all'omologia di sequenza, ed ogni classe svolge un ruolo differente nei meccanismi di segnalazione cellulare. Questi enzimi sono costituiti da una subunità catalitica del peso di 110 kDa (p110) e da una subunità regolatoria. Le PI3K di classe I sono ulteriormente suddivise in due sottogruppi (A e B). Le PI3K di classe A sono composte da una subunità catalitica di peso di 110 kDa e da una subunità regolatoria dal peso di 85 kDa, la subunità catalitica esiste in tre isoforme: alfa beta e delta e anche la subunità regolatoria (p85) viene prodotta da tre geni il PIK3R1, PIK3R2 e il PIK3R3 formando le isoforme alfa beta e gamma. La subunità p110 contiene diversi domini tra cui quello per il legame con la subunità p85. Le PI3K di classe B sono invece costituite dalla subunità catalitica p110 gamma associata ad una subunità regolatoria di peso di 101 kDa (p101) e sono attivate da recettori di membrana associati a proteine G eterodimeriche e sono abbondanti nei globuli bianchi.(Fig.2)

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Fig. 2 Classificazione delle isoforme di PI3K. Le chinasi di tutte e tre le classi vengono ampiamente espresse nell’intero organismo, ad eccezione della classe IA con subunità catalitica p110δ, presente prevalentemente nei linfociti.

La via metabolica descritta si focalizzerà sulle PI3K del gruppo I-A. I recettori “upstream” (a monte della catena del segnale) delle tirosin-chinasi (RTKs), quali l'EGFR (recettore del fattore di crescita dell’epidermide), attivano le PI3K del gruppo I-A. Il legame della subunità regolatoria “p85” della PI3K, più precisamente dei domini SH2 di p85 con i residui di fosfotirosina sulle RTKs attivate, genera una modificazione conformazionale della p85 stessa, il che a sua volta provoca l'inibizione della subunità catalitica “p110” (isoforme α, β e ƍ) della PI3K. La PI3K si localizza sulla membrana plasmatica e catalizza la formazione del FosfatidilInositolo3, 4, 5trifosfato (PIP3) per via della fosforilazione del Fosfatidilinositolo4, 5difosfato (PIP2). Il PIP3 è un attivatore essenziale della Serina/Treonina Chinasi AKT (nota anche come Proteina Chinasi B) del peso di 57kDa,se ne conoscono tre isoforme: 1 α, 2 β e 3 δ strettamente correlate tra loro. L’isoforma 1 α la troviamo espressa ubiquitariamente tranne nel rene, fegato e milza, l’isoforma 2 β si trova ad alti livelli nell’intestino, organi riproduttivi e nei muscoli scheletrici, infine l’isoforma 3 δ è maggiormente

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espressa nei testicoli e cervello. Queste tre isoforme sono costituite da un dominio catalitico che si trova al centro della proteina mentre il dominio PH (pleckstrin homology), utile per l’interazione con il fosfatidilinisitolo,e il dominio regolatorio sono localizzati nelle regioni N- e C- terminali. Questa chinasi promuove la sopravvivenza cellulare inattivando i segnali pro-apoptotici e attivando i segnali anti-apoptotici prevenendo il rilascio del citocromo C dai mitocondri attivando i fattori pro-apoptotici Bad e caspasi9. Il legame del PIP3 con l'AKT porta al reclutamento dell'AKT da parte della membrana e alla conseguente fosforilazione per mezzo della serina treonina chinasi ”PDK1” (Chinasi 3Fosfoinositide-dipendente ) sul suo residuo Thr308 e del target per il complesso 2 di mTOR (mammalian Target of Rapamicin) (mTORC2) sul residuo Ser473 a livello dell’estremità terminale dell’AKT. In seguito alla duplice fosforilazione e quindi all'attivazione, l'AKT viene reclutata a livello della membrana cellulare e, a sua volta, determina la fosforilazione, l'attivazione o l'inibizione di numerose proteine-target coinvolte nella regolazione del metabolismo, della sopravvivenza e della motilità cellulare, della sintesi di proteine e nello smistamento delle vescicole. Il principale effettore a valle dell’AKT è il complesso mTORC che è capace di integrare segnali provenienti dall’esterno e dall’interno della cellula,ad esempio segnali legati alla presenza di nutrienti ,allo stato energetico e controlla la sintesi proteica. La via metabolica della PI3K viene regolata in senso negativo da diverse proteine. La PTEN fosfatasi è dotata di doppia specificità poiché è in grado di defosforilare sia proteine che lipidi e rimuove il gruppo fosfato in posizione 3’,e le inositol-fosfatasi contenenti il dominio SH2 antagonizzano l'attività della PI3K mediante la defosforilazione del PIP3 nella sua forma inattiva PIP2. In aggiunta, l'attivazione dell'effettore del complesso 1 di mTOR (mTORC1), cioè la p70 S6 chinasi (S6K), modula l'attivazione della PI3K attraverso un'inibizione a feedback negativo. Dato che i componenti di trasmissione del segnale della via PI3K/AKT/mTOR sono regolatori centrali della crescita, proliferazione, differenziazione cellulare e dell'angiogenesi, non sorprende che la cattiva regolazione in questa catena di azioni, attraverso l'alterazione genetica di molte proteine nella trasmissione del segnale della via della PI3K

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(comprese le subunità p85, p110, le PTEN e AKT) ha dimostrato di giocare un ruolo cardine nella patogenesi del tumore..

L'espressione della tirosina chinasi e la conseguente azione di segnale, con particolare riferimento al segnale dell'EFGR sono già da tempo stati riconosciuti quali fattori della patogenesi dei GBM. L'amplificazione del segnale dell'EFGR nei GBM comporta l'attivazione della linea della PI3K ed è stata accertata nel 45% dei casi di GBM. L'amplificazione o le mutazioni attivanti del PIK3R1, il gene che codifica la subunità regolatoria p85 della PI3K, sono state accertate in approssimativamente il 15% dei pazienti con GBM. Analogamente, mutazioni corrispondenti a perdita di funzione, delezioni cromosomiche o alcuni “silencing” epigenetici di alcuni geni delle PTEN sono state riscontrate in circa il 40% dei casi di GBM, ed è stata accertato che esse conducono ad una ridotta sopravvivenza. Di fatto, almeno un'alterazione dei geni per l'EGFR, le PTEN o il PIK3R1 sono stati riscontrati in una percentuale dal 63% all'86% di GBM primari e in una percentuale del 31% di GBM secondari. Considerati nel loro insieme, questi dati sottolineano l'importanza di questa via metabolica nella patofisiologia del tumore preso in esame.

