Università degli Studi di Pisa
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale
Corso di Laurea Specialistica in Medicina e Chirurgia
Tesi di laurea:
“Associazioni atipiche degli anticorpi anticitoplasma dei neutrofili
(ANCA): profilo clinico e outcome di malattia nelle patologie
autoimmuni”
RELATORE: CANDIDATO:
Prof. Stefano BOMBARDIERI Carlotta CACCIATORE
1 INDICE ANALITICO
1. Introduzione
1a. Anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili: Cenni storici e metodiche di
determinazione
1b. Anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili: associazioni cliniche
2-6
8-16
2. Scopo del lavoro 17-20
3. Materiali e Metodi 21-24
4. Risultati
4a.Popolazione in studio
4b. Subanalisi per patologia con le caratteristiche fenotipiche
specifiche, dati istologici terapia, outcome e confronto con la letteratura
- Pazienti con Artrite Reumatoide e positività degli ANCA
- Pazienti con Lupus Eritematoso Sistemico e positività degli ANCA - Pazienti con Sclerodermia sistemica progressiva e positività degli
ANCA
- Pazienti con Sindrome di Sjögren e positività degli ANCA
25-29 29-34 35-37 38-41 42-44 5.Discussione 45-51 6. Conclusioni 52-53 7. Bibliografia 54-69
2 1. INTRODUZIONE
1a. ANTICORPI ANTICITOPLASMA DEI NEUTROFILI: Cenni storici e metodiche di determinazione
Gli anticorpi anticitoplasma dei neutrofili (ANCA) costituiscono una famiglia di autoanticorpi, prevalentemente di classe IgG, diretti contro costituenti citoplasmatici dei granulociti neutrofili e monociti quali, in particolare, la mieloperossidasi e la proteinasi 3.
Gli ANCA sono stati descritti per la prima volta da Davies et al. nel 1982 [1] nella glomerulonefrite segmentaria necrotizzante e successivamente da van
der Woude et.al [2] nel 1985 nella Granulomatosi con poliangite (ex
Granulomatosi di Wegener).
Da allora è stato ampiamente dimostrato come gli ANCA abbiano un ruolo chiave nella patogenesi, nell’espressione fenotipica e nell’outcome di un
subset di vasculiti primitive dei vasi di piccolo calibro (i.e le cosiddette
vasculiti ANCA correlate)[3]. La positività degli ANCA è stata descritta però anche in alcune malattie infettive croniche, in soggetti che fanno uso di alcuni farmaci (penicillamine, anticonvulsivanti, FANS, propiltiouracile), e in altre patologie autoimmuni come il Lupus Eritematosus Sistemico (LES), la Sindrome di Sjogren (SS), l’Artrite Reumatoide (AR), la Sclerodermia (SSc), le IBD (inflammatory bowel deseases), la colangite sclerosante primitiva. Il significato degli ANCA in queste ultime affezioni rimane però ancora
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largamente da chiarire [4].
La determinazione degli ANCA può essere effettuata mediante immunofluorescenza indiretta (IFI) su granulociti fissati con etanolo o mediante test ELISA[5].
Nell’immunofluorescenza indiretta, descritta per la prima volta da Weller e Coons i campioni dei pazienti, diluiti, sono incubati con neutrofili umani che sono fissati sui vetrini del microscopio per consentire lo specifico legame degli ANCA. Se sono presenti ANCA, gli anticorpi si legano agli antigeni neutrofilici. Dopo il lavaggio, per rimuovere anticorpi non specifici, il substrato viene incubato con anti-IgG umane coniugate con fluoresceina. Quando i risultati sono positivi, avviene la formazione di un complesso stabile in tre parti composto dall’anticorpo fluorescente antiumano legato agli ANCA umani che sono legati all’antigene presente nelle cellule. Tale complesso può essere visualizzato con l’ausilio di un microscopio a fluorescenza[6].
In tal modo possono essere individuati tre pattern fluoroscopici differenti :
a) Il pattern citoplasmatico c-ANCA che è un pattern a colorazione
citoplasmatica granulare diffusa ,spesso causato (90-95% dei casi) da anticorpi rivolti contro l'antigene Proteinasi 3 (PR3-ANCA) .
b) Il pattern perinucleare p-ANCA che è caratterizzato da una
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che si ha quando molecole antigeniche a carica positiva come la Mieloperossidasi, si spostano verso il nucleo con carica negativa. Altri target oltre la mieloperossidasi possono produrre un pattern p-ANCA, ad esempio la lattoferrina, lisozima e le proteine battericide aumentanti la permeabilità cellulare. I p-ANCA corrispondono in genere agli MPO-ANCA.
c) Pattern atipico a-ANCA: pattern alternativo possibile, di cui non si
conoscono con esattezza gli antigeni bersaglio (i.e elastasi?, cerulo plasmina? enolasi?))[6].
La metodica ELISA sfrutta invece il riconoscimento degli antigeni bersaglio degli ANCA ovvero della proteinasi 3 (PR3) e della mieloperossidasi (MPO). E’ un test complementare all’IFI in grado di aumentare sensibilità e specificità dell’immunofluorescenza indiretta[7, 8]. La PR3 è una serinoproteasi di 228 aminoacidi con un peso molecolare di 29KDa, molto simile all'elastasi o alla catepsina G, presente nei granuli azzurofili dei neutrofili e nei lisosomi perossidasi positivi dei monociti. La PR3 ha attività antimicrobica non proteolitica e in condizioni di infiammazione viene rilasciata dalla cellula con altri enzimi essendo in grado di degradare il collagene, i proteoglicani e altri costituenti del tessuto connettivo[9].
La MPO, invece , è una proteina cationica di 146 kDa cruciale nella formazione delle specie reattive dell'ossigeno. Anch’essa è contenuta nei
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granuli azzurrofili dei neutrofili -costituisce il 5% delle proteine totali contenute nei neutrofili- e nei lisosomi perossidasi positivi dei monociti[10]. Studi con Western Blot dimostrano che gli MPO-ANCA riconoscono solo forme di MPO native, non denaturate e ciò lascia supporre un coinvolgimento di epitopi conformazionali nel meccanismo di riconoscimento. Studi successivi di mapping su epitopi fatti con PR3 hanno dato risultati sovrapponibili[11].
Non è chiaro a tutt'oggi come i pazienti sviluppino questi Anticorpi[12]. Si è ipotizzata una teoria di mimetismo molecolare (molecular mimicry), in cui super-antigeni microbici o altre sostanze con struttura simile a molecole proprie dell'organismo ospite sarebbero in grado di indurre una risposta
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autoimmune attraverso l'attivazione della immunità cellulo-mediata. In alternativa è stata proposta la cosiddetta “teoria della apoptosi difettosa”: in cui una rimozione incompleta dei residui cellulari esporrebbe al sistema immunitario per tempi prolungati molecole che normalmente sono sequestrate nella cellula facendo produrre anticorpi specifici contro di esse. Si è a lungo cercato di studiare quali meccanismi potessero essere alla base di una eventuale esternalizzazione in superficie degli antigeni (che normalmente sono contenuti nei granuli azzurrofili e nei lisosomi dei neutrofili e monociti inattivi) e del loro riconoscimento da parte degli anticorpi, dato che essi sembrerebbero apparentemente inaccessibili agli anticorpi plasmatici. L'ipotesi più accreditata è la teoria della “Sequenza
ANCA-Citochine” che prevede che dosi primer di citochine pro-infiammatorie
(come quelle prodotte durante un'infezione es IL-8 o TNF-alpha o IL-1) possano indurre l'espressione in superficie degli antigeni target degli ANCA permettendone il riconoscimento come bersagli antigenici. Attraverso un meccanismo di citotossicità anticorpo mediata (ADCC) i neutrofili verrebbero attivati a seguito dell’interazione antigene-anticorpo e darebbero luogo ad un burst ossidativo. In aggiunta, l'espressione di molecole di adesione sulla superficie dei PMN attivati e la loro adesione alle cellule endoteliali dei vasi di piccolo calibro permetterebbe che l’attivazione completa dei PMN e la loro successiva degranulazione avvenisse direttamente in situ a livello della parete
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vascolare, con generazione in loco di radicali liberi dell'ossigeno e di ulteriori citochine pro-infiammatorie e danno tissutale. E’ stato osservato in vitro che i neutrofili ANCA-attivati che aderiscono alla parete vasale possono avere una azione di danno diretta sulle cellule endoteliali e provocarne la morte[8].
