Introduzione
Capitolo 1: Le Metzincine
1.1. Introduzione
I processi di rimodellamento tissutale comprendono lo sviluppo, la morfogenesi e la riparazione dei tessuti sia nelle normali condizioni fisiologiche che in risposta a stimoli esterni. Un corretto equilibrio nel rimodellamento tissutale protegge l’organismo dall’insorgere di varie patologie come il cancro, l’artrite e i disordini cardiovascolari.
Tale rimodellamento coinvolge direttamente la degradazione della matrice extra cellulare (ECM). Nel tessuto connettivo la ECM circonda le cellule fornendo supporto meccanico e resistenza fisica a tessuti ed organi ed è coinvolta in numerosi processi di comunicazione cellulare. In condizioni fisiologiche, vari tipi di proteasi intervengono per regolare la degradazione della ECM, ma il gruppo di enzimi maggiormente coinvolto è quello delle metalloproteasi1. Questi enzimi sono zinco-proteasi che individuano e idrolizzano specifiche sequenze aminoacidiche e sono quindi responsabili del rimodellamento tissutale e della degradazione della maggior parte dei componenti della matrice extracellulare (collagene, elastina, gelatina, proteoglicani e glicoproteine di matrice). Inoltre hanno un ruolo chiave in numerosi processi fisiologici come la crescita e lo sviluppo degli organi, la riproduzione, la trasmissione nervosa, la rimarginazione delle ferite, l’angiogenesi e l’apoptosi. Quando l’espressione di tali enzimi è alterata, l’organismo è soggetto ad una serie di patologie di diversa natura, come il cancro, le malattie ossee e autoimmuni, problemi cardiovascolari come l’infarto del miocardio, l’ictus, l’ipossia e l’aterosclerosi e alcune patologie neurodegenerative come il Morbo di Alzheimer.
Tra queste zinco-proteasi, la famiglia delle Metzincine comprende a sua volta cinque sottofamiglie principali che sono le Astacine, le Serralisine, le Pappalisine, le Reprolisine (o Adamalisine) e le metallo proteasi della matrice, dette Matrixine (Fig.
1.1).
Fig. 1.1: Classificazione e caratteristiche strutturali comuni delle Metzincine2.
Dal punto di vista strutturale, ci sono delle porzioni comuni a tutte le sottofamiglie, infatti oltre all’atomo di Zinco nel sito catalitico, sono presenti tre residui di istidina che coordinano lo ione Zn, e il Met-turn ovvero un dominio contenente un residuo di metionina che conferisce un ambiente idrofobico per lo ione Zinco e per i tre residui d’istidina dei centri catalitici. La sigla del motivo che lega lo Zinco è HEXXHXXGXXH in cui i residui d’istidina (H), di acido glutammico (E) e di glicina (G) restano invariati e X rappresenta un residuo variabile.
Le Astacine sono un’ampia famiglia di enzimi tra i quali uno dei primi ad essere stato isolato è la proteina 1-osteo-morfogenica (BMP-1), ovvero la C-proteinasi del procollagene, che rimuove i pro-peptidi C-terminali del procollagene fibrillare. Sono implicate in una vasta gamma di processi biologici tra cui la digestione, lo sviluppo e la morfogenesi embrionale, la crescita e la differenziazione di tessuti tra cui quello osseo, promuovendo la biosintesi del collagene e quindi la formazione della cartilagine e delle ossa.
Le Serralisine sono enzimi batterici che giocano un ruolo importante nella virulenza e nella patogenicità dei microrganismi. Infatti sono secrete da batteri responsabili di numerose patologie tra cui la meningite, l’endocardite, le pielonefrite, le dermatiti, le infezioni dei tessuti molli, la setticemia e altre infezione delle vie respiratorie e delle vie urinarie. Questi enzimi intervengono nella fase di attacco della cellula ospite, indebolendone le difese. Sono infatti diretti verso i fattori della coagulazione, le immunoglobuline, le proteine del complemento e altri meccanismi di difesa della cellula.
Le Pappalisine sono state descritte a partire dall’enzima PAPP-A, isolato dal siero materno. Sono inoltre secrete dai fibroblasti, dagli osteoblasti, dalle cellule stromali del midollo, dalla mucosa del collo dell’utero, dall’endometrio e dai testicoli. Hanno attività insulino-simile e promuovono diversi fattori di crescita.
Le Adamalisine sono enzimi isolati per la prima volta dal veleno dei serpenti (SVMPs), la cui aggressività è legata alla grande capacità che questi enzimi hanno nel degradare tutti i maggiori costituenti della ECM. Le Adamalisine si suddividono in ADAMs (A Disintegrin And Metalloproteinase Domain) e ADAMTSs (A Disintegrin And Metalloproteinase Domain whit Thrombospondin motifs)3.
