Conclusioni
4. CONCLUSIONI
Al genere Trichoderma appartengono molte specie, alcune delle quali già utilizzate per biofitofarmaci di comune impiego, in grado di comportarsi da agenti di biocontrollo delle colture grazie alle loro caratteristiche fisiologiche ed ecologiche, come la presenza in molti suoli, le capacità antagonistiche, una versatilità metabolica molto elevata ed un’efficace colonizzazione della rizosfera, ottimi presupposti per controllare un gran numero di funghi fitopatogeni.
Gran parte dei funghi appartenenti al genere producono una vasta gamma di metaboliti secondari extracellulari, in molti casi con attività degradativa, e più di un centinaio di diverse sostanze con attività antibiotica (Harman & Kubicek, 1998; Sivasithamparam & Ghisalberti, 1998), che li rendono in grado di inibire lo sviluppo di una grande varietà di patogeni (Hjelrod & Tronsmo, 1988). Oltre alle caratteristiche genetiche, anche l’ambiente influenza qualitativamente e quantitativamente la produzione di questi composti (Dennis & Webster, 1971; Claydon et al., 1987; Vannacci & Pecchia, 1987; Ghisalberti & Sivasithamparam, 1991; Howell & Stipanovic, 1995). L’azione antagonista di Trichoderma spp. è stata riportata verso molti patogeni che includono: Rhizoctonia solani, Aspergillus flavus, Fusarium moniliforme, F. oxysporum f.sp. lycopersici e Botrytis cinerea. Inoltre, esistono circa una trentina di geni noti, proteine e altri metaboliti direttamente coinvolti nel micoparassitismo compiuto dal genere Trichoderma (Harman et al., 2004). Un esempio riguarda l’attività micoparassitaria di Trichoderma spp. nei confronti di sclerozi di funghi fitopatogeni come Sclerotium cepivorum, S. rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum e Botrytis tulipae (Vannacci et al., 1989; Sarrocco et al., 2006).
Alcune Trichoderma spp. sono in grado di stabilire un’associazione simbiotica con le radici vegetali, di tipo opportunistico ed avirulento (Harman et al., 2004), che può indurre resistenza ed avere un effetto biostimolante sulla pianta, promuovendone la crescita, come riscontrato
Conclusioni
anche da ricerche svolte nel laboratorio ospitante questo lavoro di tesi (Viva, 2005). L’effetto principale che questi funghi hanno sulla pianta è il maggiore sviluppo dell’apparato radicale, che può determinare un incremento nella biomassa totale e quindi nella produttività.
Trichoderma si è rivelato in grado di indurre nelle piante anche resistenza localizzata e sistemica (ISR) contro vari patogeni, caratteristica che potrebbe risultare addirittura più importante dell’effetto antagonista diretto che queste specie hanno sui patogeni delle piante (Harman et al., 2004). Ad oggi l’induzione di resistenza localizzata e sistemica da parte di Trichoderma spp. è ampiamente documentata in studi che si riferiscono sia a monocotiledoni che a dicotiledoni. La resistenza riscontrata si esplica nei confronti di svariati funghi (R. solani, B. cinerea, Colletotrichum spp., Magnaporthe grisea, Phytophthora spp., Alternaria spp., ecc.), batteri (Xanthomonas spp., Pseudomonas syringae, ecc.) e virus (Cucumber mosaic virus). Un aspetto singolare dei meccanismi innescati da Trichoderma nella pianta riguarda la concomitanza dei due meccanismi solitamente ritenuti in competizione: la promozione della crescita vegetale si esplica nonostante il dispendio di energia associato all’attivazione nella pianta delle vie metaboliche implicate nella resistenza.
L’interazione Trichoderma / pianta, fondamentalmente di tipo non patogenico, comporta la colonizzazione dell’apparato radicale vegetale da parte del fungo, che penetra solamente i primi strati cellulari dell’epidermide radicale mimando il comportamento infettivo dei fitopatogeni e innescando così cambiamenti nel metabolismo della pianta. Questa risposta di difesa di tipo localizzato può culminare con lo sviluppo di una resistenza sistemica, definita ISR (Induced Systemic Resistance), di tipo aspecifico che permette alla pianta di controbattere successivi attacchi da parte di diversi patogeni. Per l’induzione di questi meccanismi è cruciale il coinvolgimento degli enzimi CWDE (Cell Wall Degrading Enzymes), in particolar modo delle endopoligalatturonasi (endo-PG) che svolgono un ruolo cruciale nelle prime fasi dell’interazione. Questi enzimi, prodotti anche dai fitopatogeni, consentono al fungo di degradare le pectine della parete cellulare e quindi di aprirsi un varco nel tessuto corticale
Conclusioni
radicale. Inoltre gli oligogalatturonidi derivanti dall’attività degradativa delle endo-PG fungine sulla parete cellulare vegetale hanno un ruolo fondamentale in quanto determinanti di specificità nell’interazione ospite-patogeno ed elicitori nell’induzione di resistenza (De Lorenzo et al., 1997).
La pianta a sua volta può rispondere producendo le PGIP (Poly-Galacturonase Inhibiting Protein), proteine che inibiscono l’attività delle poligalatturonasi fungine e svolgono un ruolo cruciale nella risposta difensiva di resistenza (Powell et al., 2000; Ferrari et al., 2003; Manfredini et al., 2005, Aguero et al., 2005).