8 1B. ANCA: ASSOCIAZIONI CLINICHE
Gli ANCA sono prevalentemente associati alle vasculiti sistemiche dei vasi di piccolo e medio calibro come la Granulomatosi con poliangite (GPA; ex. Granulomatosi di Wegener), la Poliangite Microscopica (MPA), la granulomatosi eosinofila con poliangite (EGPA, ex sindrome di Churg-Strauss) e la glomerulonefrite necrotizzante [13].
Le vasculiti sono malattie sistemiche eterogenee caratterizzate da flogosi e necrosi immunomediata di vasi di diverso tipo e di diverso calibro. Accanto alle vasculiti secondarie associate alle infezioni, ad altre malattie reumatiche o all’assunzione di farmaci [8], un capitolo a parte è rappresentato dalle vasculiti primitive la cui eziologia rimane ad oggi sconosciuta. Ad oggi, sono state proposte diverse classificazioni delle vasculiti primitive, vista l'estrema eterogeneità della presentazione clinica e la mancanza di una completa conoscenza del meccanismo patogenetico[14, 15]. La classificazione oggi universalmente accettata è quella della CHCC 2012 (Chapel Hill consensus
Conference di Maggio 2012) [16] che si basa principalmente sul calibro dei
vasi colpiti dal processo vasculitico, ma anche sull'età di insorgenza, sui distretti interessati, sulla presenza di anticorpi specifici (proprio come gli ANCA), su alcune caratteristiche istologiche ed immuno-istochimiche. Questo nuovo sistema classificativo separa le differenti forme di vasculite in idiopatiche primitive e secondarie e risulta essere più specifico riguardo al
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meccanismo patogenetico di danno vascolare.
La figura riporta la classificazione della CHCC del 2012 delle vasculiti sistemiche. Nell’ambito delle vasculiti di piccolo calibro si ritrovano le forme di vasculite più frequentemente associate alla presenza di ANCA (TABELLA 1.1: GPA, MPA ed EGPA a confronto).
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Classificazione delle vasculiti secondo le definizioni della Chapel Hill (2012) Vasculite dei vasi di grande calibro
Arterite di Takayasu Arterite a cellule giganti
Arterite dei vasi di medio calibro
Panarterite nodosa Malattia di Kawasaki
Vasculite dei vasi di piccolo calibro
Vasculite associata agli anticorpi anti citoplasma dei neutrofili (AAV) (tab 1.1) Micro poliangite (MPA)
Granulomatosi con poliangite (Wegener’s) (GPA)
Granulomatosi eosinofila con poliangite (Churg-Strauss) (EGPA) Vasculite da immunocomplessi
Malattia da Anticorpi anti-membrana basale glomerulare (anti-GBM) Vasculite crioglobulinemica (CV)
Vasculite a IgA (Schonlein-Henoch)
Vasculite orticarioide ipocomplementemica
Miscellanea
11
Sindrome di Cogan (CS)
Vasculiti con interessamento di singolo organo
Vasculite leucocitoclastica cutanea Arterite cutanea
Vasculite primitiva del sistema nervoso centrale Aortite isolata
Altre
Vasculiti associate a malattie sistemiche
Vasculite nel LES
Vasculite in Artrite reumatoide Vasculite in Sarcoidosi
Altre
Altre vasculiti associate a causa verosimile nota
Vasculite crioglobulinemica associata ad HCV Vasculite associata ad HBV
Aortite associata a sifilide
Vasculite da immuno-complessi associata a farmaci Vasculite ANCA associata da farmaci
Vasculite associata a neoplasie Altre
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Tabella1.1
MPA GPA EGPA
Prevalenza <2/100000 3/100000 1-2/100000
Rapporto M:F 1:1 1:1 1:1
Età max incidenza 57 anni 40 anni 48 anni Organi colpiti Rene (GNF),
Alveolite polmonare Rene, ORL, polmone (lesioni granulomatose cavitarie) Asma, poliposi, addome, snp, cute
ANCA anti-MPO (75%) anti-PR3 (90%) anti-MPO (10%)
anti-MPO(92-100%)
Associazione degli ANCA nella EGPA
Studi clinici francesi e italiani hanno dimostrato che le caratteristiche cliniche dei pazienti con EGPA si differenziano in accordo con lo stato degli ANCA[17, 18]:
I pazienti EGPA-ANCA positivi costituiscono solo il 40% di tutti i pazienti con EGPA e tendono a presentare un fenotipo più vasculitico di malattia con porpora, impegno del sistema nervoso periferico (multi nevrite sensitivo-motoria) e talora impegno renale. I pazienti EGPA-ANCA negativi invece tendono a presentare un fenotipo più eosinofilico, con infiltrazione eosinofila
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dei diversi organi e apparati (i.e miocardite eosinofila, polmonite eosinofila, gastroenterite eosinofila).
I reperti confermati istologicamente suggeriscono l'esistenza di differenti sottotipi di EGPA caratterizzati dalla predominanza di un distinto meccanismo patogenetico.
Quindi Il ruolo patogenetico degli ANCA nella formazione di danno endoteliale sarebbe cruciale nello sviluppo di manifestazioni vasculitiche in senso stretto, mentre gli eosinofili eserciterebbero un danno tissutale diretto nelle forme ANCA-negative[19, 20].
Associazione degli ANCA nella GPA
L’ associazione dei PR3 ANCA con la GPA è elevatissima. I pazienti ANCA negativi sono una minoranza <10% e tendono a presentare una forma incompleta di malattia con manifestazioni granulomatose confinate alle prime vie respiratorie. La maggior parte dei pazienti invece presenta il caratteristico profilo vasculitico in cui è centrale la glomerulonefrite pauciimmune [21-23].
Associazione degli ANCA nella MPA
L’associazione clinica tra ANCA e MPA è estremamente comune (70-80%). La positività degli ANCA correla con la presenza di impegno renale e polmonare
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che si estrinseca in forme di capillarità di diversa severità che possono esitare in alveolite emorragica[24].
Accanto al valore diagnostico, gli ANCA hanno anche un significato prognostico. La positività o la nuova positivizzazione degli ANCA nella storia clinica dei pazienti come fattore predittivo di “relapse” ovvero di recidiva di malattia una volta raggiunta la remissione della stessa è stato un argomento a lungo dibattuto. Alcuni studi hanno descritto l’associazione fra la presenza di PR3 ANCA e un maggior rischio di recidiva (motivo per cui la GPA recidiverebbe nel 50% dei casi a 8 anni), questo si pensa da studi in vitro che possa essere attribuibile alla stimolazione da parte dei PR3 ANCA sui neutrofili e quindi a una maggiore degranulazione e produzione di ROS da parte dei neutrofili stessi. Gli MPO ANCA hanno dato risultati simili. Gli ANCA potrebbero essere quindi considerati anche come un marker surrogato della attività di malattia , come suggerito dal fatto che la remissione va in parallelo generalmente con la riduzione o assenza degli ANCA e che la persistenza presenza o ricomparsa degli ANCA in pazienti in remissione è associata con recidiva di malattia[25, 26].
Tale associazione sembra supportare il ruolo patogenetico degli ANCA nelle vasculiti dei vasi di piccolo calibro. Il “possibile” ruolo patogenetico degli ANCA ha costituito il presupposto per considerarli potenziali target dei nuovi farmaci biologici specificamente rivolti contro i linfociti B che li producono.
