LA VIA DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE RHO/ROCK E I FUTURI APPROCCI TERAPEUTICI

INDICE

CAPITOLO 1 INTRODUZIONE Pag 4

1.1 Le proteine G “ 4

1.1a Le proteine G eterotrimeriche “ 4

1.1b Le proteine G monomeriche “ 4

1.1c La sub-famiglia delle proteine G monomeriche di tipo Rho “ 6

1.2 Il citoscheletro “ 7

1.2a Specifiche proteine modificano la dinamica di polimerizzazione alle estremità dei microfilamenti.

“ 9

1.2b La ramificazione dell’actina è controllata dal complesso Arp2/3 “ 10 1.2c Le proteine Rho, Rac e Cdc42 regolano la polimerizzazione dell’actina. “ 10

1.2.d La migrazione cellulare “ 11

1.3 La via di trasduzione del segnale Rho/ROCK “ 19

1.3a La struttura della proteina ROCK “ 20

1.3b Regolazione dell’attività di ROCK “ 22

1.3c I substrati di ROCK “ 23

1.4 LA PROTEINA Rho NEL FENOMENO DELL’APOPTOSI “ 25

1.4a Rho/ROCK come modulatori del processo apoptotico “ 25

1.4b Il ruolo di ROCK degli eventi morfologici apoptotici “ 27

1.4c Formazione delle vescicole “ 27

1.4d Fagocitosi delle cellule apoptotiche “ 27

1.5 Studi su topi Knockout “ 28

1.6 Conclusioni “ 29

CAPITOLO 2 LA PROTEINA Rho NELLA PATOLOGIA ASMATICA “ 30

2.1 La patologia asmatica “ 30

2.1a L’infiammazione delle vie aeree “ 34

2.1 b Il rimodellamento delle vie aeree “ 36

2.2 Conclusioni “ 39

CAPITOLO 3 LE PATOLOGIE CARDIOVASCOLARI “ 40

3.1 La via del segnale Rho\ROCK e il sistema cardiocircolatorio “ 40

3.2 ROCK e le patologie cardiovascolari “ 41

3.2.a L’infiammazione e l’aterosclerosi “ 41

3.2.b L’ipertensione “ 44

3.2.c L’ipertensione polmonare “ 45

3.2.d L’evento trombotico “ 47

3.2.e Le disfunzioni endoteliali “ 49

3.2.f Ipertrofia cardiaca e rimodellamento ventricolare “ 51

3.3 Conclusioni “ 51

CAPITOLO 4 LE PATOLOGIE TUMORALI “ 53

4.1 La via di trasduzione del segnale Rho/ROCK e il verificarsi del processo metastatico “ 53

4.1.a Il movimento ameboide “ 54

4.1.b La regolazione del movimento cellulare “ 56

4.2 Gli inibitori di ROCK nel trattamento delle neoplasie “ 58

4.2.a Fasudil “ 58

4.2.b Y-27632 “ 61

CAPITOLO 5 FARMACI DI USO CLINICO CON AZIONE SUL PATHWAY Rho\ROCK

“ 62

5.1 Le statine “ 62

5.1.a Meccanismo d’azione delle statine “ 62

5.1.b La rabdomiolisi associata all’utilizzo di statine “ 65

5.2 I glucocorticoidi “ 66

5.3 Gli estrogeni “ 67

5.4 Gli anestetici inalatori “ 68

5.5 I tiazolidindioni “ 69

CAPITOLO 6 STUDI PRECLINI E CLINICI SUGLI INIBITORI DI ROCK “ 71 6.1 Gli inibitori di ROCK nel trattamento delle patologie cardiovascolari “ 73 6.2 Gli inibitori di ROCK nel trattamento delle patologie oculari “ 77

6.2.a Glaucoma “ 77

6.2.b Rigenerazione della retina “ 79

6.2.c Trattamento dei danni alla cornea “ 79

6.3 Gli inibitori di ROCK nel trattamento del processo infiammatorio “ 80

6.5 L’inibizione della proteina Rho nel trattamento del danno spinale “ 81

6.5.a BA-210 “ 81

6.5.b Fasudil “ 83

6.6 Gli inibitori di ROCK nel trattamento delle malattie del Sistema Nervoso Centrale “ 83

6.6.a Il Morbo di Parkinson “ 83

6.6.b La sclerosi multipla “ 84

6.6.c La sclerosi amiotropica laterale (ALS) “ 84

BIBLIOGRAFIA “ 85

CAPITOLO 1

INTRODUZIONE

1.1 Le proteine G

Le proteine G sono molecole coinvolte nella trasduzione del segnale intracellulare in quanto sono direttamente associate a recettori di membrana. Nei mammiferi sono state identificate due classi principali di proteine G:

- le proteine G eterotrimeriche, costituite da tre subunità proteiche α, β, γ; - le piccole proteine G, corrispondenti a monomeri.

Tali proteine, siano esse monomeriche o trimeriche, sono GTPasi, cioè idrolizzano il GTP in GDP. In condizioni di non stimolazione la proteina G è nello stato inattivo e lega GDP, ma in seguito alla stimolazione recettoriale, da parte di una molecola segnale, la proteina subisce un cambiamento conformazionale e promuove lo scambio del GDP con il GTP; la proteina G rimane attiva finché il GTP non viene idrolizzato di nuovo a GDP.

1.1a Le proteine G eterotrimeriche

Le GTPasi eterotrimeriche sono direttamente associate a recettori di membrana caratterizzati da 7 domini transmembrana. Nello stato inattivo la subunità α lega il GDP ed è strettamente legata al complesso βγ. Il legame di una molecola segnale con il recettore determina un cambiamento conformazionale a livello delle subunità che provoca la sua dissociazione dal complesso βγ, e la sostituzione del GDP con una molecola di GTP. Entrambe le unità dissociate possono interagire con proteine bersaglio, che sono generalmente canali ionici oppure specifici enzimi, quali l’adenilciclasi, la fosfolipasi e la fosfodiesterasi.

1.1b Le proteine G monomeriche

Le piccole proteine G, caratterizzare da un basso peso molecolare (21000 Da), sono costituite da una sola subunità che è funzionalmente assimilabile alla subunità α e interagiscono con i recettori tirosin chinasici di membrana. Vengono attivate da proteine contenenti un gruppo di omologia per la serina (SH) e che interagiscono con i siti fosforilati del recettore tirosinchinasico e con le piccole

proteine G, dando così inizio ad una cascata di fosforilazioni a carico di chinasi (Schaafsma D, 2008 B).

