FARMACIJOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
Gintarė Rakauskaitė
PRIEŠIŠEMINIS ANTOCIANINŲ POVEIKIS ŽIURKĖS ŠIRDIES
MITOCHONDRIJOMS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Dr. Julius Liobikas
Konsultantai Dr. Sonata Trumbeckaitė Prof. dr. Vilmantė Borutaitė
TURINYS
SANTRAUKA... 4
SUMMARY... 5
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. Antocianinai ... 9
1.1.1. Struktūra, paplitimas ... 9
1.1.2. Antocianinų veikimas ir biologinės savybės ... 12
1.1.3. Antocianinų absorbcija ir metabolizmas ... 14
1.2. Mitochondrijų struktūra ir jų funkcijos ... 16
1.3. Išemija ir jos įtaka mitochondrijų funkcijai ir struktūrai ... 19
1.4 Apoptozė ir mitochondrijos ... 21
2. METODIKA ... 24
2.1. Eksperimentiniai gyvūnai ... 24
2.2. Reagentai... 24
2.3. Mitochondrijų išskyrimas ... 24
2.4. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu ... 24
2.5. Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas ... 25
2.6. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas ... 25
2.7. Citochromo c redukcijos nustatymas ... 26
2.9. Mitochondrinio ir citozolinio citochromo c kiekio matavimas ... 26
2.10. Statistinė duomenų analizė ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų funkcijoms... 29
3.1.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams ... 29
3.1.2. Citochromo c efektas ... 30
3.2. Citochromo c redukcija antocianinais ... 32
3.2.1. Antocianinų efektas citochromo c redukcijos būsenai ... 32
3.3. Perfuzija ir išemija ... 34
3.3.1. Antocianinų poveikis išemijos sukeltiems širdies mitochondrijų pažeidimams po perfuzijos ... 34
3.3.2. Citochromo c kiekio kitimas išeminėse mitochondrijose ... 36
3.3.3. Kaspazės 3 aktyvumo kitimas citozolinėse frakcijose ... 37
4. IŠVADOS ... 40
SANTRAUKA
G.Rakauskaitė. Magistro baigiamasis darbas - Priešišeminis antocianinų poveikis žiurkės širdies mitochondrijoms/ Mokslinis vadovas dr. Julius Liobikas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas; Neuromokslų institutas. - Kaunas 2012.
Darbo tikslas yra ištirti antocianinų įtaką širdies ląstelių energijos apykaitai ir nustatyti šių biologiškai aktyvių junginių galimo apsauginio poveikio ląstelėms mechanizmą. Darbo uždaviniai: ištirti skirtingų antocianinų poveikį žiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms; nustatyti ir palyginti penkių skirtingų antocianinų gebėjimą redukuoti egzogeninį citochromą c in vitro; nustatyti skirtingų antocianinų priešišeminį poveikį ir jo apsauginį mechanizmą ląstelėse.
Tyrimo metodika: Eksperimentams atlikti buvo naudojama 2 - 4 mėnesių, suaugę Wistar žiurkių patelės. Mitochondrijos buvo išskirtos diferencinio centrifugavimo metodu. Širdies perfuzija buvo atliekama naudojant Langendorfo tipo širdies perfuzijos sistemą. Mitochondrijų kvėpavimo greitis registruotas naudojant oksigrafinę sistemą Oxygraph-2k (Oroboros, Austrija). Citochromo c redukcija buvo matuota spektrofotometriškai, naudojant Helios spektrofotometrą. Kaspazės 3 aktyvumas matuotas fluorimetiškai, naudojant “Thermo Scientific platereader” fluorimetrą. Statistinė analizė atlikta naudojant SigmaPlot 11.0.
Rezultatai: 20 µM Dp-3-G ir Cy-3-G patikimai padinina mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje (esant 140µM atraktilozido ir pridėjus 32 µM egzogeninio citochromo c), 71% ir 30% atitinkamai. Delfinidino-3-O-gliukozidas (Dp-3-G) ir cianidino-3-O-gliukozidas (Cy-3-G) sukelia stiprią citochromo c redukciją in vitro (78% ir 54% atitinkamai), kiti tirtieji – pelargonidino-3-O-gliukozidas (Pg-3-G), malvinidino-3-O-pelargonidino-3-O-gliukozidas (Mv-3-G), peonidino-3-O-pelargonidino-3-O-gliukozidas (Pn-3-G) – turi silpnesnį gebėjimą redukuoti citochromą c. Širdies perfuzija su 20 µM Cy-3-G apsaugojo nuo išemijos sukeltos kaspazės 3 aktyvacijos, o Pg-3-G šio poveikio neturėjo.
Išvados: 20 µM Dp-3-G bei 20 µM ir 40 µM Cy-3-G ir Pg-3-G kocentracijų tirpalai neturėjo poveikio mitochondrijų kvėpavimo greičiams antroje ir trečioje metabolinėse būsenose. 20 µM Dp-3-G ir Cy-3-G 71% ir 30% atitinkamai stimuliuoja kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje esant egzogeniniam citochromui c. Dp-3-G ir Cy-3-G yra stiprūs citochromo c reduktoriai, sukeliantys greitą ir tiesioginę redukciją - 78% ir 54% po 6 min inkubacijos, atitinkamai. Silpniausias redukcines savybes turi Pg-3-G – po 6min inkubacijos redukavo 12%. 15 min širdies perfuzija 20 µM Cy-3-G apsaugojo nuo išemijos sukeltos kaspazių aktyvacijos, sumažindama kaspazės 3 aktyvumą iki kontrolinio lygio.
SUMMARY
G.Rakauskaite. Master thesis – Anti-Ischaemic effect of anthocyanins on rat heart mitochondria/ Academic supervisor dr. Julius Liobikas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Institute of Neurosciences. - Kaunas 2012.
The aim of the study is to investigate the influence of anthocyanins on the energy system of heart cells and to determine the possible protective mechanism of action of these biologically active compounds. The objectives of the study are: to investigate the direct effect of anthocyanins on mitochondrial functions; to assess and compare the effect of different anthocyanins on the redox state of extramitochondrial cytochrome c in vitro; to assess anti-ishaemic effect of different anthocyanins and its protective mechanism in cells.
The methods of the study: All experiments were performed on hearts 2-4 months old female Wistar rats. Mitochondrias were isolated by differential centrifugation method. The hearts were perfused on a Langedorff perfusion system. Mitochondria respiration rate was measured using an Oxygraph-2k (Oroboros, Austria). The cytochrome c reduction level was recorded spectrophotometerally, with a Helios spectrophotometer. Measurement of caspase 3-like activity was recorded flourimetrically, with a “Thermo Scientific platereader” fluorimeter. Statistical analysis was done by using Sigma Plot 11.0.
The Results of the study: Dp-3-G and Cy-3-G were able to reduce cytochrome c directly and rapidly in vitro (78% and 54% respectively), whereas three other investigated anthocyanins –Pg-3-G, Mv-3-G, Pn-3-G - had lower ability to reduce cytochrome c. In the presence of 140 µM atractilozide and 32 µM exogenous cytochrome c (4 metabolic state), Dp-3-G and Cy-3-G increased the mitochondrial respiration rate (71% and 30% respectively), while Pg-3-G had no effect. Perfusion of hearts with 20 µM Cy-3-G prevented from ischaemia-induced caspase 3-like activation, whereas Pg-3-G had no effect.
The Conclusions of the study: 20µM Dp-3-G, 20µM and 40µM Cy-3-G and Pg-3-G had neither effect on routine mitochondrial respiration rate , nor phosphorilation rate, but it was determined that Dp-3-G and Cy-3-Dp-3-G caused powerful respiration rate stimulation 71% and 30% respectively in the presence of 140 µM atractilozide and 32 µM exogenous cytochrome c (4 metabolic state). Dp-3-G and Cy-3-G were potent cytochrome c reductants, which were able to cause rapid and direct reduction (78 % and 50 % respectively) over 6 minutes. Other investigated anthocyanins (Pg-3-G, Pn-3-G, Mv-3-G) had less ability to reduce exogenous cytochrome c in vitro. Cy-G was assessed to have suppressive effect on caspase 3-like activation after 15 minutes perfusion of heart with 20 µM Cy-3-G.
SANTRUMPOS
ADP – adenozino 5’ - difosfatasAMP – adenozino 5’ - monofosfatas ATP – adenozino 5’ - trifosfatas ATR – atraktilozidas Cy – cianidinas Cy-3-G – cianidino-3-O-gliukozidas Cy-3-R – cianidino-3-O-rutinozidas Cyt c – citochromas c CP – kreatino fosfatas DNR – deoksiribonukleininė rūgštis Dp – delfinidinas Dp-3-G – delfinidino-3-O-gliukozidas Dp-3-R – delfinidino-3-O-rutinozidas
EGTA – etilenglikolio-bis-(β-amino-etileterio)-N,N,N’,N’- tetraacto rūgštis FADH2 – flavino adenino dinukleotidas, redukuota forma
HEPES – 4-(2-hidroksietil)-1-piperazino etano sulfoninė rūgštis Mv - malvinidinas
Mv-3-G – malvinidino-3-O-gliukozidas
NADH – nikotinamido adenino dinukleotidas, redukuota forma NO – azoto monoksidas Pg – pelargonidinas Pg-3-G – pelargonidino-3-O-gliukozidas Pn – peonidinas Pn-3-G – peonidino-3-O-gliukozidas Pt – petunidinas
ROS – reaktyvūs deguonies junginiai
ĮVADAS
Širdies ir kraujagyslių ligos yra viena pagrindinių komplikacijų ir padidėjusio mirtingumo priežasčių ekonomiškai išsivysčiose šalyse (Middleton et al., 2000; Mukamal et al., 2002 ), todėl yra labai svarbu ieškoti vis naujų būdų šių ligų prevencijai arba simptomatikai palengvinti, norint padidinti išgyvenamumą ir pagerinti žmonių gyvenimo kokybę. Esant tam tikroms širdies kraujagyslių ligoms, kaip pavyzdžiui, hipertenzija, išemija ar aterosklerozė labai dažnai sutrinka ląstelių energijos apykaita, t.y šios ligos dažnai susijusios su funkciniais ir struktūriniais mitochondrijų pakitimais, be to yra aktyvinami ir ląsteliniai keliai, skatinantys ląstelių apoptozę arba kitaip vadinamą programuotą ląstelių mirtį, kuri yra labai svarbi homeostazės užtikrinimui gyvuose organizmuose (Suto et al., 2005; Borutaite & Brown, 2007). Kai sutrinka apoptozės reguliacinis mechanizmas (pvz., išemijos metu) - ji yra arba labai stipriai suaktyvinama, arba slopinama, tuomet sutrinka ir homeostazės palaikymas, kas dažniausiai sąlygoja daugelio ligų (vėžio, Alzheimerio, Parkinsono, imuninių ligų ir kt.) pradžią arba spartesnį vystymąsi (Meier, 2000; Zuzarte-luis, 2002). Todėl yra labai svarbu gerai ištirti mitochondrijų vaidmenį fiziologinėse būsenose, suprasti išemijos sukeltos apoptozės mechanizmus, ypač jos reguliacijos būdus, kad būtų galima atrasti naujų kelių, veikiančių programuotą ląstelių mirtį ir užtikrinančių jos kontrolę, o taip pat ir išvengti įvairių patologinių sutrikimų.