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Negli ultimi anni si è studiata l'applicazione off-label del Rituximab nelle patologie immuno-mediate, farmaco appartenente alla classe degli anticorpi monoclonali, che ha come bersaglio la proteina CD20 dei linfociti B e che li distrugge nella fase precoce di differenziazione.[La regione Fab del Rituximab riconosce una sequenza di 4 aminoacidi su un anello extra-cellulare della molecola CD20 e questo legame comporta una notevole deplezione dei Linf B circolanti inducendo o in maniera diretta l'apoptosi o in maniera indiretta la attivazione di cellule NK o Complemento. Addirittura i corpi apoptotici fagocitati dalle cellule dendritiche possono indurre un'ulteriore risposta immunitaria diretta con le restanti cellule B[27, 28].Due trials clinici condotti recentemente (RITUXVAS e RAVE)[29, 30] hanno comparato l’efficacia del Rituximab con la Ciclofosfamide per os o in somministrazione endovenosa in pazienti con vasculite ANCA correlata e manifestazioni severe di malattia. I due trials hanno dimostrato la non inferiorità del farmaco rispetto alla Ciclofosfamide nell’induzione della remissione delle vasculiti ANCA-correlate . A seguito dei risultati ottenuti, nel 2011 la FDA ha esteso la applicazione del Rituximab alle AAV e in particolare alla GPA refrattaria/recidivante (la Micropoliangite granulomatosa ha un tasso di recidiva del 50% e un tasso di mortalità del 30%) o che presenti effetti collaterali che limitano l'uso di terapie immunosoppressive a lungo corso[31].
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nelle vasculiti sistemiche è andato sempre più a definirsi tanto da renderli un possibile target terapeutico, il significato patogenetico di tali autoanticorpi e le implicazioni prognostico-terapeutiche del loro riscontro in corso di altre patologie autoimmuni (i.e AR, LES, SS e SSc) rimane in larga parte da esplorare. In particolare rimane da definire se essi rappresentino solo un epifenomeno dell’autoimmunità in corso di malattie autoimmuni sistemiche o se la loro positività possa influenzare il fenotipo di malattia e il suo decorso aprendo nuove prospettive terapeutiche sempre più individualizzate per pazienti con malattie complesse ad impegno multi sistemico.
17 2.SCOPO DEL LAVORO
Le malattie autoimmuni sistemiche sono affezioni complesse a eziologia multifattoriale che derivano dall’interazione di fattori ambientali, genetici e ormonali. Tale interazione genera una disimmunità cellulare e umorale (autoanticorpale) che perpetua il danno d’organo. Il patrimonio autoanticorpale di ciascuna delle malattie autoimmuni sistemiche di pertinenza reumatologica (ed in particolare dell’ AR, della SS, del LES e della SSc) è relativamente uniforme e specifico e in letteratura vi sono numerose evidenze di un’associazione causale tra un determinato tipo di autoanticorpo e un specifica manifestazione d’organo della malattia in esame . Gli esempi più caratteristici in questo senso sono rappresentati dalla positività degli anti-dsDNA e dell’impegno renale in corso di LES, della positività degli Scl-70 e dell’impegno polmonare interstiziale in corso di SSc o degli Anti-La/SSB e della tumefazione parotidea in corso di SS[32]. In percentuali relativamente minoritarie di pazienti con malattie autoimmuni definite è descritta la positività di autoanticorpi cosiddetti “atipici” ovvero inattesi tra le manifestazioni sierologiche tipiche della malattia in esame e non è chiaro se tali autoanticorpi rappresentino “epifenomeni” dello spreading della risposta autoimmune o possano influenzare il fenotipo della malattia nel corso della quale vengano riscontrati [4].
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corso sia di AR che di LES, SS e SSc[4]. Il loro riscontro è stato generalmente oggetto di case reports o case series isolate della letteratura che hanno sottolineato come la loro presenza potesse essere correlata all’espressione “vasculitica” delle conettiviti sottostanti. In particolare in corso di SSc , di SS o di LES la positività degli ANCA è stata associata alla presenza di glomerulo nefrite o in genere ad un deterioramento della funzione renale. In corso di AR il loro riscontro è stato invece associato a vasculite cutanea o a manifestazioni vasculitiche oculari. Altri studi hanno invece descritto come la presenza degli ANCA fosse solo un epifenomeno dell’autoimmunità del tutto ininfluente sull’espressione della malattia sistemica sottostante. Tuttavia l’esiguo numero di pazienti esaminati e l’eterogeneità dei dati della letteratura non ha permesso ad oggi di trarre conclusioni definitive a tal proposito.
L’effettivo ruolo degli ANCA in subsets specifici di pazienti affetti da AR o da connettivite sistemica è ora particolarmente attuale alla luce delle nuove strategie terapeutiche disponibili in ambito reumatologico. Negli ultimi anni infatti, è andato progressivamente affermandosi il concetto che la terapia delle malattie autoimmuni sistemiche di pertinenza reumatologica dovesse essere sempre più disegnata sul singolo paziente e rivolta contro specifici target di malattia. Se gli ANCA dimostrassero di rappresentare non un epifenomeno ma un effettivo bersaglio terapeutico nei subsets di pazienti
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con altre malattie reumatiche , sulla scia dell’efficacia dimostrata da farmaci monoclonali rivolti contro i linfociti B nella terapia delle vasculiti ANCA correlate potrebbero delinearsi ulteriori possibili scenari terapeutici per
subsets specifici di pazienti affetti da connettiviti complesse ad impegno
multi organo.
Alla luce di quanto finora descritto, lo scopo di questo studio osservazionale è stato quindi quello di descrivere prevalenza, espressione fenotipica ed
outcome a lungo termine di sindromi “overlap” documentate in una coorte di
pazienti ANCA positivi al fine ultimo di verificare se la positività degli anticorpi ANCA rappresentasse un semplice epifenomeno dell’autoimmunità o rivestisse un ruolo patogenetico nell’espressione di malattie croniche definite quali: l’AR, la SSc, il LES e la SS.
Nel dettaglio il primo obiettivo dello studio è stato quello di verificare quale fosse la percentuale di pazienti ANCA positivi tra tutti i pazienti che a parità di malattia reumatica di fondo, in un periodo definito di tempo, fossero sottoposti al test per ANCA presso lo stesso laboratorio.
La specificità degli ANCA è stata registrata allo scopo di verificare se vi fosse una diversa distribuzione degli ANCA-MPO e degli ANCA-PR3 nelle diverse malattie del connettivo.
Ulteriore obiettivo dello studio è stato quindi quello di valutare l’impatto degli ANCA nella storia clinica dei pazienti identificati e nell’outcome di
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malattia a lungo termine con una particolare attenzione all’associazione tra eventuali manifestazioni vasculitiche presentate dai pazienti e la presenza degli ANCA.
21 3. MATERIALI E METODI
Disegno di studio: Lo studio in esame è uno studio osservazionale monocentrico retrospettivo di tipo cross-sectional condotto presso la UO di Reumatologia dell’Università di Pisa. I registri dei risultati dei test di laboratorio relativi alla ricerca degli ANCA del periodo compreso tra il 1995 e il 2013 sono stati analizzati retrospettivamente al fine di identificare soggetti con: a) positività documentata in almeno due occasioni mediante ELISA degli ANCA MPO o PR3, b) diagnosi di malattia autoimmune sistemica formulata in base ai criteri internazionali (i.e Artrite Reumatoide (AR), Sclerodermia (SSc), Sindrome di Sjögren (SS), Lupus eritematoso Sistemico (LES)). Tutti i soggetti affetti dalle stesse malattie reumatiche testati per anticorpi ANCA , i cui risultati per tali autoanticorpi fossero negativi hanno rappresentato il gruppo di controllo.
Al fine di caratterizzare dal punto di vista epidemiologico e clinico il subset di pazienti con malattie autoimmuni definite e positività degli ANCA è stata creata una cartella di raccolta dati standard. Le variabili registrate nella cartella di raccolta dati hanno incluso le seguenti: specificità e titolo degli ANCA, diagnosi di malattia reumatica definita in base ai criteri internazionali sopra indicati, caratteristiche demografiche dei pazienti (i.e sesso, età alla diagnosi, età all’inclusione nello studio), manifestazioni clinico-sierologiche legate sia alla malattia di base che ad un eventuale processo vasculitico,
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terapia di induzione e di mantenimento, outcome a lungo termine. La diagnosi di “manifestazione vasculitica” è stata attribuita ai diversi quadri clinici sulla base di criteri clinici e di markers di laboratorio o strumentali surrogato per vasculite e laddove disponibile con il supporto del dato istologico.