Le metallo proteasi della matrice sono ulteriormente suddivise in Collagenasi, Gelatinasi, Stromelisine, Matrilisine, Membran-Type Metallo Protease (MT-MMPs) e altre MMPs e hanno un’ampia varietà di implicazioni biologiche per la loro attività proteolitica specifica verso substrati diversi. Infatti le Collagenasi sono in grado di degradare il collagene di tipo І, ІІ e ІІІ, le Gelatinasi individuano i diversi tipi di collagene denaturato, le gelatine, l’elastina ed il collagene di tipo IV e V, le Stromelisine sono in grado di interagire con una larga scala di componenti della matrice extracellulare, tra cui i proteoglicani, la fibronectina, la laminina e diversi tipi di collagene, le Matrilisine invece sono in grado di processare i componenti della matrice extracellulare e diverse molecole di superficie, infine le MT-MMPs hanno un dominio transmembrana C-terminale che permette loro di rimanere ancorate alla membrana cellulare e sono capaci di degradare alcuni componenti della matrice extracellulare e di attivare le altre MMPs1.
Per questi motivi, le Metzincine rappresentano una vasta gamma di possibili target nella ricerca di nuovi agenti terapeutici. Infatti la ricerca farmaceutica è orientata da circa 20 anni nello studio e nella sintesi di inibitori il più possibile selettivi verso queste proteasi4.
1.2. Le ADAMs (A Disintegrin and Metalloproteinase Domain).
1.2.1. Struttura e funzioni
Le ADAMs costituiscono, insieme alle “snake-venom metalloproteinases” (SVMPs) così definite perché individuate per la prima volta nel veleno di serpente e alle ADAMTSs, la famiglia delle Reprolisine (o Adamalisine).
Esse sono un gruppo di glicoproteine integrali di membrana generalmente localizzate sulla superficie cellulare e talvolta in alcuni compartimenti intracellulari come l’Apparato del Golgi. Esse sono caratterizzate dalla presenza di due domini la cui funzione è apparentemente contrastante, il dominio d’adesione disintegrinico e il dominio di degradazione metalloproteasico, dai quali prendono il nome.
Il loro ruolo fondamentale è quello di scindere legami peptidici di una vasta gamma di proteine della matrice o ancorate alla membrana plasmatica, attivandole e liberando nella ECM molecole segnale fondamentali per la trasduzione cellulare come le citochine, i fattori di crescita e i fattori che mediano l’adesione cellulare.
Fig. 1.2: Rappresentazione schematica dell’interazione tra l’enzima e il substrato.
Ad oggi sono stati individuati 21 membri della famiglia delle ADAMs e alcuni di questi rappresentano importanti target terapeutici in varie patologie, come il morbo di Alzheimer, il cancro, l’asma, l’artrite, il morbo di Crohn (Tab. 1.1.).
Tab. 1.1: Principali ADAMs individuate nell’uomo5.
Le ADAMs sono variamente espresse nell’organismo; alcune di esse come le ADAMs - 2, -7, -18, -20 -21, -29, -30 sono espresse selettivamente nei testicoli e hanno un ruolo chiave nella spermatogenesi, le ADAMs -9, -10, -12, -15, -17, -19, sono espresse più generalmente nei tessuti somatici mentre altre proteasi sono più specifiche come la -8 e la -28 che sono tipiche delle cellule ematopoietiche (Fig. 1.3).
Fig. 1.3: I 21 membri delle ADAMs, in relazione alla loro attività metalloproteinasica e ai siti di espressione6.
Queste proteasi vengono liberate sotto forma di zimogeni inattivi dal reticolo endoplasmatico rugoso e maturano nell’Apparato del Golgi, dove viene idrolizzata la porzione propeptidica e da qui si dislocano o sulla membrana plasmatica o sulla membrana dei compartimenti intracellulari; alcune di esse come la -8 e la -28 si attivano sulla superficie cellulare mediante un meccanismo di autocatalisi 5.
Il propeptide mantiene l’enzima in forma latente, il quale si attiva solo dopo l’idrolisi di questo frammento mediante il meccanismo di “switch-cisteinico”. Nella regione del propeptide infatti c’è un residuo di cisteina conservato (PRCGVPD) che sostituisce la molecola d’acqua che coordina lo Zn nel sito catalitico. Quando questa Cys viene rimossa, rende accessibile il sito catalitico e si crea la forma attiva dell’enzima 3.
Dal punto di vista strutturale, le ADAMs sono molto simili tra di loro ed hanno una struttura multidominio che può essere facilmente confrontata con quella delle altre MMPs ( Fig. 1.4).
Fig. 1.4: Struttura multidominio delle ADAMs a confronto con le altre proteasi 6.