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Fig. 3. Una rappresentazione schematica della via metabolica della PI3K e dei suoi costituenti principali. Le linee continue rappresentano l'attivazione; quelle tratteggiate rappresentano l'inibizione. 4EBP1: Proteina 1 legante il Fattore Eucariotico di Iniziazione 4E. ERK: Chinasi legata a Segnale Extracellulare; IRS1: Substrato 1 Recettore dell'Insulina; MEK: Proteina/ERK Chinasi mitogena. mTORC1/2 “mammalian target of Rapamycin, complessi 1/2”. PI3K: Fosfatidilinositolo-3-Chinasi. PIP2: FosfatidilInositolo4,5difosfato. PIP3: Fosfatidilinositolo3,4,5trifosfato. PDK1: Proteina Chinasi 1 3Fosfoinositide-dipendente. PTEN: Omologhi della Fosfatasi e della Tensina. RAS: Oncogene del Sarcoma del Ratto. Rheb: RAS-Omologo Arricchito nel cervello. S6K: S6 Chinasi; TSC: Proteina della Sclerosi Tuberosa.

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GLI INIBITORI DELLA VIA METABOLICA DELLA PI3K E I LORO

PRELIMINARI RISULTATI CLINICI

Appurata un'aberrazione rappresentata dall' iperattivazione della via metabolica della PI3K, l'inibizione dei suoi costituenti rappresenta un obiettivo decisamente attraente nella ricerca della terapia del tumore. Grandi sforzi sono già stati dedicati allo sviluppo di nuovi inibitori della via metabolica della PI3K nel trattamento del cancro. Ad esempio, composti analoghi alla Rapamicina, l'Everolimus (Afinitor) e il Temsirolimus (Torisel), che inibiscono entrambi l'mTORC1, sono stati ufficialmente approvati per il trattamento del carcinoma avanzato delle cellule renali. L'Everolimus è indicato anche per il trattamento dell'Astrocitoma Subependimale a Cellule Giganti (SEGA) associato alla sclerosi tuberosa e, in alcuni pazienti, a Tumori Neuroendocrini Progressivi di Origine Pancreatica (PNET). In pazienti affetti da GBM, questi “rapalogs”, considerati o come agenti singoli, o in combinazione con altri agenti e/o radiazioni, hanno indotto prevalentemente risposte limitate e di breve durata. In ogni caso, i risultati di questi studi hanno permesso una più

approfondita comprensione della via metabolica della PI3K nei GBM e lo sviluppo di agenti potenzialmente più efficaci e meglio tollerati. Nei seguenti paragrafi della tesi sarà riportata una breve sintesi di dati selezionati riguardanti alcuni inibitori della via metabolica della PI3K che sono attualmente sottoposti ad indagine clinica ed evidenzieremo alcuni studi che stanno facendo ricerca su alcuni di questi inibitori nel caso specifico dei GBM.

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GLI INIBITORI DELLA PI3K

Due tipi di inibitori della PI3K hanno come bersaglio la subunità catalitica p110. In ogni caso, ricordiamo che esistono sia inibitori aspecifici (generali) della PI3K, sia inibitori isoforma-specifici della PI3K. Gli attivatori aspecifici della PI3K agiscono su tutte le forme di PI3K e comprendono i derivati della Wortmannina, mentre altri inibitori isoforma-specifici inibiscono selettivamente le subunità p110 α, β e δ.

La BKM120 (Novartis) è un inibitore aspecifico delle PI3K priva di un'attività sull'mTOR e sul VPS34. Essa inibisce la “wild-type” (isoforma normale) della PI3Kα con una IC50 da 35 nM e inibisce anche altri tre “paralogs” della PI3K (PI3Kβ , -γ, -δ) con valori della IC50 compresi tra 108 e 348 nM. Alcuni dati preclinici, assieme ai primi dati clinici ottenuti, dimostrano che la BKM120 esplica un'azione anti-proliferativa e pro-apoptotica in diverse linee cellulari tumorali, in xenotrapianti e in pazienti con tumori associati a mutazioni attivanti la PI3K. La BKM120 ha dimostrato di provocare un'inibizione della crescita dose-dipendente nelle linee cellulari dei GBM (incluse le U87, U251, LN229, LN18 e D54) a dispetto della condizione delle loro PTEN e/o

EGFR. In aggiunta, la BKM120 per via orale è stata ben tollerata in ratti che ospitavano degli xenotrapianti intracerebrali della linea U87, e la loro sopravvivenza è stata prolungata. La BKM120 può anche transitare attraverso la barriera emato-encefalica, fatto che la rende un'opzione attraente per la cura dei GBM.

In uno studio multicentrico e “open-label” (in cui il farmaco somministrato è comunicato agli sperimentatori) sul gruppo I-A, riguardante un agente singolo, con crescita progressiva della dose ed aumento della massima dose tollerata (MTD) in pazienti sofferenti di tumori solidi avanzati, la BKM120 è stata generalmente ben tollerata ed ha evidenziato un'attività biologica ed antitumorale.

