MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS
BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
KAMILIJA ČAPAITYTĖ
OLEANOLIO (3 BETA-HIDROKSI-OLEA-12-EN-28-OL
INĖS)
RŪGŠTIES POVEIKIS C6 GLIOMOS LĄSTELIŲ KULTŪRAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
dr. Julius Liobikas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS
BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
OLEANOLIO (3 BETA-HIDROKSI-OLEA-12-EN-28-OL
INĖS)
RŪGŠTIES POVEIKIS C6 GLIOMOS LĄSTELIŲ KULTŪRAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
dr. Julius Liobikas
Data
Recenzentas
Darbą atliko
Magistrantė
Data
Kamilija Čapaitytė
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 1
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1 LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Glioblastoma ... 12
1.2 C6 gliomos ląstelių linija ... 13
1.3 Oleanolio rūgštis, jos farmakokinetika ir vaisto formos... 14
1.4 Oleanolio rūgšties pritaikymas medicinoje ... 16
1.4.1 Oleanolio rūgšties priešvėžinis aktyvumas ... 17
1.4.2 Oleanolio rūgštis ir vėžinių ląstelių oksidacinis fosforilinimas bei aerobinė glikolizė .... 17
1.4.3 Oleanolio rūgštis glioblastomos tyrimuose ... 19
2 TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 21
2.1 Reagentai ir priemonės ... 21
2.2 Tyrimo objektas ... 22
2.3 Tyrimo metodikos... 22
2.3.1 Ląstelių auginimas ir išsėjimas ... 22
2.3.2 Oleanolio rūgšties poveikio ląstelių gyvybingumui įvertinimas ... 23
2.3.3 Oleanolio rūgšties poveikio ląstelių proliferacijai įvertinimas ... 24
2.3.4 Oleanolio rūgšties poveikio ląstelių migracijai nustatymas ... 24
2.3.5 Oleanolio rūgšties poveikio C6 gliomos ląstelių invazijai įvertinimas ... 25
2.3.6 Oleanolio rūgšties poveikio C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams įvertinimas ... 26
2.4 Statistinis duomenų apdorojimas ... 27
3 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1 Oleanolio rūgšties tirpumo ląstelių auginimo terpėje tyrimas ... 28
3.2 Oleanolio rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių gyvybingumui ... 28
3.3 Oleanolio rūgšties poveikis gliomos C6 ląstelių proliferacijai ... 30
3.4 Oleanolio rūgšties poveikis gliomos C6 ląstelių migracijai ... 31
3.5 Oleanolio rūgšties poveikis gliomos C6 ląstelių invaziškumui ... 32
4 IŠVADOS ... 37 5 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38 6 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
SANTRAUKA
K. Čapaitytės magistro baigiamasis darbas: Oleanolio (3 beta-hidroksi-olea-12-en-28-olinės) rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių kultūrai. Mokslinio darbo vadovas: dr. Julius Liobikas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Neuromokslų institutas, Biochemijos laboratorija. Kaunas, 2016.
Darbo tikslas: taikant įvairius tyrimo metodus įvertinti oleanolio (3 beta-hidroksi-olea-12-en-28-olinės) rūgšties (OR) poveikį C6 gliomos ląstelių kultūrai.
Darbo uždaviniai: 1) Nustatyti OR poveikį C6 gliomos ląstelių gyvybingumui; 2) Įvertinti OR poveikį C6 gliomos ląstelių proliferacijai; 3) Nustatyti OR poveikį C6 gliomos ląstelių migracijai; 5) Nustatyti OR poveikį C6 gliomos ląstelių invaziškumui; 4) Įvertinti OR poveikį C6 gliomos ląstelių kvėpavimo greičiams.
Tyrimo metodai. Įvertinti OR priešvėžinį aktyvumą in vitro buvo pasirinkta C6 žiurkių gliomos ląstelių linija. Poveikis C6 ląstelių gyvybingumui buvo vertinamas taikant dvigubo dažymo metodą panaudojant propidžio jodido (PI) ir Hoechst 33342 dažus. Poveikis proliferacijai įvertintas fotografuojant ląsteles šviesiniu mikroskopu ir skaičiuojant jas matymo lauke naudojantis ImageJ programą. C6 gliomos ląstelių migracijos pokyčiai įvertinti „žaizdos gijimo“ metodu. Rūgšties poveikis ląstelių invazinėms savybėms nustatytas formuojant sferoidus ir stebint ląstelių migraciją iš sferoido į periferiją. Medžiagos poveikis C6 gliomos ląstelių kvėpavimo greičiams skirtingose metabolinės būsenose registruotas naudojant oksimetrinę sistemą Oxygraph-2k (Oroboros, Austrija). Statistinė analizė atlikta Microsoft Excel, 2010 .
Rezultatai ir išvados. Eksperimentinių tyrimų metu nustatyta, kad OR neveikia C6 gliomos ląstelių gyvybingumo naudojant 0,1-25 µM koncentracijų rūgšties tirpalus. Nustatyta, kad tik 25 µM koncentracijos OR tirpalas po 96 h statistiškai reikšmingai nuslopino C6 gliomos ląstelių proliferaciją (22%). Tuo tarpu po 48 h ir 72 h ląstelių inkubacijos su 0,1-25 µM koncentracijų OR tirpalais buvo pastebėtas ląstelių proliferacijos suaktyvėjimas. „Žaizdos gijimo“ metodu nustatyta, jog 25 µM koncentracijos OR tirpalas sukelia tik trumpalaikį (pasireiškiantį po 48 h) C6 gliomos ląstelių migracijos slopinimą (16%), nes po 72 h inkubacijos OR ląstelių migracijos nebeveikė. Pastebėta, kad 25 µM koncentracijos rūgšties tirpalas, priešingai nei ląstelių migracijos tyrime, slopina ląstelių invaziškumą po 72 h (29%). OR neįtakojo C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičių.
SUMMARY
K. Čapaitytė Master Thesis: Effect of Oleanolic (3-beta-hydroxyolean-12-en-28-oic) acid on C6 glioma cell culture. Scientific supervisor: dr. Julius Liobikas. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Neuroscience institute, Laboratory of Biochemistry. Kaunas, 2016.
The Aim of the Research: To evaluate oleanolic (3-beta-hydroxyolean-12-en-28-oic) acid (OA) effect on C6 glioma cell culture by applying various research methods.
Objectives: 1) To determine OA effect on viability of C6 glioma cells; 2) To evaluate OA effect on proliferation of C6 glioma cells; 3) To determine OA effect on migration of C6 glioma cells; 5) To determine OA effect on invasiveness of C6 glioma cells; 4) To evaluate OA effect on respiration rate of C6 glioma cells.
Research methods. To evaluate OA anti-cancer activity in vitro a C6 rat glioma cell line was chosen. The effect on viability of C6 cells was analyzed by applying the double staining method using propidium iodide (PI) and Hoechst 33342 dyes. The effect on proliferation was evaluated by photographing the cells with the light microscope and by calculating them in the field of vision using ImageJ program. Changes in C6 glioma cell migration were evaluated using scratch assay by measuring the area healed. The effect of acid on cell’s invasive properties was determined by forming spheroids and observing cell migration from spheroid to periphery. The substance effect on C6 glioma cell respiration rates in different metabolic states was monitored using oximetric system Oxygraph-2k (Oroboros, Austria). Statistical analysis was performed with Microsoft Excel, 2010.
Results and conclusions. During the experiments it was determined that OA does not affect the C6 glioma cell viability when using 0,1-25 µM concentrations of acid solutions. It was determined that only the concentration of 25 µM OA solution after 96 hours statistically significantly reduced the proliferation of C6 glioma cells (22%). While after 48 and 72 hours of cell incubation with concentrations of 0,1-25 µM OA solutions, an increase in cell proliferation was observed. The scratch method has shown that OA solution with concentration of 25 µM causes temporary (appearing after 48 hours) reduction in C6 glioma cell migration (16%), as after 72 hours of incubation OA had no further effect on cell migration. It was observed that the acid solution of 25 µM concentration, different to the cell migration experiment, reduces cell invasiveness after 72 hours (29%). OA had no effect on mitochondria respiration rates of C6 glioma cells.
PADĖKA
Noriu padėkoti visiems prisidėjusiems rašant šį darbą. Esu dėkinga laboratorijos vedėjai prof. dr. Vilmantei Borutaitei už suteiktą galimybę atlikti magistro baigiamojo darbo tyrimus Neuromokslų Institute. Nuoširdus ačiū šio darbo vadovui dr. Juliui Liobikui už suteiktas žinias, pagalbą, patarimus bei pastabas. Dėkoju visam biochemijos laboratorijos kolektyvui už nuoširdžius patarimus ir praktines žinias. Taip pat reiškiu padėką Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedrai už galimybę naudotis Oxygraph-2k (Oroboros, Austrija) aparatu.
SANTRUMPOS
ADP – adenozino 5’ -difosfatas ATP – adenozino 5’ -trifosfatas C6 – žiurkių gliomos ląstelių linija Cyt c – citochromas c
CNS – centrinė nervų sistema DNR – deoksiribonukleininė rūgštis
NADH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas OR – oleanolio rūgštis
PSO – pasaulinė sveikatos organizacija ROS – aktyvūs deguonies junginiai RNR – ribonukleino rūgštis
ĮVADAS
Įvairių organų vėžiniai susirgimai – viena pagrindinių didėjančio žmonių mirštamumo priežasčių pasaulyje. Remiantis Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis 2008 metais tai sudarė net 13% visų mirties atvejų [1]. Be su genetika ir ląstelių morfologijos pakitimais susijusių priežasčių, susirgimus lemia nesveikas gyvenimo būdas, žalingi įpročiai: rūkymas, alkoholio vartojimas, psichinės būsenos pakitimai.