Le proteine G monomeriche sono presenti nel citoplasma della cellula in due diversi stati, uno inattivo in cui sono legate al GDP e uno attivo in cui sono legate al GTP.

Per regolare l’attività delle proteine G monomeriche è necessaria l’azione di altre proteine accessorie, in quanto tali proteine sono caratterizzate da una bassa capacità idrolitica, proprietà necessaria per degradare il GTP legato; le proteine eterotrimeriche hanno una velocità di idrolisi del GTP 300-500 volte più elevata rispetto alle monomeriche. Per aumentare l’attività GTPasica intervengono le proteine GAP (GTPasi Activating Protein); all’interno del citoplasma cellulare sono state identificate diverse isoforme delle proteine GAP e ciascuna è risultata essere specifica per una specifica proteina G monomerica (Besson A, 2004; Schaafsma D, 2008 B).

Le proteine G monomeriche sono caratterizzate anche da una bassa capacità di scambio GTP-GDP e tale reazione è catalizzata dalle proteine GEP (Guanine nucleotide Exchange Protein) dette anche GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor), che sono caratterizzate, a livello della loro sequenza amminoacidica, dalla presenza di uno o più domini Plekstrin Homology (PH) (Schaafsma D, 2008 B)

A livello citoplasmatico sono presenti anche specifiche proteine inibitrici GDI (GDP Dissociation Inhibitor) che bloccano la forma inattiva della proteina G, legante il GDP, poiché ostacolano lo scambio con il GTP (Schaafsma D, 2008 B) (Figura 1.1).

Piccola proteina G-GDP Inattiva Attiva Piccola proteina G-GTP Effettori proteici Risposta cellulare

Segnale

Le proteine G monomeriche comprendono 5 sub-famiglie:

• La sub-famiglia Ras (Ras da Rat sarcoma) che gioca un ruolo importante nel processo di differenziazione e proliferazione cellulare.

• La sub-famiglia Rab (Rab da Rat brain) che è coinvolta nel traffico vescicolare. • La sub-famiglia Arf (Arf da ADP ribosylation factor) che ha la funzione di controllare il

processo di vescicolazione.

• La sub-famiglia Ran (Ran da Ras nuclear) che svolge un ruolo fondamentale nell’organizzazione dei microtubuli e nel trasporto nucleo-citoplasma.

• La sub-famiglia Rho (rho da Ras Homology) che svolge la sua funzione a livello del citoscheletro actinico (Figura 1.2).

Figura 1.2 Le sub-famiglie appartenenti alle proteine G monomeriche

1.1c La sub-famiglia delle proteine G monomeriche di tipo Rho

Queste proteine presentano un 30% di omologia a livello della sequenza amminoacidica con la sub-famiglia delle proteine Ras. Questa classe di proteine è caratterizzata dalla specifica sequenza CAAX a livello del dominio carbossi-terminale, dove C indica un residui di cisteina, A un residuo alifatico e X un qualsiasi amminoacido. A livello di questa specifica cisteina avvengono delle modifiche post-traduzionali, come l’aggiunta di un gruppo farnesile o geranilgeranile che si associano

alla proteina tramite un legame tioetere. Una volta avvenuta la reazione di prenilazione, una specifica proteina taglia i tre residui carbossi-terminali, ed il gruppo carbossilico terminale della cisteina subisce una metilazione con la formazione di un estere. Queste reazioni sono importanti per l’ancoraggio della proteina a livello della membrana plasmatica, passaggio fondamentale per l’attivazione della cascata del segnale (Wheeler AP, 2004).

I membri principali della famiglia di proteine Rho sono: Cdc42, Rac e Rho. Queste piccole proteine G monomeriche sono importanti all’interno della cellula in quanto su di esse convergono tutti i segnali derivanti dalla stimolazione di recettori di superficie implicati nel riarrangiamento della struttura del citoscheletro di actina (Etienne-Manneville S et al., 2002).

1.2 Il citoscheletro

Il citoscheletro è una complessa rete tridimensionale di proteine che si estende dal nucleo fino alla superficie interna della membrana citoplasmatica; esso stabilizza la posizione degli organuli, fornisce il sostegno meccanico alla cellula e favorisce il trasporto delle molecole.

Il citoscheletro è costituito da tre componenti: i microtubuli, i filamenti intermedi e i microfilamenti (Figura 1.3).

Microfilamenti

Filamenti

intermedi

Microtubuli

Figura 1.3 La struttura del citoscheletro.

I microtubuli sono proteine a forma di tubo cavo, formati da subunità della proteina tubulina. I filamenti intermedi sono costituiti da subunità fibrose, associate fianco a fianco per creare una struttura a cordone. I microfilamenti di actina, con un diametro di 7 nm, sono le strutture

citoscheletriche più sottili. L’actina è una proteina globulare a basso peso molecolare, presente in forma monomerica (G-actina solubile), in condizioni di bassa forza ionica, pH basico e a basse concentrazioni di Ca2+ e di ATP. Con l’aumento delle concentrazioni di ioni metallici, quali il Mg2+ ed il K+_{, la G-actina tende a polimerizzare in lunghi filamenti (F-actina), costituiti da due file di unità} globulari avvolte tra loro ad elica. All’interno di un microfilamento, tutti i monomeri di actina sono orientati nella stessa direzione, in modo che i microfilamenti abbiano una polarità intrinseca, con una estremità che differisce sia chimicamente che strutturalmente dall’altra. Grazie alla polarità i monomeri di actina G sono aggiunti e sottratti più rapidamente all’estremità positiva e più lentamente all’estremità negativa. Man mano che l’actina G è polimerizzata nei microfilamenti l’ATP legato viene idrolizzato ad ADP. Quindi le estremità di un microfilamento in crescita sono formate da actina F-ATP, mentre il corpo del filamento è composto da actina F-ADP.

I microfilamenti sono meglio conosciuti per la loro funzione nella contrattilità delle cellule muscolari, nelle quali interagiscono con i filamenti più spessi di miosina per scatenare la contrazione caratteristica del muscolo. I filamenti di actina non sono però confinati alle cellule muscolari, ma si trovano in quasi tutte le cellule eucariotiche, dove sono coinvolti in funzioni strutturali e di movimento.