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La dose MTD è stata di 100 mg/giorno. Episodi di tossicità che hanno fatto limitare il dosaggio sono stati riscontrati in 9 pazienti; i sintomi sono stati iperglicemia (di grado 4 in 2 pazienti), dolore addominale superiore (di grado 3 in 1 paziente), eruzione cutanea (di grado 2 in 2 pazienti e di grado 3 in 1 paziente) e alterazioni dell'umore (di grado 2 in 2 pazienti e di grado 3 in 1 paziente). Di tutti i pazienti idonei alla sperimentazione, 3 (il 5%) su 66 hanno manifestato risposte parziali (2 confermate e 1 non confermata), 28 (il 42%) di 66 hanno avuto quale miglior effetto una stabilizzazione della malattia e 20 pazienti sono andati incontro ad una risposta durevole (più di 16 settimane). Tra i casi di risposte parziali, due pazienti avevano tumore al seno, un paziente presentava una tripla negatività del tumore (sia del Recettore per l'Estrogeno: ER-, sia del Recettore per il Progesterone: PR-, sia del Recettore 2 del Fattore di Crescita Epidermico Umano: Her2-), mentre l'altro paziente aveva un tumore con caratteristiche ER+/PR-/Her2- (di risposta positiva solo per l'ER). Il terzo caso di risposta parziale è stato un paziente con carcinoma duttale delle ghiandole paratiroidi. I frequenti eventi avversi in questo studio sono stati quelli comuni alla maggior parte degli inibitori della PI3K: affaticamento, eruzioni cutanee e tossicità gastrointestinale (che induce nausea, diarrea e riduzione dell'appetito). Solo l'evento avverso di grado 3 / 4, sospettato di essere in relazione alla sostanza studiata, evidenziava una epatotossicità (aumento delle transaminasi, iperbilirubinemia; 11%) che si è verificata nel 5% o più dei pazienti. L'unico evento avverso

registrato nella somministrazione di BKM120 a non essere stato osservato clinicamente con altri inibitori della PI3K sono state le modificazioni dell'umore (comprendenti oscillazioni dell'umore, disturbi emotivi e disturbi affettivi), per quanto la sua effettiva relazione con la BKM120 ha cominciato solo adesso ad essere studiata. Inoltre, l'iperglicemia è stata riscontrata in circa il 30% dei pazienti, dei quali solo 4 (il 5%) hanno fatto esperienza di una sua gravità di livello 3. L'iperglicemia non è necessariamente un effetto tossico non prevedibile con gli inibitori della via metabolica della PI3K, dato che questa catena di reazioni influisce sul metabolismo cellulare e sulla regolazione glucosio/insulina; l'iperglicemia è stata riscontrata in diversi studi clinici e preclinici.

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Complessivamente, le sperimentazioni cliniche in fase I e fase II della BKM120, attualmente in corso o in via di attivazione, sono circa 20. In alcune di esse la BKM120 è somministrata come unico agente, in altre è in combinazione con altre terapie. Per quanto riguarda i GBM, è attualmente in corso una sperimentazione clinica in fase II sulla BKM120, su pazienti alla loro prima o seconda recidiva e attivazione comprovata della linea metabolica PI3K (NCT01339052). I pazienti di questo studio sono stati distinti in base ai loro stati mutazionali delle PTEN e PIK3CA in modo che si possa accertare quali di questi sottogruppi potrebbe essere più sensibile all'inibizione della PI3K. Sono attualmente in fase di svolgimento le seguenti due sperimentazioni cliniche: - un trial di fase I sulla BKM120 somministrata assieme a radioterapia e Temozolomide in pazienti con recente diagnosi di BGM (NCT01473901), e un trial di fase I e II con somministrazione di BKM120 e Bevacizumab in pazienti con GBM recidivante (NCT01349660). Anche altri trials in fase II della BKM120 sono attualmente in svolgimento e sono rivolti a casi di tumore dell'endometrio, tumore prostatico metastatico castrazione-resistente e di carcinoma polmonare non a cellule piccole (NSCLC). Il PX-866 (Oncothyreon) è un derivato semi-sintetico della Wortmannina ed inibisce irreversibilmente la PI3K attraverso la formazione di un legame covalente con la PI3K stessa. Il metabolita primario del PX-866, cioè con il gruppo 17-OH, è ancora più potente del suo composto-parente per quanto riguarda le isoforme α e β della PI3K e dimostra un'accresciuta potenza anche sulla PI3Kα che contiene mutazioni attivanti. In un gruppo di xenoimpianti tumorali umani, la presenza di mutazioni del PI3KCA e la perdita di attività delle PTEN sono stati predittori positivi della risposta al PX-866, mentre le mutazioni oncogene RAS sono state un predittori di resistenza. Nelle cellule del glioma, il PX-866 ha sensibilmente inibito la proliferazione in diverse linee cellulari, con una maggiore sensibilità osservata nelle linee cellulari PTEN-negative, nelle quali i valori dell'IC50 erano tre volte più bassi di quelli delle linee cellulari PTEN-positive. Il PX-866 ha anche indotto un'accresciuta autofagia e una diminuzione del potenziale invasivo e oncogenico delle cellule. Nei modelli con xenoimpianti su ratto della linea cellulare umana U87, il PX-866 ha inibito la crescita tumorale sottocutanea ed ha incrementato il

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tempo di sopravvivenza mediano degli animali con tumori intracranici. I risultati provenienti da uno studio di fase I del PX-866 come agente singolo, in condizione “open-label” (vedi spiegazione di cui sopra) e con crescita progressiva della dose in pazienti con tumori solidi avanzati non rispondenti o non tolleranti le terapie standard, hanno dimostrato che il PX-866 veniva ben tollerato sia nella sua somministrazione intermittente (una volta al giorno nei giorni dall'1 al 5 e dall'8 al 12 di un ciclo da 28 giorni) che in quella giornaliera continuativa.

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INIBITORI DELLE VIE DELLE PI3K, AKT, mTOR ATTUALMENTE

SOTTOPOSTI A SPERIMENTAZIONE CLINICA

Inibitori PI3K aspecifici

BKM120 (Novartis)

Target molecolari Patologia Fase di sperimentazione

Inibitore aspecifico delle PI3K GMB,tumori solidi,carcinoma colon rettale,cancro della prostata,tumore

dell’endometrio, NSCLC,Her2+

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XL147 (Exelixis)

Target molecolari

Inibitore aspecifico delle PI3K

PX866 (Oncothyreon)

Target molecolari

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Patologia Fase di sperimentazione

Inibitore aspecifico delle PI3K GBM,tumore

dell’endometrio,tumore ovarico,linfoma,tumori solidi,NSCLC

Fase II

aspecifico delle PI3K GBM,tumore alla

prostata,NSCLC arcinoma colon rettale,HNSCC e altri tipi di tumori solidi

Fase II

Fase di sperimentazione

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GDC-0941 (Genentech)

Target molecolari

GSK2126458 (GlaxoSmithKline)