Gliomos – dažniausiai pasitaikanti centrinės nervų sistemos (CNS) navikų grupė. Apie 50% visų šios grupės auglių sudaro glioblastoma – piktybiškiausias pirminis smegenų navikas, kuris pagal PSO parengtą CNS navikų klasifikaciją dar vadinamas IV -ojo laipsnio astrocitoma [2]. Nors šiais laikais medicina sparčiai tobulėja, atsiranda naujų diagnostikos bei terapijos metodų, didžiulė pažanga padaryta ir mokslinių tyrimų srityje, tačiau pacientų išgyvenimo trukmė po diagnozuotos glioblastomos išlieka maža, vidutiniškai nuo kelių mėnesių iki vienerių metų [3].
Tam, kad būtų pagerinta pacientų išgyvenamumo trukmė po glioblastomos diagnozavimo yra atliekama daugybė mokslinių tyrimų, naudojant įvairius šios vėžio formos eksperimentinius modelius. Jais siekiama išsiaiškinti vėžinio susirgimo etiologiją bei patogenezę, suprasti molekulinius mechanizmus, genetinius pakitimus nulemiančius ligos vystymąsi. Vykdomi eksperimentai taip pat svarbūs analizuojant naujas diagnostikos, gydymo ir prevencijos galimybes [4].
Viena iš mokslinių tyrimų krypčių yra naujų chemoterapinių gydymo metodų paieška ir pirminis jų vertinimas. Ieškoma priešvėžiniu aktyvumų pasižyminčių medžiagų, kurios slopintų vėžinių ląstelių proliferaciją, migraciją bei invaziją ir pakitusį metabolizmą.
Vis daugiau dėmesio yra skiriama natūralioms, iš vaistinių augalinių žaliavų išskiriamoms medžiagoms. Jos pasižymi įvairiomis biologinėmis savybėmis, rečiau pasitaiko šalutinių poveikių, augalinio preparato sintezė yra paprastesnė ir reikalaujanti mažiau ekonominių išteklių. Dėl šių priežasčių natūralūs junginiai gali būti plačiai taikomi medicininėje praktikoje. Augalai kaupiantys aktyvius junginius įtraukiami sudarant mitybos racioną, vartojami profilaktiškai, kaip prevencinė priemonė.
Viena iš daugelio biologiškai aktyvių medžiagų aptinkama gamtoje - oleanolio rūgštis (OR). Tai – pentaciklis triterpeninis junginys, antrinis augalų metabolitas, randamas augalų organuose: lapuose, žievėje, sėklų luobelėse [5]. Remiantis jau atliktų tyrimų duomenimis tiriant įvairias vėžio formas (krūties, prostatos, kepenų, plaučių ir kt.) pastebėtas priešvėžinis aktyvumas slopinant ląstelių proliferaciją, invaziją [6].
Literatūroje nėra daug duomenų apie OR poveikį ir veikimo mechanizmus tiriant glioblastomas, nors tai ir viena piktybiškiausių bei dažniausiai diagnozuojamų CNS auglių formų. Dėl šios priežasties
atliekamame darbe buvo nuspręsta ištirti OR poveikį naudojant eksperimentinį ląstelių kultūros modelį - C6 gliomos ląsteles. Mums buvo įdomu įvertinti, kaip pasirinktas junginys veikia ląstelių gyvybingumą, ar turi įtakos jų proliferacijai, migracijai, invazinėms savybėms, ar yra poveikis ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams skirtingose metabolinėse būsenose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: taikant įvairius tyrimo metodus įvertinti oleanolio (3 beta-hidroksi-olea-12-en-28-olinės) rūgšties poveikį C6 gliomos ląstelių kultūrai.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti oleanolio rūgšties poveikį C6 gliomos ląstelių gyvybingumui. 2. Įvertinti oleanolio rūgšties poveikį C6 gliomos ląstelių proliferacijai. 3. Nustatyti oleanolio rūgšties poveikį C6 gliomos ląstelių migracijai 4. Ištirti oleanolio rūgšties poveikį C6 gliomos ląstelių invaziškumui.
5. Įvertinti oleanolio rūgšties poveikį C6 gliomos ląstelių mitochondirjų kvėpavimo greičiui skirtingose metabolinėse būsenose.
1
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Glioblastoma
Viena iš dažniausiai įvardijamų mirties priežasčių pasaulyje, tiek gerai, tiek prasčiau ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse, yra vėžys. Mokslinių tyrimų duomenimis 2012 metais dėl įvairių organų vėžinių susirgimų mirė 8,2 mln. žmonių [7]. CNS onkologiniai susirgimai yra rečiau pasitaikantys lyginant su kitų organų patologijomis, tačiau svarbūs kalbant apie pacientų išgyvenamumą.
Pagal PSO klasifikaciją, CNS navikai yra išskiriami į kelias grupes: nugaros ir galvos smegenų, smegenų dangalų, metastaziniai, hematopoetiniai ir neuroepiteliniai. Glioblastoma priskiriama neuroepitelinių auglių grupei ir dar kitaip yra vadinama IV-ojo laipsnio astrocitoma [2]. Remiantis literatūros duomenimis ji sudaro apie 45-55% visų CNS navikų. Tiriant Europos ir Jungtinių Amerikos Valstijų populiaciją IV-ojo lygio astrocitoma diagnozuojama apytiksliai trims pacientams iš 100 tūkstančių. 60% sergančiųjų sudaro 55-74 metų amžiaus žmonės [7,8].
IV-ojo lygio astrocitoma – pats piktybiškiausias astrocitų kilmės navikas, kuriam būdingas ląstelių polimorfizmas (jos skiriasi savo dydžiu ir forma, branduoliai padidėję), suaktyvėjusi mitozė, kraujagyslių trombozė, endotelio kraujagyslių proliferacija ir nekrozė. Platus kraujagyslių tinklas ir nekrozė yra svarbūs žymenys ligos diagnozavimui [8]. Vėžinėms ląstelėms būdingi įvarūs viduląsteliniai pakitimai lyginant jas su normaliomis. Pakitimai ląstelinių signalų gamyboje ir perdavime sutrikdo ląstelių dauginimąsi, aktyvinamas augimo veiksnių signalų perdavimas dėl ko intensyvėja ląstelių proliferacija [9].
Pacientų išgyvenimo tikimybė yra ganėtinai maža. Diagnozavus glioblastomą išgyventi metus yra 30% tikimybė, išgyventi tris metus – 5% tikimybė ir vos 3% tikimybe, kad žmogus išgyvens bent 5 metus. Vidutinis pacientų išgyvenimo laikotarpio vidurkis po diagnozavimo siekia 12 mėnesių. Tam įtakos turi histologinis naviko tipas, lokalizacija, piktybiškumo laipsnis, paciento amžius, genetiniai ir biologiniai glioblastomos veiksniai bei pacientui taikytos gydymo metodikos [3].
Glioblastomos simptomai įvairūs ir linkę lėtai vystytis. Pacientai dažniausiai įvardija galvos skausmą, virškinamojo trakto sutrikimus, psichikos sutrikimus, neurologinio pobūdžio sutrikimus: kalbos funkcijos sutrikimas, traukuliai, kūno paralyžius [10]. Diagnozuojama kompiuterinės tomografijos arba magnetinio rezonanso pagalba.
Efektyvus glioblastomos gydymas yra siejamas su tam tikrais sunkumais, tokiais kaip didele rizika pažeisti sveikus smegenų audinius, įgytu atsparumu paskirtiems vaistams ir netinkamai parinktu medikamentiniu gydymu [11]. Diagnozavus vėžinį susirgimą visų pirma turėtų būti svarstomas
chirurginis gydymo būdas, tačiau dėl glioblastomai būdingo invaziškumo ir savybės infiltruoti į šalia esančią parenchimą auglio ribos nėra aiškios, todėl praktiškai nėra įmanoma pilna chirurginė rezekcija. Po chirurginių procedūrų siekiant užkirsti kelią ligos atsinaujinimui yra taikomas gydymas chemoterapiniais vaistais arba paskiriama radioterapija. Pastarųjų metodų taikymas, įskaitant ir imunoterapiją gali būti ir kaip pirminio gydymo alternatyva [4, 8, 10].
Remiantis mokslinių tyrimų duomenimis glioblastomos gydymo metodai nėra itin efektyvūs. Ligos paplitimas ir agresyvumas reikalauja naujų tyrimo metodikų, naujų gydymo variacijų, tam kad būtų mažinamas atsparumas taikomoms terapijoms ir didinamas sergančiųjų išgyvenamumas.
1.2 C6 gliomos
ląstelių linija
Analizuojant glioblastomos genetines savybes, vystymosi mechanizmą, naujus gydymo metodus ir galimą jų pritaikymą medicinoje yra svarbūs eksperimentiniai tyrimo modeliai. Dažniausiai aprašomi yra ląstelių kultūrų implantacija į graužikų smegenų audinius ir transgeniniai graužikų modeliai. Vieni labiau atspindi molekulinių procesų pokyčius, kiti morfologinius. Laboratorijose atliekamuose tyrimuose in vitro yra naudojami eksperimentiniai ląstelių kultūrų modeliai, kurie padeda įvertinti naujų gydymo būdų ir naujų medikamentų efektyvumą. Svarbu paminėti, kad tokio pobūdžio eksperimentai gali rodyti ir klaidingus rezultatus, nes neįmanoma tyrimuose in vitro sukurti glioblastomai būdingos biologinės aplinkos, bei atspindėti naviko sąveikos su hormonais ar augimo veiksniais, tačiau tokie tyrimai yra svarbus pirminiam naujos gydymo alternatyvos įvertinimui [10].