La porzione N-terminale che si distende nella matrice extracellulare è costituita dal propeptide, dal sito catalitico, dal dominio disintegrinico, da un segmento ricco di cisteine e da una porzione EGF-like; a queste seguono il segmento transmembranale e la coda citoplasmatica all’estremità C-terminale. Il sito catalitico, dove risiede lo zinco, in 17 delle 29 ADAMs, contiene la sequenza HEXGHXXGXXH, altamente conservata anche nelle altre MMPs. Al sito catalitico, segue il sito disintegrinico costituito da circa 90 amminoacidi, che nella maggior parte delle ADAMs contiene un loop di 14 residui amminoacidici detto proprio “disintegrin loop”; esso si contraddistingue per la presenza di tre cisteine, una all’inizio, una al centro e una alla fine. Nonostante siano poco chiare la struttura e le funzioni di questa porzione è probabile che essa stabilisca un’interazione con le integrine di membrana mediante i residui Gln, Glu, e Asp che si trovano nei pressi della Cys centrale. Al sito disintegrinico segue un segmento ricco di cisteine, che probabilmente ha il compito di interagire con alcuni componenti della matrice
extracellulare, facendo da ponte tra questi e le integrine. Oscuro è invece il ruolo della sequenza ripetuta EGF (Epidermal Grow Factor), forse anch’essa coinvolta nella ricognizione dei substrati. Il segmento citoplasmatico delle ADAMs invece, interagendo intracellularmente con molecole segnale e con il citoscheletro, potrebbe essere determinante per modulare l’attività dell’enzima, ed inoltre la lunghezza di questa porzione probabilmente caratterizza le diverse isoforme delle ADAMs 7.
Fig. 1.5: Rappresentazione schematica dei domini strutturali delle ADAMs 2.
1.2.2. Meccanismo d’azione
Il potere catalitico delle metallo proteasi in genere dipende da 4 fattori: dal legame del substrato al sito proteolitico, dalla specificità di legame del substrato mediante i sottositi, dall’azione chelante delle tre istidine e dal potere catalitico del glutammato, ed infine dal legame del substrato ad altri siti esterni al sito attivo che incrementano la specificità e la selettività dell’interazione tra il peptide e l’enzima 8.
Fondamentale è il ruolo della molecola d’acqua presente nel dominio catalitico: essa interagisce mediante legami ad idrogeno con il glutammato e chela lo zinco catalitico.
La catalisi è avviata dall’attacco nucleofilo al carbonile del peptide da parte della molecola d’acqua, la quale poi cede un protone al glutammato che a sua volta lo dona all’azoto ammidico. Il passaggio del secondo protone dall’acqua al glutammato e quindi all’azoto, determina la rottura del legame e la scomparsa della molecola d’acqua. Lo zinco, che da uno stato tri-coordinato passa ad uno stato penta-coordinato, compensa la carica negativa che si crea sul carbonile, mentre un residuo di alanina stabilizza la carica positiva presente sull’azoto (Fig. 1.6).
Fig. 1.6: Meccanismo d’azione della catalisi enzimatica delle MMPs 9.
1.2.3. Meccanismi di regolazione
Un’alterata attività delle ADAMs e delle Metzincine in generale può causare notevoli squilibri nell’omeostasi cellulare e quindi è necessario che la loro attività sia finemente regolata. Ci sono diversi sistemi che assolvono a tale compito.
In primo luogo l’espressione di queste proteasi può essere modulata a livello trascrizionale, ad opera di citochine, ormoni, e fattori di crescita.
Altri punti di intervento riguardano la secrezione del propeptide e l’attivazione dello zimogeno. Tuttavia, la regolazione più consistente è il meccanismo di inibizione da
parte degli inibitori endogeni tra i quali l’α2-macroglobulina, il RECK (REversion inducing Cysteine-rich protein with Kazal motifs) ma in particolar modo i TIMPs (Inibitori Tissutali delle MMPs).
I TIMPs sono glicoproteine con peso molecolare di 21-34 kDa denominate TIMP-1, -2, -3, -4. Essi differiscono tra loro sia per la solubilità, che per la diffusione che per l’interazione con le varie MMPs. TIMP-2 è costitutiva ed è ampiamente espressa nell’organismo, TIMP -1, -3, -4 sono inducibili e si trovano in diversi tipi di cellule, ed in particolare TIMP- 4 è tessuto specifica, difatti si concentra nelle cellule cerebrali, nelle cellule cardiache adulte, nell’ ovario e nel muscolo scheletrico. Inoltre mentre TIMP -1, -2, -4 sono solubili TIMP-3 è strettamente legata all’ECM. TIMP-1 è un debole inibitore di MT1-MMP, MT3-MMP, MT5-MMP e MMP-19, TIMP-2 e -4 sono inibitori delle gelatinasi, mentre TIMP-3 ha dimostrato di essere un ottimo inibitore per le ADAMs, specie per il TACE e per le ADAMTSs 10.
Fig. 1.7: Inibitori delle MMPs nell’ambiente pericellulare.
I TIMPs sono divisi in due domini principali, il C-terminale e l’N-terminale, dove 12 cisteine instaurano sei legami disolfuro. L’estremità N-terminale di tutte i TIMPs conserva altamente una sequenza VIRAK (Val-Ile-Arg-Ala-Lys).
L’estremità N-terminale ha funzione inibitoria perchè si introduce nel sito attivo della
Fig. 1.8: Struttura primaria dei TIMPs. Le cisteine sono unite da 6 ponti disolfuro. Le frecce indicano l’unione tra il dominio C- e N-terminale. In giallo la sequenza VIRAK 11.
L’estremità N-terminale ha funzione inibitoria perchè si introduce nel sito attivo della MMP e mediante il gruppo amminico terminale e il carbonile della Cys 1, allontana la molecola d’acqua e chela in maniera bidentata lo zinco catalitico12. L’estremità C- terminale invece lega preferibilmente le pro-MMPs.