Target molecolari

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ER+mBC,Her2+Mbc,NSCLC,tumori solidi

Fase II

GSK2126458 (GlaxoSmithKline)

Inibitore aspecifico delle PI3K Linfoma e tumori solidi Fase I

Fase di sperimentazione Fase II

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BAY80-6946 (Bayer)

Target molecolari

Inibitori isoforme-specifici

BYL719 (Novartis)

Target molecolari PI3K p110alfa 18 Patologia Fase di

Inibitore aspecifico delle PI3K Tumori solidi Fase I

specifici

Tumori solidi Fase I

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GS-1101

PI3K P110 delta CLL,NHL e proliferazioni

maligne ematologiche

Fase II

Inibitori duplici delle PI3K e dell’ mTOR

BEZ235 (Novartis)

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XL765(Exelixis)

Target molecolari PI3K,mTOR

GDC-0980 (Genentech)

Target molecolari PI3K,mTOR 20

GMB,NSCLC e tumori solidi Fasi Ib e II

Tumori solidi,NHL,mBC Fase II

Fase di sperimentazione Fasi Ib e II

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SF1126 (Semafore pharmaceuticals)

Target molecolari PI3K,mTOR

PF-4691502 (Pfizer)

Target molecolari PI3K,mTOR 21

(Semafore pharmaceuticals)

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Inibitori AKT

Perifosina (Keryx)

AKT MM,CRC,glioma,linfoma,cancro

ovarico,sarcoma,RCC,NSCLC,tumori solidi

Fase III

GDC-0068 (Gennentech)

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MK2206 (Merck)

AKT Tumori solidi Fase II

RX-0201 (Rexahn Pharmaceutical) : anticorpo antisenso

AKT Cancro al pancreas Fase II

GSK2110183 (GalaxoSmithKline)

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PBI-05204 (Phoenix Biotechnology)

Target molecolari AKT

Inibitori duplici dell’ AKT e dell’ mTOR

MKC-1 (EntreMed)

Target molecolari AKT,mTOR

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05204 (Phoenix Biotechnology)

i duplici dell’ AKT e dell’ mTOR

Tumore ovarico,tumore del seno,NSCLC,tumore metastatico pancreatico e CRC metastatico Fase II Fase di sperimentazione Fase di sperimentazione

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Inibitori dell’ mTOR

Everolimus (Novartis)

mTORC1 RCC,HCC,linfoma,GMB e

mBC

Approvato per gli RCC,PNET e SEGA

Temsirolimus (Wyeth)

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Ridaforolimus (Merck/Ariad)

mTORC1 Sarcoma,tumore

dell’endometrio,mBC,tumore prostatico,Her2+mBC,altri tumori solidi

Fase III

OSI-027 (Astellas/OSI Pharmaceutical)

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AZD8055 (AstraZeneca)

mTORC 1/2 Tumori solidi,GBM Fase I/II

AZD2014

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INK128 (Intellikine)

Target molecolari Patologie Fase di sperimentazione

mTORC 1/2 mBC,NHL,MM,tumori solidi Fase I

CC-223 (Celgene)

Target molecolari Patologie Fase di sperimentazione

mTORC 1/2 NHL e MM Fase I

Legenda: CLL: Leucemia Linfocitica Cronica, CRC: Carcinoma Colon-rettale. ER: Recettore per l'Estrogeno. GBM: Glioblastoma. HCC: Carcinoma Epatocellulare. Her2: Recettore Umano di tipo 2 per il Fattore di Crescita Epidermico.HNSCC: Carcinoma a Cellule Squamose della Testa e Collo. HR: Recettore dell'Ormone. MBC: Tumore del seno Metastatico. MM: Mieloma Multiplo. NHL: Linfoma Non-Hodgkin. NSCLC: Tumore del polmone Non a Cellule Piccole. PI3K: Fosfatidilinositolo3Chinasi. PNET: Tumori Neuroendocrini Pancreatici. RCC: Carcinoma delle Cellule Renali: SEGA: Astrocitoma Subependimale a Cellule Giganti.

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Globalmente, il 13% (22) dei pazienti trattati con il PX-866 sono andati incontro ad una stabilizzazione della malattia dopo un periodo di 57 giorni (valore mediano) dello studio, considerando una variabilità di questo periodo tra i 4 e i 235 giorni. Gli eventi avversi più comuni sono stati diarrea, nausea, vomito, affaticamento ed innalzamento dei livelli della Alanina-amino Transferasi e della Aspartato-amino Transferasi (quest'ultimo evidenziatosi nei casi di somministrazione continuativa giornaliera). Le dosi MTD sono state di 12 e 8 mg rispettivamente nella somministrazione intermittente e in quella continuativa. Un'indagine clinica che attualmente è in fase I sta accertando l'efficacia e la sicurezza di una somministrazione giornaliera di PX-866 in pazienti con GBM alla sua prima recidiva, come appurato da una risposta oggettiva e dai precedenti tassi di progressione (NCT01259869).

L'XL147 (SAR245408; Sanofi), un altro inibitore aspecifico delle PI3K, ha dimostrato, come agente singolo in fase preclinica, una sua attività in linee cellulari di tumore del seno umano e in modelli di xenotrapianti con un IC50 di approssimatamente 6 µM e ha evidenziato un'attività sinergica con altre terapie. In una ricerca open-label, in fase I con aumento progressivo del dosaggio, è stato studiato l'XL147 in pazienti con tumori solidi e linfomi in stadio avanzato; la massima dose tollerata (MTD) dell'XL147 è stata di 600 mg al giorno sia con un protocollo di somministrazione intermittente (21 giorni con somministrazione intervallati da 7 giorni senza somministrazione) che con un dosaggio continuativo. La DLT (dose-limiting toxicity) nel protocollo con somministrazione intermittente è stata l'eruzione cutanea. Globalmente questo evento avverso, a qualsiasi sua entità di manifestazione, si è verificato in 13 pazienti su 62 (21%); una sua manifestazione di livello 3 ha riguardato 2 pazienti (il 3%) di 62. Su di un totale di 75 pazienti idonei alla sperimentazione, 13 di essi (il 17%) ha ottenuto una stabilizzazione della malattia ed 1 paziente (1%) con NSCLC ha ottenuto una risposta parziale. In un'altra sperimentazione in fase I dell'XL147, in combinazione con l’Erlotinib (Tarceva), 7 pazienti su 26 (il