Tyrimams atlikti gali būti naudojamos įvairios GMB ląstelių linijos: U – 87 (žmogaus glioblastoma), 9L (žiurkių gliosarkoma), F98, RG2, C6 (žiurkių glioma).
Ne retai glioblastomos tyrimuose naudojamas eksperimentinis ląstelių kultūros modelis yra C6 žiurkių gliomos ląstelių linija (1 pav.). Ji buvo sukurta 1968 metais suaugusiose Wistar – Furth žiurkėse [11]. Šios linijos ląstelės pagal histologiją yra klasifikuojamos kaip astrocitoma. Lyginant su kitomis žiurkių gliomos ląstelių linijomis C6 yra labiausiai panaši į žmogaus glioblastomos ląsteles, kurias sieja keli bendri histopatologiniai ir augliui specifiniai žymenys. Nustatyta, kad C6 gliomos ląstelėse ir žmogaus glioblastomos ląstelėse yra padidėjusi PDGFβ, IGF-1, EGFR ir Erb3/Her3 genų raiška [12]. Šis eksperimentinis vėžio modelis pasižymi židinine invazija smegenų audiniuose, navikinėms ląstelėms yra būdinga nekrozė, branduolių polimorfizmas bei aktyvi mitozė [13].
1 pav. C6 gliomos ląstelės. Padidinimas 40 kartų
1.3
Oleanolio
rūgštis, jos farmakokinetika ir vaisto formos
Oleanolio (3 beta-hidroksi-olea-12-en-28-olinė) rūgštis (OR) – tai pentaciklis triterpeninis junginys, antrinis augalų metabolitas, dėl savo struktūros taip pat yra priskiriamas ir kitoms natūralių junginių grupėms: steroliams, steroidams, triterpeniniams saponinams (2 pav.).
2 pav. Struktūrinė oleanolio rūgšties formulė. Paimta iš Chem Spider (prieiga per internetą:
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.10062.html)
OR kaupia daugiau nei 1600 skirtingų maistinių ir vaistinių augalų, ji aptinkama įvairių augalų organų audiniuose: žievėje, kamštiniame audinyje, vaškiniame lapų ar žievės sluoksnyje. Gamtoje dažnai aptinkama kartu su savo izomeru – ursolo rūgštimi, ursano tipo pentacikle triterpenine rūgštimi [14].
Išskiriamos kelios augalų rūšys, kurios yra pagrindiniai OR gamtiniai šaltiniai. Jose rūgšties kiekis sudaro daugiau nei 1% sausai išdžiovinto atitinkamo augalo organo masės. (1 lent.) [5].
Augalas Augalo dalis Didžiausias OR kiekis (%) Baltasis beržas L., Beržiniai
(Betula alba L., Betulaceae)
žievė 1,5%
Vaistinis rozmarinas L., Notreliniai
(Rosmarinus officinalis L., Lamiaceae)
lapai 1,2%
Paprastasis amalas L., Amaliniai
(Viscum album L., Viscaceae)
ūgliai 1,0%
Europinis alyvmedis L., Alyvmediniai
(Olea europaea L., Oleaceae)
lapai 3,1%
Kvapusis gvazdikmedis L., Mirtiniai
(Syzygium aromaticum L., Myrtaceae)
žiedai 1,6%
1 lent. Augalai kaupiantys didžiausią kiekį oleanolio rūgšties (pakeista iš [5])
OR aptinkama laisvos rūgšties pavidalu arba kaip triterpeninių saponinų aglikono pirmtakas, sujungtas su viena ar keliomis sacharido grandinėmis. Nekonjunguota rūgštis kaupiasi augalų kutikulės vaškiniame sluoksnyje, kuris augalą apsaugo nuo dehidratacijos ir yra laikomas pirminiu barjeru ginančiu nuo patogeninių mikroorganizmų. Alyvuogių lapuose galima aptikti beveik grynus OR kristalus, kurių sudarytas fizinis barjeras saugo nuo grybelių plitimo. Glikozilinti rūgšties dariniai veikia prieš žolėdžius bei įvarius patogeninus organizmus [15].
Dėl biologinių savybių, lengvo prieinamumo ir mažų gavybos kaštų nuspręsta, kad OR gali būti gera pradinė molekulė biologiškai aktyvių junginių sintezėje. Rūgšties cheminėje struktūroje yra trys vietos: C3 hidroksi, C12=C13 dviguboji jungtis ir C28 karboksilo grupė, prie kurių cheminės sintezės metu prijungus atitinkamus pakaitus gaunami efektyvumu pasižymintys analogai. Literatūroje dažniausiai minimi šie trys: CDDO (2-cian-3,12-dioksoolein-1,9(11)-dien-28-oinė rūgštis) ; CDDO-Me (C-28 metilo esteris); CDDO-Im (C28 imidazolas), kurie pasižymi panašiu, o kai kuriais atvejais ir stipresniu biologiniu aktyvumu, kuris labiausiai susijęs su priešuždegiminiu poveikiu gydant įvairių organų patologijas [14, 16].
OR identifikavimui laboratorijose yra taikomi įvairūs analizės metodai: plonasluoksnė chromatografija, skysčių chromatografija, dujų chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, masių spektrometrija [15].
Įprastai OR farmacinė vaisto forma yra tabletės ar kapsulės. Vertinant peroraliai vartojamos kietos vaisto formos bioprienamumą in vivo nustatyta, kad žmonėms skiriama 40 mg vienkartinė paros
dozė nėra gerai įsisavinama: Cmax – 12,12 ±6,84 ng/ml, Tmax – 5,2 ± 2,9 h [17]. Analogiškos vaisto formos biologinis pasisavinimas tirtas ir naudojant eksperimentinį žiurkių modelį. Nustatyta, kad skiriant 25 ir 50 mg/kg OR dozes žiurkėms jos biopasisavinimas buvo tik 0,7% [18]. Skirtingų Taivano universitetų mokslininkai atliko OR bioįsisavinimo tyrimą, įtraukiant 0,5% OR kiekį į pelių mitybą 8 savaitėms, po kurių išmatuotas rūgšties pasiskirstymas skirtinguose audiniuose. Gauti eksperimentų duomenys: OR plazmoje 0,55 µg/ml, smegenų audinyje 1,7 µg/g, širdies audinyje -4,2 µg/g, kepenų audinyje - 10,3 µg/g, ir 5,5 µg/g inkstų audinyje [19]. Tokie farmakokinetiniai duomenys yra siejami su prastu rūgšties tirpumu vandenyje (20 ºC 4,6 mg/l) [6]. Siekiant pagerinti farmakokinetinius parametrus ir padidinti farmakoterapinį pritaikymą būtina kurti naujas vaisto formuluotes.
OR turinčių vaistų kūrime pasitelkiant nanotecnologijas yra modeliuojamos naujos nanodalelių vaisto formos: nano dalelės, nano sferos, nano kapsulės, kietosios lipidų nano dalelės, nano emulsijos ir suspensijos. Lyginant su įprastiniais vaistais jos pasižymi geresniu tirpumu ir stabilumu, nes sumažėja dalelių dydis ir padidėja paviršiaus plotas, organizmas apsaugomas nuo toksiško poveikio, išvengiama cheminės ir fizinės degradacijos bei pagerinamas bioprieinamumas [18, 20].
1.4 Oleanolio
rūgšties pritaikymas medicinoje
OR – biologiškai aktyvus junginys. Jai būdingas priešuždegiminis, priešvėžinis, antivirusinis, antidiabetinis, antimikrobinis, antiparazitinis, analgezinis ir žaizdų gijimą skatinantis poveikis [21].
Vienas iš svarbiausių OR farmakologinių efektų yra apsauginis poveikis kepenims. Mokslinių tyrimų duomenys rodo, kad medžiaga veikia ne tik prieš ūminius, cheminių veiksnių sukeltus, kepenų pažeidimus, bet ir apsaugo nuo lėtinių ligų sukeliamų kepenų pažeidimu – fibrozės ir cirozės [15]. Antidiabetinis OR poveikis yra aiškinamas gliukozės koncentracijos kraujyje sumažinimu ir įgyto atsparumo insulinui slopinimu diabetinėse pelėse [22]. Vertinant antimikrobines OR savybes buvo nustatyta, kad rūgštis sumažina patogeninių mikroorganizmų atsparumą ampicilinui ir oksacilinui [23].
Remiantis moksliniais literatūriniais šaltiniais ir atliktais tyrimais galima daryti išvadą, jog OR tai medžiaga, kuri gali būti taikoma medicininėje praktikoje, tačiau saugiam ir efektyviam pritaikymui yra svarbūs eksperimentai, kurie praplėstų žinias apie veikimo mechanizmus, metabolinius pokyčius, signalinių kelių pokyčius.