Esempi di movimento cellulare in cui sono coinvolti i microfilamenti sono il movimento ameboide su una superficie di ancoraggio, e le correnti citoplasmatiche, un andamento regolare di flussi all’interno della cellula. Le cellule che strisciano possiedono strutture specializzate dette lamellipodi e filopodi all’estremità che avanza, le quali permettono loro di muoversi lungo una superficie. La forma delle protusioni sembra dipendere dalla natura del movimento cellulare e dall’organizzazione dei filamenti di actina all’interno della cellula. Nelle cellule che aderiscono strettamente al substrato sottostante e che non si muovo bene, fasci organizzati di actina, detti fibre di stress, si estendono dalla coda, o estremità trascinata, della cellula verso il lato anteriore; grazie alla presenza di queste strutture la cellula può esercitare una forza di trazione sulla matrice extracellulare. Le cellule che si muovo rapidamente, invece, non posseggono questi tipi di fasci di actina.

I microfilamenti inoltre sono coinvolti nella produzione del solco di clivaggio che divide il citoplasma delle cellule animali durante la citocinesi e sono anche localizzati nei punti di contatto tra cellula e cellula e tra cellula e matrice extracellulare.

Oltre a mediare una varietà di movimenti cellulari, i microfilamenti sono importanti nello sviluppo e nel mantenimento della forma della cellula. Infatti, molte cellule animali contengono una

densa rete di microfilamenti detta corteccia cellulare, distribuita nella zona posta immediatamente al di sotto della membrana plasmatica la quale conferisce una rigidità strutturale alla superficie cellulare e facilita il cambiamento di forma e il movimento della cellula.

Infine, fasci paralleli di filamenti di actina formano la struttura portante dei microvilli, le protrusioni digitiformi che di trovano sulla superficie di molte cellule animali.

L’actina, quindi, attraverso la formazione di differenti strutture citoscheletriche partecipa attivamente al processo di regolazione della forma e del movimento cellulare, in risposta a stimoli esterni ed a variazioni della composizione ionica dello spazio intra ed extracellulare.

1.2a Specifiche proteine modificano la dinamica di polimerizzazione alle estremità dei microfilamenti

Le cellule controllano il processo di polimerizzazione dei microfilamenti a livello di vari passaggi, tra cui quello di nucleazione dei nuovi microfilamenti e di allungamento di quelli già esistenti; esse controllano, inoltre, anche la velocità di depolimerizzazione dell’actina. La formazione, la stabilità e la degradazione dei microfilamenti sono regolate sia dalle proteine che dai lipidi della membrana plasmatica. Questi includono una varietà di proteine che legano l’actina e i fosfolipidi derivati dall’inositolo, che si trovano sulla superficie interna della membrana plasmatica, nonché, come già detto in precedenza, proteine G monometriche: Rac, Rho e Cdc42.

In assenza di altri fattori, la crescita dei microfilamenti dipende dalla concentrazione dell’actina G-ATP. Se la sua concentrazione è alta, i microfilamenti si assemblano sino a quando l’actina G non diventa limitante. Nella cellula, tuttavia, non è disponibile una grossa quantità di actina G libera, perché essa è normalmente legata alla proteina timosina β4. Una seconda proteina chiamata profilina sembra capace di trasferire i monomeri di actina G dalla timosina β4 all’estremità di un filamento in crescita, ma solo quando sono disponibili estremità libere. Ancora un’altra proteina chiamata ADF/cofilina, può legare l’actina G-ADP e l’actina F e si pensa che essa sia in grado di aumentare la velocità di turnover dell’actina-ADP all’estremità negativa dei microfilamenti. In questo modo, l’actina G-ADP rilasciata diventa disponibile per la conversione in actina G-ATP, che può essere riciclata per aggiunta all’estremità positiva dei microfilamenti.

La disponibilità delle estremità dei microfilamenti per una ulteriore crescita dipende dall’eventuale incappucciamento delle estremità stesse. L’aggiunta del cappuccio si verifica quando una proteina cappuccio che, legandosi all’estremità di un filamento ed inibendo ulteriori aggiunte o

sottrazioni di subunità, stabilizza il microfilamento. La proteina cappuccio che si lega all’estremità positiva dei microfilamenti è chiamata CapZ e il suo legame impedisce l’aggiunta di nuove subunità all’estremità positiva, mentre la sua rimozione permette di riprendere il processo di addizione di subunità.

1.2b La ramificazione dell’actina è controllata dal complesso Arp2/3

Oltre all’allungamento e all’accorciamento di singoli filamenti di actina, le cellule contengono altri tipi di reti di actina caratterizzate da filamenti di actina ramificati. Ad esempio, i lamellipodi contengono filamenti di actina ramificati a formare una rete dendritica. Le estremità sfrangiate di rami lineari si formano per polimerizzazione dei monomeri di actina attraverso la profilina e vengono incappucciate da proteine cappuccio. Il complesso di proteine Arp2/3 contribuisce alla formazione delle ramificazioni, mediante la nucleazione di nuovi rami laterali su filamenti preesistenti. La ramificazione dovuta ai complessi Arp2/3 è attivata da una famiglia di proteine che include la proteina della sindrome di Wiskott Aldrich, o WASP.

1.2c Le proteine Rho, Rac e Cdc42 regolano la polimerizzazione dell’actina

Le cellule che migrano devono regolare il tempo e il luogo in cui formare le protrusioni, mediante l’assemblaggio di reti di actina nei nuovi siti di formazione delle protrusioni ed il loro disassemblaggio nel momento in cui non sono più necessarie. Un ottimo esempio di tale regolazione è rappresentato dal notevole cambiamento a livello del citoscheletro delle cellule esposte a fattori di crescita. Ad esempio, in risposta alla stimolazione da parte del fattore di crescita di derivazione piastrinica (PDGF) i fibroblasti cominciano a crescere, a dividersi e a formare protrusioni della membrana ricche di actina, che somigliano ai lamellipodi. Altri fattori, come l’acido lisofosfatidico (LPA), inducono le cellule a formare le fibre da stress.

Questi cambiamenti strutturali a livello del citoscheletro sono resi possibile dall’azione delle piccole proteine G monometriche Rac, Rho e Cdc42 le quali hanno un effetto diverso sul citoscheletro di actina. Tali proteine sono essenziali affinché i fattori di crescita, come il PDGF, e l’LPA possano esercitare i loro effetti.

L’attivazione di Cdc42 scatena la polimerizzazione e la formazione di fasci di actina dando origine ai filopodi o protrusioni cellulari più corte chiamate microspine.

L’attivazione di Rac promuove la polimerizzazione dell’actina alla periferia della cellula che porta alla formazione di lamellipodi a forma di foglietto e di increspature della membrana (Yamazaki D, 2005).