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27%) con tumori solidi in stadio avanzato sono andati incontro ad una stabilizzazione della malattia ed un paziente (il 4%) con NSCLC ha fatto registrare una conferma di risposta parziale. Inoltre, in un'ulteriore sperimentazione in fase I dell'XL147, in combinazione con il Pavlitaxel (Taxol) e la Carboplatin (Paraplatin), si è evidenziata un'attività anti-tumorale in 10 pazienti su 22 idonei al test (46%), comprendendo tra essi 5 pazienti con una confermata risposta completa o parziale. Una ricerca esplorativa di farmacodinamica è attualmente in corso su pazienti con GBM recidivante, i quali sono dei candidati per una resezione chirurgica. Questi pazienti riceveranno l'XL147 prima dell'intervento chirurgico e il tessuto tumorale verrà analizzato per determinare se le concentrazioni (volute) di sostanza terapeutica possono essere raggiunte nella sede della neoplasia, nonché per una prova effettiva dell'inibizione della via metabolica della PI3K (NCT01240460).

In aggiunta agli inibitori aspecifici delle PI3K, gli inibitori selettivi per le isoforme p110 delle PI3K sono attualmente in fase di sperimentazione. Si spera che l'inibizione delle isoforme p110 possa condurre ad un'inibizione più calibrata del segnale patogenetico veicolato dalle PI3K e, in base a ciò, consentire un migliore scenario dal punto di vista della sicurezza. Alcuni inibitori isoforme-selettivi per le p110ɑ sono attualmente oggetto di sperimentazioni in fase I e II su pazienti con tumori solidi in stadio avanzato; tali composti sono il BYL719, il GDC0032 e l'INK1117. (Fig.4)

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INIBITORI DUPLICI DELLA PI3K E DELL’mTOR

I domini catalitici delle p110 e dell'mTOR sono strutturalmente simili e, dato che mutazioni attivanti la via metabolica della PI3K e l'AKT attivano anche la via metabolica dell'mTOR, è stato suggerito che la duplice inibizione di queste vie può rappresentare un approccio terapeutico più efficace. In generale, gli inibitori duplici delle PI3K e dell'mTOR agiscono in maniera reversibile e in competizione con l'ATP. Alcuni di questi inibitori duplici attualmente soggetti a sperimentazione sono il BEZ235, l'XL765, il GDC-0980, il GDC0084, l'SF1126, e il PF-4691502. Il BEZ235 (Novartis) è un potente inibitore duplice della PI3K e dell'mTORC1/2. Inibisce l'attività di queste due chinasi associandosi alla sede del sito di legame di questi enzimi, con valori del C50 di 4, 75, 7, 5 e 21 mMol/L nelle p110ɑ, p110β, p110γ, p110δ ed mTOR, rispettivamente. Questa molecola è stata studiata estensivamente in modelli preclinici, compresi tumori al seno refrattari, gliomi, carcinoma delle cellule renali, sarcoma e NSCLC. Nelle linee cellulari del glioma, il trattamento con BEZ235 ha condotto ad un arresto del ciclo cellulare allo stadio G1, ha indotto un'autofagia e ridotto l'espressione del VEGF. In vivo, il BEZ235 ha significativamente prolungato il tempo di sopravvivenza di ratti affetti da tumore. In uno studio in fase I/IIb, 28 pazienti con tumore in stadio avanzato sono stati trattati con una formulazione di BEZ235 in Capsula dal Sistema di Rilascio Speciale (SDS: Special Delivery System). Tale agente è stato utilizzato singolarmente o in combinazione con il Trastuzumab..

Una risposta stabile è stata osservata in 6 pazienti (40%) su un totale di 15 idonei alla sperimentazione, 4 dei quali sono stati trattati per un periodo superiore alle 12 settimane. In generale, il BEZ235 è stato ben tollerato e i più comuni eventi avversi sono stati nausea, diarrea, vomito e affaticamento. La somministrazione della formula SDS due volte al giorno è attualmente oggetto di un'ulteriore indagine in uno studio in fase I su pazienti con tumori solidi in

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stadio avanzato. Diverse altre sperimentazioni del BEZ235, sia come agente singolo, sia in combinazione, sono al momento in corso su pazienti affetti da tumori solidi.

L'XL765 (SAR245408; Sanofi) manifesta una citotossicità dose-dipendente nelle linee cellulari dei GBM, associata ad una specifica inibizione del segnale della PI3K, con valori dell'IC50 di 39, 113, 43 e 9 nM rispettivamente verso le isoforme α, β, δ e γ della p110.._{In aggiunta, in modelli di} xenotrapianti di GBM marcati con luciferasi, l'XL765 ha indotto una riduzione del 92% della

bioluminescenza mediana dei tumori in rapporto al controllo.Oltre a ciò, i dati provenienti da questo studio hanno dimostrato un'attività sinergica quando l'XL765 è stato combinato al Temozolomide e una tendenza verso una migliore sopravvivenza è emersa con l'impiego singolo di Temozolomide. In uno studio in fase I, con agente singolo e su 79 pazienti, l'XL765 è stato ben tollerato ed ha evidenziato un'attività farmacodinamica in una gamma di tumori solidi. Le dosi MTD sono state di 50 mg due volte al giorno e di 90 una volta al giorno. I più comuni eventi avversi associati all'XL765 sono stati nausea (31%), diarrea (20%), anoressia (12%), elevati livelli di enzimi (12%), eruzione cutanea (10%) e vomito (13%). Un innalzamento dei livelli di transaminasi di grado 3 o superiore è stato osservato in 4 pazienti (5%), L'XL765 è stato studiato anche in combinazione con Erlotinib in pazienti con tumori solidi refrattari in stadio avanzato. In questo studio in fase I non è stata identificata una dose MTD. In generale, una combinazione di agenti è stata ben tollerata, con assenza di importanti interazioni farmacocinetiche tra le sostanze stesse. Analogamente, nessuna MTD è stata identificata in un altro studio attualmente in corso su pazienti con glioma maligno (n = 22) nel quale l'XL675 è stato somministrato in combinazione con Temozolomide coadiuvante. Ciononostante, dato il livello di intensità 3 dei maggiori eventi aversi associati allo studio con questa sostanza, comprendenti trombocitopenia (15%), linfopenia (10%), edema cerebrale (5%), leucopenia (5%), incrementi nelle transaminasi (5%) ed eruzione cutanea (5%), è stata determinata