Le ADAMs e le ADAMTs risultano sensibili unicamente all’azione del TIMP-3 e hanno meccanismi di inibizione diversi,che nonostante non siano ancora del tutto chiari, sono in relazione alle loro differenze strutturali. In particolare, l’ orientazione spaziale
dell’ADAM-17 fa si che il dominio C-terminale impedisca stericamente l’accesso del TIMP-3 al sito catalitico, invece è proprio questo dominio a incrementare l’affinità dell’inibitore nelle ADAMTSs -4 e -5 13.
Essendoci molte analogie strutturali e funzionali tra le ADAMs e le altre Metzincine è molto difficile la ricerca di inibitori selettivi verso una specifica proteasi.
Risulta molto interessante la possibilità di inibire selettivamente una di queste proteasi ovvero l’ADAM-17 (o TACE), per il suo coinvolgimento nello sviluppo e nella progressione dei tumori.
1.2.4. Il TACE (Tumor necrosis factor-α converting enzyme).
Il TACE (Tumor necrosis factor-α converting enzyme) o ADAM-17, è un’enzima che ha un ruolo fondamentale nel meccanismo di rilascio di molecole segnale, e opera su substrati strutturalmente e funzionalmente diversi, come il pro-TNFα, il precursore della β-amiloide (APP), fattori di crescita (EGF, heparin-binding epidermal grow factor) e fattori che mediano l’adesione tra le cellule. Alcuni di questi come ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule) e pro-TNFα, sono mediatori dell’infiammazione e sono coinvolti in una serie di gravi disturbi come l’artrite reumatoide, le malattie autoimmuni, la sclerosi multipla e il cancro14.
Il principale ruolo fisiologico del TACE è quello di attivare una citochina detta Tumor Necrosis Factor-α (TNFα), che viene sintetizzata come propeptide di 26 kDa formato da 223 aa. Il pro-TNFα è un trimero a forma di cono che è ancorato alla membrana plasmatica mediante un linker di 26-28 aa cui segue un tratto transmembranale e uno
citoplasmatico. L’idrolisi selettiva del legame peptidico tra Ala 76 e Val 77 catalizzata dal TACE libera nell’ECM la forma solubile di 17 kDa (Fig. 1.9).
Durante il meccanismo di azione, per lo più analogo a quello delle altre MMPs, anche nel TACE è importante per la catalisi la funzione svolta dal carbossilato del Glu 406 e da una molecola d’acqua. La selettività con la quale il TACE idrolizza il legame Ala 76- Val 77dell’TNFα sembra favorita da una particolare interazione che si instaura tra la base del cono trimerico del pro-TNFα e la destra del sito catalitico. Tale interazione è probabilmente favorita in vivo anche dalla disposizione del sito di rottura del pro-TNFα in fase di assemblaggio ad una distanza definita dalla membrana plasmatica.
Fig. 1.9: Rappresentazione schematica della regolazione del TFN-α e il ruolo del TACE 15.
Tuttavia nonostante il TNFα costituisca il principale substrato del TACE, esso catalizza anche l’idrolisi di altre molecole, e probabilmente riconosce i diversi substrati mediante più isoforme, o mediante un'unica isoforma differentemente localizzata.
Il TACE è una transpeptidasi costituita da diversi domini; la porzione N-terminale, che si spiega nella matrice extracellulare, è costituita dal pro-dominio, dal dominio catalitico, dal dominio disintegrin-like e dal segmento “Cystein rich” seguito dal dominio EGF-like che si unisce al frammento citoplasmatico C-terminale mediante un segmento transmembranale.
Fig. 1.10: Rappresentazione schematica della struttura multidominio del TACE 6.
Il dominio catalitico del TACE ha la forma di un elissoide schiacciato, con il sito di proteolisi all’interno di una fessura che divide il dominio in una porzione inferiore più piccola e in una parte superiore più grande (Fig 1.11). Al centro del dominio vi sono quattro α-eliche che circondano cinque β-strands ripiegati, due dei quali sono uniti da un
“multiple loop” contorto che estroflettendosi verso l’esterno forma una caratteristica protuberanza sulla superficie dell’enzima e numerosi ponti disolfuro tra le cisteine concorrono a mantenere la stabilità strutturale della proteasi16.
Fig. 1.11: Superficie solida del TACE in presenza di un inibitore16.
Il sito attivo del TACE contiene tre sottositi pianeggianti sulla sinistra (unprimed site) e tre più profondi sulla destra (primed site). Una caratteristica interessante è la forma delle cavità idrofobiche S1’ e S3’: la tasca S1’ si dispone a forma di “L” e mediante un accesso polare comunica con la tasca S3’, il cui ingresso è tuttavia parzialmente impedito dal residuo di Ala 439 e di Leu 348 (Fig. 1.12).
Fig. 1.12: Superficie solida del dominio catalitico del TACE. La freccia indica il punto di comunicazione tra S1’ e S3’ 17.