Paskutiniais metais farmacijos pramonėje vis didesnis dėmesys yra kreipiamas į natūralius preparatus, pagamintus iš vaistinės augalinės žaliavos bei į juose įeinančius biologiškai aktyvius junginius ir jų veikimo mechanizmus. Pastebima, kad intensyvėjant farmacijos pramonei, didėja ir natūralių augalinių preparatų suvartojimas. Lygiai taip pat ir maisto pramonėje, vis didėja susidomėjimas ekologiškais, natūraliais maisto produktais. Domintis atliktomis epidemiologinėmis studijomis (Martin et al., 2003; Estruch et al., 2006; de Lorgeril & Salen, 2007; Kuriyama, 2008), pastebėta, kad reguliarus vaisių ir daržovių vartojimas reikšmingai sumažina širdies ir kraujagyslių ligų riziką, nes juose gausu maistinių antioksidantų (Kris-Etherton et al., 2002). Vieni iš tokių antioksidantų yra antocianinai – vandenyje gerai tirpūs augaliniai pigmentai, priskiriami flavonoidų klasei ir randami įvairiuose augaluose, kuriems suteikia mėlyną, raudoną, violetinę ir purpurinę spalvas. Antocianinai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis ir paskutiniais metais jų biologinis poveikis yra labai aktyviai tyrinėjamas. Manoma, kad skirtingas antocianinų nei kitų flavonoidų veikimas priklauso nuo jų struktūroje prisijungusių radikalų ir dėl teigiamo molekulės krūvio. Ir nors jau daug tyrimų yra atlikta tyrinėjant šių biologiškai aktyvių junginių biologinio veikimo ypatumus, vis dar nėra pakankamai duomenų apie
antocianinų poveikį mitochondrijų funkcijoms, o ypač apie jų galimą vaidmenį apoptozės reguliavime ir apsauginiame širdies mechanizme. Remiantis, ankstesniais Neuromokslų institute atliktais tyrimais (Liobikas et al., 2009), buvo pastebėta, kad antocianinai turi stiprų stimuliacinį efektą mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje metabolinėje būsenoje (esant atraktilozido ir pridėjus egzogeninio citochromo c), todėl buvo susidomėta šių pigmentų poveikiu citochromui c. Citochromas c yra nedidelis baltymas, silpna elektrostatine jungtimi susirišęs su mitochondrijų kvėpavimo grandine, dalyvaujantis elektronų pernešime tarp citochromo c reduktazės ir citochromo c oksidazės, o taip pat ir specifinis apoptozės aktyvatorius (Garrido et al., 2006; Ow et al., 2008). Iš pradžių buvo manoma, kad šis mitochondrijų kvėpavimo greičio stimuliavimas antocianinais gali būti susijęs su išorinės mitochondrijų membranos pažeidimu (Liobikas et al., 2009), tačiau vėliau buvo iškelta prielaida, kad tai susiję su antocianinų gebėjimu redukuoti citochromą c (Skemiene et al., 2010 a, b). Taigi, buvo nuspręsta ištirti skirtingų antocianinų standartų citochromą c redukuojančius efektus, o tuo pačiu išsiaiškinti, ar citochromo c redokso būsenos pakeitimas gali apsaugoti ląsteles nuo išeminių pažeidimų bei apoptozės kaskados aktyvacijos.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Šio darbo tikslas yra ištirti antocianinų įtaką širdies ląstelių energijos apykaitai ir nustatyti šių biologiškai aktyvių junginių galimo apsauginio poveikio ląstelėms mechanizmą.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti skirtingų antocianinų poveikį žiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms;
2. Nustatyti ir palyginti penkių skirtingų antocianinų gebėjimą redukuoti egzogeninį citochromą c in
vitro;
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Antocianinai
1.1.1. Struktūra, paplitimas
Antocianinai – tai augalų pigmentai, priskiriami plačiai paplitusiai fenolinių junginių klasei – flavonoidams (Gould, 2002; Kong et al., 2003; Hou et al., 2003). Jie randami įvairiose uogose, daržovėse ir vaisiuose, kuriems suteikia raudoną, violetinę ar mėlyną spalvą (Kong et al., 2003; Fleschuhut et al., 2006). Žodis antocianinas yra kilęs iš graikų kalbos žodžių anthos (gėlė) ir kyanos (mėlyna), kurie buvo naudojami apibūdinti mėlynus pigmentus, randamus rugiagėlėje. Susidomėjimas antocianinais per paskutinius kelerius metus ypatingai išaugo, nes manoma, kad jie pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis ir yra svarbūs gydant oksidacinio streso sukeltas ligas, pvz., vainikinių širdies kraujagyslių, Parkinsono ligas, uždegiminius procesus, vėžį (Kong et al., 2003; Zafra-stone et al., 2007). Ir nors įvairūs antocianinų biologinio poveikio tyrimai atliekami jau seniai, tačiau dar nėra užtektinai tikslių duomenų apie šių pigmentų tiesioginį poveikį mitochondrijų funkcijoms.
Cheminė struktūra. Antocianinai susideda iš aglikono (antocianidino) ir angliavandenių molekulių, kurios gali būti prisijungusios acilo grupių (Andersen & Jordheim, 2006). Antocianinai, kaip cheminiai junginiai, yra 2 - fenilbenzopirilio (flavilio) druskų darinių glikozidai. Jie vieni nuo kitų skiriasi hidroksi- ir/arba metoksi- grupių, taip pat ir angliavandenių molekulių skaičiumi, prisijungimo būdu bei padėtimi (Bloor & Abrahams, 2002; Kong et al., 2003; Fleschuhut et al., 2006). Antocianinų, kaip ir kitų flavonoidų grupių, pagrindą sudaro C6-C3-C6 struktūra, susidedanti iš dviejų aromatinių benzeno žiedų (A ir B), sujungtų trijų anglies atomų grandine, kuri, besijungdama su hidroksilo grupe, suformuoja heterociklinį (C) žiedą (1 pav.) (Jeremy Spencer, 2009; van Beek & Montoro, 2009). Pagrindinė antocianinų struktūros ypatybė yra laisvas deguonies atomo valentingumas (C) žiede. Dėl teigiamo molekulės krūvio, antocianinai rūgščiame tirpale veikia kaip katijonai ir sudaro druskas reaguodami su rūgštimis. Antocianinai yra gerai tirpūs vandenyje ir kuo daugiau angliavandenių molekulių prisijungusių prie jų aglikono, tuo jie labiau poliški. Šiuo metu yra žinoma daugiau nei 600 skirtingų antocianinų, tačiau 90% iš antocianinų sutinkamų gamtoje yra šešių pagrindinių antocianidinų (aglikonų) – pelargonidino (Pg), peonidino (Pn), cianidino (Cy), malvinidino (Mv), petunidino (Pt) ir delfinidino (Dp) – dariniai (1 pav.) (Kong et al., 2003; Fleschuhut et al., 2006; Prior & Wu, 2006). Visi šie šeši antocianidinai skiriasi
tik B žiedo 3’ ir 5’ padėtyse esančiomis hidroksilo ir metilo grupėmis, todėl manoma, kad būtent šie radikalai lemia antocianinų biologinio poveikio skirtumus, o ypač jų oksidacines-redukcines savybes.
1. pav. Pagrindinė cheminė antocianidinų struktūra
Angliavandenių molekulės antocianinų struktūroje dažniausiai yra (C) žiedo 3 - padėtyje arba (A) žiedo 5 ir 7 – padėtyse. Angliavandenių molekulės prie antocianidinų dažniausiai jungiasi per O-glikozidines jungtis (Williams & Grayer, 2004; Bjoroy et al., 2007). Gliukozė (dažniausiai sutinkamas monosacharidas, ~90%), galaktozė, arabinozė, ramnozė ir ksilozė yra pagrindinės angliavandenių molekulės (2 pav.), kurios prisijungusia prie antocianidinų ir sudaro mono-, di- arba tri- sacharidų formas. Labiausiai paplitę yra antocianidinų 3–O-glikozidai, kurie sutinkami gamtoje apie du kartus dažniau nei 3, 5–O-diglikozidai (Andersen & Jordheim, 2006; Prior & Wu, 2006). Daugiau nei 65% antocianinų savo stuktūroje turi ir riebalų rūgščių liekanų. Angliavandenių molekulės gali būti prisijungusios alifatines ir/arba aromatines riebalų rūgščių grupes, pvz., malato, oksalo, acetato, sukcinato, galo, hidroksibenzoine ar kitas rūgštis.