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una dose ottimale di somministrazione pari a 60 mg al giorno. Globalmente, 11 pazienti hanno mantenuto la loro partecipazione allo studio per 16 settimane o più. Questo studio è stato recentemente allargato per valutare la dose MTD dell'XL765 in combinazione con radioterapia e Temozolomide nel tessuto tumorale di pazienti con recente diagnosi di GBM. Uno studio esplorativo in fase I sta cercando di appurare gli effetti dell'XL765 sul tessuto tumorale di pazienti con GBM recidivante e che sono candidati per una resezione chirurgica (NCT01240460). Un altro inibitore duplice dell'PI3K e dell'mTOR per via orale, il GDC-0980 (Genentech), con valori di dell'IC50 di 4.8, 26.8, 6.7, 13.8 e di 17.3 nM verso le p110 α, β, δ, γ ed mTOR rispettivamente, ha dimostrato un favorevole profilo di sicurezza e una preliminare azione anti-tumorale in un'indagine in fase I, con crescita progressiva della dose e una tabella di somministrazione nei giorni dal 21 al 28 in pazienti affetti da tumore solido o linfoma non-hodgkin. La dose MTD era di 70 mg, con insorgenza di un'eruzione cutanea maculopapulosa. 3 pazienti dei 33 reclutati nello studio, con mesotelioma, hanno riportato diminuzioni del 23%-28% nell'attività tumorale, attraverso i Criteri di Valutazione della Risposta nei Tumori Solidi (RECIST), e tra i pazienti esaminati attraverso Tomografia a Emissione di Fluorodeossiglucisio-positroni (FDG-PET), 5 su 6 hanno ottenuto diminuzioni del 29%-64% nel Valore di Captazione Standard Massima (SUVmax). Test clinici in fase Ib che valutano l'uno il GDC-0980 in combinazione con Bevacizumab, Trastuzumab e Paclitaxel l'altro in combinazione con Paclitaxel e Carboplatin sono rispettivamente in corso di svolgimento e allo stadio di progettazione. Infine, una sperimentazione clinica in fase I voluta per valutare il GDC-0980 in combinazione con Fluoropirimidina, Oxaliplatin (Eloxatin) e Bevacizumad in pazienti con tumori solidi in stadio avanzato è attualmente in corso.

Il GDC-0084 è un potente inibitore selettivo della PI3K di classe I e dell'mTOR, con un buon transito attraverso la barriera emato-encefalica. Studi preclinici dimostrano un'inbizione in un gruppo di linee cellulari di GBM e in tumori ortotopici U87. É anche in corso di svolgimento una prima sperimentazione in fase I su umani con glioma di alto livello (NCT01547546). (Fig.4)

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INIBITORI DELL’AKT

Dato che il ruolo principale dell'AKT è di facilitare la sopravvivenza e reprimere la morte per apoptosi delle cellule, e dato che l'attivazione si è dimostrata giocare un ruolo chiave nella genesi tumorale, l'inibizione della AKT è un obiettivo terapeutico promettente per i GBM. Generalmente, gli inibitori dell'AKT o competono per il legame con l'ATP nel dominio catalitico, o agiscono come inibitori allosterici che si legano al dominio di omologia con la plextrin dell'AKT impedendo la sua traslocazione alla membrana cellulare.

Diversi inibitori dell'AKT sono stati sottoposti a sperimentazione clinica, ma il Perifosine (Keryx Biopharmaceuticals), conosciuto anche come KRX-0401, è quello che si trova in fase più avanzata. Il Perifosine fa parte della classe degli alchil-fosfolipidi, è un inibitore allosterico dell'AKT e si è dimostrato bloccare la fosforilazione dell'AKT, legandosi al dominio PH e impedendo cosi al PIP3 di interagire con AKT, pur non avendo effetto sull'attivazione delle PI3K. Il Perifosine è stato studiato in numerose ricerche cliniche in fase I e II, sia come agente singolo, sia in combinazione con altri agenti quali Bortezomide, Capecitabine, Sorafenibe e Rapamicina

Somministrato in combinazione, il Perifosine ha dimostrato una modesta attività antitumorale mentre, come agente singolo, esso ha condotto a risultati misti ma non sembra essere efficace in pazienti con Macroglobulinemia di Waldenstrom e con sarcoma. I più comuni eventi avversi con il Perifosine sono affaticamento e tossicità gastrointestinale. In aggiunta alle indagini cliniche in fase I

e II attualmente in corso, il Perifosine è anche oggetto di ricerca in due studi in fase III (tumore colon-rettale e mieloma multiplo). Sulla base di alcuni promettenti dati preclinici,

un test in fase II con il Perifosine su casi di GBM recidivante è stato condotto; sfortunatamente, però, esso ha

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evidenziato una minima attività come agente singolo (NCT00590954). Alcuni dati, che suggeriscono che l'inibizione combinata dell'AKT e dell'mTOR può essere più efficace dell'inibizione singola di questi target, hanno condotto ad una sperimentazione di fase I/II del Perifosine attualmente in corso e in combinazione con Temsirolimus nei gliomi recidivanti di alto livello (NCT01051557).