I pazienti per i quali non fossero disponibili le informazioni cliniche suddette sono stati esclusi dallo studio.
Protocollo di determinazione degli ANCA
La ricerca degli anticorpi anticitoplasma dei neutrofili (ANCA) è stata condotta in tutti i pazienti utilizzando la tecnica ELISA (enzyme–linked
immunosorbent assay) secondo le direttive dell’European Standardization Workshop”.
Sono state ricercate le due principali specificità antigeniche derivate da neutrofili umani: la mieloperossidasi (Calbiochem, La Jolla, CA) e la proteinasi-3 (PR3) in forma di estratto di alpha granuli, ottenuto nel nostro laboratorio mediante centrifugazione differenziale. Per la messa a punto della metodica ELISA sono state impiegate piastre micro elisa (Nunc). Il
“coating” di ciascuno dei pozzetti delle piastre è stato effettuato con 10
gamma/ml di MPO, diluita in tampone carbonato a ph 9.6; l’estratto di alpha granuli è stato diluito 1/100 in tampone fosfato a pH 11.9. I pozzetti sono stati saturati con PBS (Phospate Buffered saline) + BSA (Bovine Serum Albumine) al
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3%. A ciascun passaggio, i lavaggi sono stati effettuati con PBS + BSA all’1%+ Tween-20 0.05%. I sieri dei pazienti sono stati diluiti rispettivamente 1/400 per ELISA con MPO e 1/100 per l’ELISA con estratto di alpha granuli. Successivamente è stato aggiunto un antisiero anti-igG umane (anti Human
IgG F (ab’)2 fragment), coniugato con fosfatasi alcalina e diluito 1/1000. Per
ultimo è stato aggiunto il Para-Nitro-Fenil-Fosfato (PNPP), substrato della fosfatasi alcalina. La reazione colorimetrica è stata lasciata sviluppare finché il siero di riferimento positivo non determinava un’assorbanza a 405 nm pari a 1,000 OD. I valori di densità ottica dei sieri sono stati espressi in percentuale del valore ottenuto rispettivamente da sieri MPO positivi e PR3 positivi di riferimento.
Revisione della letteratura: La revisione della letteratura è stata effettuata
utilizzando Pub Med e inserendo i seguenti termini Mesh:
1° ricerca: ("Arthritis, Rheumatoid"[Majr]) AND "Antibodies, Antineutrophil Cytoplasmic"[Mesh]
2° ricerca: ("Lupus Erythematosus, Systemic"[Majr]) AND "Antibodies, Antineutrophil Cytoplasmic"[Mesh]
3° ricerca: ("Scleroderma, Diffuse"[Majr]) AND "Antibodies, Antineutrophil Cytoplasmic"[Mesh]
4° ricerca: ("Sjogren's Syndrome"[Majr]) AND "Antibodies, Antineutrophil Cytoplasmic"[Mesh]
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In tutti I casi non sono stati definite a priori i termini temporali della ricerca né il tipo di pubblicazione. E’ stato però pre-specificato che fossero selezionati esclusivamente contributi in lingua inglese, italiana, francese e spagnola.
Analisi statistica: le variabili continue sono state espresse come media (DS)
mentre le nominali come percentuale di frequenza (%). La comparazione delle variabili continue è stata effettuata mediante t-test di Student e ANOVA test. L’analisi delle variabili categoriche è stata effettuata mediante tabelle di contingenza e test esatto di Fisher. Un p-value <0.05 è stato considerato
25 4. RISULTATI
4a.Popolazione in studio
L’analisi retrospettiva dei registri di laboratorio della nostra Unità Operativa ha evidenziato che nel periodo compreso tra 1/1/1995-1/1/2013, 4011 soggetti giunti a visita presso la UO di Reumatologia sono stati testati per anticorpi ANCA MPO e PR3. Di essi, 1867 soggetti sono stati immediatamente esclusi dallo studio per la mancanza di informazioni cliniche che ne permettessero una diagnosi finale. Dei rimanenti, sono stati inoltre identificati ed esclusi 180 che avevano una diagnosi di vasculite primitiva ANCA – correlata. Nell’analisi sono stati quindi inclusi 428 soggetti la cui diagnosi e il cui profilo sierologico per ANCA sono sintetizzati in TABELLA 4.1
Tabella 4.1
ANCA MPO ANCA PR3
positivi negativi positivi negativi Artrite reumatoide 5/96 91/96 0/96 96/96 LES 3/168 165/168 0/168 168/168 Sclerosi Sistemica 4/106 102/106 2/106 104/106 Sindrome di Sjogren 3/58 55/58 0/58 58/58
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Dai dati riportati nella tabella emerge chiaramente come tra tutti i pazienti testati per la presenza di ANCA MPO e PR3, 17 pazienti abbiano presentato una positività “inattesa” per ANCA nel contesto di malattie reumatologiche definite. Nello specifico dei 17 pazienti: 5 erano affetti da AR, 6 da SSc diffusa, 3 da LES e 3 da SS. Globalmente quindi una positività inattesa degli ANCA è stata riscontrata nel 5.2% dei pazienti con AR, nell’1,8% dei pazienti con LES, nel 5,6% dei pazienti con SSc e nel 5,17% dei pazienti con SS.
Dal punto di vista delle caratteristiche demografiche, dei 17 pazienti con quadri “overlap”, 15/17 erano di sesso femminile (rapporto maschi: femmine 2:15); inoltre, i 17 soggetti presentavano un età media alla diagnosi di 47±14 anni ed un follow-up medio di 127±95 mesi. Relativamente alla specificità degli ANCA, 15/17 pazienti presentavano positività per ANCA-MPO e 2/17 per ANCA-PR3.
Per quanto relativo alle manifestazioni cliniche, accanto a manifestazioni d’organo specifiche della malattia reumatica di base, in tutti i casi è stato possibile documentare la presenza di forme di impegno d’organo a patogenesi vasculitica quali: vasculite retinica (1/17), vasculite leucocitoclastica (6/17), ulcere vasculitiche (2/17), mononeurite multipla (1/17), emorragia alveolare (1/17), glomerulonefrite (11/17). Le manifestazioni cliniche stratificate per la diagnosi di base dei pazienti sono riportate in
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Tabella 4.2.
In media il tempo di latenza intercorso tra la diagnosi della malattia reumatica “principale” e la comparsa di manifestazioni vasculitiche è stata di 75 ±96 mesi.
Tabella 4.2
Manifestazioni vasculitiche AR LES SSc SS
Oculari 0/5 1/3 0/6 0/3 Cutanee - Porpora - Ulcere vasculitiche 2/5 0/5 0/3 1/3 0/6 2/6 3/3 0/3 Neurologiche 1/5 0/3 0/6 0/3
Polmonari (emorragia alveolare) 0/5 0/3 1/6 0/3
Renali 3/5 3/3 4/6 1/3
L’impegno cutaneo e quello renale sono risultate le manifestazioni vasculitiche più comuni nelle diverse affezioni indipendentemente dalla diagnosi reumatologica di partenza. Nei pazienti con SSc, in particolare, l’impegno renale ha posto inevitabilmente problemi di diagnosi differenziale con la crisi renale sclerodermica . In termini di severità i casi di
28
glomerulonefrite a semilune con insufficienza renale rapidamente progressiva e il caso della paziente con alveolite emorragica sono quelli che hanno imposto le strategie terapeutiche più severe.
Nel dettaglio, la tabella4.3 riassume gli schemi terapeutici di induzione utilizzati. Tabella4.3 AR LES SSc SS CYC e steroidi 4/5 3/3 5/5 1/3 Plasmaferesi 1/5 0/3 1/5 0/0 Rituximab 1/5 1/3 0/0 0/0 Dialisi 0/5 1/3 2/5 1/3
Dall’analisi dei dati si osserva come in generale la maggior parte dei pazienti siano stati trattati con steroidi e boli di Ciclofosfamide (dose media, DS= 7±4 g); questa ultima è stata associata a plasmaferesi nei due pazienti che presentavano rispettivamente un’alveolite emorragica e un’insufficienza renale rapidamente progressiva. Una paziente con AR, glomerulonefrite e ANCA-MPO positivi è stata trattata con Rituximab ottenendo sia il controllo del quadro articolare che di quello renale. Analogamente il Rituximab è stato
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utilizzato con successo in un paziente con LES e impegno renale refrattario alla Ciclofosfamide. Nel mantenimento della remissione il Methotrexate è stato utilizzato nel 11,7% dei casi, l’Azatioprina nel 35,29% dei casi, il MMF nel 5,88% dei casi e la Ciclosporina nel 5,88%.