2 pav. Pagrindinės angliavandenių molekulės randamos antocianinų struktūrose
Antocianidinas R1 R2 Pelargonidinas (Pg) H H Cianidinas (Cy) OH H Delfinidinas (Dp) OH OH Peonidinas (Pn) OCH3 H Petunidinas (Pt) OCH3 OH
Malvidinas (Mv) OCH3 OCH3
β – D – gliukopiranozė β – D – galaktopiranozė – L – ramnopiranozė 3
5 7
Paplitimas. Kalbant apie žmogaus mitybą, antocianinai yra randami raudonajame vyne, tam tikrose javų rūšyse, lapinėse ir šakninėse daržovėse (baklažanuose, kopūstuose, pupelėse, svogūnuose, ridikėliuose), bet daugiausia jų gausu vaisiuose, ypač uogose (mėlynėse, spanguolėse, serbentuose, avietėse, šeivamedžio uogose ir t.t.). Vakarų šalyse ypač paplitę įvairių uogų produktai, kaip uogienės, sultys, koncentratai, vynai ir netgi maistiniai dažai, kuriuose taip pat yra randami nemaži antocianinų kiekiai. Dažniausiai maiste aptinkamas antocianinas yra cianidinas (Manach et al., 2004). Antocianinų kiekis maisto produktuose (vaisiuose, uogose ir t.t.) yra paprastai proporcingas jų spalvos intensyvumui, pvz., jų būna iki 2 - 4 g/kg sunokusiose šviežiai nuskintose juodųjų serbentų ir mėlynių uogose. Vaisiams, uogoms nokstant antocianinų kiekis padidėja. Raudonasis vynas turi 200 - 350 mg antocianinų/L ir vynui senstant antocianinai transformuojasi į įvairias sudėtingas kompleksines struktūras (Clifford & Brown, 2006; Chun et al. 2007; Heinonen 2007; Zamora-Ros et al., 2010).
Vienas iš daugybės augalų, turtingų antocianinų ir auginamas Lietuvoje yra juodasis serbentas (Ribes nigrum L., Grossulariaceae). Jo vaisiai kaupia labai didelius kiekius šių veikliųjų medžiagų, t.y. apie 250 mg/100 g šviežio vaisiaus (Slimestad et al., 2002). Beje, antocianinų kiekis, pasiskirstymas ir įvairovė labai priklauso nuo augalo, kuris juos kaupia, rūšies, augimo sąlygų, uogų sunokimo laipsnio, apdirbimo ir kitų savybių. Kaip pavyzdys, pateikiamas antocianinų kiekis 2007 metais surinktų juodojo serbento veislės „Ben Lomond“ sunokusių (techninės brandos) uogų ekstrakte (3 pav).
3pav. Antocianinų kiekis (%) juodojo serbento veislės „Ben Lomond“ sunokusių uogų ekstrakte (Liobikas et al., 2009)
Nustatyta, kad, nepriklausomai nuo juodojo serbento uogų sunokimo laipsnio, jų uogų ekstraktuose vyrauja keturi pagrindiniai antocianinai: Cy-3-R, Dp-3-R, Dp-3-G ir Cy-3-G. Taip pat yra aptinkami nedideli kiekiai Mv-3-G, Pn-3-G ir Pel-3-G (Liobikas et al., 2009). Tiriant juodojo serbento
ekstraktų kiekybinę sudėtį buvo susidomėta ir jų biologiniu poveikiu, nes jie, veikdami kaip antioksidantai galėtų būti pritaikomi gydant įvairias oksidacinio streso sukeltas ligas. Buvo nustatyti juodojo serbento uogų ekstraktų poveikiai žiurkės širdies (Liobikas et al., 2009; Skemiene et al., 2010 a, b), kepenų mitochondrijų funkcijoms (Rakauskaitė ir Liobikas, 2011), tačiau kiekybiniai antocianinų sudėties skirtumai ir esamos priemaišos serbentų uogų ekstraktuose, matyt, sąlygojo nevienodą poveikį mitochondrijų funkcijoms in vitro. Tolimesniems tyrimams atlikti buvo nuspręsta pasirinkti antocianinų standartus, taip siekiant gauti tikslesnius rezultatus ir išsiaiškinti šių medžiagų tiesioginį poveikį, išvengiant šalutinių medžiagų efektų.
1.1.2. Antocianinų veikimas ir biologinės savybės
Paskutiniu metu iššaugo susidomėjimais antocianinais, nes jie turi potencialių farmokologinių ir biologinių savybių, dėl to gali būti naudojami terapiniams tikslams. Pavyzdžiui, buvo įrodyta, kad antocianinų ekstraktai, išskirti iš paprastosios mėlynės efektyviau sumažina kapiliarų pralaidumą ir trapumą nei rutinas bei turi stipresnį priešuždegiminį ir priešedeminį poveikį (Kong et al., 2003). Antocianinai taip pat pasižymi stipriu imunomoduliaciniu, antimikrobiniu veikimu (Puupponen-Pimia et al., 2001). Yra manoma, kad labiausiai antocianinų svarba žmogaus sveikatai susijusi su jų oksidacinėmis-redukcinėmis savybėmis arba, kitaip tariant, antioksidaciniu veikimu: jie suriša laisvuosius radikalus, lipoproteinų oksidacijos produktus, veikia kaip uždegimą slopinanti priemonė, saugo nuo navikų susidarymo, stabdo lipidų ir baltymų oksidaciją organizme ir maisto produktuose (Gould, 2004; Glinska et al., 2007; Posmyk & Janas, 2008). Vis daugiau ir daugiau publikacijų skelbia, kad vartojant antocianinų turtingus produktus galima sumažinti širdies ir kraujagyslių ligų riziką (Zern et al., 2005; Falchi et al., 2006; Lazze et al., 2006; Akhlaghi and Bandy, 2009; de Pascual-Teresa et al., 2010). Paremiant šį teiginį, Suomijoje buvo vykdytas projektas, kurio metu žmonėms buvo skiriama kasdieninė maisto dieta su padidintu uogų kiekiu ir tai sumažino sergamumą širdies ir kraujagyslių ligomis bei insultų tikimybę apie 60% ir privertė kitas Vakarų Europos šalis pradėti rimčiau domėtis uogose esančiomis naudingomis medžiagomis (Jordheim et al., 2007). Lyginti antocianinų turtingų braškių, raudonųjų slyvų, vyšnių, aviečių ekstraktų ir Cy-3-G standarto antioksidaciniai poveikiai su Vitaminu C, geležimi, -tokoferoliu. (Proteggente et al., 2002). Buvo pateikti duomenys, kad antocianinai turi daug stipresnį reaktyvių deguonies junginių (ROS) surišimo laipsnį nei kiti tirtieji junginiai. Taip pat antocianinai geriau apsaugo
nuo lipidų peroksidacijos bei yra stipresni redukuojantys veiksniai nei geležis, padedantys išvengti ir metalų jonų oksidacijos, pvz., Cu2+ (Proteggente et al., 2002; Wang H et al., 1999). Manoma, kad vienas iš antocianinų, kaip ir kitų flavonoidų, anktioksidacinių mechanizmų yra tiesioginis laisvųjų radikalų surišimas, atiduodant laisvos hidroksilo grupės vandenilio atomą. Antocianinų aglikonai, turintys savo struktūros žieduose daugiau –OH grupių (pvz., delfinidinas, cianidinas) turi didesnį giminingumą laisviesiems radikalams bei yra aktyvesni radikalų surišėjai nei tie, kurie turi metilintas –OH grupes (Silva et al., 2002; Dorta et al., 2008).
Antocianinai pasižymi ir priešvėžiniu veikimu, kuris buvo įrodytas, kai žmogaus gaubtinės žarnos ir skrandžio vėžio ląstelės buvo paveiktos antocianinų frakcijomis ir ląstelių augimas buvo nuslopintas daug reikšmingiau nei veikiant kitų flavonoidų frakcijomis (pvz., kvercetino, rutino) (Kamei et at., 1995). Literatūroje yra keletas darbų, kuriuose aprašomas antocianinų aglikonų poveikis žmogaus vėžinių ląstelių mitochondrijoms ir pateikiami duomenys, jog Dp sukelia hepatomos HepG2, gimdos
karcinomos HeLa S3 bei gaubtinės žarnos adenokarcinomos CaCo-2 ląstelių apoptozę (Lazze et al., 2004; Yeh & Yen, 2005). Kitu tyrimu buvo įrodytas efektyvus saldžiosios bulvės antocianinų priešmutageninis poveikis (Yosihimoto et al., 1999). Taip pat antocianinai apsaugo nuo ūminio pankreatito, nes sumažina kasos padidėjimą, lipidų peroksidaciją, slopina adenozino deaminazės aktyvumą (Jankowski et al., 2000). Tikrosios kinrožės antocianinai buvo tirti in vivo ir nustatyta, kad duodant juos žiurkėms prieš vieną tetra-butilo hidroperoksidazės gydymo dozę, yra žymiai sumažinamas kepenų fermentų žymenų (alanino ir aspartato aminotransferazių) lygis serume ir oksidacinė kepenų žala (Wang et al., 2000). Atlikus histopatologinę žiurkės kepenų analizę paaiškėjo, kad kinrožės pigmentai sumažino tetra-butilo hidroperoksidazės sukeltus kepenų pažeidimus, įskaitant uždegimą, leukocitų inflirtaciją ir nekrozę (Wang et al., 2000). Antocianinai turi ir priešdiabetinį poveikį, kaip pvz., skiriant šilkmedžio lapų ekstrakto dietą, ji apsaugojo nuo streptozotocino sukelto diabeto žiurkėse (Andallu et al., 2003; Heo et al., 2007). Be to, antocianinų turtingi vaisiai pasirodė esantys efektyvūs atminties gerinimo procese, tai tiriant eksperimentiniuose gyvūnėliuose (Andres - Lacueva et al., 2005). Šilkmedžio lapų ekstraktai apsaugo ir nuo amiloido fibrilių formavimosi bei turi neuroprotekcinį veikimą, todėl manoma, kad gali būti panaudojami Alzheimerio ligos prevencijai (Niidome et al., 2007; Shih et al., 2009).