L'MK-2206 è un inibitore allosterico dell'AKT non ATP-competitivo e altamente selettivo. É somministrato per via orale ed è ugualmente potente sull'AKT1 e sull'AKT2. Ha una potenza di circa il 20% sull'AKT3 umana rispetto alle altre AKT (IC50 = 8,12, e 65 nM, rispettivamente). Studi in fase I hanno valutato la sostanza utilizzando dei protocolli di somministrazione a “un giorno sì-un giorno no” e di una volta a settimana. La dose MTD stabilita per il protocollo di somministrazione “un giorno sì-un giorno no” era di 60 mg, e l'unico evento avverso è stato l'eruzione cutanea. La dose MTD per il protocollo di somministrazione una volta a settimana è stata di 200 mg, e anche in questo caso si è verificata eruzione cutanea come evento avverso. In questi studi, si è registrata una limitata azione del MK-2206 somministrato come agente singolo. Attualmente sono in corso diversi studi che stanno indagando combinazioni di questo composto con altri agenti. Si sta anche prendendo in considerazione una ricerca su gliomi recidivanti di alto livello, sebbene siano emersi dubbi sulla capacità della molecola considerata di attraversare la barriera emato-encefalica.(Fig.4)

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GLI INIBITORI DELL’mTOR

L'mTOR media la trasmissione di segnale lungo la via canonica della PI3K e utilizza in questo processo due distinti complessi funzionali: l'mTORC1 e l'mTORC2. L'mTORC1 (sensibile alla Rapamicina) regola in senso positivo la crescita e la proliferazione cellulare attraverso la fosforilazione dei regolatori translazionali S6K1 e 4EBP1, mentre l'mTORC2 (insensibile alla Rapamicina) regola l'attività di segnale dell'AKT. Come descritto precedentemente, i composti analoghi alla Rapamicina: Everolimus e Temsirolimus sono inibitori dell'mTORC1 che sono stati approvati per il trattamento di diverse neoplasie.

Mentre la Rapamicina e i suoi derivati impediscono l'attività dell'mTORC1, gli inibitori dell'mTOR ATP-competitivi hanno come target il dominio comune della chinasi e, come risultato di ciò, sono represse entrambe le attività dell'mTORC1 e dell'mTORC2. Si è ipotizzato che l'aumentata proliferazione delle cellule tumorali, osservata in alcune neoplasie maligne in seguito a trattamento con Rapamicina, che è un inibitore dell'mTORC1 ma non dell'mTORC2 fosse correlata alla regolazione con feedback negativo dell'mTORC2 sul segnale della via PI3K. Per questa ragione, l'inibizione simultanea di entrambi l'mTORC1 e l'mTORC2 può apportare un vantaggio terapeutico. Gli attuali inibitori degli TORC1/2 in sperimentazioni cliniche comprendono l'AZD8055 e l'AZD2014 (Astra Zeneca), l'INK128 (Intellikine), and OSI-027 (OSI Pharmaceuticals).

I dati preliminari provenienti da uno studio in fase I sull'AZD8055 sono stati presentati al meeting annuale ASCO del 2011. In tutto, in questa ricerca, sono stati reclutati 49 pazienti (dei quali 42 idonei alla sperimentazione) con tumori solidi allo stadio avanzato. La dose MTD era di 90 mg due volte al giorno e l'evento avverso registrato è stato un aumento contenuto dei livelli di transaminasi. A differenza di altri “rapalog”, l'eruzione cutanea e la mucosite non sono stati sintomi che hanno

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determinato una limitazione del dosaggio. Si ricordano anche: un altro studio clinico in corso in fase I e II su pazienti asiatici con carcinoma epatocellulare in stadio avanzato e con una compromissione epatica da lieve a moderata, e uno studio di fase I di prossima attuazione su pazienti con glioma recidivante che non assumono farmaci anti-epilettici attivi su enzimi. Si sta anche progettando

un'indagine clinica sul CC-223 in pazienti con GBM recidivante. (Fig.4)

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POTENZIALI BIOMARCATORI DI RISPOSTA

La possibilità di predire una risposta all'azione di agenti per bersagli specifici attraverso “markers” (marcatori) istopatologici e molecolari è un fattore divenuto integrante le terapie di pazienti affetti da vari tipi di tumori. Nei GBM non è ancora stato validato e standardizzato alcun tipo di campionamento di biomarkers specificamente indicativi; in ogni caso, recenti indagini cliniche hanno dedicato ingenti risorse e sforzi all'identificazione di marker che potenzialmente potrebbero far predire e valutare la risposta, la resistenza e/o le recidive. Un importante passo nella progettazione di ricerche cliniche riguarda la selezione e il monitoraggio di pazienti per l'attivazione di vie metaboliche rilevanti nella terapia mirata di interesse. Per gli inibitori della via della PI3K, dati preclinici hanno suggerito che le mutazioni attivanti del PIK3CA e l'inattivazione o perdita delle PTEN sono le alterazioni molecolari più rilevanti per la predittività di risposta all'inibizione della PI3K in tumori multipli. Un elegante studio di Nicolantonio et al. ha evidenziato che pazienti con tumori che contenevano mutazioni della PIK3CA e perdita dell'attività delle PTEN manifestavano benefici clinici con trattamento con Everolimus (Inibitore dell'mTOR), fatta eccezione per i casi in cui erano presenti mutazioni del gene KRAS. Questa acquisizione è confortata da dati preclinici provenienti da modelli di xenotrapianti di cellule e tumori (realizzati attraverso l'iniezione subcutanea di cellule HKe-3 o ME-180 in ratti immunocompormessi). In un altro studio è stata condotta un'analisi retrospettiva di 7 sperimentazioni per valutare l'effetto di mutazioni BRAF in popolazioni indipendenti di pazienti affetti da tumore colon-rettale. Questo studio ha riscontrato che l'8,3% dei pazienti con mutazioni BRAF, rapportati al 38% di pazienti privi di mutazioni BRAF(P = 0.0012), hanno risposto al trattamento con l'inibitore dell'EFGR Cetuximab.

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Inoltre, in uno studio retrospettivo su 96 pazienti affetti da tipologie di tumore multiple e che erano sottoposti a trattamento in test clinici con agenti il cui bersaglio era la via metabolica della PI3K, i tassi di risposta più elevati sono stati registrati nei portatori di mutazioni della PIK3CA e/o perdita delle PTEN (mutazione o completa perdita della colorazione nelle procedure immunoistochimiche) e gene KRAS “wild-type” (normale), in rapporto a pazienti non selezionati o con mutazioni della PIK3CA e/o perdita delle PTEN con simultanee mutazioni del gene KRAS. Alterazioni aggiuntive, che si verificano con una certa regolarità nei GBM e che attendono ancora di essere valutate per quanto riguarda le predizioni sulla risposta, comprendono mutazioni della PIK3R1 e dell'AKT e un'amplificazione del gene dell'EGFR e del PDGFRA che possono attivare in modo potente la via metabolica della PI3K. Considerati nel loro insieme, questi studi dimostrano che un monitoraggio prospettivo dello status mutazionale deve essere garantito nella progettazione e nell'implementazione di trials clinici in modo che ci si riferisca a dei profili informativi delle mutazioni nel paziente.