Con tali schemi terapeutici, una remissione completa è stata raggiunta in 10/17 pazienti; 4/17 soggetti hanno invece sviluppato un quadro di insufficienza renale terminale che ha richiesto terapia dialitica mentre la paziente con mononeurite multipla ha recuperato parzialmente il deficit motorio ma ha continuato a presentare il danno sensitivo. Nessun decesso è stato registrato nel follow-up.
4b. Subanalisi per patologia con le caratteristiche fenotipiche specifiche, dati istologici terapia, outcome e confronto con la letteratura
Pazienti con Artrite Reumatoide e positività degli ANCA
96 pazienti con Artrite Reumatoide (AR) hanno effettuato la ricerca per gli
ANCA MPO e ANCA PR3. Trai pazienti sottoposti al dosaggio degli ANCA, 5/96, tutti di sesso femminile, hanno presentato una positività degli ANCA MPO, mentre nessun soggetto ha presentato una positività per gli ANCA PR3. L’età media alla diagnosi dei pazienti con AR e positività per ANCA MPO è risultata pari a 54±9,8 anni mentre l’età media dei pazienti con AR e ANCA
30
negativi è risultata pari a 53.8 ± 5.4(p=ns). Quattro dei cinque pazienti hanno sviluppato un’artrite erosiva , 3/5 presentavano un profilo sierologico caratterizzato da positività del fattore reumatoide e degli anticorpi anticitrullina. Relativamente alla prevalenza delle manifestazioni extra articolari lo studio ha permesso di documentare accanto alla sindrome sicca (1/5) e alla presenza di una lieve compromissione delle prove di funzionalità respiratoria e della DLCO legate ad interstiziopatia polmonare (2/5), alcune manifestazioni a patogenesi vasculitica. Tra esse l’analisi delle cartelle cliniche dei pazienti ha permesso di descrivere la presenza di porpora ortostatica agli arti inferiori (2/5), neuropatia sensitivo motoria (1/5), e glomerulonefrite con compromissione modesta della funzione renale e proteinuria in range non nefrosico (3/5). Due dei tre pazienti sono stati sottoposti a biopsia renale che ha documentato rispettivamente un quadro di glomerulonefrite mesangioproliferativa e di glomerulonefrite focale segmentale. Il quadro di impegno renale si è manifestato lentamente e nessuno dei pazienti ha richiesto terapia dialitica. In tutti i casi le manifestazioni vasculitiche menzionate si sono manifestate come “isolate” nella storia clinica dei pazienti tendendo a rimanere “confinate” ad un singolo organo bersaglio come la cute o il rene piuttosto che sommarsi a ricreare quelle forme di impegno sistemico che sono la regola nella presentazione clinica delle vasculiti primitive dei vasi di piccolo calibro ANCA correlate. Il riscontro di
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impegno renale glomerulonefritico nei pazienti con AR e positività per ANCA MPO è apparso particolarmente indicativo dell’impatto degli ANCA sull’espressione vasculitica della malattia. Nessuno dei pazienti con AR e ANCA negativi, infatti ha presentato una glomerulonefrite nel corso del
follow-up a fronte del fatto che il 3.4% di tali soggetti ha invece presentato
nel tempo un deterioramento progressivo della funzione renale, attribuibile però in primis a comorbidità quali l’ipertensione arteriosa, l’iperglicemia e/o all’effetto avverso dei farmaci utilizzati per la cura dell’artrite. L’impatto degli ANCA sul fenotipo di malattia si è tradotto nelle scelte terapeutiche adottate. Quattro dei cinque pazienti sono stati trattati con Ciclofosfamide seguita da Azatioprina o Methotrexate. In un caso, come già accennato, l’utilizzo del Rituximab (MabThera) ha permesso non solo di controllare l’impegno articolare legato alla malattia passando da un DAS 28 di 5,62 ad un DAS 28 di 2.65, ma soprattutto di controllare l’impegno renale (creatinina pre RTX=2,2 mg/dl , creatinina post RTX = 1.1 mg/dl). Si trattava di una paziente di 51 anni seguita presso la U.O di Reumatologia per una Artrite Reumatoide erosiva sieropositiva diagnosticata nel 2006. La paziente che negli anni era stata trattata con diverse classi di farmaci immunosoppressivi e che aveva mostrato scarsa tolleranza e reazioni idiosincrasiche di diverso tipo nonché recidive di malattia, ha risposto in maniera sorprendente all'infusione di 1 g di RTX (previa premedicazione con Paracetamolo, Trimeton e Solumedrol
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100mg). La peculiarità del quadro in esame è stata la lenta evolutività del quadro renale (glomerulonefrite mesangioproliferativa) che pur essendo insorto prima della diagnosi di AR (anomalie del sedimento urinario sono documentate nella storia della paziente a partire da tre anni prima della diagnosi di AR) è stato riconosciuto e correttamente attribuito ad una patogenesi vasculitica ANCA correlata solo dopo 5 anni dalla diagnosi di AR. Il titolo degli ANCA al lor primo riscontro è risultato pari al 39% , l’utilizzo del RTX ha portato il titolo degli ANCA dal 39% al 13%. La revisione della letteratura ha permesso di selezionare a partire dalle 103 voci bibliografiche ottenute, alcuni contributi pubblicati tra il 1991 e il 2013. La tabella 4.4 riassume alcuni degli studi più significativi della letteratura relativi alle implicazioni fenotipiche della positività degli ANCA in corso di AR [33-42]. Si tratta in genere di case reports o di case series e solo raramente di studi cross
sectional osservazionali condotti su più ampie casistiche di pazienti con AR. In
generale la prevalenza degli ANCA Perinucleari in corso di AR è stimata intorno al 20%, la positività per ANCA MPO tra il 6 e il 12%. Relativamente al loro significato clinico con l’eccezione di un lavoro in cui non vengono documentate associazioni tra gli ANCA e le manifestazioni articolari ed extra-articolari dei pazienti, la maggior parte dei dati della letteratura, in linea con i dati evidenziati nel nostro studio evidenzia come l’impatto degli ANCA si ripercuota in genere nel determinare un’aumentata frequenza di
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manifestazioni vasculitiche renali nei pazienti con AR. Il quadro renale più frequentemente riportato è quello della glomerulo nefrite necrotizzante pauciimmune lentamente progressiva. In un numero più limitato di studi la presenza degli ANCA sembra aver comportato una maggiore severità sull’espressione fenotipica della malattia articolare nei pazienti con AR, dato questo non emerso nella nostra analisi di casistica.