1.4.1 Oleanolio
rūgšties priešvėžinis aktyvumas
Ankstesniame skyriuje užsiminta, apie OR priešvėžinį aktyvumą. Remiantis paskutinio dešimtmečio tyrimais, kurių metu naudota nemažai skirtingų ląstelių linijų, nustatyta, kad šis triterpininis junginys veikia įvairių organų auglių vystymosi stadijas slopindamas angiogenezę, navikinių ląstelių diferenciaciją bei invaziją į kitus audinius [6, 24]. Toks poveikis pastebėtas tiriant krūties, smegenų, plaučių, kepenų, storosios žarnos, odos ir kitų organų vėžines ląsteles in vitro [14]. Tiriant poveikį kepenų vėžinėms ląstelėms in vitro naudoti 5 µM, 25 µM ir 50 µM koncentracijų OR tirpalai. Kai medžiagos tirpalo koncentracija buvo 25 µM ir 50 µM nustatytas apoptozę sukeliantis poveikis. Apoptozės skatinimas yra siejamas su morfologiniais ir biocheminiais pasikeitimais, kuriuos sukelia genų reguliacijos signaliniai keliai. Mikroskopu vertinant ląstelių morfologinius požymius pastebėta, kad jas paveikus 50 µM koncentracijos OR tirpalu ląstelės visiškai prarado joms būdingą formą [25]. Manoma, kad šie pokyčiai nustatyti dėl priešvėžinė medžiagos sukelto pažeidimo ląstelių mitochondrijoms. Mitochondrijų membranos depoliarizacija ir suaktyvinta išorinės membranos permeabilizacija – svarbios ląstelių apoptozės stadijos, kurias sukelia mitochondrijų membraninio potencialo pažeidimai. Nustatyta, kad OR sukelia mitochondrijų membraninio potencialo sumažėjimą kepenų vėžinėse ląstelėse veikiant jas 48 h 25 µM ir 50 µM koncentracijų tirpalais [25].
Tyrimų metu vertinant OR poveikį astrocitomos vėžinėms ląstelėms nustatytas antiproliferacinis medžiagos poveikis. Eksperimentai atlikti naudojant 1 µM, 5 µM, 25 µM ir 50 µM koncentracijų medžiagos tirpalus. Proliferaciją slopinantis poveikis pastebėtas po 24 h inkubacijos, astrocitomos ląsteles veikiant 25 µM ir 50 µM koncentracijų OR tirpalais [26]. Tie patys mokslininkai vertino ir morfologinius ląstelių pokyčius, naudojant fazių kontrasto mikroskopą. Pastebėta, kad po dviejų valandų ląstelės pakeičia savo morfologinę formą jas veikiant 25 µM ir 50 µM koncentracijų OR tirpalais [26].
Priešvėžinis aktyvumas: apoptozė, proliferacijos slopinimas, navikinių ląstelių augimo slopinimas yra grindžiamas viduląstelinių signalinių kelių pokyčiais dėl OR poveikio [27].
1.4.2 Oleanolio
rūgštis ir vėžinių ląstelių oksidacinis fosforilinimas bei aerobinė
glikolizė
Mitochondrijos yra vienos iš svarbiausių ląstelės organelių, atsakingų už daugelį ląstelinių procesų, tokių kaip hormonų sintezė, homeostazė, energijos metabolizmas, aktyvių deguonies formų (ROS) gamyba, apoptozė. Pagrindinė jų funkcija – ATP sintezė oksidacinio fosforilinimo metu. Yra
žinoma, kad daugelis vėžinių ląstelių tipų keičia savo metabolizmą – aktyvinama glikolizė ir slopinamas mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas, - tai vadinama Varburgo efektu.
Varburgo efektas (Warburg effect angl.) – vėžinių ląstelių savybė energijos gauti glikolizės būdu (produktas – laktatas), o ne vykstant oksidaciniam fosforilinimui. Pirmasis tai pastebėjo ir 1956 metais aprašė, Nobelio premijos laureatas, Oto Varburgas (Otto Warburg,) [28, 29].
Be aerobinės glikolizės vėžinėms ląstelėms būdingi ir kiti metaboliniai pokyčiai susiję su mitochondrijomis: sulėtėjusi kvėpavimo grandinės substratų oksidacija, ypatingai NADH, pakitusi kvėpavimo grandinės komponentų raiška ir aktyvumas, suintensyvėjusi ROS sintezė, mitochondrijų DNR mutacijos, sutrikusi kvėpavimo grandinės kompleksų ir ATP sintazės sąveika su vidine mitochondrijų membrana, nuslopinta apoptozės kontrolė [29].
Aerobinei glikolizei vėžinėse ląstelės yra būdingas padidėjęs gliukozės panaudojimas bei laktato gamyba, sumažėjęs deguonies suvartojimas. Mokslininkai tirdami OR priešvėžinį aktyvumą vertino medžiagos poveikį susijusį su aerobine glikolize. Tyrimams atlikti buvo naudotos žmogaus prostatos vėžinių ląstelių PC – 3 ir krūties vėžinių ląstelių MCF – 7 linijos [30]. Gauti rezultatai parodė, kad 50 µg/ml ir 100 µg/ml OR tirpalai sumažino gliukozės sunaudojimą, laktato rūgšties gamybą, padidino deguonies suvartojimą tirtose vėžinėse ląstelėse. Tačiau palyginus O2 kiekį vėžinėse
ląstelėse be OR priedo ir su priedu gauti rezultatai parodė jog medžiaga neturi įtakos deguonies koncentracijai ląstelių kultūroje [30].
Pastaraisiais metais, tiriant glikolizės procesą vėžinėse ląstelėse yra bandoma išsiaiškinti, kokius biologinius taikinius reikėtų paveikti, kad būtų nuslopintas šis procesas, ir taip sustabdoma ląstelių proliferacija ir infiltracija į kitus audinius. Eksperimentinių tyrimų metu buvo nagrinėtas piruvato kinazės M genas (pyruvate kinase M angl. genas), koduojantis dvi piruvato kinazes, PKM1 ir PKM2, atsakingas už fosfoenolpiruvato virtimą piruvatu, kuris naudojamas laktato rūgšties gamybai ir dalyvauja mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo procese. PKM2 kinazės padidėjusi ekspresija nustatyta intensyvia proliferacija pasižyminčiose ląstelėse, įskaitant ir vėžines bei manoma yra viena iš suaktyvėjusios aerobinės glikolizės auglio ląstelėse priežasčių. Siekiant suvokti mechanizmą, kaip OR veikia aerobinę glikolizę, buvo vertinami PKM kinazių PKM1 ir PKM2 ekspresijos pokyčiai paveikus ląsteles šiuo triterpeniniu junginiu. Remiantis analizės duomenimis nustatyta, kad veikiant ląsteles 10 – 100 µM OR tirpalais PKM2 kiekis sumažėjo, o tuo tarpu PKM1 raiška padidėjo [30].
Manoma, kad aerobinė glikolizė gali būti svarbus taikinys vėžio chemoterapijoje. Atliktų tyrimų duomenys rodo, kad veikiant šį procesą yra slopinamas vėžinių ląstelių augimas [31]. Siekiant platesnio klinikinio OR bei jos darinių pritaikymo yra svarbu suprasti ir gilintis į junginių veikimo mechanizmus vėžinėse ląstelėse.
1.4.3 Oleanolio
rūgštis glioblastomos tyrimuose
Nagrinėjant OR priešvėžinį aktyvumą yra atliekama nemažai tyrimų ne tik tiriant kepenų, plaučių ar krūties vėžinių ląstelių linijas, bet skelbiama ir tyrimų naudojant gliomos ląsteles.
Viena iš OR chemoterapinių savybių – ląstelių proliferacijos slopinimas. Remiantis literatūros duomenimis, nustatyta, kad ląstelių dauginimasis inaktyvinamas slopinant STAT 3 aktyvaciją [32]. STAT 3 – transkripcijos veiksnys, kurio aktyvacija yra svarbi tumorogenezei ir jis gali būti laikomas svarbiu taikiniu priešvėžinėje terapijoje įskaitant ir glioblastomos gydymą [33].
Tyrimams naudojant žmogaus glioblastomos ląstelių liniją buvo nustatyta, kad OR slopina navikinių ląstelių migraciją. Poveikis pastebėtas taikant „žaizdos gijimo“ metodą inkubuojant ląsteles 48 h su 10 µM ir 25 µM koncentracijų OR tirpalais [34]. Tie patys mokslininkai nustatė, kad ląstelių migracijos slopinimas galimai yra susijęs su MAPK (mitogenų aktyvuojamos baltymų kinazės)/ERK (ekstraląstelinių signalų reguliuojamos kinazės) signalinių kelių inaktyvacija. Eksperimento metu nepastebėtas citotoksiškas ar apoptozę skatinantis OR poveikiai [34].
Žinant, kad epitelinė mezenchiminė tranzicija (epithelial-mesenchymal transition angl.) yra glaudžiai susijusi su vėžinių ląstelių invazija bei migracija buvo vertinamas OR poveikis šiam procesui, stebint su epiteline mezenchimine tranzicija susijusių transmembraninių baltymų (žymenų), atsakingų už ląstelių sukibimą, raiškos pokyčius [34]. Gauti rezultatai parodė, kad naudojant 5 µM, 10 µM ir 25 µM koncentracijų OR tirpalus buvo sumažinta tirtų baltymų raiška žmogaus glioblastomos ląstelėse stebint po 24 h ir 48 h.
Radioterapija – veiksmingas greitai besivystančio vėžio gydymo būdų žinduoliams. Jonizuojanti spinduliuotė paskatina ROS susidarymą, kurių perteklius sutrikdo apasuginės organizmo sistemos funkcijas, prasideda ląstelių destrukcija – sukeliama vėžinių ląstelių žūtis [35]. Ląsteliniai antioksidantai yra svarbūs apsaugai prieš ROS. Glutationas yra vienas iš svarbiausių ląstelėse esančiu atioksidantų. Jo viduląstelinė koncentracija normaliomis sąlygomis svyruoja nuo 0,5 iki 10 mM [36], tačiau įvairių tipų auglių ląstelėse gali būti padidėjusi, kas sukelia atsparumą jonizuojančiai spinduliuotei [37]. Anhui Medicinos Universiteto (Anhui Medical University, Kinija) mokslininkų atlikto tyrimo metu naudojant C6 gliomos ląstelių liniją, nustatytas OR sukeltas vėžinių ląstelių padidėjęs jautrumas radiacijai, slopinant glutationo sintezę [38].
