Tutti i prodotti oggetto di studio di questa tesi sono stati saggiati per la loro affinità al TSPO presso i laboratori della Prof Claudia Martini del Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia,
Farmacologia e Biotecnologie dell’Università di Pisa.
L’affinità di legame al TSPO dei ligandi esaminati è stata determinata sulla base della capacità delle molecole di inibire il legame specifico del ligando radioattivo [3H]PK11195 da membrane mitocondriali di rene di ratto . In un primo momento viene fatto uno screening ad una determinata concentrazione (per i composti oggetto di questa tesi 10 µM) ; successivamente per quelli più attivi, viene calcolato l’IC50 , cioè la concentrazione del composto che è in grado
di spiazzare il 50% del ligando marcato del recettore . Una volta ottenuto l’IC50 , viene calcolata la Kiiii
del composto in accordo con
l’equazione di Cheng e Prusoff.[11]
Nella Tabella 3 sono riportati i dati di affinità dei derivati di nuova sintesi 25-36 e 39-40. Si riportano inoltre i valori di Ki di alcuni composti indolici precedentemente descritti a-c, d-g , a scopo di paragone.
Possiamo osservare che in generale , i derivati di nuova sintesi N,N-dialchil-2-(arilindol-3-il)gliossilamidici 25-36 portanti sostituenti aromatici in posizione 2 dell’anello indolico molto ingombranti, di tipo bifenilico e naftilico mostrano ottime affinità al recettore, con valori di Kiiii dell’ordine del basso nanomolare/ subnanomolare.
Tabella 3. Affinità di legame al recettore dei derivati N,N-dialchil-2- arindol-3-ilgliossilamidici 25-36, 39-40 e i loro effetti stimolatori sulla biosintesi del pregnegnolone.
Aumento nella Composti R1 R2 Ar Kiiii (nM) a produzione di pregnegnolone ad (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 C6H5 12.2±1.0 8±1 bd (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C6H5 7.5±0.7 23±3 cd (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 C6H5 1.4±0.2 30±3 de CH2CH3 CH2C6H5 C6H5 11±1.0 20±2 ee CH3 (CH2)3CH3 C6H5 53.3±4.0 32±2 fe CH3 (CH2)4CH3 C6H5 12.1±1.0 36±4 ge CH2CH3 CH2)3CH3 C6H5 12.6±1.0 43±5 25 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 2-naftil 0.305±0.04 29±1 26 (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 2-naftil 0.535±0.06 50±2 27 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 2-naftil 0.518±0.06 55±3 28 CH2CH3 (CH2)3CH3 2-naftil 0.507±0.05 69±4 29 CH2CH3 CH2C6H5 2-naftil 0.512±0.05 - 30 CH3 (CH2)3CH3 2-naftil 0.0599±0.06 107±8 31 CH3 (CH2)4CH3 2-naftil 0.368±0.04 115±9 32 CH3 CH2C6H5 2-naftil 2.51±0.2 67±7 33 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 2-bifenil 0.53±0.05 - 34 (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 2-bifenil 5.5±1.0 -
Aumento nella Composti R1 R2 Ar Kiiii (nM) a produzione di pregnegnolone 39 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 2-tiofenil 1.234±0.12 - 40 (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 2 -tiofenil 2.829±0.3 - PK11195 9.3±0.5 48±5 Ro5-4864 23±3 41±4 Alpidem 0.5-7 -
[a] La concentrazione dei composti saggiati che inibisce il 50% del legame del [3H] PK11195 nelle membrane mitocondriali delle cellule di rene di ratto. (IC50) è stata determinata mediante
analisi log-probit utilizzando 6 concentrazioni diverse del composto. I valori di Ki sono medie ± SEM di 3 determinazioni.[c] Si riferisce alle cellule C6 di glioma che sono state incubate per 2h a
37° C, in presenza di ogni composto. Il pregnegnolone è stata quantificato mediante il test immunoradiologico. I valori rappresentano la media di almeno tre determinazioni. Per confronto sono inclusi anche gli effetti di PK11195 e Ro5-4864 sulla produzione di pregnegnolone.[d] Dati ottenuti dal riferimento 7.[e] Dati ottenuti dal riferimento 10.
All’interno della sottoclasse dei derivati 2-naftil e 2-bifenil sostituiti, tutti i composti 25-32 , mostrano valori di Kiiii di ordine sub-nanomolare e una migliore quindi affinità al recettore, rispetto ai corrispondenti 2-fenilindoli a-g . Ciò è evidente per esempio se confrontiamo i derivati 25 e 29 con ad e de rispettivamente.
I composti meno attivi di questa serie sono i derivati 32 , 34 e 36 che comunque presentano Ki nel range del basso nanomolare; 32 , Ki=2.51 nM ; 34 , Ki=5.5 nM ; 36 , Ki=1.15 nM. Infine
l’introduzione in posizione 2 di un anello 2-tienilico porta all’ottenimento di composti altamente affini, 39-40 , con valori di Ki rispettivamente 1,23nM e 2.83 nM.
La natura dei gruppi legati all’azoto amidico, non sembra quindi influenzare significativamente il legame dei ligandi 25- 32 al TSPO, avendo essi valori di Kiiii paragonabili. Al contrario l’introduzione di un gruppo bifenilico o 2-tienilico in posizione 2, determina solo un piccolo decremento nell’affinità al recettore .
Da tali considerazioni deduciamo che i composti N,N-dialchil-2-aril-3-ilgliossilammidici 25-36 e 39-40 sono capaci di produrre una efficace interazione alla tasca lipofilica L1 del farmacoforo. Tale effetto positivo si ottimizza con l’introduzione di un gruppo naftilico in posizione 2, al punto tale da rendere ininfluenti modifiche strutturali a livello delle catene legate all’azoto amidico.
Per quanto riguarda l’effetto prodotto da questi nuovi ligandi sull’attività steroidogenica , di cellule C6 di glioma di ratto,
possiamo vedere dai dati preliminari in Tabella 3 che i composti più performanti sono il 30 e 31, avendo essi prodotto un aumento nella produzione di tale ormone rispettivamente del 107 % e 115 % . Questi incrementi nella produzione di pregnegnolone risultano essere decisamente maggiori rispetto a quelli degli standard PK11195 e Ro5-4864 , che sono invece rispettivamente del 48 % e 41 %.[7,10]
Nonostante tutto, l’affinità al TSPO dei ligandi N,N-arilindolgliossilmidici , non sembra generalmente correlare, con l’attività stereoidogenica: ligandi con valori di Ki paragonabili possono