34 Tabella 4.4.ANCA nella Artrite Reumatoide
Autore Anno Provenienza N di casi Commento Ruolo patogenetico Epifenomeno
Savige J.A. 1991 Australia Studio su 58 pz età media 61 anni
Positività per ANCA in 10/58 casi (70% p-ANCA positivi)
si
Cambridge G. 1994 UK Studio su 97 pz età media 60 anni
Positività per MPO-ANCA in 29/97 pz Polmone, Artrite no
Constantin A. 1996 Francia Case report Positività per p-ANCA GNRP no
Mustila A. 1997 U.S.A Studio su 246 pz età media 59 anni
Positività per p-ANCA 52 pz GNF focale segmentale no
Stewart O.G 2001 U.K. Case report Positività per p-ANCA SNP no
Tur 2004 Francia Studio su 85 pz Positività per MPO-ANCA in 6/85 pz si
Goto A. 2005 Giappone case report Positività per MPO-ANCA GNRP, episclerite no
Sugimoto T. 2006 Australia Case report Positività per ANCA GNRP no
Ashok D. 2008 UK Case report (uomo 31 anni) Positività per c-ANCA Cute, IRA, GNRP no Kida I. 2011 Giappone 125 pz età media 56 anni Positività per ANCA 30/125 pz Artrite no
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Pazienti con Lupus Eritematoso Sistemico e positività degli ANCA
168 pazienti con Lupus Eritematoso Sistemico hanno effettuato la ricerca per
ANCA MPO e ANCA PR3. Trai pazienti sottoposti al dosaggio degli ANCA, 3/168,(2F:1M, età alla diagnosi 27 ± 8 anni, follow-up medio 44±8 mesi), hanno presentato una positività degli ANCA MPO, mentre nessun soggetto ha presentato una positività per gli ANCA PR3. Una paziente ha presentato concomitantemente una positività per anti-Ro/SSA ed una sindrome da anticorpi antifosfolipidi con trombosi venose profonde agli arti inferiori complicate da embolia polmonare. L’altra paziente ha presentato una positività degli anti Ro/SSA e l’ultimo paziente degli anticorpi anticardiolipina IgG a basso titolo in assenza di una sindrome da anticorpi antifosfolipidi conclamata. Tutti e tre i pazienti hanno presentato impegno renale con sindrome nefrosica. Il quadro bioptico ha evidenziato due quadri di glomerulonefrite diffusa proliferativa (classe IV). In due casi la terapia immunosoppressiva ha consentito di controllare l’impegno renale, in un caso invece nonostante la terapia immunosoppressiva con steroidi e Ciclofosfamide, il paziente è rapidamente progredito verso un’insufficienza renale terminale che ha richiesto terapia dialitica. Oltre alle manifestazioni relative all’impegno renale, i tre pazienti hanno in genere presentato manifestazioni di attività di malattia sovrapponibili a quelle documentate nei pazienti con LES e ANCA negativi I.e sierositi, impegno articolare,
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costituzionale, cutaneo, ipocomplementemia ). E’ interessante osservare inoltre che un paziente ha sviluppato una vasculite cutanea a carico delle mani bilateralmente mentre una seconda paziente una vasculite retinica. L’analisi della letteratura ha permesso di identificare 107 pubblicazioni. La tabella 4.5 sintetizza gli studi più informativi sull’argomento [43-51]. In generale la prevalenza degli ANCA in corso di LES è riportata con una frequenza tra il 6 e il 10%. I dati relativi all’impatto clinico degli ANCA in corso di malattia sono molto controversi e non sembra possibile definire se abbiano un ruolo patogenetico complementare (ad esempio nel danno renale) o se si tratti esclusivamente di una manifestazione dello “spreading” dell’autoimmunità.
37 Tabella 4.5.ANCA nel Lupus Eritematoso Sistemico
Autore Anno Provenienza N di casi Commento Ruolo patogenetico Epifenomeno
Pauzner R. 1994 Canada Studio su 114 pz 12pz c-ANCA 29 pz p-ANCA
si
Wong S.N. 1995 Germania Studio su 23 bambini 69% ANCA positivi si
Schnabel A. 1995 U.K. Studio su 157 pz 25% ANCA positivi si
Spronk P.E. 1996 U.K Studio su 84 pz recidive no
Manolova I. 2001 Germania Studio su 55 pz 6/55 pz MPO-ANCA 7/55 pz PR3-ANCA
sierosite, artrite no
Molnar K. 2002 U.K Studio su 41 pz p-ANCA 10/41pz c-ANCA in 3/41 pz
si
Amer A K 2003 Egitto Studio su 29 bambini Positività per ANCA 55% no
Pradhan V.D.
2004 India Studio su 18 pz Positività per ANCA 37.3% GNF no
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Pazienti con Sclerodermia sistemica progressiva e positività degli ANCA
106 pazienti con SSc sono stati indagati per la presenza di ANCA MPO e PR3.
Dall’analisi è stato possibile identificare 4 pazienti ANCA MPO positivi e 2 ANCA PR3 positivi. Tutti e sei i soggetti (5 F:1 M, età media=51±14, follow-up 131±33 mesi) presentavano una positività per anticorpi anti topo isomerasi (Scl 70) e un impegno cutaneo suggestivo per una forma di sclerodermia diffusa. Due pazienti oltre agli anticorpi anti Sclero70 presentavano una positività del Fattore Reumatoide. Tutti i pazienti con quadro overlap presentavano un’interstiziopatia polmonare con diverso grado di fibrosi fino all’honey combing, in questo in maniera del tutto sovrapponibile rispetto ai pazienti con SSC Scl70+ ma con ANCA negativi. Una paziente ha però presentato un’alveolite emorragica , complicanza vasculitica temibile osservata quasi esclusivamente in relazione agli anticorpi ANCA nelle vasculiti dei vasi di piccolo calibro (d.d MPA e GPA vs Sindrome di GoodPasture) e riportata solo in rari casi in letteratura.[122, 123] La paziente in questione era una donna di 74 anni affetta da Sclerosi Sistemica che dopo sette anni dalla diagnosi di malattia ha presentato improvvisamente emoftoe, dispnea per sforzi di lieve entità e una anemizzazione a rapida evoluzione (da 10,4 g/dl a 8,4 g/dl in 20 giorni). L'HRCT e il Lavaggio bronco alveolare permettevano di confermare il sospetto diagnostico di alveolite emorragica e il profilo sierologico della paziente consentiva di documentare la presenza di una
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Sindrome overlap dato il riscontro confermato della positività degli ANCA MPO-al 64%. La paziente veniva trattata con successo con Ciclofosfamide, steroidi e plasamferesi. Negli altri casi clinici raccolti invece l’impegno clinico prevalente è risultato quello renale. Quattro dei sei pazienti inclusi nello studio hanno presentato impegno renale dopo un follow-up medio di 78±85 mesi. In tutti i casi oltre ad un incremento >20% dei valori della creatinina registrata al basale è stato possibile documentare alterazioni del sedimento e comparsa di proteinuria suggestive per glomerulonefrite. La compromissione della funzione renale è avvenuta senza alterazioni concomitanti dei valori della pressione arteriosa. In tre dei quattro casi è stata effettuata la biopsia renale che ha confermato il quadro di glomerulonefrite pauciimmune. Due dei quattro pazienti hanno sviluppato un’insufficienza renale terminale che li ha portati alla dialisi dopo 65 e 8 mesi rispettivamente rispetto all’esordio dell’impegno renale. Il quadro di insufficienza renale sviluppato dai pazienti con positività per gli ANCA ha posto problemi di diagnosi differenziale rispetto alla crisi renale sclerodermica, complicanza rara ma estremamente severa della Sclerodermia caratterizzata dall’improvvisa comparsa di insufficienza renale e di ipertensione. Nell’intera coorte di pazienti con SSc inclusa nello studio, una crisi renale sclerodermica è stata presentata da 5
pazienti La tabella 4.6 riassume le caratteristiche differenziali tra i pazienti
40
SSc ANCA negativi e crisi renale sclerodermica. Tabella 4.6
Crisi renale Rene _ANCA p-value
Numero pz 5 6 ns
Sesso (M:F) 1:4 1:5 ns
Età alla diagnosi SSc (aa) 49±11 51±14 ns Età impegno renale (aa) 52±11 60±10 ns Tempo SSc_rene (mesi) 35±52 75±48 ns
Sviluppo insuff renale (mesi) 2±1 18±6 0,001
C3 (mg/dl) 93±21 105±16 ns C4 (mg/dl) 19±4 22±8 ns Creatinina (mg/dl) 4,4±1,1 3,5±3,8 ns Sedimento patologico 4/5 4/6 ns Ipertensione 5/5 0/6 0,002 Evoluzione in IRC 4/5 2/6 ns Dialisi 1/5 2/6 ns Scl70 2/5 6/6 0,06 Fattore Reumatoide 4/5 2/6 ns
La ricerca della letteratura ha permesso di selezionare alcune delle 93 voci bibliografiche identificate dalle parole chiave. La tabella 4.7 sintetizza alcuni dei lavori principali che enfatizzano la diagnosi differenziale tra crisi renale sclerodermica e la glomerulonefrite ANCA positiva [52-60]
41 Tabella 4.7 Anca nella Sclerosi Sistemica
Autore Anno Provenienza N. Casi Commento Ruolo Patogenetico Epifenomeno
Endo, H. 1994 Giappone Studio su 6 pz Positività per ANCA Rene (pressione normale) no Kiraz, S 1996 Belgio Studio su 11 pz, età media 40
anni
Positività di 1/11 pz per MPO-ANCA
Cute, polmone no
Carvajal I. 1997 Spagna Case report uomo 54 aa Positività per p-ANCA, IRA no
Omote, A. 1997 Giappone Case report pz donna 46 anni
Positività per MPO-ANCA GNRP e IRA(pressione normale)
no
Katrib, A. 1999 Germania Case series di 3 pz Positività per MPO-ANCA GNRP e IRA(pressione normale)
dialisi per 2/3 pz
no
Caramaschi , P. 2002 Francia Studio su 62 pz Positività di 1 /61 pz per PR3 ANCA
Positività DI 1/61 pz per MPO-ANCA
Cute e polmone no
Yamada, T. 2003 Giappone Case report pz donna 54 anni Positività per MPO-ANCA Emorragia polmonare microematuria e proteinuria
no
Sol, E.B 2008 Belgio Case report pz donna 70 Positività per MPO-Anca Rene no Chan,P.T. 2012 Germania Case report pz donna 57
anni
42
Pazienti con Sindrome di Sjögren e positività degli ANCA
58 pazienti con SS sono stati sottoposti alla ricerca degli ANCA MPO e PR3.