Šiame darbe pagrindinis dėmesys yra skiriamas antocianinų poveikiui širdžiai. Epidemiologinėse studijose įrodyta, kad raudonojo vyno vartojimas yra naudingas apsaugai nuo širdies ir kraujagyslių ligų, šis efektas įgavo terminą „Prancūziškas parodoksas“ (Belleville, 2002). Manoma, kad pagrindinė apsauginio poveikio priežastis yra polifenoliniai junginiai, įskaitant ir antocianinus, kurių yra gausu
raudonajame vyne, ir kurie pasižymi stipriu antioksidaciniu veikimu (Belleville, 2002; Sun et al., 2002). Nustatyta, kad polifenoliniai junginiai tiesiogiai suriša laisvuosius radikalus ir sumažina mažo tankio lipoproteinių kiekį plazmoje, o tai yra svarbu širdies ir kraujagyslių ligų patogenezėje. Kitose epidemiologinėse studijose teigiama (Kuriyama, 2008; Hsieh et al., 2009), kad žaliosios arbatos vartojimas yra taip pat susijęs su sumažėjusia mirčių nuo širdies ir kraujagyslių ligų rizika. Atliktos eksperimentinės studijos įrodė, kad žaliojoje arbatoje esantys polifenoliniai junginiai turi kardioprotekcinį veikimą, nes pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, taip pat padidina vazodiliatatoriaus NO produkciją ir turi teigiamą inotropinį veikimą, kuris pasiekiamas per Na+/H+ ir Na+/Ca2+ nešiklių aktyvaciją (Hsieh et al.,2009; Lorenz et al., 2008). In vivo tyrimuose, kuriuose dalyvavo pre- ir pomenopauzinio laikotarpio moterys buvo įrodyta, kad vynuogėse esantys polifenoliniai junginiai turi kardioprotekcinį poveikį, nes efektyviai sumažina lipidų kiekį plazmoje ir oksidacinį stresą (Zern et al., 2005). Viename tyrime įrodyta, kad ilgalaikė antocianinų dieta žiurkėms sąlygojo mažesnį miokardo jautrumą išemijai-reperfuzijai tiek in-vivo, tiek ex-vivo bandymuose. Yra manoma, kad šis apsauginis mechanizmas susijęs su širdies endogeninių antioksidantų moduliacija (Berthonneche et al., 2007; Toufektsian et al., 2008). Polifenolinių junginių teigiamas terapinis efektas gydant širdies ir kraujagyslių ligas yra siejamas ne tik tai su jų oksidacinėmis-redukcinėmis savybėmis, bet ir su gebėjimu mažinti trombocitų hiper-reaktyvumą bei jų agregaciją, arterijų pažaidą, uždegimo mediatorių ir mažo tankio lipoproteinų gamybą, taip pat su gebėjimu padidinti kraujagysles plečiančių faktorių gamybą ir taip sumažinti sistolinį kraujo spaudimą (de Pascual-Teresa et al., 2000; Urpi-Sarda et al., 2009).
1.1.3. Antocianinų absorbcija ir metabolizmas
Pastaruoju metu vis daugiau ir daugiau straipsnių yra publikuojama apie antocianinų metabolizmą ir absorbciją organizme, tačiau šie keliai vis dar išlieka pakankamai painūs. Vis dėl to, norint suprasti antocianinų biologines savybes ir jų vaidmenį ligų gydyme ar prevencijoje, pirmiausia reikia išsiaiškinti jų pasiskirtymo organizme kelius. Daugelis tyrimų, kuriuose minima antocianinų absorbcija ir metabolizmas žmogaus ir eksperimentinių gyvūnėlių organizmuose, buvo atlikti naudojant vaisių ekstraktus, kaip antocianinų šaltinį.
Pradžioje buvo manoma, kad tik antocianinų aglikonai yra absorbuojami plonojo žarnyno ląstelių ir taip patenka į kraujo plazmą, tačiau keletas studijų pateikė duomenis apie antocianinų ir antocianidinų buvimą žmogaus ir žiurkės plazmoje po suvartojimo per os, todėl buvo susidomėta ir kitais galimais jų
absorbcijos mechanizmais (Tsuda et al., 1999; Cao et al., 2001; Galvano et al., 2003). Matuojant antocianinų koncentracijos lygį žiurkės kraujo plazmoje, po to, kai žiurkėms buvo sugirdyta vaivoro uogų ekstrakto per os, nustatyta, kad Cy glikozidai patenka į kraujo plazmą iš virškinamojo trakto visai nepakitę (Talavera et al., 2004, 2006). Antocianinų absorbcija įvyksta labai greitai po jų suvartojimo. Jų biopraeinamumas tirtas keliose skirtingose eksperimentinių gyvūnėlių ir žmonių farmokokinetinėse studijose, parodant, kad antocianinų maksimali koncentracija kraujo plazmoje yra pasiekiama po 15 – 60 min nuo jų suvartojimo. Tačiau, kada antocianinai yra vartojami su kitais maisto produktais, ypač su produktais, turinčiais daug riebalų, kurie stabdo skrandžio išsituštinimą, antocianinų pikas gali būti pasiekiamas ir po 4 - 6 valandų (Mazza et al., 2002; Norton et al., 2005; Mullen et al., 2008; Kalea et al., 2009). Manoma, kad greita jų absorbcija gali priklausyti nuo specifinių fermentų, tokių kaip bilitranslokazė. O taip pat absorbcija priklauso ir nuo maisto terpės (Passamonti et al., 2003). Lyginant antocianinus su kitais flavonoidais, jų absorbcijos ir ekskrecijos į šlapimą proporcijas, pastebima, kad antocianinų procentas šlapime yra labai mažas, apie <0,1% nuo suvartotos dozės. Maksimali antocianinų plazmos koncentracija žmogaus organizme svyruoja nuo 1 iki 100 nmol/l suvartojus 0,7-10,9 mg/kg dozės (Prior RL., 2003; Kurilich et al., 2005). Jų pasišalinimas iš kraujo plazmos yra taip pat labai greitas ir jau po 4 – 6 h plazmoje nerandama antocianinų arba jų kiekiai labai minimalūs (Cao et al., 2001). Tyrimuose, kuriuose naudoti antocianinų standartai, buvo palygintos antocianinų absorbcijos savybės ir nustatyta, kad greičiausiai absorbuojamas buvo Dp, o toliau sekė: Cy > Pt = Pn > Mv. Tai įrodo, kad antocianinų absorbcija ir metabolizmas skiriasi priklausomai nuo B žiedo struktūros, t.y. prie B žiedo prisijungusių radikalų (Ichiyanagi et al., 2006).
Manoma, kad yra keli pagrindiniai antocianinų absorbcijos mechanizmai. Visų pirma, jie gali būti absorbuojami plonajame žarnyne kaip glikozidai aktyviosios pernašos būdu, dalyvaujant nuo natrio jonų priklausomam gliukozės nešikliui, bet absorbciją šiuo būdu lemia cheminė struktūra (prie B žiedo prisijungusių hidroksilo ir metilo grupių skaičius bei prie aglikono prisijungusių angliavandenių molekulių rūšis bei skaičius). Kadangi kraujyje aptinkama nemaži kiekiai nepakitusių antocianinų glikozidų, manoma, kad jie į plazmą patenka ir organinių anijonų nešiklio – bilitranslokazės pagalba (Passamonti et al., 2003). Antocianinai yra stabilūs rūgščioje skrandžio aplinkoje, o tai paaiškina jų tiesioginę absorbciją per skrandžio gleivinę į kraują ir greitą, bet trumpalaikį jų koncentracijos padidėjimą serume. Ilgai buvo manoma, kad tiktai antocianidinai gali būti absorbuojami žarnų ląstelėse (nes jie sugeba pereiti per žarnų sienelę) ir taip patenka į kraujotaką, kur nėra aptinkama jų cukrinės dalies. Anksčiau nebuvo žinoma jokių fermentų, kurie galėtų specifiškai hidrolizuoti glikozidines jungtis, todėl buvo manoma, kad antocianinai
yra prastai absorbuojami. Ši nuomonė pakito, kai daugelio tyrimų rezultatai įrodė, jog glikozidiniai flavonoidai, ypatingai Cy-3-G ir kiti cianidino glikozidai, buvo absorbuoti in vivo (Passamonti et al., 2002; Ichiyanagi et al., 2006). Todėl dar vienas iš galimų mechanizmų yra pasyvus aglikonų perėjimas per membranas žarnyne, po cukrinės dalies atskilimo. Nepakitę antocianinai yra per daug hidrofiliški absorbcijai per plonajį žarnyną (Holman, 2004), todėl jie yra hidrolizuojami fermentų (pvz., laktazės floridzino hidrolazės, LPH) arba žarnyno mikrofloros prieš absorbciją (Wu et al., 2002; Passamonti et al., 2002). Dviejuose tyrimuose, atliktuose su žiurkėmis, taip pat pateikta, kad Cy-3-G yra dalinai hidrolizuojamas (hidrolizės reakcijoje dalyvaujant žarnyno bakterijų β-glikozidazei) plonajame žarnyne ir tai galėtų paaiškinti, kodėl dalis aglikonų yra randama ir tuščiojoje žarnoje (Tsuda et al., 1999).
Tiriant antocianinų pasiskirstymą po jų suvartojimo praėjus 4 h jie aptinkami dvylikapirštėje, klubinėje, gaubtinėje ir aklojoje žarnose (Wu et al., 2006). O įvedus juos per skrandį jau per kelias minutes vynuogių antocianinai pasiekia smegenis (Passamonti et al., 2005). Randami gliukuronil-, metil-, ir sulfokonjungatai kepenyse, inkstuose, žarnyne yra siejami su antocianinų metabolizmu (Tsuda et al., 1999; He et al., 2006). Žarnyno mikroflora metabolizuoja antocianinus į fenolines rūgštis ir aldehidus (Forester & Waterhouse, 2010). Manoma, kad antocianinai, kurie nebuvo absorbuoti, gali būti skaidomi gaubtinėje žarnoje. O absorbuoti antocianinai su tulžimi taip pat gali būti išskiriami į gaubtinę žarną, kur jie metabolizuojami žarnyno mikrofloros iki fenolinių junginių, hidrolizės ir demetilinimo reakcijų pagalba. Pagrindiniai antocianinų metabolitai randami šlapime yra gliukuronil- ir metil- konjungatai bei antocianidinai (aglikonai). Sulfokonjungatų randami labai maži kiekiai. Teigiama, kad kepenys yra pagrindinis organas, kur vyksta gliukuronizacija ir metilinimas. Metilintos antocianinų formos didžiausiomis koncentracijomis yra aptinkamos kepenyse. Vėliau metilinti antocianinai gali būti sekretuojami į tulžį, nes kraujo plazmoje randama labai maži jų kiekiai. Inkstuose irgi aptinkami metil- ir glukuronil- kojungatai, todėl manoma, kad konjungacija yra vienas pagrindinių antocianinų metabolizmo kelių (Wu et al., 2002).