Mentre l’attivazione di Rho promuove sia la formazione di fibre da stress, composti dall’unione di fasci di filamenti di actina con filamenti di miosina II, che il raggruppamento di integrine e di proteine associate per formare contatti focali. Questi cambiamenti strutturali drastici e complessi avvengono perché ciascuno di questi 3 interruttori molecolari ha numerose proteine bersaglio a valle che influenzano l’organizzazione e la dinamica dell’actina (Yamazaki D, 2005).

Figura 1.4 Ruolo delle proteine appartenenti alla famiglia Rho nella riorganizzazione citoscheletrica.

Alcuni bersagli chiave di Cdc42 attivata sono membri della famiglia di proteine WASP. Le proteine WASP, come le proteine della famiglia ERM, possono essere in una forma ripiegata inattiva e in una forma aperta attivata. L’associazione con Cdc42-GTP stabilizza la forma aperta di WASP, rendendola capace di legarsi al complesso ARP. Rac-GTP, oltre ad attivare membri della famiglia WASP, attiva la PI(4)P-5 chinasi, che genera PI(4,5)P2 (una forma di PIP2) (Yamazaki D, 2005).

Questi risultati indicano che queste piccole proteine G regolano la formazione dei diversi tipi di protrusioni. Esse svolgono questa funzione mediante la regolazione della polimerizzazione locale dei microfilamenti, che vengono quindi assemblati nei diversi tipi di protrusioni (figura 1.5).

Figura 1.5 Funzioni delle proteine Rho, Rac e Cdc42

1.2.d La migrazione cellulare

La migrazione cellulare può essere descritta come un processo ciclico ed estremamente dinamico, che richiede il perfetto coordinamento di numerose e complesse attività cellulari. Dal punto di vista concettuale, una cellula migrante può essere descritta come un’entità altamente polarizzata, con attività e strutture molecolari spazialmente segregate. Questa distribuzione funzionale asimmetrica consente di distinguere un fronte di migrazione e una porzione cellulare posteriore.

Affinché una migrazione regolata e direzionale abbia luogo, le attività di queste due porzioni, pur se separate spazialmente, devono essere estremamente coordinate.

Il processo di migrazione direzionale prende inizio con la risposta della cellula ad uno stimolo chemiotattico, proveniente dal microambiente circostante, che induce la polarizzazione delle strutture cellulari e la conseguente estensione di una protrusione citoplasmatica (guidata dal riarrangiamento dei filamenti di actina) nella direzione del movimento.

La successiva formazione di complessi di adesione, permette al fronte cellulare protrudente di interagire con il substrato circostante. Tali interazioni adesive servono, in parte, come punti di trazione per la migrazione, ma agiscono anche come segnali regolatori dell’intera dinamica cellulare.

Successivamente, si assiste alla contrazione del corpo cellulare e alla rottura delle interazioni adesive della estremità posteriore rispetto all’asse del movimento, che a questo punto si retrae, completando il ciclo di attività associate al movimento direzionale. È tuttavia importante sottolineare che le informazioni relative a questo modello sono state in gran parte ottenute studiando il comportamento in vitro di cellule migranti in un ambiente bidimensionale. Una comprensione approfondita della migrazione cellulare in vivo non può tuttavia prescindere dallo studio di cellule in movimento all’interno di spazi tridimensionali, cosa che si sta tentando di fare attraverso lo sviluppo di modelli sperimentali di migrazione in tre dimensioni, che consentano di monitorarne i riarrangiamenti morfologici e molecolari in condizioni analoghe a quelle fisiologiche.

Il punto chiave dei meccanismi di migrazione risiede nell’innesco della polarizzazione delle strutture sub-cellulari. Un’ampia gamma di molecole presenti nel microambiente extracellulare è stata in particolare descritta come capace di dare inizio e promuovere i processi di polarizzazione e migrazione cellulare. A seconda delle molecole stimolatorie, si distinguono tre tipi fondamentali di risposta migratoria:

- Chemochinesi: risposta cellulare a molecole in grado di indurre un fenotipo migratorio adirezionale, attraverso un incremento/diminuzione della velocità e frequenza dei movimenti cellulari, oppure mediante un aumento/decremento della frequenza o entità di movimenti rotatori.

- Chemiotassi: processo di migrazione direzionale, guidato da gradienti di sostanze chemio-attrattive/-repulsive all’interno di un determinato microambiente extracellulare.

- Aptotassi: processo di migrazione direzionale secondo un gradiente di molecole di adesione o di molecole chemio-attrattive/-repulsive legate ad un substrato. Gradienti adesivi di questo tipo si trovano normalmente all’interno della matrice extracellulare.

Le molecole in grado di indurre tali risposte migratorie sono state studiate in particolare nei leucociti, il cui pattern di migrazione verso i focolai flogistici rappresenta tuttora il miglior modello, seppur approssimativo, delle dinamiche di migrazione delle cellule staminali emopoietiche da, e verso, il microambiente midollare.

È possibile, quindi, schematizzare il processo di migrazione in diverse tappe: la polarizzazione della cellula, l’estensione dei lamellipodi, la formazione di nuovi contatti focali, la contrazione del corpo cellulare e il distacco della coda della cellula.

Le cellule sono caratterizzate da una sostanziale polarità antero-posteriore che morfologicamente si manifesta con un ampio lamellipodo anteriore e spesso con un altro posteriore,

retrattile, chiamato uropodio. In termini molecolari, la direzione della migrazione implica che venga stabilita e mantenuta un’asimmetria spaziale e temporale tra l’estremità anteriore e posteriore della cellula migrante delle componenti molecolari correlate ad adesione e migrazione. Questa distribuzione asimmetrica, o polarizzazione, è ampiamente conservata filogeneticamente dalle amebe ai mammiferi (Van Haastert e Devreotes, 2004) e sembra essere mediata da segnali provenienti dai recettori per le chemochine e per le integrine. Le proteine localizzate nella regione anteriore sono PI3K, l’actina, WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein), la cofilina, ARP2/3 (actin-related protein), Rac e Cdc42, mentre quelle localizzate nella regione posteriore sono la fosfatasi dei lipidi (PTEN: phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10), la miosina II, Rho e la calpaina. L’attivazione localizzata di PI3K ed i bassi livelli di PTEN, nella regione anteriore della cellula, inducono un rapido accumulo di fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato (PIP3) al fronte che avanza e tale accumulo asimmetrico di PIP3 attiva Rac. Tale attivazione avviene attraverso la formazione del legame tra il dominio PH di Rac-GEF e PIP3. È possibile, comunque, che Rac possa essere attivata indipendentemente da PI3K. In tal modo essa agirebbe a monte di PI3K (Keely et al., 1997; Inabe et al., 2002) legando la subunità regolatrice p85α (Bokoch et al., 1996) e creando così un meccanismo a feedback positivo in cui Rac attiva ed è attivata da PI3K (Weiner et al., 2002; Srinivasan et al., 2003).