Di essi 3/58 hanno presentato una positività per gli ANCA MPO.
Nessuno di tali pazienti ha presentato positività per ANCA PR3. Le tre pazienti erano tutte di sesso femminile (età alla diagnosi 46±7 anni). Oltre alla positività per gli ANCA, presentavano tutte positività degli anticorpi antinucleo degli anti-Ro/SSA e del fattore reumatoide. Tutte e tre presentavano porpora agli arti inferiori legata ad una vasculite cutanea leucocitoclastica. Una delle tre pazienti (e nessuno dei soggetti di controllo con SS ma ANCA negativi) ha presentato un’insufficienza renale rapidamente progressiva legata ad una glomerulonefrite necrotizzante pauciimmune che l’ha portata entro 4 mesi a necessitare di terapia dialitica.
Nel gruppo di pazienti con SS e ANCA negativi solo in tre casi su 55 è stato possibile documentare una glomerulonefrite. In un caso il quadro renale si è associato ad un linfoma non Hodgkin diffuso a grandi cellule. Negli altri due casi la biopsia renale ha permesso di porre diagnosi di glomerulonefrite membranosa nella prima paziente e di una glomerulo nefrite a lesioni minime nella seconda paziente.
Dei 50 contributi della letteratura derivati dalla ricerca, alcuni studi hanno enfatizzato l’associazione tra la positività degli ANCA e lo sviluppo di
43
glomerulonefrite nei pazienti con SS . La tabella 4.8 riassume i principali dati emersi dalla revisione [61-71].
44 Tabella 4.8.ANCA nella sindrome di Sjogren
Autore Anno Provenienza N di casi Commento Ruolo Patogenetico Epifenomeno
Bottinger EP . 1992 U.S.A Case report (donna 63 anni) Positività per MPO- ANCA GNRP no Font J. 1998 Spagna Studio cross sectional di 82 pz (75
donne) età media 61 anni
Positività per ANCA in 9/82 pz (2 MPO-ANCA)
SNP, f. Raynaud, vasculite cutanea
no
Kamachi M. 1999 Giappone Case report (donna 67 anni) Positività per MPO-ANCA GNRP e Polmone no Nishiya K. 1999 Giappone Case series 60 pz (59 donne)
età media 61,2 anni
Positività per MPO- ANCA in 10/60 pz
si
Young C. 2000 U.K Case report Positività per PR3 -ANCA polmone no
Tatsumi H. 2000 Giappone Case report (donna 49 anni) Positività per MPO- ANCA GNRP no Ramos-Casals
M.
2006 Spagna Case series 82 pz età media di 62 anni
Positività per ANCA in 13/82 pz (5 MPO-ANCA)
Polmone e fenomeno di Raynaud
no
Shimoyama K. 2007 Giappone Case report (donna 65 anni) Positività per PR3-ANCA Nefrite interstiziale no Yazisiz V. 2010 Turchia Case report (donna 63 anni) Positività per PR3 ANCA. Pneumopatia infiltrativa
diffusa
no
Wang WJ. 2011 Taiwan Case report (uomo 86 anni) Positività per MPO-ANCA GNRP con ricorso alla dialisi
no
45 5.DISCUSSIONE
Questo studio ha avuto come obiettivo quello di esplorare l’impatto clinico della positività degli ANCA in pazienti con malattie reumatiche definite quali l’AR, il LES, la SSc e lo SS.
In primis è stata definita la prevalenza del subset di pazienti con ANCA positivi nell’ambito di ciascuna affezione confermando anche nella nostra coorte di pazienti , in linea con i dati della letteratura, che si tratta di una minoranza di pazienti complessivamente stimabile intorno al 10% in ciascuna delle singole malattie. Un dato interessante emerso dall’analisi dei dati è quello che in generale nelle malattie reumatiche sopramenzionate la positività degli ANCA si traduce in positività degli ANCA MPO mentre il riscontro di una positività degli ANCA rivolta contro i PR3 è estremamente rara. Queste prime osservazioni confermano quanto già riportato in letteratura dove è sottolineato come gli ANCA PR3 siano strettamente associati alla GPA mentre gli ANCA MPO possano far parte del profilo sierologico non solo delle vasculiti ANCA correlate ma anche di altre affezioni [4]. Le due pazienti descritte con positività degli ANCA PR3 rappresentano due casi di overlap completo tra una GPA e la SSc.
Seppure più frequente degli ANCA PR3, il riscontro degli ANCA MPO nelle malattie autoimmuni sistemiche è comunque raro e ad oggi mancano
46
pertanto in letteratura dati conclusivi relativi all’impatto clinico che tali autoanticorpi possano avere sulle caratteristiche fenotipiche e di outcome nelle malattie cui si associano. In letteratura sono descritti singoli case report
o piccole case series nelle quali è stato evidenziato come pazienti con una
diagnosi reumatologica definita potessero presentare una positività per ANCA e sviluppare manifestazioni vasculitiche in associazione alle manifestazioni più tipiche legate alla condizione reumatologica pre-esistente. Ciò è stato interpretato ora come uno spreading dell’autoimmunità ovvero come un “deragliamento aspecifico e clinicamente silente” della risposta autoimmune ora come lo sviluppo di una condizione “overlap” in cui gli ANCA svolgessero un ruolo patogenetico diretto definendo nuovi subset di pazienti con connettiviti complesse e manifestazioni vasculitiche concomitanti.
Il nostro studio è il primo che su larga scala ha considerato trasversalmente non una singola malattia reumatica ma più condizioni contemporaneamente (i.e AR, LES, SSc, SS) partendo dall’ipotesi di lavoro che la specificità autoanticorpale degli ANCA fosse in grado di condizionare il fenotipo clinico indipendentemente dal concomitare di altre malattie reumatiche. Questa ipotesi nasce dall’osservazione delle associazioni cliniche di altri autoanticorpi come ad esempio gli anticorpi anticentromero che quando
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riscontrati al di fuori della Sclerodermia, nel contesto di altre malattie del connettivo come laad esempio di una SS, condizionano l’instaurarsi nel quadro clinico dei pazienti di manifestazioni specifiche come il fenomeno di Raynaud, le teleangiectasie e la dismotilità esofagea. In altri termini, l’ipotesi di lavoro esplorata nella tesi è che se un paziente con una malattia autoimmune sistemica, nel contesto di una risposta policlonale, sviluppa oltre agli autoanticorpi attesi per quella affezione altre positività autoanticorpali (i.e ANCA), queste ultime siano comunque in grado di influenzare il quadro clinico “orchestrando” manifestazioni fenotipiche anticorpo-specifiche e/o anticorpo-correlate.