1.2. Mitochondrijų struktūra ir jų funkcijos
Mitochondrijos yra ląstelės organelės, kurios turi savo DNR ir yra atskirtos nuo citozolio dviguba membrana (Chen & Butow, 2005). Mitochondrijų kiekis įvairiose ląstelėse skiriasi, kaip ir jų išvaizda, išsidėstymas bei pasiskirstymas. Buvo nustatyta, kad mitochondrijų daugiausia yra tose audinių ląstelėse, kur intensyviausiai vyksta fiziologiniai ir biocheminiai procesai. Pavyzdžiui, širdies raumens
ląstelėse, kur vyksta intensyvus nepertraukiamas mechaninis darbas, mitochondrijos sudaro 30-38% viso miocito tūrio (Moncada, 2010). Širdies raumens mitochondrijos skiriasi nuo kitų organų mitochondrijų, nes turi labai didelį vidinės membranos paviršių. Tai susiję su dideliu šių organelių aktyvumu aprūpinant širdies raumenį dideliu energijos kiekiu, kuris būtinas jo susitraukimui atlikti.
Išorinė mitochondrijų membrana yra pralaidi tik mažoms, neigiamai įkrautoms molekulėms, kaip nukleotidams ir fosforilintiems junginiams, nes membranos sudėtyje, be lipidų yra ir baltymo porino, kuris suformuoja kanalus. Vidinė mitchondrijų membrana yra nelaidi jonams, kaip H+, OH-, K+ ir kitiems hidrofiliniams metabolitams, tačiau joje yra išsidėščiusios specifinės nešiklių sistemos, pvz., adenino nukleotidų nešiklis, kurios dalyvauja pernešant įvairius junginius į mitochondriją (Chan, 2006; McBride et al., 2006). Mitochondrijų užpildas yra vadinimas matriksu, kuriame yra riebalų rūgščių oksidacijos fermentai, Krebso ciklo fermentai, piruvato dehidrogenazė ir kitos svarbios sistemos.
4 pav. Mitochondrijos pagrindinė struktūra. Mitochondrija turi dvi membranas – išorinę ir vidinę (vidinės membranos paviršius labai didelis ir ji sudaro vadonamąsias kristas (užlinkimus)), tarp
membranų yra tarpmembraninė erdvė, o vidinis mitochondrijos užpildas vadinamas matriksu.
Labiausiai mitochondrijos yra žinomos dėl pagrindinės funkcijos žinduolių ląstelėse - ATP (energijos) sintezės, kuri vyksta oksidacinio fosforilinimo metu. Oksidacinis fosforilinimas – tai eilė cheminių reakcijų, kurių metu vyksta įvairių substratų oksidacija ir atsipalaiduoja energija, kuri transformuojama į ATP. Vidinėje mitochondrijų membranoje be nešiklių yra išsidėščiusi ir mitochondrijų kvėpavimo grandinė, kurią sudaro keturi kompleksai (I – NADH dehidrogenazė, II - sukcinato dehidrogenazė, III - kofermento Q-citochormo c oksireduktazė, IV - citochromo c oksidazė) ir ATP sintazė, kuri kartais vadinama penktu kompleksu (5 pav.) (Moncada, 2010; Lenaz, 2012). Kiekvienas
kompleksas susideda iš kelių baltyminių komponentų, kurie asocijuoti prostetinėmis grupėmis ir turi didėjantį standartinį redukcijos potencialą. Tai sudaro sąlygas elektronų perdavimui iš trikarboninių rūgščių ciklo donorų per atitinkamus kvėpavimo grandinės kompleksus iki galutinio elektronų akceptoriaus - deguonies. Vykstant elektronų perdavimui tuo pat metu iš I, III ir IV kompleksų yra išmetami protonai į tarpmembraninę erdvę. Vidinės membranos nelaidumas protonams lemia elektrocheminio protonų gradiento susidarymą, kuris naudojama ADP fosforilinimui iki ATP.
5 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės struktūra. Kvėpavimo grandinė sudaryta iš 4 pagrindinių kompleksų (I – NADH dehidrogenazė, II - sukcinato dehidrogenazė, III - kofermento
Q-citochormo c oksiredutkazė, IV - citochromo c oksidazė) ir ATP sintazės (dar vadinamos 5 kompleksu)
Oksidacinis fosforilinimas yra dviejų procesų – substratų oksidacijos ir ADP fosforilinimo junginys. Kad šie procesai vyktų yra reikalingi kvėpavimo substratai, kuriais gali būti piruvatas, malatas, gliutamatas, sukcinatas ar kitas Krebso ciklo tarpinis metabolitas, kurio oksidacijos metu susidaro redukuoti kofermentai (NADH ir FADH2) ir ADP. Registruojant mitochondrijų kvėpavimą in vitro šiuos
procesus galima vertinti ir atskirai. Kai į mitochondrijų kvėpavimo terpę pridedami kvėpavimo substratai, jie yra oksiduojami susidarant redukuotiems kofermentams NADH ir FADH2, tai vadinama antrąja
mitochondrijų kvėpavimo būsena, kai yra registruojamas pradinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0).
Vėliau į terpę pridėjus ATP sintazės substrato ADP, panaudojant elektrocheminio protonų gradiento energiją, ATP sintazė sintetina ATP ir ši būsena vadinama trečiąja metaboline būsena ir jos metu mitochondrijos kvėpuoja didžiausiu greičiu (VADP, V3). Kai yra sunaudojamos visos ADP atsargos arba
Matriksas Tarpmembraninė erdvė
I kompleksas II kompleksas III kompleksas IV kompleksas
adenino nukleotidų nešiklis nuslopinamas atraktilozidu, susidaro ketvirtoji metabolinė būsena, kartais dar vadinama ramybės. Mitochondrijos išorinės membranos intaktiškumui įvertinti yra atliekamas citochromo
c testas: mitochondrijoms perėjus į ketvirtą metabolinę būseną, į matavimo terpę yra pridedama
egzogeninio citochromo c (Toleikis et al., 2005).
Kitos svarbios mitochondrijų funkcijos yra termogenezė, hemo biosintezė, lipidų katabolizmas, kalcio jonų homeostazė. Pastaraisiais metais vėl išaugo susidomėjimas mitochondrijų funkcijomis ir jau žinoma, kad šios organelės dalyvauja ląstelės mirties reguliaciniuose procesuose (pvz., programuota ląstelių mirtis – apoptozė) skirtingais lygiais: citozolinio kalcio jonų homeostazėje, reaktyvių deguonies ir azotų formų generacijoje, mitochondrinės membranos pralaidumo padidinime ir pro-apoptotinių baltymų paleidime, apoptosomos formavimosi reguliavime ir kaspazių aktyvavime, redukuojant citozolinį citochromą c (Brown, 2007; Pinton et al., 2008; Borutaite, 2010).
1.3. Išemija ir jos įtaka mitochondrijų funkcijai ir struktūrai
Miokardo išemija – tai kraujo sumažėjimas organe arba jo dalyje dėl nepakankamo pritekėjimo arterijomis, dėl ko ima trūkti deguonies, substratų bei nepašalinami ląstelės metabolizmo produktai (Jennings et al., 1969). Išemija gali atsirasti sumažėjus arteriniam kraujospūdžiui ar dėl deguonies nepakankamumo kraujyje (santykinė išemija), taip pat dėl arterijų spindžio susiaurėjimo, dėl dalinio arba visiško jų užsikimšimo: susidarius krešuliui (trombui) ar kraujo srovės atneštam dujų burbului, stambesnėms dalelėms (embolija). Priklausomai nuo pažeistos organo dalies dydžio išemija gali būti totalinė, globalinė ir regioninė.
Širdies ląstelėse vykstant išemijai vystosi įvairūs struktūriniai ir funkciniai pakitimai, pvz., ilgą laiką negaunant deguonies ir reikalingų maisto medžiagų, prasideda ląstelių nekrozė. Manoma, kad vienas iš svarbiausių faktorių, kuris lemia miocitų pažaidos lygį, yra ATP kiekis ląstelėje (Pollard, 2002). Kadangi didžiausias kiekis ATP (apie 80-90%) susidaro mitochondrijose oksidacinio forforilinimo metu, o ATP kiekis priklauso nuo arteriniame kraujyje esančio deguonies kiekio, tai sumažėjus deguonies kiekiui, lygiagrečiai mažėja ir ATP koncentracija. Sumažėjus oksidacinio forforilinimo greičiui yra stebimas sistemos pažeidimas, kuris apima išorinės membranos pažeidimus, padidėjusį vidinės membranos pralaidumą jonams, sumažėjusį dehidrogenazių aktyvumą, kvėpavimo grandinės ir ATP-sintazių pažeidimą. Jau po 5 min nuo miokardo išemijos pradžios, ATP kiekis širdies ląstelėse sumažėja 25%, po 15 min – 35%, o po 60 min – 94%. Nustatyta, kad išemijos metu padidėja vidinės mitochondrijų
membranos pralaidumas, dėl to sumažėja membraninis potencialas ir lėtėja substratų oksidacijos greitis bei ATP-sintazės aktyvumas. Oksidacinio fosforilinimo nuslopinimą gali sąlygoti ir mitochondrijų kvėpavimo grandinės bei Krebso ciklo fermentų aktyvumo ir kiekio sumažėjimas, adenino nukleotidų nešiklio pažeidimai (Toleikis et al., 1989; Di Lisa & Bernardi, 2006).