Lo zinco catalitico adiacente a S1’ è coordinato da tre istidine (His 405, His 409, His 415) che come nelle altre Metzincine appartengono alla sequenza altamente conservata HEXXHXXGXXH. In figura 1.13 sono identificati i sottositi facenti parte del dominio catalitico del TACE, ovvero l’S1, S1’, S2, S2’e S3’. In particolare, il dominio S2’ è compreso tra 2 degli aminoacidi che coordinano lo Zn ovvero la His 409e la His 415.
L’altro aminoacido che coordina lo Zn, l’His 405, si trova invece all’entrata del dominio S1’ insieme al residuo conservato di Glu 406.
Fig. 1.13: Sito catalitico del TACE, con le varie subunità e in presenza di un ligando (magenta)17.
La forma pianeggiante del sottosito S1’ è comune tra le MMPs, e questo fa si che molti inibitori dell’ADAM-17 siano attivi anche su altre MMPs. Tuttavia il tunnel caratteristico che si crea tra S1’ e S3’ costituisce un elemento potenzialmente discriminante nella progettazione di molecole selettive per il TACE.
La figura 1.14 rappresenta il sito catalitico del TACE con gli aminoacidi che delineano la tasca S1’ (magenta) in presenza di un inibitore di tipo idrossammato.
Fig. 1.14: Residui della tasca S1’del TACE in presenza di un inibitore di tipo idrossammato (verde)18.
La catena polipeptidica del TACE, in particolar modo per quel che riguarda il sito catalitico, è per il 20-25% analoga alle altre ADAMs e per il 35-44% è analoga alle MMPs, specialmente alla MMP-2.
Tuttavia a differenza delle MMPs la sequenza del sito catalitico del TACE è più lunga e manca dello ione calcio strutturale. Studi strutturali, cinetici e spettroscopici, hanno anche dimostrato che rispetto alle altre metalloproteasi, il microambiente attorno allo zinco catalitico del TACE è molto più polare (Thr 404, Glu 406, Gly 408, Asn 410, Asp 416, Glu 414), specie se confrontato con la MMP-2 ( Ala 402, Glu 404, Gly 406, Ala 408, Glu 412, Ser 414)19.
Per la sintesi di molecole selettive verso il TACE risultano quindi fondamentali la forma caratteristica della tasca S1’ e la comunicazione di questa con il sottosito S3’.
Un altro importante substrato del TACE sono le molecole ALCAM (Activated leukocyte cell adhesion molecule) appartenenti alla famiglia delle immunoglobuline.
Esse hanno un ruolo fondamentale nella genesi e nello sviluppo dei tumori. Le ALCAM sono prevalentemente espresse sulla superficie delle cellule epiteliali ovariche tumorali (EOC) e sono rilasciate a livello sistemico in una forma solubile, in seguito all’attività dell’ADAM-17. Questo meccanismo spiega la mobilità e l’invasività delle cellule EOC, che viene ridotta di conseguenza grazie a inibitori non-specifici dell’ADAM-17.
In qualità di CAM, giocano un ruolo fondamentale nell’omeostasi e nella strutturazione delle cellule nell’organismo, essendo coinvolte nelle interazione cellula-cellula e cellula-matrice. È necessario menzionare, infatti, che il raggruppamento cellula-cellula ALCAM-mediato, attraverso interazioni omofiliche (ALCAM-ALCAM) ed eterofiliche (ALCAM-CD6), ancora le ALCAM all’actina; di conseguenza queste risultano strettamente correlate alla mobilità del citoscheletro.
Durante lo sviluppo tumorale, complesse interazioni adesive, che acquisiscono importanza in concomitanza all’attivazione delle cascate proteolitiche, determinano il rilascio di cellule dal tumore primario, promuovendo così l’invasività. La sovraespressione o l’espressione de novo delle ALCAM sulla superficie cellulare, quindi, può promuovere l’adesione cellulare e il loro raggruppamento. Queste osservazioni hanno un collegamento diretto con alcuni tumori nell’uomo, inclusi melanoma, tumori della prostata, del seno, della vescica, del tratto colon-intestinale; si parla, infatti, di neoplasie caratterizzate da livelli di ALCAM alterati 20.
Fig. 1.15: Rappresentazione schematica dell’attività del TACE sulle ALCAM 20.
Il TACE quindi ha un ruolo essenziale nella perdita di adesione cellula-cellula, e inibirlo vorrebbe dire ridurre l’invasività delle cellule dell’EOC.
Questa proteasi quindi è coinvolta a più livelli nello sviluppo tumorale e rappresenta un target interessante nella ricerca di nuovi agenti terapeutici.
1.3. Le ADAMTSs (A Disintegrin And Metalloproteinase whit Thrombospondin motifs).
Le ADAMTSs costituiscono una famiglia di proteasi strettamente correlata alle ADAMs, ma con struttura e funzioni leggermente diverse.
Le ADAMTSs sono enzimi multidominio extracellulari implicati in un vasto numero di funzioni biologiche, come l'elaborazione del collagene ad opera delle N-proteinasi del procollagene, la rimozione dalla matrice di proteoglicani come l’aggrecano, il versicano e il brevicano, l'inibizione dell'angiogenesi, e il mantenimento dell’equilibrio del sistema sanguigno attraverso la regolazione di fattori della coagulazione come il fattore von-Willebrand. Inoltre hanno un ruolo chiave per quanto riguarda l’organogenesi, l'infiammazione e la fertilità e un’espressione alterata di queste proteasi è stata riscontrata in situazioni patologiche come i tumori, l’artrite, e varie patologie del tessuto connettivo, come l’encefalomielite, la sindrome di Ehler-Danlos e la sindrome di Weill- Marchesani.