Tiriant OR poveikį glioblastomai taikant eksperimetinį ląstelių kultūros modelį gautais rezultatais visiškai nereikėtų pasitikėti. Tokie tyrimai nesukuria augliui identiškų biologinių sąlygų, tačiau yra svarbūs pradiniam vertinimui. Remiantis jau atliktais tyrimų rezultatais galima daryti išvadą, jog OR pasižymi priešvėžiniu aktyvumu gydant glioblastomą ir kitas vėžio formas, tik svarbu atsirinkti biologinius taikinius siekiamam poveikiui sukelti. Dėl mažai išnagrinėto OR poveikio gliomos vėžinėms ląstelėms šiame darbe buvo nuspręsta atlikti priešvėžinio aktyvumo tyrimus vertinant ląstelių
gyvybingumą, proliferaciją, migraciją bei invaziją ir gautus rezultatus susieti su ląstelėms labai svarbiu oksidacinio fosforilinimo procesu. Norėta patikrinti ar OR turi įtakos C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams skirtingose metabolinėse būsenose.
2 TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1
Reagentai ir priemonės
Reagentai
Adenozino 5’ -difosfatas (ADP, Sigma-Aldrich) Citochromas C ( Sigma-Aldrich)
Digitoninas (Merck)
Dimetilsulfoksidas (DMSO, Sigma-Aldrich )
Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM(1x)+GlutaMAXTM, Gibco) Fetalinis jaučio serumas (FBS, Gibco)
Fosfatinis druskų tirpalas, pH 7,4 (PBS, Sigma-Aldrich) Hoechst 33342 ( Sigma-Aldrich )
Malato rūgštis (Sigma-Aldrich) Metilceliuliozė (Sigma-Aldrich)
Penicilino-streptomicino tirpalas (10.000 U/ml, Briochrom AG) Piruvato rūgštis (Sigma-Aldric)
Poli-L-Lizinas (Cultrex)
Propidžio jodidas (PI, Sigma-Aldrich)
Tripsino/EDTA 0,25% tirpalas (Sigma-Aldrich) Triptano mėlio dažai (Fluka).
Oksimetrinės sistemos inkubacinės terpės komponentai įsigyti iš Sigma-Aldrich.
Įranga
Inkubatorius su palaikomaja 37 ºC temperatūra ir 5% CO2 aplinka (Heracell 150i, Thermo Scientific) Laminaras (Herasafe KS, Thermo Scientific)
Mikroskopas (Olympus CKx41, Japonija) Mikroskopas (Olympus IX71S1F-3, Japonija) Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5810R
2.2 Tyrimo objektas
Vėžinių ląstelių linija – žiurkių gliomos ląstelių linija C6 (C6, Cell Lines Service, Vokietija).
Tiriamoji medžiaga – oleanolio rūgštis ≥ 97% įsigyta iš Sigma-Aldrich. Buvo ruošiamas motininis 20 mM tirpalas, kuris išpilstytas po 10 µl ir laikomas minusinėje temperatūroje iki eksperimento. Tirpiklis DMSO.
2.3 Tyrimo metodikos
2.3.1
Ląstelių auginimas ir išsėjimas
Darbai, kurie susiję su ląstelių atkėlimu, persėjimu ar išsėjimu buvo atliekami steriliai, laminare. Kiekvieną kartą darbo pradžioje laminaras buvo 10 min veikiamas UV spinduliais. Visi darbui reikalingi įrankiai (mėgintuvėliai, pipetės, flakonai, terpės ir kiti) prieš dedant į laminarą buvo sterilizuojami dezinfekcinėmis priemonėmis, dirbama su pirštinėmis.
C6 gliomos ląstelės su 8 ml mitybinės terpės buvo auginamos specialiuose flakonuose, kurių augimo paviršiaus plotas 75 cm2. Mitybinė terpė ruošiama nedideliais kiekiais – po 50 ml, ir ji susideda iš 10% FBS, 1% penicilino/streptomicino tirpalo ir 89% DMEM terpės. Šviežiai pagamintos terpės spalva raudonai rožinė, kultivuojant ląsteles palaipsniui sumažėja maisto medžiagų, – tai parodo terpėje esantis pH indikatorius – ir terpės spalva pakinta į geltonai oranžinę. Tam, kad būtų sudarytos kuo natūralesnės augimo sąlygos flakonai su ląstelėmis buvo laikomi inkubatoriuje su palaikomąja 5% CO2 koncentracija, 37 ºC temperatūroje.
Persėjant ar norint išsėti ląsteles konkretiems eksperimentams flakone turėtų būti pakankamas ląstelių kiekis, jos turėtų konfluentiškai padengti apie 80% flakono dugno paviršiaus. Jei ląstelių yra pakankamai seka tolimesni žingsniai:
1) Flakonas su ląstelėmis švelniai pasukiojamas ir sena terpė išpilama į flakoną atliekoms. 2) Ląstelės flakone praplaunamos užpilant 3-5 ml PBS, kuris po to išpilamas į atliekų flakoną. 3) Užpilamas 1 ml tripsino/EDTA tirpalo, kuris tolygiai pasklaidomas ant ląstelių ir flakonas su
ląstelėmis dedamas į inkubatorių 2-3 min.
4) Išėmus flakoną iš inkubatoriaus stebint per mikroskopą patikrinama ar ląstelių monosluoksnis atkibo nuo flakono dugno.
5) Flakonas su atkibusiomis ląstelėmis perkeliamas į laminarą. Ant ląstelių užpilama 3 ml mitybinės terpės, kad nustotų veikti tripsinas. Ląstelių suspensija surenkama ir perkeliama į 15 ml mėgintuvėlį.
6) Ląstelės centrifuguojamos 5 min, esant 1500 aps/min, naudojant centrifugą Eppendorf 5810R. 7) Po centrifugavimo supernatantas atsargiai nupilamas, ant ląstelių užpilama 1 ml mitybinės
terpės ir resuspenduojama.
8) Ląstelių skaičiavimui į ependorfo tipo 1,5 ml talpos mėgintuvėlį įpilama 340 µl PBS ir 20 µl gautos ląstelių suspensijos. Už laminaro ribų į tą patį mėgintuvėlį įpilama 40 µl triptano mėlio dažų ir suspenduojama. 20 µl gautos suspensijos pipete yra suleidžiama į hemocitometro kamerą (Fuchs-Rosenthal) ir suskaičiuojamos gyvybingos ląstelės, jos yra skaidrios, nes membrana nepraleidžia dažų, o negyvos ląstelės nusidažo mėlynai dėl padidėjusio membranos pralaidumo.
9) Priklausomai nuo to, koks eksperimentas bus atliekamas yra ruošiamos skirtingos ląstelių suspensijos.
2.3.2 Oleanolio
rūgšties poveikio ląstelių gyvybingumui įvertinimas
OR poveikis C6 ląstelių gyvybingumui buvo vertinamas taikant dvigubo dažymo metodą panaudojant propidžio jodido (PI) ir Hoechst 33342 dažus.
Eksperimentui atlikti ląstelės išsėtos į 96 šulinėlių plokšteles, viename šulinėlyje 1200 ląstelių/100µl, ir paliekamos inkubatoriuje 24 h. Po paros ląstelės paveiktos skirtingų koncentracijų (0,1 µM, 1 µM, 10 µM, 25 µM) OR tirpalais, o kontrolinė grupė 1,5 % DMSO tirpalu. Poveikis vertinamas kas 24 h, iš viso tris paras. Kiekvieną dieną ląstelių gyvybingumo stebėjimui ląstelės buvo dažomos į kiekvieną šulinėlį (po tris šulinėlius kiekvienai skirtingai koncentracijai) pridedant po 1µl propidžio jodido (7 µM) ir Hoechst 33342 (4 µg/ml). Plokštelės dedamos į inkubatorių 2-3 min, tuomet nusiurbiama po 60 µl terpės ir mikroskopuojama OLYMPUS IX71S1F-3 mikroskopu esant 40 kartų padidinimui (3 pav.).
Propidžio jodidas – florescuojantis DNR dažas, kuris normaliomis sąlygomis nepraeina per gyvybingų ląstelių plazminę membraną. Jis naudojamas žuvusioms ląstelėms identifikuoti, nes prasiskverbdamas pro pažeistą plazminę membraną pasiekia ląstelių branduolius kur susijungia su DNR ir RNR ir sukelia ryškiai raudoną fluorescensiją. Taip identifikuojamos nekrozavusios ląstelės (3 pav. B) [39].
Hoechst 33342 dažas prasiskverbia ir per gyvų ląstelių plazminę membraną, ir branduolyje jungiasi su chromatinu. Tai sukelia mėlyną gyvybingų ląstelių branduolių fluorescensiją. Žūvant ląstelėms apoptozine mirtimi chromatinas yra linkęs kondensuotis, todėl dažo spalva intensyvėja, pastebima ryški žydra fluorescensija. Taip identifikuojamos apoptotinės ląstelės (3 pav. B).
Ląstelės fotografuojamos, jų kiekis skaičiuojamas naudojant ImageJ programa, duomenys apdorojami Microsoft Office Excel 2010 programa.
3 pav. Ląstelių gyvybingumo stebėjimas. A – fazių kontrastas, B– ląstelės nudažytos Hoechst
33342 ir propidžio jodido dažais. Pavyzdinės nuotraukos, padidinimas 40 kartų.
2.3.3 Oleanolio
rūgšties poveikio ląstelių proliferacijai įvertinimas
C6 gliomos ląstelių proliferacijos tyrimui pasirinktos OR koncentracijos iki 25 µM. C6 gliomos ląstelės inkubuotos keturias paras su skirtingų koncentracijų (0,1 µM, 1 µM, 10 µM ir 25 µM) OR tirpalais, kontrolinė grupė paveikta 0,75% DMSO tirpalu. Ląstelių tankis kiekvieną dieną buvo vertinamas fotografuojant jas šviesiniu mikroskopu ir skaičiuojant ląsteles regėjimo lauke naudojant ImageJ programą, duomenys apdorojami Microsoft Office Excel 2010 programa.