In linea con questa ipotesi, nel nostro studio, indipendentemente dalla malattia di fondo , il subset di pazienti ANCA positivi ha presentato una maggiore tendenza a manifestare quadri clinici riconducibili ad un processo vasculitico, principalmente a livello cutaneo e renale. I corrispettivi quadri istologici di una vasculite leucocitoclastica e di una glomerulonefrite necrotizzante pauciimmune sono apparsi sostanzialmente indistinguibili da quanto osservato nel corso delle vasculiti sistemiche ANCA-correlate. Tuttavia le manifestazioni vasculitiche osservate nella nostra coorte di pazienti hanno mostrato la tendenza a rimanere confinate a singoli organi ed apparati piuttosto che prendere una connotazione sistemica come di regola
48
riscontrato nelle vasculiti primitive. In altri termini la positività degli ANCA che si verifichi nel contesto di altre malattie reumatiche definite, sembra comportare lo sviluppo di quadri di vasculite isolata di alcuni organi o apparati. Lo sviluppo di una glomerulonefrite pauciimmune è apparsa la manifestazione clinica più comune e più severa nella nostra coorte. Il dato riflette quanto descritto nei case reports o nelle case series sopramenzionate e rappresenta un dato clinico estremamente interessante. Da un lato infatti, in alcune malattie come l’AR e la SS si osserva con una frequenza inattesa la comparsa di quadri di impegno renale che la malattia di base non comporterebbe e che possono influenzare drammaticamente l’atteggiamento terapeutico da adottare e l’outcome dei pazienti. In malattie come il LES o la SSc in cui il rene può essere già bersaglio della risposta autoimmune, la presenza degli ANCA può rappresentare un ulteriore meccanismo patogenetico di danno renale e se identificati tali autoanticorpi possono venire a costituire un bersaglio terapeutico più mirato cui indirizzare la terapia immunosoppressiva, nell’ottica di intraprendere una terapia sempre più individualizzata , efficace e sicura per il singolo paziente. In particolare nella Sclerodermia lo sviluppo di una compromissione della funzione renale è da sempre considerato il palesarsi della cosiddetta “crisi renale sclerodermica”, complicanza estremamente temibile di malattia che
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almeno in passato rappresentava la seconda causa di morte nei pazienti con SSc dopo l'impegno polmonare (ipertensione polmonare e fibrosi polmonare interstiziale)[72]. La “crisi renale sclerodermica” colpisce precocemente circa il 20% dei pazienti con Sclerodermia diffusa ed è caratterizzata da un improvvisa insorgenza di ipertensione maligna seguita da rapido deterioramento della funzione renale e accompagnata da iper-reninemia come effetto di una proliferazione fibrotica sub-intimale e di una necrosi fibrinoide della tonaca media dei vasi di piccolo e medio calibro. Altre caratteristiche di accompagnamento sono la retinopatia ipertensiva , la encefalopatia ipertensiva, l'anemia emolitica micro-angiopatica, l'edema polmonare e la trombocitopenia[73, 74]. Dalla recente letteratura emerge che la prognosi attuale resta severa nonostante il trattamento nefroprotettore con ACE-inibitori e dialisi[72, 75]. L’osservazione che altri meccanismi patogenetici possano concorrere al danno renale arricchisce l'insieme di strumenti terapeutici a disposizione per la malattia. E’ noto infatti come un 10% dei pazienti con SSc diffusa sviluppi una forma di coinvolgimento renale più lenta e progressiva della crisi renale sclerodermica contraddistinta dal progressivo deterioramento degli indici di funzione renale svincolati dal rialzo dei valori pressori sistemici o comunque accompagnati da valori border-line di pressione arteriosa [76]. Attribuire a questo subset di
50
pazienti con danno renale una diagnosi di glomerulonefrite ANCA correlata apre lo scenario all’utilizzo precoce di farmaci immunosoppressivi come la Ciclofosfamide ed il Rituximab che possono permettere di controllare la progressione del danno renale o addirittura di risolverla. Da questo punto di vista il nostro studio ha enfatizzato come elementi chiave nella diagnosi differenziale tra le due forme di impegno renale siano la presenza di ipertensione arteriosa e il tempo di compromissione della funzione renale sensibilmente più breve nei pazienti che hanno sviluppato una crisi renale sclerodermica. In termini di outcome non vi è differenza statisticamente significativa nella percentuale di pazienti che hanno sviluppato una insufficienza renale terminale con necessità di ricorso alla dialisi anche se vi è una tendenza ad un maggiore recupero dell’andamento della funzione renale nei pazienti ANCA positivi rispetto ai pazienti ANCA negativi che hanno sviluppato una crisi renale sclerodermica.
Il messaggio pragmatico che emerge quindi dall’analisi dei dati è che in pazienti con malattia reumatica nota e manifestazioni cliniche o di laboratorio suggestive per una possibile patogenesi vasculitica la ricerca degli ANCA debba essere fatta routinariamente, specie in presenza di un danno renale, indipendentemente dalla diagnosi di malattia reumatica già nota. In un contesto come quello attuale in cui la gamma di farmaci
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immunosoppressori disponibili è estremamente ampia, una migliore caratterizzazione dei diversi volti dell’autoimmunità presentati dal singolo paziente potrà aiutare a indirizzare la scelta terapeutica verso il farmaco più appropriato, ottimizzando la gestione del singolo paziente. Nell’esperienza riportata, ad esempio, l’utilizzo del Rituximab in una paziente con artrite reumatoide e glomerulonefrite ANCA-correlata ha fatto che si che il singolo farmaco anti CD20 abbia permesso di controllare simultaneamente la poliartrite e l’impegno renale, rendendo possibile stabilizzare rapidamente il quadro clinico della paziente.
Dal punto di vista degli sviluppi futuri , i subsets di pazienti con malattie reumatiche complesse e aspetti sierologici “atipici” rappresentano modelli di studio estremamente utili per chiarire meglio i rapporti tra autoimmunità e danno d’organo.
In particolare, studi futuri potranno aiutare a carpire se è la singola specificità autoanticorpale a governare una determinata manifestazione di malattia indipendententemente dalla diagnosi reumatologica sottostante o alternativamente se aspetti genomici ancora inesplorati predispongano allo sviluppo sia di un certo profilo sierologico che di un certo pattern di malattia.
52 6. CONCLUSIONI
Il nostro studio ha permesso di valutare la frequenza e l’impatto clinico degli ANCA in pazienti affetti da malattie sistemiche autoimmuni complesse.
Seppure rara la presenza degli ANCA è risultata in grado di poter condizionare l’espressione fenotipica e l’outcome a lungo termine di pazienti con quadri reumatologici definiti concorrendo alla patogenesi di manifestazioni vasculitiche indistinguibili da quelle delle vasculiti primitive ANCA correlate dei piccoli vasi. Tali manifestazioni vasculitiche, in particolare quelle estrinsecatesi a livello renale, hanno avuto la peculiarità di rimanere confinate all’organo colpito senza estendersi a livello sistemico come invece generalmente riscontrato nelle vasculiti ANCA-correlate dei vasi di piccolo calibro.
Dal punto di vista pragmatico i dati raccolti nella tesi sottolineano l’importanza della ricerca routinaria degli ANCA, ed in particolare degli ANCA MPO, anche in pazienti con malattie reumatiche già note che presentino manifestazioni vasculitiche inattese in relazione alla condizione reumatologica pre-esistente.
Nei pazienti con Sclerodermia e impegno renale in particolare è cruciale che vengano ricercati per completare l’iter diagnostico differenziale tra “crisi renale sclerodermica” e “glomerulonefrite necrotizzante pauciimmune
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ANCA-correlata”. Dal punto di vista terapeutico identificare pazienti ANCA positivi può aprire la strada all’utilizzo di farmaci specificamente rivolti contro i linfociti B come il Rituximab che sembra migliorare l’outcome a lungo termine di malattie autoimmuni “overlap” complesse.
Dal punto di vista della ricerca , i subsets di pazienti con malattia reumatica complessa e positività atipiche di specificità autoanticorpali inattese come gli ANCA rappresentano un modello di studio ideale per chiarire il ruolo patogenetico degli autoanticorpi nell’espressione fenotipica di una determinata manifestazione di malattia e il confine tra genotipo e fenotipo nell’autoimmunità.
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