Ad oggi si conoscono 19 ADAMTSs, e recentemente è stato evidenziato un nuovo sottogruppo di proteasi strutturalmente simili alle ADAMTs, le ADAMTS-like o punctine e questi enzimi sembrano partecipare nella regolazione endogena delle ADAMTSs 21. Soltanto per alcune ADAMTSs è stato identificato il ruolo biologico.
(Tab. 1.2). La ADAMTS-1 e la ADAMTS-8 hanno proprietà angioinibitorie, ADAMTS-2, ADAMTS-3, e ADAMTS-14 sono N-propeptidasi del procollagene, ed è stato evidenziato come una deficienza di ADAMTS-2 comporti la sindrome di Ehler- Danlos. ADAMTS-4 e ADAMTS-5 sono aggrecanasi, coinvolte nella degradazione della cartilagine e sovraespresse nell’osteoartrite, ADAMTS-13 è la proteasi coinvolta
nel rilascio del von-Willebrand-factor, ed una sua mutazione comporta una microangiopatia nota come thrombotic thrombocytopenic purpura.
Tab.1.2: Classificazione delle ADAMTSs e loro substrati 22.
Per quanto riguarda le ADAMTS-like, ad oggi si conoscono 6 enzimi (ADAMTSL-1, ADAMTSL-2,-3,-4,-5,-6) e sono ancora in fase di studio. Recentemente è stato evidenziato che l’ADAMTSL-2 è implicata nella sindrome di WMS soprattutto per quanto riguarda la degenerazione del cristallino e anche l’ADAMTSL-4, nella fase di ectopia lentis 23.
Come le altre Metzincine, le ADAMTSs sono secrete sotto forma di zimogeni inattivi e la successiva rimozione del propeptide N-terminale conferisce la forma attiva dell’enzima. In particolare le ADAMTSs sono riconosciute mediante una sequenza segnale in testa al propeptide durante la traslazione e il transito della proteina attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico, e successivamente subiscono la rimozione del propeptide. Oltre a dare la forma attiva dell’enzima, la rimozione del propeptide è importante per il corretto ripiegamento dell’enzima e per una sua corretta secrezione.
L’attivazione delle ADAMTSs però non avviene, come per le ADAMs attraverso il meccanismo di swich-cisteinico, e soltanto poche ADAMTSs hanno un residuo di cisteina della regione del propeptide. Questi enzimi infatti hanno una sequenza segnale, che è una sequenza SPC (subtilisin-like protein convertasi) che è sito di riconoscimento per alcune proteasi, ovvero enzimi SPC1 o PACE ( paired basic amino acid converting enzime), appartenenti alla famiglia enzimatica delle furine. Sono questi enzimi che operano l’attivazione delle ADAMTSs 22.
L’espressione delle ADAMTSs, come quella delle ADAMs, è regolata a più livelli, come quello trascrizionale, i processi proteolitici e di secrezione, la stimolazione da parte di cofattori e l’inibizione tissutale (ad opera esclusivamente del TIMP-3).
La struttura multidominio delle ADAMTSs (A Disintegrin And Metalloproteinase whit Thrombospondin motifs), rispecchia in parte quella delle ADAMs, infatti sono presenti
il propeptide N-terminale, il sito catalitico metalloproteinasico, il dominio disintegrinico, separato però dal segmento ricco di cisteine da un residuo di trombospondina, uno spaziatore e altri residui di trombospindina nella porzione C- terminale dove è assente il dominio transmembrana (Fig. 1.16) 24. Essendo enzimi secreti nell’ ambiente extracellulare e non enzimi transmembrana come le ADAMs, queste proteasi hanno un’alta capacità di legare la ECM, e questa capacità sembra risiedere proprio nei domini di trombospondina e nella regione dello spaziatore 22.
Fig. 1.16: Domini strutturali di ADAMs e ADAMTSs a confronto 24.
Il dominio catalitico delle ADAMTSs contiene la tipica sequenza delle Metzincine HEXXHXXGXXH in cui lo Zn è coordinato da tre residui di istidina. Questo assetto è facilitato dal residuo conservato di glicina che obbliga le tre istidine a occupare la posizione corretta. Inoltre il residuo contenete lo Zn è seguito dalla porzione Met-turn contenente un residuo di Metionina che crea un ambiente idrofobico ottimale per il sito catalitico 25.
Tra le varie ADAMTSs, la -4 e la 5- sono rispettivamente l’aggrecanasi-1 e l’aggrecanasi-2, simili dal punto di vista strutturale, e sono i due enzimi responsabili della rimozione dell’aggrecano, il maggior costituente delle cartilagine. Una loro sovraespressione si traduce in un’eccessiva rimozione di aggrecano e quindi nella formazione di una cartilagine alterata che porta allo sviluppo della patologia osteoartritica.