Nel presente lavoro è stata indagata la complessità dell’interazione molecolare che s’instaura fra Trichoderma virens e le radici di diverse piante. L’isolato fungino I10 utilizzato è stato selezionato in quanto già precedentemente caratterizzato: esso riveste notevole importanza in ambito biotecnologico come agente di biocontrollo dei fitopatogeni (Vannacci & Pecchia 2000; Sarrocco et al. 2006; Catalano et al. 2011), ma anche come promotore della crescita vegetale ed induttore di resistenza.
Sulla base di queste premesse e dei risultati ottenuti in lavori pregressi, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di analizzare l’interazione che il fungo instaura con le radici di Phaseolus vulgaris, Arabidopsis thaliana e Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom dal punto di vista molecolare.
Per la realizzazione delle analisi sono stati utilizzati due diversi sistemi sperimentali. Il primo sistema consente l’accrescimento di T. virens direttamente sulle radici delle diverse plantule. Nel secondo le piantine vengono fatte interagire con il fungo adagiando su di esse un disco di cellophane contenente il micelio fungino, precedentemente sviluppato. Mentre il primo sistema ha il vantaggio di consentire l’interazione in condizioni più naturali, nel secondo i due organismi interagiscono rimanendo separati dai dischi, così da permettere la raccolta dei diversi campioni biologici (pianta e fungo) separatamente.
Conclusioni
quanto in Pomodoro era già stata indagata in un precedente lavoro di tesi (Moncini, 2010). In piastra invece è stata saggiata l’interazione del fungo con Pomodoro e Arabidopsis, scelte come piante modello la prima di interesse agronomico, la seconda per studi di genetica molecolare e genomica.
Nell’indagine sul dialogo molecolare che si stabilisce fra T. virens e le radici vegetali delle diverse specie di piante, in particolare è stata studiata la degradazione della parete cellulare vegetale da parte del fungo e l’eventuale reazione inibitoria da parte della pianta, che può rappresentare anche un’importante risposta di resistenza. Allo scopo è stata valutata l’espressione in T. virens di 2 geni (Tvpg1 ed Tvpg2) codificanti per endopoligalatturonasi e l’induzione nella pianta di: un gene, Lepgip1, codificante per una proteina inibitrice delle poligalatturonasi (PGIP) di S. lycopersicum; due geni, bpgip1 e bpgip2, codificanti per due PGIP di P. vulgaris; due geni, pgip1 e pgip2, codificanti per due PGIP di A. thaliana.
Per quanto riguarda i geni fungini, Tvpg2 è risultato costitutivo in quanto espresso in tutte le condizioni saggiate, inclusi i controlli, in tutti e due i sistemi sperimentali adottati. Relativamente al gene Tvpg1, precedentemente risultato inducibile nell’interazione tra T. virens e S. lycopersicum in perlite (Moncini, 2010), il saggio in un sistema diverso di interazione con pomodoro (in piastra) non ne ha mostrato l’induzione, né se ne è riscontrata l’espressione in alcun campione derivato dall’associazione con le altre piante. Questo risultato conferma la natura inducibile di questo gene, non essendo espresso neanche nei controlli, ma implica una sua specificità di espressione in associazione con diverse famiglie di pianta, almeno nello schema sperimentale adottato.
Riguardo allo studio della funzione PGIP, il gene Lepgip1 di S. lycopersicum in un precedente lavoro risultava indotto, contemporaneamente al gene di T. virens Tvpg1, a 48 ore dal contatto del fungo con le radici di pomodoro in perlite. Nel presente lavoro di tesi non si è osservata l’espressione del gene Lepgip1 nel sistema in piastra. Questo risultato implica che ad una mancata induzione del gene fungino Tvpg1 corrisponda una mancata induzione del gene di
Conclusioni
pianta Lepgip1, confermando ulteriormente una correlazione tra le due funzioni.
Nell’interazione con Fagiolo, il profilo di espressione dei geni bpgip1e bpgip2 di P. vulgaris mostra che sono entrambi costitutivi: si è infatti rilevata la presenza dei trascritti ad ogni tempo di campionamento considerato e nel controllo della pianta.
L’associazione T. virens / Arabidopsis ha rilevato una diversa espressione dei 2 geni di pianta saggiati. Il gene pgip1 di A. thaliana è risultato inducibile in quanto il trascritto è risultato presente soltanto a 24 ore dall’inoculazione, nel sistema sperimentale in perlite, e a 48 ore nel sistema in piastra. Il gene pgip2 di A. thaliana è invece risultato costitutivo in tutti e due i sistemi sperimentali adottati. Le differenze di timing, riscontrate per Arabidopsis, nell’espressione del gene pgip1 nei due sistemi sono probabilmente dovute alle caratteristiche intrinseche dei due metodi: in perlite, dove il contatto tra i due organismi è diretto, l’espressione del gene in questione si verifica in anticipo rispetto al sistema in piastra.
In conclusione i sistemi sperimentali adottati hanno permesso una parziale caratterizzazione della risposta reciproca dei due organismi coinvolti nell’interazione, utile per la comprensione dei meccanismi molecolari di cross-talking tra T. virens e la pianta, sia per scopi teorici che applicativi. Inoltre ulteriori indagini potranno servire ad approfondire la natura della comunicazione molecolare tra il fungo e la pianta: a questo scopo è in corso la caratterizzazione di un mutante di T. virens trasformato per delezione del gene costitutivo Tvpg2.
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