III RIASSUNTO
Le infezioni del tratto respiratorio (RTI), che sono causa di mortalità e morbidità in tutto il mondo, sono causate da agenti patogeni che sono in grado di replicarsi nel tratto respiratorio, nel parenchima polmonare o sulle sierose della pleura. Le RTI possono essere classificate in infezioni del tratto respiratorio superiore (URI), che colpiscono il naso e la gola e infezioni del tratto respiratorio inferiore (LRTI), che interessano le basse vie respiratorie e i polmoni. Gli agenti infettivi delle RTI possono essere: batteri, funghi e protozoi, ma i principali agenti eziologici sono virus. I virus più frequentemente associati ad RTI sono, Adenovirus (ADV), Bocavirus (BOV), Coronavirus (CoV), Enterovirus (ENTV), virus influenzali (INFLU A, B, C), Metapneumovirus (MetV), Parainfluenzavirus (IPV 1, 2, 3, 4a e b), Rinovirus (RV), Virus Respiratorio Sinciziale (RSV). I virus respiratori appartengono a diverse famiglie e spesso presentano una sintomatologia sovrapposta, quindi l’identificazione del singolo agente eziologico può essere compromessa dalla grande varietà dei potenziali agenti patogeni coinvolti e dalle frequenti coinfezioni, che rendono difficile per il clinico porre al laboratorio di analisi un quesito diagnostico. Per tali ragioni è necessario utilizzare metodi diagnostici rapidi, sensibili e specifici che consentano l’identificazione di tutti i virus possibili che possono essere presenti nel campione clinico prelevato da pazienti affetti da sindromi respiratorie. Le tecniche ad oggi maggiormente utilizzate per la diagnosi delle infezioni virali sono spesso poco sensibili e specifiche e richiedono competenze altamente specifiche da parte degli operatori, inoltre spesso non sono sufficientemente rapide. Negli ultimi anni la tecnologia utilizzata per la diagnosi di laboratorio delle RTI virali ha portato allo sviluppo di tecniche basate sull’amplificazione degli acidi nucleici per la rilevazione simultanea dei virus più comunemente associati a RTI. Gli array sono una tecnologia sviluppata per la rilevazione di più target contemporaneamente, di cui esistono varie piattaforme, che recentemente è stata applicata alla diagnosi virologica; sono stati sviluppati i clinical array
IV (CLART) che sono basati sul’amplificazione e marcatura di RNA e DNA appartenenti a diversi virus contemporaneamente e la loro rilevazione mediante ibridazione con sonde virus specifiche. Per valutare l’utilizzo della tecnologia CLART alla diagnosi delle infezioni respiratorie, in questo studio sono stati analizzati v 8 campioni del controllo di qualità per la diagnostica molecolare (QCMD) con carica virale nota, separatamente e in seguito a miscelazione per testare la sensibilità e specificità del metodo. Sono stati inoltre analizzati 10 residui di campioni respiratori (tamponi faringei) prelevati da pazienti con sintomi correlati a infezioni del tratto respiratorio pervenuti al laboratorio di Virologia Universitaria dell’Azienda Ospedaliera Pisana tra Aprile e Maggio 2009 durante la pandemia da virus influenzale H1N1v. I campioni clinici erano pervenuti al laboratorio con solo la richiesta per la ricerca del virus influenza A (H1N1) ed erano risultati negativi. I campioni sono stati analizzati con la tecnologia CLARTR PneumoVir kit ® (Genomica) che permette la rilevaziono contemporanea di 17 virus respiratori : INFLU A, B e C; IPV 1, 2, 3 e 4 (sottotipi A e B); RSV A e B, RSV, MPV (sottotipi A e B); ENTV (Echovirus), ADV, CoV e BOV. La metodica prevede l'utilizzo di array posizionati o sul fondo di un tubo eppendorf e sull'amplificazione e marcatura con biotina in due multiplex PCR di frammenti specifici di genoma virale di circa 120-330 pb, estratti e purificati da diversi tipi di campioni (lavaggi naso-faringei, essudati naso-faringei, essudati naso-faringei), che vengono poi ibridati con sonde di cattura specifiche. Per la risoluzione dell’ibridazione e l'interpretazione dei risultati è stato utilizzato il software di elaborazione di immagini, dello scanner ottico (SAICLART ®), in grado di rilevare e risolvere automaticamente i genotipi. Tutti i campioni sono stati analizzati in triplicato e tutti i virus rilevati sono stati confermati mediante Real Time PCR (Light Cycler, Roche). Mediante CLART Pneumovir sono stati rilevati tutti i genomi virali sia singolarmente che nelle confezioni in tutti i campioni QCMD. Nei campioni clinici sono state rilevate singole infezioni con: RSV A, MPV A, CoV 229,una coinfezione di MPV A, RSV A e B, una coinfezione di CoV 229, Ipv3 e RSV A, e una coinfezione di BoV e MPV A. Solo nel campione con la coinfezione CoV 229, Ipv3, RSV A, la Real Time PCR non ha confermato la
V presenza del genoma di Ipv3. I dati in questo studio dimostrano che il CLART può rilevare correttamente i virus respiratori più frequentemente associati a sindromi respiratorie e con elevata sensibilità e specificità.