15 min. Glikolizė ↑ 60 min. Glikolizė lėtėja ir sustoja ↓ Laktatas ↑ ADP ↓
Glikogenas ↓ AMP ↑
IŠEMIJA ATP ↓ ATP ↓
ADP ↓ mitochondriju brinkimas
CP ↓ Bendras adeninnukleotidų kiekis ↓ AMP ↑
Bendras adenino nukleotidų kiekis ↓
GRĮŽTAMI PAŽEIDIMAI NEGRĮŽTAMI PAŽEIDIMAI
6 pav. Išemijos pažaidos šuns miokarde po 15 ir 60 min (adaptuota iš Jennings et al., 1981) Glikolizės procesas ląstelėje prasideda pirmosiomis išemijos minutėmis. Dėl to, audinyje mažėja glikogeno kiekis, ima kauptis laktatas, kaupiasi adenozino 5‘- monofosfatas (AMP) (6 pav.). Terpės parūgštėjimas bei laktato koncentracijos išaugimas greitai nuslopina glikolizės fermentus. Po 15 min išemijos bendras nukleotidų kiekis sumažėja 55 %. Kreatino fosfato kiekis (CP) po 10 min išemijos sumažėja 10 % (6 pav.). Po 60 min išemijos netenkama apie 69 % bendro nukleotidų kiekio, pastebimi mitochondrijų membranos pažeidimai, žymiai mažėja DNR bei baltymų sintezės greitis (Di Lisa & Bernardi, 2006).
Išemijos sąlygomis kinta oksidacinio fosforilinimo aktyvumas. Jį galima įvertinti matuojant mitochondrijų kvėpavimo greitį. Eksperimentiniai duomenys rodo, kad mitochondrijose jautriausias išemijai funkcinis parametras yra oksidacinio fosforilinimo greitis (Toleikis et al., 1989). Šio greičio sumažėjimas rodo oksidacinio fosforilinimo sistemos pažeidimą, apimant išorinės membranos pažeidimus, padidėjusį vidinės membranos pralaidumą jonams, sumažėjusį dehidrogenazių aktyvumą, kvėpavimo grandinės bei ATP-sintazių pažeidimą. Parodyta, kad ilgėjant išemijos laikui, didėja piridino nukleotidų, flavino nukleotidų netekimas. Taip pat stebimas adenino nukleotidų nešiklio aktyvumo sumažėjimas. Nustatyti ir mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų pažeidimai: mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, esant substratui glutamatui + malatui ar piruvatui + malatui, išemijos metu mažėja (Toleikis et al., 1989).
Vertinant išemijos įtaką mitochondrijų kvėpavimo grandinės fermentų aktyvumui, manoma, kad mitochondrijų kvėpavimo grandinės I kompleksas (NADH dehidrogenazė) yra labiausiai pažeidžiamas esant deguonies trūkumo sąlygoms. Priežastys, dėl ko mažėja I komplekso aktyvumas – tai gali būti dėl nekovalentiškai prijungto flavino mononukleotido disociacijos, užpildo (matrikso) pH sumažėjimo ar vidinės mitochondrijų membranos pažeidimų, specifinio vidinės mitochondrijų membranos fosfolipido - kardiolipino kiekio sumažėjimo dėl ROS. Dar kiti mokslininkai mano, kad NO gali būti tas veiksnys, kuris sumažina I komplekso aktyvumą (Jakabsone et al., 2003). Mažesniu laipsniu išemija veikia kitus kvėpavimo grandinės kompleksus: 24% sumažėja II komplekso aktyvumas, 9–14% III komplekso, ir 9– 13% IV komplekso aktyvumai (Toleikis et al., 1989; Lebuffe et al., 2003). Citochromo oksidazės aktyvumo sumažėjimas siejamas su tiesioginiu komplekso pažeidimu arba su citochromo c netekimu. Spektrofotometriškai buvo nustatyta, kad po 30 min totalinės išemijos citochromo c kiekis širdies mitochondrijose sumažėja 25%, o po 60 min - apie 60% (Toleikis et al., 1989; Wang et al., 2006). Intaktiška išorinė mitochondrijų membrana yra nepralaidi citochromui c, todėl citochromo c išėjimas iš mitochondrijų išemijos metu siejamas su išorinės membranos pažaidomis. Miokardo išemijos metu dėl suaktyvėjusių mitochondrinių fosfolipazių intensyviai vyksta hidrolizė, tuomet susidaro fosfolipidų skilimo produktai, kurie veikia kaip skyrikliai ir padidina mitochondrijų membranos laidumą bei citochromo c išėjimą.
Jau yra atlikta nemažai mokslinių tyrimų, kur tyrinėtas polifenolinių junginių apsauginis poveikis nuo išemijos sukeliamų funkcinių ir struktūrinių pažeidimų. Manoma, kad šis poveikis yra susijęs su antioksidacinėmis, kraujagysles atpalaiduojančiomis ir prieuždeginėmis savybėmis bei antiagregaciniu efektu (Sener et al., 2005; Alhlaghi & Bandy, 2009). Yra ir duomenų, kad flavonoidiniams junginiams patekus į organizmą per os, jie taip pat apsaugo širdį nuo išeminių pažeidimų (Modum et al., 2003; Ikilzer et al., 2007). Vis dėl to, tikslaus apsauginio antocianinų mechanizmo vis dar nėra nustatyta, yra tik keli straipsniai kur tirtas Dp ir kitų flavonoidų kardioprotekcinis poveikis, esant širdies išemijos/reperfuzijos pažeidimams, bet tirtas apsauginis mechanizmas nesusijęs su jų antioksidacinėmis savybėmis (Alhlaghi & Bandy, 2009).
1.4
Apoptozė ir mitochondrijos
Išemijos poveikyje vystosi ląstelių pažaidos, sukeliančios ląstelių žūtį. Išeminiame miokarde ląstelės žūsta nekrozės ir apoptozės keliais. Nekrozės metu aktyvuojasi degradacinius procesus
sąlygojantys fermentai, ląstelės brinksta, sutrūkinėja jų membranos, o išsiliejęs turinys pažeidžia gretimas ląsteles. Apoptozė, arba programuota ląstelių mirtis, yra ląstelės savęs sunaikinimo mechanizmas, kuris yra svarbus keletai biologinių procesų, tokių, kaip augimo reguliacija, audinių homeostazė ir nereikalingų ląstelių pašalinimas. Sutrikus apoptozei, gali pasireikšti keletas ligų: nepakankama apoptozė gali būti susijusi su vėžio, imuninių ligų vystimusi, o per intesyvi apoptozė gali lemti neurodegeneracines, širdies ir kraujagyslių sistemos bei kitas ligas (Meier, 2000; Zuzarte-luis, 2002). Daugelio šių ir kitų ligų gydymas galėtų būti grindžiamas apoptozės aktyvinimu arba slopinimu, todėl racionalių gydymo metodų paieškos skatina toliau tyrinėti apoptozės mechanizmus. Yra žinoma, kad mitochondrijos vaidina svarbų vaidmenį apoptotinių procesų kaskadoje, o kardiomiocitai pasižymi tuo, kad mitochondrijų kiekis juose pats didžiausias lyginant su kitų tipų ląstelėmis (Cerveny et al., 2007; Jeong & Seol, 2008). Mitochondrijų tarpmembraninėje erdvėje ir išorinėje membranoje atrasta baltymų, kurie gali aktyvuoti arba slopinti apoptozę. Citochromas c, gerai žinomas kaip nedidelis baltymas silpna elektrostatine jungtimi susirišęs su mitochondrijų kvėpavimo gradine, dalyvaujantis elektronų pernešime tarp citochromo c reduktazės ir citochromo c oksidazės, yra taip pat ir specifinis apoptozės aktyvatorius (Garrido et al., 2006; Ow et al., 2008). Citochromas c iš mitochondrijų tarpmembraninės erdvės patekęs į citoplazmą jungiasi su baltymu Apaf-1 (angl. Apoptosis protease-activating factor 1), ir sukelia oligomerizaciją, šiam procesui yra reikalinga energija. Susidarę oligomerai yra gimingi prokaspazei 9, todėl su ja sudaro apoptosomą ir susidaro sudėtingas, daugiamolekulinis kompleksas. Apoptosoma aktyvuoja kaspazę 3, kuri paleidžia tolimesnę kaspazių kaskadą (Michael, 2000; Jeong & Seol, 2008). Kaspazės yra dar vadinamos aspartatui specifinėmis cisteino proteazėmis, o tai reiškia, kad kaspazės yra proteazės, turinčios cisteino aktyviajame centre ir ardančios baltymuose esančias peptidines jungtis, kurias sudaro aspartato karboksilo grupė. Kuomet kaspazės pradeda veikti, atsiranda ląstelių struktūros pokyčių, būdingų apoptozei, todėl jos ir vadinamos pagrindinėmis apoptozės vykdytojomis.
Citochromo c išėjimas iš mitochondrijų yra laikomas vienu iš ankstyviausiųjų negrįžtamų procesų apoptozėje. Citochromas c gali egzistuoti redukuotoje arba oksiduotoje formoje. Ilgą laiką buvo manoma, kad citochromo c redokso būsena nėra svarbi apoptosomos funkcionavimui. Sveikose ląstelėse citozolinis citochromas c yra greitai redukuojamas įvairių fermentų arba reduktorių ir taip gali blokuoti apoptozę. Tačiau apoptotinėse ląstelėse citozolinis citochromas c yra staigiai oksiduojamas citochromo oksidazės, kuomet mitochondrijų išorinė membrana yra pažeista. Taigi, yra žinoma, kad apoptosomos susidaryme labiau linkęs dalyvauti oksiduotos formos citochromas c (Borutaite, 2010; Borutaite & Brown, 2007; Hancock et al., 2001). Paremiant šį teiginį, yra atlikta keletas tyrimų, įrodančių, kad oksiduotas
citochromas c greitai aktyvuoja kaspazę 9 ir kaspazę 3 citozolyje, o tuo tarpu ditiotreitoliu, N- acetil-cisteinu arba gliutationu redukuotas citochromas c buvo visiškai neaktyvūs (Hancock et al., 2001; Suto et al., 2005). Todėl vienas iš mūsų tyrimų tikslų buvo ištirti, antocianinų standartų gebėjimą redukuoti citochromą c ir jų galimą priešapoptozinį veikimą (7 pav.). Buvo iškelta hipotezė, kad antocianinai gali redukuoti iš išorės pridedamą arba po išemijos pažeidimo iš mitochondrijų į citozolį patenkantį citochromą c. O redukuotas citochromas c gali blokuoti apoptozės kaskados aktyvaciją.