La genotipizzazione di mutazioni somatiche multiple ed altri saggi clinici per un efficiente monitoraggio dei pazienti sono stati recentemente introdotti nelle procedure di clinica patologica e dovrebbero aiutare nella progettazione di sperimentazioni più efficaci, _{ma c'è ancora bisogno di un} tale tipo di studi prospettivi su pazienti con GBM per validare questo approccio.

I biomarcatori dei processi farmacodinamici offrono la possibilità di determinare se gli agenti inibiscono effettivamente i target cui si mira nel substrato tumorale e se ci sia con essi una modulazione delle stazioni e costituenti chiave della via metabolica dai quali ci si aspetta una risposta. È in continua crescita l'entità di questi screening eseguiti su campioni di tessuto tumorale e non-tumorale valutati sia immediatamente prima che durante il trattamento con gli agenti considerati. Nel caso degli inibitori delle PI3K, gli studi utilizzano biopsie cutanee molto poco invasive per analizzare i follicoli piliferi in virtù dei loro alti livelli basali di attività delle PI3K. Ad

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esempio, i ricercatori degli studi clinici in fase I con gli agenti XL147 e XL675 sono stati in grado i dimostrare la modulazione dei costituenti la via delle PI3K, assieme ad una riduzione della trasmissione di segnale della via dell'ERK/MAPK nelle biopsie di cute, follicoli piliferi, biopsie di tumori e in un ampio spettro di tipologie di neoplasie solide. In particolare si sono osservate riduzioni nella fosforilazione dei substrati di AKT ricchi di prolina dell'ordine di 40 Kilodalton (PRAS40) a valle della catena (“downstream”), della proteina1 legante l'eIF4E (4EBP1) e dell'S6, così come del MEK ed ERK. Si è evidenziato che una ridotta attività di segnale della via PI3K e la fosforilazione delle MEK e ERK erano associate ad una riduzione del marker di proliferazione Ki67 e ad aumenti dell'apoptosi in pazienti trattati con XL147. Un altro marker surrogato di risposta agli Inibitori della via metabolica delle PI3K, attualmente oggetto di valutazione in trials clinici, consiste nell'impatto degli inibitori della via delle PI3K sull'omeostasi del glucosio, attraverso la misurazione del glucosio a digiuno, dell'insulina o dei peptidi-C nel plasma. I risultati provenienti da studi in fase I con XL147 e XL765 hanno dimostrato che il trattamento con questi composti produceva incrementi dei livelli dell'insulina nei pazienti, secondo una modalità esposizione-dipendente ma aveva un impatto minimo sui livelli di glucosio. In aggiunta, in sperimentazioni cliniche con impiego di BEZ235 e BKM120 sono stati notati incrementi dose-dipendenti nei livelli dei peptidi-C plasmatici.

La captazione dell'FDG dal PET è stata ampiamente utilizzata come marker farmacodinamico nelle sperimentazioni dei BKM120 e del BEZ235 e il suo impiego è attualmente in via di ulteriore implementazione nelle sperimentazioni dei GDC-0980 e CAL-101. Ad esempio, nella sperimentazione in fase I del BKM120 presentata da Grana et al. al meeting annuale ASCO del 2011, l'inibizione dell'attività metabolica del tumore è stata registrata addirittura a partire dal ciclo 1 e la variazione di percentuale rispetto ai valori della baseline suggeriva una tendenza verso l'indicazione di una risposta. Ad ogni modo, nei casi di tumori al sistema nervoso centrale, né le

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biopsie cutanee, né l'omeostasi del glucosio periferico possono essere surrogati affidabili per la misurazione dei livelli di farmaci e dell'inibizione della via metabolica nel cervello e nei tumori dei suoi tessuti, e ciò a causa della presenza della barriera emato-encefalica. Si ricorda inoltre che il campionamento dei tumori cerebrali prima e dopo la terapia mirata rappresenta una sorta di sfida e non è una prassi comunemente attuata. Per i tumori del sistema nervoso centrale, quindi, gli effetti di una terapia mirata nel cervello sono misurati sula base delle più recenti biopsie disponibili prima della terapia comparati con i dati di una biopsia post-terapia (se disponibile). Questa consuetudine dell'utilizzo di una biopsia recente, piuttosto che di una effettuata immediatamente prima della terapia mirata, presuppone che le terapie più ricorrenti dovrebbero produrre un effetto minimo sul tumore per quanto riguarda le specifiche vie metaboliche considerate, a partire dalla valutazione iniziale del tumore e per tutto il corso dei ricorrenti campionamenti del tumore.

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CONCLUSIONI

Sebbene ci siano ancora diversi ostacoli nel percorso per un'approfondita conoscenza della complessità della trasduzione del segnale nella via metabolica delle PI3K e nell'implementazione di misure diagnostiche routinarie, validate e standardizzate, il futuro delle cure dei GBM con agenti mirati sulla via della PI3K è promettente. In linea generale, la più recente ricerca ha compiuto passi da gigante verso la comprensione della patogenesi di questa malattia e nell'identificazione delle varie opzioni terapeutiche. Inoltre, alcune prove precliniche e cliniche suggeriscono che gli inibitori della via metabolica della PI3K potranno apportare nuove opzioni praticabili per i pazienti affetti da tumore, compresi quelli colpiti da GBM. Ulteriori sfide possono essere rappresentate dalla determinazione di quali popolazioni di pazienti beneficeranno di questi inibitori (distinguendo da casi di perdita delle PTEN e casi di mutazioni del PIK3CA) e dall'ottimizzazione della combinazione degli inibitori della via delle PI3K con inibitori di altre vie metaboliche, quali la MAP Chinasi, con inibitori di cellule staminali tumorali, con la radioterapie, la chemioterapia e terapie anti-angiogeniche. Un'esplorazione continuativa di potenziali biomarkers è auspicabile per ottenere maggiori successi nelle cure dei pazienti con GBM.

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