2.3.4 Oleanolio
rūgšties poveikio ląstelių migracijai nustatymas
OR poveikis C6 gliomos ląstelių migracijai buvo vertinamas „žaizdos gijimo“ metodu. Eksperimentui atlikti, buvo naudojamos 24 šulinėlių plokštelės. Į kiekvieną šulinėlį išsėta po 100 tūkstančių ląstelių/500 µl terpės. Ląstelės paliktos inkubatoriuje 24 h. Praėjus parai ląstelių suformuotame monosluoksnyje padaryta „žaizda“ – kiekvieno šulinėlio centre 20 µl tūrio pipetės antgaliu perbraukiama kiek įmanoma lygesnė ir tiesesnė linija. Tam, kad pašalinti atkibusias ląsteles,
sena terpė atsargiai nusiurbta ir šulinėliai du kartus praplauti PBS tirpalu po 500 µl. Tuomet ant ląstelių užpilama 500 µl šviežios mitybinės terpės ir pridedama po 50 µl tiriamų koncentracijų (0,1 µM, 1 µM, 10 µM ir 25 µM) OR tirpalų, kontrolinė grupė – 0,75% DMSO tirpalas.
Atlikus šiuos etapus ląstelės fotografuotos šviesiniu mikroskopu, esant 40 kartų padidinimui ir pasižymima kuri žaizdos dalis užfiksuota. Migracijos stebėjimas vykdytas po 24 h, 48 h ir 72 h priklausomai nuo „žaizdos gijimo“ greičio (4 pav.). Po 72 h „žaizda“ visiškai „sugijo“. „Užgijusios žaizdos“ plotas išmatuotas naudojantis ImageJ programa.
4 pav. Ląstelių migracijos stebėjimas „žaizdos gijimo“ metodu po 0 h, 24 h ir 48 h.
Pavyzdinės nuotraukos, padidinimas 40 kartų.
2.3.5 Oleanolio
rūgšties poveikio C6 gliomos ląstelių invazijai įvertinimas
Stebint OR poveikį C6 ląstelių invazijai naudota metilceliuliozė, kuri turi savybę sutelkti ląstelęs į viena rutulį – suformuojamas sferoidas. Vienam sferoidui reikalinga 5000 ląstelių, kurios sėtos į U formos šulinėlius, naudojant 96 šulinėlių plokštelę. Šulinėlio mitybinės terpės tūris 100 µl sudarytas iš 80% mitybinės terpės ir 20% metilceliuliozės. Po 24 h inkubacijos susiformavę sferoidai perkeliami į plokščiadugnius šulinėlius. Prieš perkėlimą šulinėliai padengiami poli-L-lizino tirpalu, kad pagerinti sferoido prikibimą. Poli-L-lizinas skiedžiamas PBS tirpalu (1:10), į kiekvieną šulinėlį įpilama po 100 µl pasiruošto mišinio, tolygiai pasklaidoma ir paliekama laminare 30 min. Po pusvalandžio tirpalas pašalinamas, paliekant tuščius šulinėlius.
Nuo sferoidų atsargiai nusiurbiama sena terpė su metilceliulioze ir pridedama po 100 µl naujos mitybinės terpės. Tuomet visas turinys, nauja terpė ir sferoidas, perkeliami į paruoštą 24 šulnėlių plokštelę. Į šulinėlius pridedama po 400 µl terpės ir po 50 µl tiriamų koncentracijų (10 µM ir 25 µM) OR tirpalų, o kontrolinei grupei 0,75% DMSO tirpalo.
Atlikus perkėlimą sferoidai fotografuojami po 0 h, 24 h ir 48 h šviesiniu mikroskopu esant 40 kartų padidinimui (5 pav.). Ląstelių užimtas plotas išmatuojamas naudojant ImageJ programą.
5 pav. Ląstelių invazijos stebėjimas „sferoidų“ metodu po 0 h, 24 h, 48 h. Pavyzdinės nuotraukos, 40
kartų padidinimas.
2.3.6
Oleanolio rūgšties poveikio C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo
greičiams įvertinimas
C6 gliomos ląstelių kvėpavimo greičiai buvo registruojami, naudojant oksimetrinę sistemą Oxygraph-2k (OROBOROS Instruments, Innsbruck, Austria). Matavimai atlikti 37 ºC temperatūroje, inkubacinėje terpėje (0,5 mM EGTA (etileno glikolio tetraacto rūgšties), 3 mM MgCl2 × 6H2O, 60
mM K-laktobionato, 20 mM taurino, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES
(4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfono rūgšties), 1 g/L BSA (jaučio serumo albumino), D-manitolio). C6 ląstelės buvo veikiamos šiais reagentų tirpalais: 10µg digitonino/4mln.ląst (permeabilizuoti ląstelių membraną), 1 mM malato, 1 mM piruvato, 0,4 mM ADP, 30 µM citochromo c.
Kvėpavimo greičio registravimui ląstelių suspensija buvo ruošiama atliekant 2.3.1 skyriuje aprašytus etapus (1-7). Po centrifugavimo, nupylus supernatantą ant ląstelių užpilama 5 ml PBS tirpalo, kad visiškai pašalinti mitybinės terpės likučius. Ląstelės pakartotinai centrifuguojamos 1500 aps/min, 3 min. Po to ląstelės resuspenduojamos užpylus 400 µl PBS. Imama 20 µl gautos suspensijos ir suskaičiuojamos gyvos ląstelės (žr. 2.3.1 skyrius, 8 punktas). Eksperimentui atlikti vienai oksimetro kiuvetei, kurios tūris 2 ml, užpildyti reikalingi 4 mln. ląstelių. Ląstelių suspensija sumaišoma su tokiu tūriu inkubavimo terpės, kad būtų užpildyta oksimetro kiuvetė.
C6 ląstelių kvėpavimo greitis išreiškiamas pmol O2/s/2x106ląstelių.
2.4
Statistinis duomenų apdorojimas
Eksperimentiniai duomenys apdoroti „Microsoft Excel 2010“ paketu. Mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkiai pateikti su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis, eksperimentinių grupių statistiniam palyginimui taikytas grupinis Stjudento t-testas. Jei reikšmė p <0,05 – skirtumai tarp vidurkių laikomi statistiškai patikimi.
3
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Oleanolio
rūgšties tirpumo ląstelių auginimo terpėje tyrimas
Atliekant apžvalginius eksperimentus, įvertinti OR poveikį C6 gliomos ląstelių kultūrai buvo pasirinkti 0,1 µM, 1 µM, 10 µM, 25 µM ir 50 µM OR koncentracijų tirpalai. Mikroskopuojant pastebėta, kad naudojant 50 µM koncentracijos OR tirpalą medžiaga ląstelių mitybinėje terpėje yra linkusi keisti savo savybes – vyksta OR kristalizacija (6 pav.). Sumažėjus tirpumui, sumažėja naudojamo OR tirpalo koncentracija terpėje, o susidariusių kristalų užimamas plotas galimai trukdo ląstelėms proliferuoti, dėl šių priežasčių tolimesniems tyrimams pasirinkta 25 µM didžiausia OR tirpalo koncentracija.
6pav. 50 µM koncentracijos oleanolio rūgšties tirpalas ląstelių mitybinėje terpėje
Padidinimas 40 kartų
3.2 Oleanolio
rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių gyvybingumui
OR poveikis C6 gliomos ląstelių gyvybingumui buvo vertinamas dvigubo dažymo metodu naudojant PI ir Hoechst 33342 dažus. Vėžinės ląstelės buvo veikiamos skirtingomis oleanolinės rūgšties koncentracijomis nuo 0,1 iki 25 µM. Gyvos ląstelės šulinėliuose buvo suskaičiuojamos kas 24 valandas iš viso 4 paras. Ląstelių gyvybingumas išreikštas procentais nuo kontrolinės grupės, kuri buvo paveikta 1,5% DMSO tirpalu.
7 pav. C6 gliomos ląstelių gyvybingumas paveikus jas oleanolio rūgštimi 0 – 96 h laiko intervale
n=3, kiekvienas n po 3 šulinėlius
Gauti rezultatai (7 pav.) rodo, kad OR nepaveikė C6 gliomos ląstelių gyvybingumo naudojant skirtingų koncentracijų (0,1 µM - 25 µM) medžiagos tirpalus. Be to OR poveikis ląstelėms nepriklausė nuo inkubavimo trukmės.
Neuromokslų instituto biochemijos laboratorijoje K. Šalčiūno atliktų mokslinių tyrimų metu buvo vertinamas OR giminingo junginio – ursolo rūgšties – poveikis C6 ląstelių gyvybingumui taikant MTT metodą. Atliekant šį metodą ląstelės yra paveikiamos MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromido) oksidoreduktazės substratu, kuris yra priklausomas nuo NAD(P)H kiekio. Kuo daugiau gyvybingų ląstelių, tuo intensyviau vyksta substrato redukcija, kurios produktas netirpios, violetinės spalvos formazano druskos. Gauti rezultatai parodė, kad 10 µM ir didesnių UR koncentracijų tirpalai po 24 h inkubacijos sumažina C6 gliomos ląstelių gyvybingumą iki 3% [40].
Tad tiriant OR įtaką ląstelių gyvybingumui reikalingi tolimesni tyrimai ieškant biologinių taikinių, kuriuos veikiant būtų aktyvinama ląstelių žūtis.