7 pav. Antocianinų vaidmuo apoptozės kelyje (adaptuota iš Borutaite, 2010). COX – citrochromo
2. METODIKA
2.1. Eksperimentiniai gyvūnai
Eksperimentams atlikti buvo naudojamos 2 - 4 mėnesių, suaugę Wistar žiurkių patelės. Žiurkės buvo užmigdomos anglies dioksido dujomis ir nutraukiamas stuburo kanalas kaklo srityje (leidimo, atlikti laboratorinius bandymus su gyvūnais, Nr. 0217).
2.2. Reagentai
Delfinidino-3-O-, cianidino-3-O-, pelargonidino-3-O-, peonidino-3-O- ir malvidino-3-O- gliukozidai buvo iš Extrasynthese firmos (Prancūzija). Visi kiti darbe naudoti reagentai, jeigu nenurodyta kitaip, buvo iš Sigma-Aldrich firmos.
2.3. Mitochondrijų išskyrimas
Širdies mitochondrijų išskyrimas. Mitochondrijos buvo izoliuotos diferencinio centrifugavimo metodu (Scholte et al., 1973). Širdis, kontrolinė arba po išemijos, buvo praplaunama 0,9% 1-2ºC temperatūros KCl tirpalu, audinys susmulkinamas žirklutėmis ant ledų padėtoje Petri lėkštelėje ir homogenizuojama mechaniniu homogenizatoriumi (stiklas/teflonas) užpilant 10 ml/g homogenizavimo terpės (250 mM sacharozės, 5 mM HEPES, 2 mM EGTA, pH 7,3 4ºC). Centrifuguojama 750xg 5 min, po to supernatantas buvo perpilamas per dvigubą marlinį filtrą, nenupilant nuosėdų ir paskutinių supernatanto lašų, ir vėl centrifuguojamas 6800xg 10 min. Širdies mitochondrijos buvo suspenduojamos suspendavimo terpėje (180 mM KCl, 20 mM Tris/HCl, 7,3 2ºC). Mitochondrijų suspensija (~50 mg/ml baltymo) buvo laikoma leduose viso eksperimento metu.
2.4. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu
Baltymo kiekis mitochondrijų suspensijoje nustatytas modifikuotu biureto metodu (Gornal et al., 1949). Į 0,05 ml mitochondrijų suspensijos įpilama 0,95 ml 0,33% dezoksicholato tirpalo, gerai sumaišoma ir 5 min inkubuojama vandens termostate 37ºC temperatūroje. Po to įpilama 4 ml biureto reagento, sumaišoma ir inkubuojama vandens termostate 37ºC, 15 min. Gauto tirpalo optinis tankis matuojamas spektrofotometru Helios α (Thermo Electron, Anglija) 536 nm ilgio bangoje. Baltymo kiekis
nustatomas pagal kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti naudojamas standartinis jaučio serumo albumino tirpalas.
2.5. Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas
Atvėrus žiurkės krūtinės ląstą, kraujo krešėjimui sustabdyti, į kairįjį širdies skilvelį buvo suleidžiamas 1 ml (5000 aktyvumo vienetų/ml, 37ºC) injekcijoms skirto heparino tirpalo. Tuomet buvo nukerpamos širdies kraujagyslės bei pasaitai ir širdis perkeliama į termostatuojamą (37ºC), pusiau uždarą kamerą. Į aortą buvo įstatoma plastikinė kaniulė, prijungta prie Langendorfo tipo širdies perfuzijos sistemos. Perfuzijai buvo naudojamas Krebs-Henseleit tirpalas, kurio sudėtis: 11 mM gliukozės, 118 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM CaCl2, 1,6 mM MgSO4, ir 0,7 mM
Na-piruvato (prisotintas 95 proc. O2 ir 5 proc. CO2, pH 7,4 37ºC), esant 80 cm H2O spaudimui. Po 10 min
nusistovėjimo periodo, papildomai pridedant tyrimui naudojamų 20 µM ar 40 µM antocianinų (Cy-3-G arba Pg-3-G) buvo perfuzuojama dar 15 min. Srauto tekėjimo greitis – 20-25 ml/min. Tais atvejais, kai po širdies perfuzijos buvo sukeliama išemija (autolizė), tirpalo tekėjimas buvo sustabdomas ir širdis laikoma uždaroje drėgnoje termostatuojamoje kameroje 45 min. Kontrolinės širdys buvo perfuzuojamos tokį patį laiko tarpą į terpę nepridedant antocianinų. Prieš izoliuojant mitochondrijas širdis kelias minutes buvo palaikoma 0,9 % 2 - 4 ºC KCl tirpale, kad nustotų susitraukinėti, sulėtėtų metabolizmas bei nevyktų autolizės procesai.
2.6. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas
Mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo registruojamas, naudojant oksigrafinę sistemą Oxygraph-2k (OROBOROS Instruments, Innsbruck, Austria). Mitochondrijų kvėpavimo matavimai buvo atliekami inkubacinėje terpėje (0,5 mM EGTA,3 mM MgCl2, 60 mM kalio laktobionato, 20 mM taurino, 10 mM
KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozės (pH 7,1 37ºC), pridedant 1 mM piruvato ir 1 mM malato,
kaip kvėpavimo substratų. Matavimai atlikti 37ºC temperatūroje. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje buvo pasiekiamas į kiuvetę pridedant 1 mM ADP (V3). Citochromo c efektas
(gebėjimas aktyvuoti 140 µM atraktilozido nuslopintą mitochondrijų kvėpavimą) buvo nustatytas į kiuvetę įdedant 32 µM citochromo c. Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreiškiamas pmol O/s-1/mg-1 mitochondrijų baltymo. Galutinė mitochondrijų baltymo koncentracija buvo 0,125 mg/ml.
2.7. Citochromo c redukcijos nustatymas
Citochromo c redukcija buvo matuojama spektrofotometriškai, naudojant Helios (Thermo Electron, Anglija) spektrofotometrą. Absorbcijos spektrai buvo gaunami, matuojant 500 nm – 600 nm bangos ilgių ribose, o citochromo c redukcijos maksimumas buvo stebimas 550 nm bangos ilgyje. Skirtingų antocianinų spektrai buvo registruojami 1 ml terpėje, kuri susideda iš 0,5 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM kalio laktobionato, 20 mM taurino, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozės
(pH 7,1). Citochromo c redukcijos spektrai matuoti pirmąją minutę, po 3 ir 6 min. Matavimai atlikti 25ºC temperatūroje. Palyginimui buvo matuota egzogeninio citochromo c redukcija. 32 µM citochromo c buvo pridedama į tą patį buferinį tirpalą ir citochromo c spektras matuotas kas minutę 500 - 600 nm bangos ilgių ribose. Citochromo c redukcijos lygis nustatytas pagal absorbcijos padidėjimą 550 nm (redukuoto citochromo c maksimumas) bangoje lyginant su visiškai redukuoto citochromo c absorbcijos lygiu 550 nm pridėjus kelis kristalus ditionito. Ditionitu redukuoto citochromo c absorbcijos maksimumas buvo prilygintas 100% redukuoto citochromo c.
2.8. Kaspazės 3 aktyvumo matavimas
Mitchondrijų išskyrimo metu (3.2. skr.) po antro centrifugavimo surinkta citozolinė frakcija ir įvertintas kaspazės 3 aktyvumas. Naudota 1 mg/ml citozolinio baltymo, kuris 60 min inkubuotas buferiniame tirpale, susidedančiame iš 250 mM sacharozės, 5 mM HEPES, 2 mM EGTA (pH 7,3, 37ºC) ir 0,1 mM substrato Acetil–Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metilkumarino (DEVD). Kaspazės hidrolizė buvo matuojama fluorimetriškai naudojant “Thermo Scientific platereader” fluoritmetrą (Anglija); sužadinimas vyko prie 380 nm bangos ilgio, emisija – 460 nm. Substrato skilimo aktyvumas buvo visiškai nuslopintas naudojant grįžtamąjį kaspazės 3 slopiklį: 0,02 mM N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aldehido.
2.9. Mitochondrinio ir citozolinio citochromo c kiekio matavimas
Citochromo c kiekis mitochondrijose ir citozolinėje frakcijoje buvo nustatomas naudojant Quantikine žiurkės/pelės imunotyrimo ELISA rinkinį (R&D System). Citochromo c kiekio matavimui mitochondrijos buvo ištirpinamos 1 % Tritono X-100 tirpale ir kitos procedūros buvo atliekamos, kaip nurodyta gamintojo instrukcijose.
2.10. Statistinė duomenų analizė
Eksperimentinių duomenų, mažiausiai trijų nepriklausomų atvejų, vidurkiai pateikti su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis, statistiškai palyginti tarp eksperimentinių grupių naudojant grupinį Stjudento t-testą. Skirtumai tarp vidurkių laikomi statistiškai patikimi, jei reikšmė p <0,05. Statistinė analizė atlikta naudojant SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc.).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Anksčiau LSMU Neuromokslų institute atliktuose eksperimentiniuose tyrimuose (Liobikas et al., 2009), tiriant izoliuotų žiurkės širdies mitochondrijų funkcijas buvo pastebėta, kad kai kurie antocianinai (pvz., Dp-3-G) apie 60% padidina išoriniu citochromu c aktyvuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje (esant atraktilozidui ir pridėjus egzogeninio citochromo c) (8 pav.). Intaktiška išorinė mitochondrijų membrana nepralaidi citochromui c, todėl citochromo c išėjimas iš mitochondrijų gali būti susijęs su išorinės membranos pažaida. Tačiau buvo iškelta prielaida, kad šis padidėjimas gali būtų susijęs ne su išorinės mitochondrijų membranos pažeidimu, o su antocianinų sugebėjimu redukuoti citochromą c (Skemiene et al., 2010a).