Le cellule migrano estendendo le protrusioni in corrispondenza del fronte di avanzamento. Tali protrusioni possono essere ampie come i lamellipodi o allungate come i filopodi. I filopodi sono strutture monodimensionali che si presentano come proiezioni appuntite della membrana plasmatica. Essi si estendono dal fronte di avanzamento della cellule migranti e contengono filamenti di actina che formano legami incrociati con proteine leganti l’actina quali la fimbrina formando fasci. I filopodi formano adesioni focali con il substrato, collegandolo alla superficie cellulare. Una cellula migra lungo una superficie estendendo filopodi all’altezza del fronte di avanzamento. Essi si legano al substrato anteriormente alla via di migrazione, e in seguito la contrazione delle fibre di stress fa retrarre la parte posteriore della cellula che quindi si muove in avanti. Per chiudere una ferita nei vertebrati, i fattori di crescita si legano a recettori di membrana dotati di attività tirosino-chinasica e stimolano la formazione di filopodi nei fibroblasti in modo da indirizzare la divisione dei fibroblasti e chiudere la ferita.

I lamellipodi sono proiezioni ampie, presenti sul bordo di una cellula mobile. Essi sono strutture bidimensionali e contengono molti fasci di actina con numerosissimi rami collaterali. I fasci

di actina sono collegati da legami ortogonali, la maggior parte dei quali si trova su un piano parallelo al substrato solido.

Durante la nucleazione dei filamenti di actina verso la membrana plasmatica si forma una rete bidimensionale che si estende per tutto il lamellipodio. La rete nel suo insieme subisce un continuo rimodellamento, assemblandosi anteriormente e disassemblandosi posteriormente (Pollard et al., 2003).

Figura 1.7. Modello per la protrusione della rete di actina all’estremità guida di una cellula in movimento. Sono illustrati due momenti del processo di avanzamento dei lamellipodi. Le strutture assemblate in un secondo momento sono mostrate in colore più chiaro. La nucleazione è mediata dal complesso ARP al fronte. I filamenti di actina appena nucleati sono attaccati ai lati di filamenti preesistenti in gran parte ad angolo di 70°. I filamenti si allungano spingendo la membrana plasmatica in avanti. All’equilibrio, le estremità dei filamenti neosintetizzati diventano incappucciate, mentre i filamenti più vecchi vanno incontro a depolimerizzazione da parte della cofilina. Questo ciclo provoca una separazione spaziale fra assemblaggio netto di filamenti al fronte e disassemblaggio netto di filamenti posteriormente. In tal modo la rete di actina può muoversi nel suo insieme in avanti.

Ovviamente, affinché la cellula possa muoversi è necessario che porti il suo corpo in avanti. Per fare ciò si rende necessaria la formazione di nuovi contatti focali attraverso cui la cellula esercita trazione sul substrato. Man mano che la cellula si muove, nuovi contatti focali vengono formati e quelli vecchi, nella parte posteriore della cellula, vengono disassemblati.

I contatti focali sono stabiliti dall’interazione tra filamenti di actina e matrice extracellulare. In questi siti le fibre da stress terminano in corrispondenza della membrana plasmatica, dove si localizzano le integrine, gruppi di proteine di adesione transmembrana.

Le integrine funzionano da sistemi di adesione, tra la matrice extracellulare ed il citoscheletro, e da trasduttori del segnale, attivando una serie di proteine regolatorie e strutturali facenti parte dei contatti focali (Liu et al., 2000). I contatti focali, in questo modo, oltre a servire da ancore per le cellule possono anche trasmettere segnali dalla matrice extracellulare all’interno della cellula (outside-in) e viceversa (inside-out).

L’assemblaggio ed il successivo disassemblaggio delle adesioni focali sono determinati dalla dinamica associazione di proteine che si legano alla chinasi in maniera spazio–tempo regolata. Dopo la formazione dei lamellipodi, la formazione di nuovi contatti focali è un processo regolato inizialmente da Rac e successivamente, da Rho. Il turnover dei complessi focali e la contrazione del corpo cellulare è determinato dalla modulazione dell’attività delle due GTPasi.

Dopo che le cellule hanno fatto presa sul substrato, segue la contrazione del corpo cellulare. La contrazione del corpo cellulare dipende dalla contrazione dell’actino-miosina che è a sua volta regolata da Rho. Rho attiva la chinasi Rho (ROCK) che fosforila la catena leggera della miosina (MLC) nonché la fosfatasi che defosforila MLC (Amano et al., 2000). La fosforilazione della catena leggera della miosina attiva la miosina II, determinando l’aumento della contrazione delle stress fibers all’interno della cellula, e la trasmissione della conseguente tensione ai siti di adesione.

In una cellula in movimento, il distacco della regione posteriore può coinvolgere due tipi di meccanismi: uno che determina la riduzione della formazione di siti di contatto, l’altro che provvede alla loro dissoluzione. La fosforilazione operata da FAK su GRAF determina l’inibizione di Rho GTPasi provocando riarrangiamenti dell’actina citoscheletrica con conseguente disassemblaggio dei siti di contatto focale e riduzione della loro successiva formazione. Una proteolisi selettiva (ad opera della proteasi calpaina) delle molecole coinvolte nei siti di contatto ne determina la loro dissoluzione (Dourdin et al., 2001; Franco et al., 2004).

Quindi, l’adesione delle cellule, seguita dalla contrazione del citoscheletro, determina una tensione sul substrato che si converte in trazione quando si ha il rilascio dei punti di contatto focale. Durante il processo di migrazione, la trazione esercitata sul substrato determina l’avanzamento della cellula. Riassumendo, la locomozione di una cellula avviene in tre fasi principali:

1) Protrusione: la cellula si polarizza e le strutture di actina si spingono in avanti.

2) Attacco: il citoscheletro di actina nella parte anteriore della cellula si connette al substrato. Nuovi contatti focali sono formati anteriormente e quelli vecchi sono disassemblati nella parte posteriore della cellula man mano che striscia in avanti.