Fig. 1.17: Struttura multidominio delle aggrecanasi 26.
Oltre alla differenza strutturale, è stato evidenziato che nei condrociti l’ADAMTS-4 è un’enzima inducibile (ad esempio da citochine infiammatorie come l’interleuchina-1) mentre l’ADAMTS-5 è costitutiva. Recenti studi hanno evidenziato inoltre che l’
ADAMTS-5 è il maggior responsabile di questa attività proteolitica e quindi un suo studio più approfondito può essere utile ai fini terapeutici.
1.3.1. L’ADAMTS-5 (Aggrecanasi-2).
L’osteoartrite è la patologia muscoloscheletrica più diffusa al mondo ed è causata dalla degradazione dell’aggrecano e del collagene nella cartilagine articolare, che comporta un’infiammazione cronica associata a dolore e ad una progressiva perdita della mobilità.
Così come il collagene rappresenta il maggiore componente strutturale della cartilagine, l’ aggregano è il proteoglicano principale, che si complessa con l’acido ialuronico e il collagene formando degli aggregati che assicurano flessibilità, elasticità e resistenza alla struttura articolare. In condizioni fisiologiche, la matrice cartilaginea è costantemente rimodellata attraverso la degradazione e la neosintesi del collagene di tipo 2 e dell’aggrecano per assicurare e mantenere l’integrità della cartilagine. La perdita di aggregano è l’evento primario della degradazione della cartilagine ed è causata dall’attività proteolitica degli enzimi aggrecanasi. Quando l’attività di questi enzimi non è più strettamente regolata la rimozione di aggregano diventa eccessiva e si va incontro alla patologia osteoartritica.
Fig. 1.18: Cartilagine in condizioni patologiche: dominanza di processi litici 27. Agg
MMP
Condrocita Matrice cartilaginea
S
MMP MMP
Agg
Sintesi della matrice Sintesi di enzimi
proteolisi
proteolisi
S
proteolisi Agg
Agg MMP MMP MMP MMP
Agg
MMP
proteolisi
IL-1
IL-1 Interleuchina-1
Inibizione Stimolazione
=
=
=
=Nessuna S
S
Aggrecano Collagene Aggrecanasi
(metalloproteinasi)
Metalloproteinasi di matrice S
MMP MMP
Agg
Sintesi
L’aggrecano è un proteoglicano i cui monomeri sono costituiti da tre principali domini globulari (G1, G2, G3,) dove la porzione N-terminale G1 è quella capace di interagire con gli altri costituenti strutturali come l’acido ialuronico. Il dominio G1 è seguito da una dominio interglobulare IGD, dal dominio G2, da una regione GAG (glycosaminoglycan attachment region), che contiene una regione KS (keratansulfate rich region) e due diverse regioni CS (chondroitinsulfate rich region), e dal dominio C- terminale G3 (Fig. 1.19 ) 28.
Le aggrecanasi agiscono su di esso in 5 specifiche sequenze aminoacidiche, ovvero in prossimità di: Glu373-Ala374, Glu1545-Gly1546, Glu1714-Gly1715, Glu1819- Ala1820, e Glu1919-Leu1920, con lo stesso meccanismo di azione comune delle altre MMPs.
Fig. 1.19: Rappresentazione schematica dell’aggrecano: A,B,C,D,E sono i siti di idrolisi delle aggrecanasi, mentre 1,2,3,4,5,6 indicano possibili siti di interazione con altre MMPs 28.
L’ ADAMTS-5, anche se probabilmente agisce anche su altri proteoglicani come il versicano (costituente dei vasi sanguigni) e il brevicano (espresso prevalentemente nel SNC), è l’enzima maggiormente coinvolto nella proteolisi dell’aggrecano come dimostra la selettività con cui lo idrolizza in prossimità del sito Glu373- Ala374 , situato nel dominio IGD dell’aggrecano. Gli altri siti di interazione appartengono invece alla regione GAG 22.
L’ADAMTS-5 rispecchia la struttura multidominio delle altre ADAMTSs, infatti sono presenti la sequenza segnale, il pro-dominio, il dominio catalitico metalloproteinasico, il dominio disintegrinico (Dis), un residuo di trombospondina (Ts), una regione ricca di cisteine, lo spaziatore, e un altro residuo di trombospondina nella regione C-terminale (Fig. 1.20).
Fig. 1.20: Rappresentazione schematica della struttura multidominio di ADAMTS-5 22.
L’ADAMTS-5, come le altre ADAMTSs viene attivata tramite il riconoscimento della sequenza segnale e la rimozione del propeptide, e per l’aggrecanasi-2 è l’enzima PACE4 a svolgere questo compito 29.
La regione C-terminale sembra essere il sito che conferisce la selettività di substrato e influisce sulla localizzazione dell’enzima. Infatti, la maggiore attività proteolitica di ADAMTS-5 rispetto alla ADAMTS-4, è attribuibile al residuo di Ts che ADAMTS-5 ha in più nella porzione C-terminale. Questo residuo infatti incrementa l’affinità verso la regione CS-2 dell’aggrecano, potenziando il legame dell’enzima con la catena CS. La regione dello spaziatore invece non sembra avere una specifica funzione regolatoria, ma sembra influire sull’attività catalitica dell’enzima, cosi come la regione Cys-rich.