Šiame darbe buvo siekiama nustatyti, ar įvairių antocianinų standartų tirpalai in vitro geba redukuoti egzogeninį citochromą c ir kokiu laipsniu. Spektrofotometriškai vertinta skirtingų koncentracijų antocianinų standartų tirpalų sugebėjimas redukuoti citochromą c laike. Taip pat buvo tiriamas antocianinų poveikis mitochondrijų funkcijoms, vertinant šių junginių efektus skirtingiems mitochondrijų kvėpavimų greičiams (V0, V3).
8 pav. Dp-3-G (20 µM kocentracijos) sukeltas 60% mitochondrijų kvėpavimo greičio padidėjimas ketvirtoje metabolinėje būsenoje (esant atraktilozido ir pridėjus egzogeninio citochromo c)
Kadangi antocianinai pasižymi stipriomis oksidacinėmis - redukcinės savybės, iškėlėme hipotezę, kad šie junginiai, keisdami citozolinio citochromo c redokso būseną, taip pat gali apsaugoti ląsteles ir nuo išeminių širdies pažeidimų. Širdies išemijos metu, sutrinka širdies aprūpinimas maisto medžiagomis, deguonimi, o tai labai stipriai paveikia jautrias širdies ląsteles, ypač ląstelių energijos apykaitą. Už energijos gamybą ląstelėse atsakingos mitochondrijos, kurios ir yra pažeidžiamos išemijos metu, t.y. dažniausiai pažeidžiama mitochondrijų išorinė membrana ir tuomet baltymas citochromas c lengvai išeina iš mitochondrijų į ląstelės citozolį, sukeldamas apoptozės kaskados aktyvaciją. Antocianinai gali būti natūralūs ir efektyvūs agentai, redukuojantys citochromą c ir taip apsaugantys nuo apoptozės kaskados aktyvacijos, t.y. apoptosomos susidarymo. Kaip jau minėta anksčiau, apoptosomos susidarymas inicijuojamas tada, kai oksiduotos formos citochromas c jungiasi su apaf-1 faktoriumi ir prokaspaze 9. Dėl šios priežasties tęsėme tyrimus ir siekėme nustatyti antocianinų biologinį aktyvumą, įvertinant jų poveikį mitochondrijų funkcijoms bei mitochondrijų tarpmembraninės ertmės baltymo citochromo c oksidacinei būsenai. Taip pat bandėme išsiaiškinti, ar antocianinai sugebėtų apsaugoti širdies miocitus nuo išemijos metu sukeltų mitochondrijų struktūrinių ir funkcinių pažeidimų, taip bandydami suprasti šių pigmentų kardiopotekcinį veikimą.
3.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų funkcijoms
3.1.1. Antocianinų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams
Norint ištirti tiesioginį antocianinų poveikį mitochondrijų funkcijoms, t.y. oksidacinio fosforilinimo sistemai, mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo matuojamas esant kelioms skirtingoms mitochondrijų metabolinėms būsenoms.
Remiantis 9 paveikslėlyje pateiktu mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo pavyzdžiu, pradinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0) buvo matuojamas į terpę be mitochondrijų pridedant ir
kvėpavimo substratų (piruvato ir malato). Tada į mitochondrijų kvėpavimo terpę pridedant antocianinų standartų (Dp-3-G, Cy-3-G, Pg-3-G) buvo matuojamas jų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams. Trečiosios metabolinės būsenos metu, mitochondrijų kvėpavimo greitis (V3) buvo pasiekimas pridedant
ADP. Vėliau, pridedant adenino nukleotidų nešiklio slopiklio atraktilozido, kvėpavimo greitis sumažėdavo beveik iki pradinio mitochondrijų kvėpavimo greičio (V0). Galiausiai, į terpę pridėjus
citochromo c buvo vertinamas citochromo c efektas.
9 pav. Izoliuotų širdies mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo pavyzdys. A linija – mitochondrijų kvėpavimo greitis; B linija – deguonies koncentracijos kitimo išvestinė, leidžianti įvertinti kvėpavimo
efektyvumą. Pradinis (V0) mitochodrijų kvėpavimo greitis (1) gaunamas į kiuvetę pridėjus 0,125mg
mitochondrijų ir 6 mM piruvato+6 mM malato. Vėliau pridedant priedus, užrašomas mitochondrijų kvėpavimo greitis skirtingose metabolinėse būsenose ( Cy3G – 40 µM Cy-3-G; ADP- 1 mM ADP; ATR –
140 µM atraktilozido; Cyt c – 32 µM citochromo ).
Kaip matome 10 paveikslėlyje, visi tirtieji antocianinai (Dp-3-G, Cy-3-G ir Pg-3-G), esant 20 µM koncentracijai, neturėjo poveikio nei mitochondrijų kvėpavimo greičiui (V0) antroje metabolinėje
A
B 1
būsenoje, nei mitochondrijų kvėpavimo greičiui (V3) (trečios metabolinės būsenos metu). Priešingai, 40
µM Dp-3-G padidino pradinį mitochondrijų kvėpavimo greitį (V0) net 53%±3%. Šis poveikis gali būti ir
dėl to, kad didesnės Dp-3-G koncentracijos pasižymi oksidacinį fosforilinimą atskiriančiuoju poveikiu (Pav.10B). 40 µM koncentracijos Cy-3-G ir Pg-3-G tirpalai neturėjo jokio efekto kvėpavimo greičiui (V0)
antroje metabolinėje būsenoje. Įdomu tai, kad kvėpavimo greičiai (V3) trečioje metabolinėje būsenoje
nepakito nei pridėjus 20 µM, nei 40 µM antocianinų koncentracijas (10 pav. A ir B).
D e g u o n ie s su n a u d o ji m o g re it is , p m o l O2 /s /m g b a lt ym o 0 100 200 300 400 V 0 V 3 +D p- 3-G +D p- 3-G +C y- 3-G +C y- 3-G +Pg -3-G +Pg -3-G A V0 V3 D e g u o n ie s su n a u d o ji m o g re it is , p m o l O2 /s /m g b a lt ym o 0 100 200 300 400 V 0 +D p- 3-G +C y- 3-G +Pg -3-G V 3 +D p- 3-G +C y- 3-G +Pg -3-G * B V3 V0
10 pav. Antocianinų (Dp-3-G, Cy-3-G, Pg-3-G) poveikis širdies mitochondrijų kvėpavimo greičiams antroje ir trečioje metabolinėse būsenose. Pradinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (V0) užrašytas terpėje esant subratatams – 6 mM piruvato ir 6 mM malato. Kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje
būsenoje (V3) pasiekiamas, pridedant 1 mM ADP, po to pridedant 20 µM (A) arba 40 µM (B) Dp-3-G,
Cy-3-G, Pg-3-G. *- statistiškai patikimas efektas lyginant su kontroliniu V0 (be antocianinų).
3.1.2. Citochromo c efektas
Tiriant antocianų poveikį izoliuotų žiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms buvo pastebėta, kad kai kurie antocianinai padidina išoriniu citochromu c aktyvuotą mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje. Ketvirtosios metabolinės būsenos metu, mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo matuojamas, esant adenino nukleotidų nešiklio slopikliui atraktilozidui ir pridedant egzogeninio citochromo c tam, kad patikrinti mitochondrijų išorinės membranos intaktiškumą. Iškėlus prielaidą, kad šis padidėjimas susijęs ne su išorinės mitochondrijų membranos pažeidimu, o su antocianinų sugebėjimu redukuoti citochromą c (Škėmienė et al.,2012 a), buvo tirta, kaip skirtingi antocianinų standartai geba paveikti mitochondrijų kvėpavimo greitį ketvirtos metabolinės būsenos metu.
D e g u o n ie s su n a u d o ji m o g re it is , p m o l O2 /s /m g b a lt ym o 0 50 100 150 200 250
ATR + Cyt c + D p-3-G + Cy-3-G + Pg-3-G 71%
30%
-7%
11 pav. Antocianinų (20µM Dp-3-G, Cy-3-G, Pg-3-G) poveikis širdies mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje metabolinėje būsenoje. Kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje būsenoje užrašytas po ADP priedo, pridedant 140µM atraktilozido (ATR) ir 32µM egzogeninio citochromo c (Cyt c). Skaičiai
virš stulpelių rodo procentais (%) išreikštą antocianinų stimuliuojantį efektą kvėpavimo greičiui.
Nustatyta, kad skirtingi antocianinai nepaveikė mitochondrijų kvėpavimo greičio ketvirtoje metabolinėje būsenoje, esant tik adenino nukleotidų nešiklio slopikliui atraktilozidui (duomenys nepateikti). Pastebėta, kad pridėjus 20 µM Dp-3-G ir Cy-3-G į mitochondrijų kvėpavimo terpę, esant egzogeniniam citochromui c ir matuojant kvėpavimo greitį ketvirtoje metabolinėje būsenoje, vyksta labai stipri kvėpavimo greičio stimuliacija (71% ir 30% atitinkamai) lyginant su kontroliniu citochromo c stimuliuotu greičiu, terpėje nesant antocianinų (11 pav.). Ir priešingai, Pg-3-G šio stimuliuojančio efekto neturėjo. Manoma, kad šis skirtingas kvėpavimo greičio stimuliavimas yra susijęs su antocianinų struktūriniais skirtumais, o ypač, su B žiede prisijungusiais hidroksilo radikalais (1 pav.), kas lemia ir skirtingą jų oksidacinių-redukcinių savybių stiprumą. Taip pat buvo matuotas ir 40 µM koncentracijos antocianinų tirpalų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui ketvirtoje metabolinėje būsenoje, tačiau poveikio nebuvo (duomenys nepateikti).