3) Trazione: la massa del citoplasma restante viene tirata in avanti per contrazione delle stress fibers

Protusione

Adesione

Traslocazione

Retrazione

Direzione  del  movimento

Substrato

Actina  polimerizzata  che  preme   sulla  membrana

Formazione  di  un  nuovo   contatto

Contrazione  dell’acto-­‐miosina     che  promuove  la  traslocazione  del  

corpo  cellulare

Perdita  dell’adesione

Actina Adesione Complesso Actina  e  miosina Proteina  della  famigli  Rho

Figura 1.9 La funzione delle proteine G monometriche nel movimento cellulare: Cdc42 svolge la sua funzione nel regolare la polarità della migrazione.

Rac ha un ruolo fondamentale nel determinare la formazione di protusioni di membrana determinando quindi il movimento in avanti.

Rho determina la contrazione della parte posteriore con il conseguente distacco del substrato (Yamazaki D, 2005).

I meccanismi che attivano i tre membri della famiglia di proteine Rho sono similmente complessi. La loro attivazione, tramite uno scambio di GTP con GDP, è promossa, come già detto, da fattori di scambio del nucleotide guaninico (GEF), di cui sono stati identificati più di 20 membri. Alcuni sono specifici per una singola GTPasi della famiglia Rho, mentre altri sembrano agire su tutti e tre. Nella maggior parte dei casi , i meccanismi che accoppiano i recettori all’attivazione dei GEF sono sconosciuti (Figura 1.10).

Membrana  plasmatica

Figura 1.10 Attivazione delle proteine Rho

1.3 La via di trasduzione del segnale Rho/ROCK

Le proteine Rho sono risultate essere coinvolte in diverse funzioni cellulari come l’organizzazione del citoscheletro, la crescita cellulare, la migrazione, l’apoptosi, la progressione del ciclo cellulare, il fenomeno metastatico e la risposta della cellula a stimoli di stress (Hall A 1994; Van Aelst L et al., 1997) (Figura 1.11).

Segnale extracellulare Effettori

00

Esistono 3 isoforme della proteina Rho: RhoA, RhoB e RhoC, che mostrano omologia nella sequenza amminoacidica dell’85%, ma hanno dimostrato svolgere ruoli diversi nella regolazione del citoscheretro e nella motilità cellulare. Nonostante la loro similarità amminoacidica alcuni regolatori o effettori interagiscono maggiormente con una delle 3 diverse isoforme. La proteina RhoA gioca un ruolo chiave nella regolazione della contrattilità dell’actomiosina, mentre RhoB, che è localizzata principalmente a livello degli endosomi, si è dimostrata coinvolta nei movimenti delle citochine e nella sopravvivenza cellulare ed infine, RhoC svolge il suo ruolo principale nella locomozione cellulare. (Wheeler and Ridley, 2004).

Uno degli effettori di Rho, identificato nel 1996, maggiormente caratterizzato e descritto in letteratura è la proteina ROCK (Rho chinasi) che appartiene alla famiglia delle serina/treonina chinasi (Shi J, 2007). La proteina ROCK è coinvolta in un’ampia gamma di funzioni fondamentali per la cellula come la contrazione, l’adesione, la migrazione e la proliferazione (Shi J, 2007).

Negli ultimi anni la via di trasduzione del segnale Rho/ROCK è stata oggetto di studio in vari campi della ricerca ed è stata posta particolare attenzione alla funzione di ROCK a livello del sistema circolatorio, del sistema nervoso centrale, dell’insorgenza delle neoplasie e dello sviluppo embrionale. Tali indagini hanno quindi dimostrato che ROCK è un importante bersaglio terapeutico per il trattamento di varie malattie cardiocircolatorie, di disordini neurologici e di cancro (Ishizaki T, 1996; Nakagawa O, 1996)

1.3a La struttura della proteina ROCK

La sequenza della proteina ROCK comprende un dominio serina/treonina chinasi localizzato nella regione ammino-terminale seguito da una regione centrale coiled-coil che contiene il dominio di legame per la proteina Rho (Rho binding domain, RBD) e un dominio carbossi-terminale PH che comprende al suo interno una sequenza ricca di cisteine (cysteine rich, CR) (Riento K, 2003).

Il dominio chinasico è composto da 300 amminioacidi mentre il dominio RBD risulta essere formato da 80 amminoacidi che vanno ad interagire con la Rho GTPasi attiva incluso RhoA, RhoB e RhoC (Hanks SK, 1988).

Il dominio PH va ad interagire con specifici mediatori lipidici quali l’acido arachidonico (AA) e la sfingosilfosforilcolina (SPC) (Erwig LP, 2006; Shirao S, 2002).

La regione ammino-terminale, sopra il dominio chinasico di ROCK, sembra essere coinvolta nell’interazione con gli specifici substrati ed è risultata essere importante anche per l’attività chinasica della proteina stessa (Shi J, 2007).

Figua 1.12 Struttura molecolare della proteina ROCK1 e ROCK2

La proteina ROCK ha un’attività autoinibitoria, ossia nella forma inattiva il dominio carbossi-terminale PH e la sequenza RBD interagiscono con il dominio chinasico formando un loop auto-inibitorio (Shi J, 2007) (Figura 1.13).

Sono state identificate due isoforme di ROCK: ROCK1 (chiamato anche ROCKβ o p160ROCK) e ROCK2 (chiamato anche ROCKα) che hanno una sequenza amminoacidica simile per il 65% e, in particolare, a livello del dominio chinasico hanno un’omologia del 92% (Matsui T, 1996; Nakagawa O, 1996). Le due isoforme sono ubiquitariamente espresse a livello dei tessuti umani (Ishizaki T, 1996) anche se ROCK2 risulta essere maggiormente localizzata a livello del cervello e del muscolo scheletrico mentre ROCK1 è maggiormente presente a livello del fegato, dei testicoli e del rene. Sia ROCK1 che ROCK2 sono ugualmente presenti a livello della muscolatura liscia vascolare e del cuore. Le due isoforme si trovano a livello citosolico quando la cellula è in uno stato di riposo ma in seguito ad uno specifico stimolo, che va ad attivare la proteina Rho, vengono traslocate a livello della membrana plasmatica (Wei L, 2001).