0% 20% 40% 60% 80% 100% Kontrolė 0,1µM 1µM 10µM 25µM Ląs te lių gyvyb in gu m as %
Oleanoliorūgšties koncentracija µM
0h 24h 48h 72h 96h
3.3 Oleanolio
rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių proliferacijai
C6 gliomos ląstelės buvo inkubuojamos 96 h su 0,1 µM, 1 µM, 10 µM ir 25 µM koncentracijų OR tirpalais. Ląstelių tankis kiekvieną dieną buvo vertinamas fotografuojant jas šviesiniu mikroskopu ir skaičiuojant ląsteles matymo lauke.
Po pirmųjų 24 h nepastebėta jokių ryškių C6 gliomos ląstelių proliferacijos pokyčių. Įdomu tai, kad po 48 h ir 72 h OR sukėlė priešingą poveikį nei tikėtasi – ląstelių proliferacija buvo suaktyvinta. Rezultatai po dviejų parų parodė statistiškai reikšmingą ląstelių proliferaciją aktyvinantį OR poveikį su visais naudotais skirtingų koncentracijų rūgšties tirpalais. Po trijų parų vėžinių ląstelių proliferaciją statistiškai reikšmingai aktyvino 0,1 µM ir 10 µM OR koncentracijų tirpalai. Įvertinus ketvirtos paros duomens nustatyta, kad 1 µM koncentracijos OR tirpalas statistiškai reikšmingai aktyvavo proliferaciją, o tuo tarpu 25 µM koncentracijos OR tirpalas statistiškai reikšmingai nuslopino ląstelių dauginimosi procesą. Ląstelių skaičius lyginant su kontrole buvo 22% mažesnis (8pav.).
Japonijos mokslininkų atliktų tyrimų metu buvo nustatyta, kad OR pasižymi glioblastomos ląstelių proliferaciją slopinančiu poveikiu [32]. Jie nustatė, kad 30 µM ir didesnių koncentracijų OR tirpalai patikimai inaktyvuoja šį procesą stebint poveikį po 24 h. Ląstelių dauginimosi inaktyvinimą mokslininkai pagrindė STAT 3, transkripcijos veiksnio, kuris svarbus tumorogenezei aktyvacijos slopinimu [32].
8 pav. Oleanolio rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių proliferacijai
* statistiškai reikšmingas 0,1 µM OR tirpalo poveikis ląstelių skaičiui lyginant su kontrole # statistiškai reikšmingas 1 µM OR tirpalo poveikis ląstelių skaičiui lyginant su kontrole × statistiškai reikšmingas 10 µM OR tirpalo poveikis ląstelių skaičiui lyginant su kontrole + statistiškai reikšmingas 25 µM OR tirpalo poveikis ląstelių skaičiui lyginant su kontrole
Duomenys laikyti statistiškai reikšmingais, kai p<0,05 n=3, kiekviename n po 3 šulinėlių 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 24 48 72 96 L ąs te lių sk aič iu s (v n t) Laikas (h) Kontrolė 0,1µM 1µM 10µM 25µM * # x + * x # +
3.4 Oleanolio
rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių migracijai
Vėžinės ląstelės pasižymi gebėjimu migruoti ir infiltruotis į kitus audinius, kas neleidžia aiškiai atskirti auglio ribų. Šio proceso nuslopinimas pagerintų chirurginių operacijų rezultatus, nes būtų paprasčiau pašalinti naviką. OR poveikį C6 gliomos ląstelių kultūrai stebėjome 72 h „žaizdos gijimo“ metodu. Ląstelės buvo veikiamos 0,1 µM, 1 µM, 10 µM ir 25 µM koncentracijų OR tirpalais (9 pav.).
9 pav. Oleanolio rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių migracijai
* statistiškai reikšmingas 25 µM koncentracijos OR tirpalo poveikis lyginant su kontrole p<0,05 n=3, kiekvienas n po 3 šulinėlius
Gauti rezultatai (9 pav.) rodo, kad OR turi įtakos ląstelių migracijai. Atlikus rezultatų analizę pastebėta, kad po 48 h „užgijusios žaizdos“ plotas naudojant 25 µM koncentracijos OR tirpalą statistiškai reikšmingai skyrėsi, t.y., buvo mažesnis 16%, lyginant su kontroline grupe (10 pav.). Kitų autorių atliktų tyrimų duomenimis, vertinant glioblastomos ląstelių migracijos pokyčius, nustatyta, kad OR migraciją slopinantis poveikis tikriausiai yra susijęs su MAPK/ERK signalinių kelių inaktyvacija [34]. Tuo tarpu jau minėto K. Šalčiūno tyrimai [40] naudojant UR (OR izomeras) parodė, kad C6 ląstelių migraciją slopina 5 µM koncentracijos tirpalas, taikant analogišką „žaizdos gijimo“ metodą „žaizda nesugijo“ net po 72 h. Toks poveikis galėtų būti paaiškintas tuo, kad ląstelių migracijos slopinimas UR susijęs su MMP-9 aktyvumo slopinimu [41]. MMP-9 tai pagrindinis už naviko progresavimą ir gliomos ląstelių invaziškumą atsakingas baltymas.
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 0 24 48 72 " U žgi ju si os ž ai zd os " p lot as ( % ) Laikas (h) Kontrolė 0,1µM 1µM 10µM 25µM
*
10 pav. Oleanolio rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių migracijai „žaizdos gijimo“ metodu. A –
kontrolinė grupė; B – 25 µM koncentracijos oleanolinės rūgšties tirpalu paveiktos ląstelės. Poveikis stebėtas 72 h. Po trijų parų žaizda buvo pilnai sugijusi. Pavyzdinės nuotraukos padidinimas 40 kartų
3.5 Oleanolio
rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių invaziškumui
Vertinant OR poveikį C6 gliomos ląstelių invaziškumui buvo pasirinkti 10 µM ir 25 µM koncentracijų rūgšties tirpalai. Iš C6 gliomos ląstelių sudaryti sferoidai buvo paveikti minėtų koncentracijų OR tirpalais ir buvo stebimas ląstelių migravimas iš sferoido į periferiją (5 pav.).
Nustatyta, kad tik 25 µM koncentracijos OR tirpalas statistiškai reikšmingai sumažino C6 gliomos ląstelių invaziškumą po 72 h, numigruotas plotas lyginant su kontrole buvo 29% mažesnis (11 pav.). Ši OR savybė galėtu būti svarbi glioblastomos augliams, kuriems būdinga intensyvi invazija.
A
0h 24h 48h
B
11 pav. Oleanolio rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių invaziškumui
C6 gliomos ląstelių sferoidų invazija buvo vertinama ląstelių užimamu plotu pikseliais, Image J programa. Po 72 h inkubacijos 25 µM koncentracijos OR tirpalas statistiškai reikšmingai *(p <
0,05) sumažino ląstelių invaziškumą lyginant su kontroline grupe. n=3, kiekvienas n po 3 šulinėlius
3.6 Oleanolio
rūgšties poveikis C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo
greičiams
Mokslinių tyrimų duomenimis nustatyta, kad 50 µg/ml ir 100 µg/ml OR tirpalai turi įtakos aerobinės glikolizės procesui vėžinėse ląstelėse. Poveikis įvertintas naudojant žmonių krūties ir prostatos vėžio eksperimentinius ląstelių kultūrų modelius matuojant gliukozės bei laktato rūgšties kiekius, kurie OR paveiktose ląstelėse buvo sumažėję lyginant su kontroline grupe [30].
Apžvelgus 3.3-3.5 skyriuose pateiktus duomenis pastebėta, kad OR, naudojant 0,1-25 µM koncentracijų tirpalus, po 48 h ir 72 h aktyvina C6 gliomos ląstelių proliferaciją. Ląstelių dauginimąsi slopinantis OR poveikis nustatytas po 96 h inkubacijos, kai OR tirpalo koncentracija buvo 25 µM. Trumpalaikis migraciją slopinantis poveikis pastebėtas po 48 h inkubacijos, o C6 gliomos ląstelių invaziškumą slopinantis poveikis pasireiškė po 72 h, kai tirpalo koncentraciją buvo 25 µM. Norint išsiaiškinti ar toks poveikis yra susijęs su C6 gliomos ląstelių oksidacinio fosforilinimo sistema buvo nuspręsta ištirti, OR įtaką vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams. Šiems eksperimentams atlikti buvo naudojamas aukštos rezoliucijos respirometras Oxygraph-2k (OROBOROS, Austrija).
Visų pirma pasirinkta įvertinti tiesioginį OR poveikį C6 gliomos ląstelių mitochondrijoms (12 pav.). Ląstelėms permeabilizuoti naudotas digitonino tirpalas. Pradinis ląstelių kvėpavimo greitis (V0)
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 24 48 72 C6 g lio m os lą st elių u žim ta s p lo ta s (p ik se lia is) Laikas (h) Kontrolė 10µM 25µM *
buvo vertinamas į terpę pridedant I-ojo kvėpavimo grandinės komplekso substratų piruvato ir malato (antra metabolinė būsena ). Tada į kvėpavimo terpę pridedant skirtingų koncentracijų 0,1 µM, 1 µM ir 10 µM OR tirpalus buvo matuojamas jų poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiams. Įvertinti trečios metabolinės būsenos kvėpavimo greitį (V3) į kvėpavimo terpę įdėta ADP. Galiausiai, paveikus
citochromu c buvo vertinamas mitochondrijų išorinės membranos pažeidimas.