Quest’ultima regione è coinvolta nel legame con la ECM. Se vengono rimosse le porzioni di Ts e il dominio disintegrinico invece, l’enzima risulta inattivo. Il dominio
Dis infatti gioca un ruolo fondamentale nella proteolisi della regione IGD dell’aggrecano, e favorisce l’interazione con l’intera porzione GAG 30.
Il sito catalitico dell’enzima presenta la sequenza HEXXHXXGXXH, comune alle altre Metzincine, attorno all’atomo di Zn e presenta un omologia del 17% con quello del TACE anche se risulta più simile all’ADAM-33 (30%). La Fig. 1.21 mostra una sovrapposizione dei domini catalitici di tre esponenti di tre famiglie di proteasi:
l’ADAMTS-5, l’ADAM-33 e la MMP-3. Per quanto riguarda la struttura secondaria, l’ADAMTS-5 e l’ADAM-33 risultano praticamente sovrapposte, mentre la MMPs ha maggiori analogie nella parte centrale (eliche A e C). Un elemento fondamentale è che la tasca S1’ è differente per tutte le strutture e infatti è la regione che conferisce la specificità e la selettività agli enzimi 31.
Fig. 1.21: Sovrapposizione dei domini catalitici di ADAMTS-5 (celeste), ADAM-33 (rosso) e MMP-3 (giallo), in presenza di un inibitore (magenta) 31.
La struttura secondaria del dominio catalitico assomiglia a quella delle altre MMPs in cui si ritrovano al centro 5 β-strands ripiegati di cui 4 sono in parallelo tra loro e l’ultimo è in configurazione antiparallela. Il foglietto-β centrale è fiancheggiato da due α-eliche, le eliche A e C sul suo lato concavo e da una lunga α-elica, la elica B su quello convesso. Quest’ultima elica si lega allo strand-V tramite un legame disolfuro tra le Cys 342 –Cys 394(legame assente nelle altre MMPs). In totale il dominio catalitico contiene 4 legami disolfuro (disegnati in giallo nella Fig. 1.22) 31.
Il dominio catalitico, oltre all’atomo di Zn contiene 3 atomi di Calcio, fondamentali per mantenere l’integrità e il corretto ripiegamento dell’enzima. In particolare, 2 atomi stanno nello stesso sito di legame e formano un cluster di coordinazione vicino al residuo C-terminale, e questo è un elemento caratteristico di ADAMTS-5, assente in tutte le altre MMPs conosciute 31.
Fig. 1.22: Struttura secondaria del dominio catalitico di ADAMTS-5 in presenza di un inibitore (verde)31.
La regione “flexible-loop” in figura 1.22 comprende i residui Gly322- Asp323- Lys324- Asp325- Lys-326 ed è l’unica porzione flessibile della struttura, e possibilmente rappresenta un sito di riconoscimento endogeno.
Il sito catalitico ha una caratteristica forma ad imbuto, che si apre verso l’atomo di Zn e successivamente crea una forma a “L” che consiste in un canale idrofobico attraverso il sito S1’. Il residuo di Leu 433 delinea la parte superiore del canale. Lo Zn catalitico è coordinato da tre istidine, His 410, His 414, His 424 (Fig 1.23).
La figura 1.23 descrive inoltre le interazioni del sito catalitico in presenza di un inibitore di tipo idrossammato. La funzione idrossammica chela lo Zn e instaura un legame a idrogeno con il Glu 411, la funzione solfonica interagisce con la Leu 379 e la catena bifenilica si inserisce nella tasca di selettività S1’ e vi instaura una forte interazione idrofobica 31.
Fig. 1.23: Caratteristica forma del sito catalitico di ADAMTS-5 e interazioni con un inibitore di tipo idrossammato 31.
La tasca di selettività S1’, può essere definita attraverso 3 elementi fondamentali: la base dello strand-IV definita dagli aminoacidi 379-382, la porzione di elica C compresa
tra gli aminoacidi Leu 402- Glu 411 e il loop costituito dagli aminoacidi Arg 437-Ile 446. Questa tasca è fondamentale per quanto riguarda la sintesi di inibitori selettivi di ADAMTS-5, come dimostra la figura 1.24.
Fig. 1.24: Sovrapposizione dei residui delineanti la tasca S1’ di ADAMTS-5 (celeste) ADAM-33 (rosso), TACE (viola), e MMP-3 (giallo) in presenza di un inibitore 31.
L’ADAMTS-5 ha quindi diversi elementi di differenza con le altre proteasi, come la caratteristica forma del dominio catalitico, la tasca di selettività S1’, e la presenza degli ioni calcio con i loro siti di legame caratteristici.
Alcuni studi in modelli animali sulla patologia osteoartritica hanno evidenziato che un’inibizione selettiva di ADAMTS-5 è sufficiente per proteggere la cartilagine dalla progressione del danno32. La ricerca farmaceutica degli ultimi anni si è quindi indirizzata verso la sintesi di inibitori il più possibile selettivi verso l’aggrecanasi-2.