1.3b Regolazione dell’attività di ROCK

L’attività di ROCK è regolata attraverso molteplici distinti meccanismi (Tabella 1.1)

Tabella 1.1 Meccanismi di attivazione e inattivazione della proteina ROCK

Regolatore

Sito di interazione su ROCK

Effetto

Rho

Interazione con RBD (ROCK1/2)

Attivazione

AA

Interazione con il dominio PH(ROCK2)

Attivazione

SPC

Interazione con il dominio PH(ROCK2)

Attivazione

PI3,4,5P

,

PI4,5P

Interazione con il dominio PH(ROCK2)

Attivazione

Gem, Rad

Interazione con il dominio coiled-coil (ROCK1/2) Inattivazione

Caspasi 3

Interazione a livello di DETD1113 (ROCK1)

Attivazione

RhoE

Interazione con gli aminoacidi 1-420 di ROCK1

Inattivazione

Raf-1

Sito di interazione sconosciuto

Inattivazione

p21

_{Sito di interazione sconosciuto}

_{Inattivazione}

L’attività chinasica di ROCK è aumenta in seguito all’interazione tra il dominio RBD e la forma attiva di Rho con la conseguente alterazione dell’interazione tra il dominio catalitico e la regione carbossi-terminale di ROCK (Li H, 1998; Matsui T, 1996). In seguito all’attivazione di ROCK da parte di Rho si possono osservare svariati effetti che possono essere il cambiamento della contrattilità, della permeabilità cellulare, della migrazione, della proliferazione o dell’apoptosi.

Inoltre, mediatori lipidici come l’acido arachidonico (AA) (Feng J, 1999; Fu X, 1998) e la sfingosilfosforilcolina (SPC) (Shirao S, 2002) possono interagire con il dominio carbossil-terminale di ROCK e stimolarne quindi l’attività indipendentemente da Rho. A livello cellulare l’attivazione del segnale AA o SPC/ROCK è stato osservato a livello delle cellule della muscolatura liscia e determina un aumento della sensibilità all’aumento del calcio (Morikage N, 2006; Shirao S, 2002).

La caspasi 3 determina l’attivazione della proteina ROCK1 a livello delle cellule apoptotiche e in particolare la via di trasduzione del segnale caspasi3/ROCK causa la formazione delle vescicole a livello della membrana di tali cellule (Sebbagh M, 2001).

In letteratura sono stati anche descritti inibitori della proteina ROCK, ne è un esempio la proteina RhoE, che interagisce con la regione N-terminale di ROCK1 e previene il legame di Rho con il dominio RBD (Ongusaha PP, 2006; Riento K, 2003). Altri regolatori negativi di ROCK sono anche piccole proteine che legano il GTP come Gem e Rad, Raf-1, p21, ma il loro meccanismo d’azione non è ancora stato completamente spiegato (Du J, 2004).

1.3c I substrati di ROCK

Entrambe le isoforme, ROCK1 e ROCK2, fosforilano un’ampia varietà di proteine substrato caratterizzate dalla presenza di residui di serina e di treonina.

La maggior parte dei substrati di ROCK sono proteine cellulari associate alla regolazione del citoscheletro di actina ed in particolare molti di questi sono coinvolti nella regolazione della morte e della sopravvivenza cellulare (Hu E, 2005; Li Z, 2005). Allo stato attuale sono stati caratterizzati più di 20 substrati ed il primo target ad essere stato caratterizzato è la catena leggera della miosina (MLC) (Amano M, 1996; Kureishi Y, 1997). Studi hanno dimostrato che ROCK va ad incrementare la fosforilazione di MLC attraverso un effetto diretto su MLC oppure indirettamente attraverso l’inattivazione della fosfatasi di MLC. Con l’aumento della fosforilazione di MLC si ha una stimolazione a livello della contrattilità dell’actomiosina (Amano M, 1997; Ishizaki T, 1997).

Infatti, l’aumento della fosforilazione di MLC e la conseguente contrazione dell’actomiosina a livello delle cellule apoptotiche è associato alla formazione delle tipiche vescicole a livello della membrana plasmatica, alla disgregazione nucleare e alla frammentazione cellulare, eventi tipici del processo apoptotico che verranno approfonditi successivamente (Mills JC, 1998).

Inoltre, dati in letteratura riportano le modifiche apportate a livello del citoscheletro di actina in seguito all’azione di ROCK sono coinvolte nell’attivazione delle fasi iniziali del processo apoptotico come ad esempio la dimerizzazione recettoriale e la perdita dell’adesione tra le cellule.

Un altro substrato di ROCK identificato recentemente è risultato essere PTEN (Li Z, 2005). ROCK determina la fosforilazione di PTEN con la conseguente stimolazione dell’attività fosfatasica di quest’ultima. PTEN è un regolatore negativo della via di trasduzione del segnale fosfatidilinositolo 3-chinasi/Akt la quale determina l’attivazione di mediatori del segnale coinvolti in diversi processi biologici come ad esempio la sopravvivenza cellulare; in particolare è stato dimostrato che PTEN agisce riducendo la fosforilazione della proteina antiapoptotica Akt, con un conseguente aumento della morte cellulare (Di Cristofano A, 2000). Inoltre, ROCK si è dimostrata efficace nell’inibire il recettore dell’insulina S1 (insulin receptor substrate 1, IRS1) a cui fa seguito l’inattivazione di Akt (Begum N, 2002) (Figura 1.14).

Proteina ROCK attiva

MLC

PTEN IRS1 Ezrin MYPT1

Attivazione di Akt Via Intrinseca Espressione recettori di morte Via Estrinseca Contrazione actomiosina Perdita adesione

cellulare _{Processo apoptotico:}

● Formazione delle vescicole ●Disgregazione nucleare

● Frammentazione cellulare Cascata delle caspasi

Figura 1.14 Potenziali targets di ROCK nel segnale apoptotico. (MYPT1= fosfatasi di MLC)

Infine, due diversi studi hanno riportato dati contrastanti in quanto uno ha dimostrato che ROCK regola negativamente l’attivazione del PI3K in cellule della muscolatura liscia vascolare (Begum N, 2002). Mentre l’altro afferma che ROCK aumenta l’attivazione di PI3K in quanto va a fosforilare la proteina a livello dei residui di serina 632/635 a livello degli adipociti e in linee cellulari di muscolatura (Furukawa N, 2005). Quindi da questi dati emerge che ROCK è coinvolta sia nella

regolazione positiva che negativa della via di trasduzione del segnale PI3K/Akt e l’effetto prodotto dipende dal tipo di cellula in esame e dal tipo di stimolo (Figura 1.15).

Contrazione cellulare

Stabilizzazione dei filamenti di actina

Assemblamento

reticolo di actina _{actina-membrana}Collegamento

Adesioni focali

Rottura filamenti intermedi

Figura 1.15 La via di trasduzione del segnale Rho/ROCK

1.4 LA PROTEINA Rho NEL FENOMENO DELL’APOPTOSI 1.4a Rho/ROCK come modulatori del processo apoptotico Sono conosciuti 3 tipi diversi di morte cellulare:

1) Apoptosi: forma di morte controllata energia dipendente caratterizzata da cambiamenti conformazionali come condensazione della cromatina e distruzione della cellula in piccoli frammenti che vengono poi rimossi per fagocitosi (Danial NN, 2004).