12 pav. C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo pavyzdys tiriant tiesioginį oleanolio rūgšties poveikį. Mėlyna linija – deguonies koncentracija kiuvetėje; raudona linija –
deguonies sunaudojimo greitis (pmol O2/s/2x106ląstelių). Dig – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo
greitis esant 10 µg digitonino; P+M – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis esant 1 mM malato ir 1 mM piruvato; OR – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis esant 0,1 µM, 1 µM arba 10µM OR
tirpalui; ADP – ląstelių kvėpavimo greitis esant 0,4 mM ADP; Cit.c – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis esant 30 µM citochromo c.
Nustatėme, kad OR neturėjo statistiškai reikšmingos įtakos C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams vertinant skirtingų (0,1 µM, 1 µM ir 10 µM) koncentracijų OR tirpalų poveikį antros ir trečios metabolinės būsenos metu, bei mitochondrijų išorinės membranos pažeidimo lygį (13 pav).
13 pav. Oleanolio rūgšties įtaka C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičių išvestiniams parametrams ir mitochondrijų išorinės membranos pažeidimui, tiesioginis rūgšties poveikis.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
VOR/VP+M VADP/VP+M VADP/VOR VCit.c/VADP
O 2 s un au do jim o g rei čio s an ty ki s Kontrolė 0,1µM 1µM 10µM
VOR/VP+M – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičio pridėjus pasirinktos koncentracijos OR tirpalo
santykis su kvėpavimo greičiu esant 1 mM piruvato ir 1 mM malato; VADP/VP+M – ląstelių
mitochondrijų kvėpavimo greičio pridėjus 0,4 mM ADP santykis su kvėpavimo greičiu esant 1 mM piruvato ir 1 mM malato; VADP/VOR – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo grečio pridėjus 0,4 mM ADP
santykis su kvėpavimo greičiu esant pasirinktos koncentracijos OR tirpalui; VCit.c/VADP – ląstelių
mitochondrijų kvėpavimo greičio pridėjus 30 µM citochromo c santykis su kvėpavimo greičiu esant 0,4 mM ADP
n=3
3.3 skyriuje aptartų eksperimentų duomenys parodė, kad OR turi įtakos, 0,1 – 25 µM konc. OR tirpalai aktyvina, C6 gliomos ląstelių proliferacijai inkubuojant jas bent 48 h, todėl mums buvo įdomu pažiūrėti ar tai susiję su mitochondirjų kvėpavimo greičių pasikeitimais. Ląstelės buvo inkubuojamos 24-72 h į mitybinę terpę priededant 0,1 µM, 1 µM ir 10 µM koncentracijų OR tirpalų. Mitochondrijų kvėpavimo greičiai išmatuoti respirometru (14 pav.). Ląstelių permeabilizacijai naudotas digitonino tirpalas, įvertinti V0 pridėta I-ojo kvėpavimo grandinės komplekso substratų
piruvato ir malato, įvertinti V3 į terpę įdėta ADP, mitochondrijų išorinės membranos pažeidimui
nustatyti pridėta citochromo c.
14 pav. C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo pavyzdys vertinant oleanolio rūgšties poveikį po 24-72 h inkubacijos. Mėlyna linija – deguonies koncentracija kiuvetėje;
raudona linija – deguonies sunaudojimo greitis (pmol O2/s/2x106ląstelių). Dig – ląstelių mitochondrijų
kvėpavimo greitis esant 10 µg digitonino; P+M – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis esant 1 mM malato ir 1 mM piruvato; ADP – ląstelių kvėpavimo greitis esant 0,4 mM ADP; Cit.c – ląstelių
mitochondrijų kvėpavimo greitis esant 30 µM citochromo c.
Išanalizavus gautus rezultatus (15 pav.) galime daryti išvadą, kad OR atliktų eksperimentų sąlygomis neturėjo įtakos C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams ląsteles inkubuojant 0,1 µM, 1 µM ir 10 µM koncentracijų tirpalais 24 h, 48 h ir 72 h.
15 pav. Oleanolio rūgšties įtaka C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičių išvestiniams parametrams ir mitochondrijų išorinės membranos pažeidimui inkubuojant ląsteles 24-72 h.
VADP/VP+M – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičio pridėjus 0,4 mM ADP santykis su kvėpavimo
greičiu esant 1 mM piruvato ir 1 mM malato; VCit.c/VADP – ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičio
pridėjus 30 µM citochromo c santykis su kvėpavimo greičiu esant 0,4 mM ADP. n=3-5
Šių tyrimų rezultatai neparodė jokio statistiškai reikšmingo OR poveikio C6 gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams, kurį būtų galima sieti su vėžinėms ląstelėms būdingu oksidacinio fosforilinimo pakitimu, tačiau rūgšties priešvėžinio aktyvumo negalima nuvertinti. Yra atlikta tyrimų, kurių metu nustatytas OR poveikis glikolizei [30], todėl tolesni eksperimentai tiriant galimą OR priešvėžinį poveikį galėtų būti vystomi šia kryptimi.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 O 2 s un au doj am o gr ei či o s an tyk is sa n ty k is 24 h Kontrolė 0,1µM 1µM 10µM 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 O 2 s un au doj am o gr ei či o sa n ty k is 48h Kontrolė 0,1µM 1µM 10µM 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 O 2 s un au doj am o gr ei či o sa n ty k is 72h Kontrolė 0,1µM 1µM 10µM
4 IŠVADOS
1. Nustatyta, kad 0,1-25 µM koncentracijų OR tirpalai neveikia C6 gliomos ląstelių gyvybingumo.
2. Nustatyta, kad tik 25 µM koncentracijos OR tirpalas po 96 h statistiškai reikšmingai nuslopino C6 gliomos ląstelių proliferaciją (22%). Tuo tarpu po 48 h ir 72 h ląstelių inkubacijos su 0,1 - 25 µM koncentracijų OR tirpalais buvo pastebėtas ląstelių proliferacijos suaktyvėjimas.
3. Nustatyta, jog 25 µM koncentracijos OR tirpalas sukelia tik trumpalaikį (pasireiškiantį po 48 h) C6 gliomos ląstelių migracijos slopinimą (16%), nes po 72 h inkubacijos OR ląstelių migracijos nebeveikė.
4. Parodyta, kad priešingai nei ląstelių migracijos atveju 25 µM koncentracijos OR tirpalas po 72 h inkubacijos statistiškai reikšmingai sumažino C6 gliomos ląstelių invaziškumą (29%).
5. Nustatyta, kad naudotomis eksperimentinėmis sąlygomis OR neturėjo jokio poveikio C6 ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiams skirtingose metabolinėse būsenose.
5
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Literatūros duomenimis OR – priešvėžinių aktyvumu pasižyminti medžiaga, galinti tiek slopinti vėžinių ląstelių proliferaciją, tiek sukelti ląstelių žūtį. Norint naudoti didesnių koncentracijų (>25 µM) OR tirpalus, kurie galėtų sukelti stipresni priešvėžinį aktyvumą, būtų naudinga atlikti rūgšties tirpumo tyrimus.
Tolimesni OR priešvėžinio aktyvumo tyrimai eksperimentuojant su C6 gliomos ląstelių linija galėtų būti tęsiami nagrinėjant aerobinės glikolizės procesą vėžinėse ląstelėse. Manoma, kad šis procesas yra svarbus taikinys vėžio chemoterapijoje.
6 L
ITERATŪROS SĄRAŠAS
1. WHO | Cancer mortality and morbidity. World Health Organization; [cited 2016 April 27]; Available from:http://www.who.int/gho/ncd/mortality_morbidity/cancer_text/en/
2. Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, Scheithauer BW, Kleihues P. The 2007 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System. Acta
Neuropathol. 2007 Aug; 114(2) p. 97-109.
3. Krex D, Klink B, Hartmann C, von Deimling A, Pietsch T, Simon M, Sabel M, Steinbach JP, Heese O, Reifenberger G, Weller M, Schackert G. Long-term survival with glioblastoma multiforme. Brain. 2007 October; 130 p. 2596-2606.
4. Álvarez de Eulate-Beramendi S, Álvarez-Vega MA, Balbin M, Sanchez-Pitiot A, Vallina-Alvarez A, Martino-González J. Prognostic factors and survival study in high-grade glioma in the elderly. British Journal of Neurosurgery. 2016 June; 30(3) p.330-336.
5. Laszczyk MN. Pentacyclic Triterpenes of the Lupane, Oleanane and Ursane Group as Tools in Cancer Therapy. Planta Medica. 2009 December; 75(15) p. 1549-1560.
6. Liu J. Oleanolic acid and ursolic acid: Research perspectives. Journal of Ethnopharmacology. 2005 August; 100(1-2) p. 92-94.
7. Pourgholi F, Hajivalili M, Farhad JN, Kafil HS, Yousefi M. Nanoparticles: Novel vehicles in treatment of Glioblastoma. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2016 February; 77 p. 98-107. 8. Brandes AA, Tosoni A, Franceschi E, Reni M, Gatta G, Vecht C. Glioblastoma in adults. Critical
Reviews in Oncology/Hematology. 2008 August; 67(2) p. 139-152.
9. Cheng N, Chytil A, Shyr Y, Joly A, Moses HL. Transforming growth factor-beta signaling-deficient fibroblasts enhance hepatocyte growth factor signaling in mammary carcinoma cells to promote scattering and invasion. Molecular cancer research. 2008 October; 6(10) p. 1521-1533.
10. Neringa B. Glioblastomos morfologinės išraiškos viščiuko embriono morfologinėje membranoje. Daktaro disertacija. Kaunas: Kauno Medicinos Universitetas, Biomedicinos mokslai; 2009. Prieiga per internetą:
http://vddb.library.lt/fedora/get/LT-eLABa-0001:E.02~2009~D_20090925_125120-17159/DS.005.0.01.ETD
11. Grobben B, De Deyn PP, Slegers H. Rat C6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion. Cell and Tissue Research. 2002 December; 310(3) p. 257-270.