2 Necrosi: morte incontrollata non dipendente dallo stato energetico della cellula ed è caratterizzata da edeme e rottura della membrana plasmatica portando al rilascio dei componenti cellulari ed a una risposta infiammatoria del tessuto (Jugdutt BI, 2005).

3) Autofagia: processo cellulare caratterizzato da sequestro del materiale citoplasmatico all’interno di vescicole che vengono poi degradate da parte del sistema lisosomiale (Shintani T, 2004). L’apoptosi avviene durante lo sviluppo e lo svolgersi della vita e gioca un ruolo importante nella normale omeostasi del tessuto (Danial NN, 2004). Una disregolazione del processo apoptotico è stata associata all’insorgenza di cancro, alla neurodegenerazione, a malattie autoimmuni e

cardiovascolari (Danial NN, 2004). L’apoptosi può essere iniziata attraverso 2 distinte vie, una intrinseca, che utilizza i recettori di morte localizzati a livello della membrana plasmatica e che rispondono a specifici segnali, e una estrinseca (Foo RS, 2005) (Figura 1.16).

Figura 1.16 La via intrinseca ed estrinseca dell’attivazione delle caspasi. I segnali di morte nella via estrinseca sono rappresentati da FasL e TNF-α che determinano l’attivazione della caspasi 8. Gli stimoli di morte nella via intrinseca sono indotti da Bid, Bad, Bak, che appartengono alla famiglia delle proteine Bcl-2.

Esteve e collaboratori (1998) hanno dimostrato che le proteine Rho sono capaci di indurre apoptosi in differenti sistemi cellulari. È stata verificato che Rho induce apoptosi mediante la formazione di ceramidi. Nello stesso studio è stato verificato che i livelli endogeni della proteina Rho aumentano quando le cellule sono esposte a condizioni che induco il processo apoptotico come ad esempio i trattamento con TNFα. Inoltre, un recente studio ha dimostrato che anche la proteina ROCK gioca un ruolo importante nella regolazione del processo apoptotico mentre risulta non essere coinvolta nell’autofagia (Shi, 2007).

1.4b Il ruolo di ROCK degli eventi morfologici apoptotici

La proteina ROCK è riconosciuta come la principale regolatrice degli eventi morfologici che si verificano durante la fase apoptotica, incluso la formazione delle vescicole a livello della membrana cellulare, la disgregazione nucleare e la frammentazione della cellula in corpi apoptotici (Figura 1.17).

Figura 1.17 Osservazione di cellule apoptotiche con microscopia a fluorescenza

1.4c Formazione delle vescicole

La formazione delle vescicole a livello della membrana plasmatica è regolata dalla fosforilazione della proteina MLC e dalla conseguente contrazione dell’actomiosina (Mills JC, 1998). Infatti, l’attivazione di ROCK1, a seguito dell’interazione con la caspasi3 è sufficiente e necessaria a determinare la formazione delle vescicole attraverso l’aumento della fosforilazione di MLC (Coleman ML, 2001). L’importanza di questa via nel determinare la formazione delle vescicole è stata confermata anche da altri studi in un’ampia varietà di tipi cellulari e indipendentemente dal tipo di stimolo apoptotico. Inoltre, ulteriori indagini che cellule caratterizzate da una iperespressione della forma wild-type di ROCK2 o da una proteina ROCK2 costitutivamente attiva vanno incontro al fenomeno di formazione delle vescicole a livello della membrana plasmatica attraverso l’attivazione della contrazione actomiosinica (Song Y, 2002).

1.4d Fagocitosi delle cellule apoptotiche

La fagocitosi delle cellule apoptotiche comprende 4 steps principali: il richiamo dei fagociti nel sito dove le cellule apoptotiche sono localizzate in risposta a specifici segnali di attrazione rilasciate dalle cellule; il riconoscimento delle cellule da parte dei fagociti attraverso specifiche molecole e recettori; la fagocitosi delle cellule apoptotiche; la degradazione delle cellule inglobate all’interno dei fagociti. Recenti studi hanno dimostrato che la via di trasduzione del segnale Rho/ROCK è coinvolta nell’eliminazione delle cellule apoptotiche attraverso la regolazione del citoscheletro di actina (Erwig LP,2006). Molti studi hanno puntato la loro attenzione per identificare il ruolo pro-apoptotico di ROCK in diverse linee cellulari. La fosforilazione di MLC mediante l’azione di ROCK agisce come

evento a monte richiesto per la contrazione della membrana e l’attivazione delle caspasi 8, 10 e 3. Inoltre ROCK media altri eventi molecolari come la prevenzione della distribuzione nucleare di ERK fosforilato e l’inibizione dell’induzione dell’inibitore del ciclo cellulare p21 e la traslocazione citosolica della ribonucleoproteina C1 e C2.

L’espressione di ROCK1 attivo è sufficiente per indurre la formazione delle vescicole apoptotiche ma non per regolare altri eventi come ad esempio la perdita della respirazione mitocondriale e il rilascio del citocromo C in cellule dell’epitelio polmonare (McElhinney B, 2003). Inoltre è stato anche dimostrato che riarrangiamenti a livello del citoscheletro di actina indotti dall’attivazione di ROCK sono coinvolti non solo nella fase finale del processo apoptotico ma anche a livello dei segnali intracellulari che danno inizio alla cascata del segnale apoptotico (McElhinney B, 2003).

Altri studi hanno invece messo in evidenza che le adesioni focali e l’attivazione delle integrine da parte di ROCK sono fenomeni coinvolti nella sopravvivenza cellulare (Shi, 2007). Inoltre altri dati riportati in letteratura affermano che ROCK sembra essere il principale responsabile dell’inibizione della fagocitosi, in quanto durante la degradazione delle cellule apoptotiche all’interno dei macrofagi la cascata del segnale Rho\ROCK\ERM determina la diminuzione del grado di maturazione dei fagosomi; inoltre una diminuzione dell’attività di Rho è stata registrata durante la fagocitosi delle cellule apoptotiche (Erwig, 2006).

Quindi in base ai dati riportati è possibile concludere che la funzione di ROCK nel regolare il processo apoptotico non è ancora completamente chiara poiché varia in base allo stimolo apoptotico e in base al tipo di cellula in esame.

1.5 Studi su topi Knockout

Recentemente sono stati generati topi knockout per ROCK1 e ROCK2 e questi mostrano un fenotipo diverso (Rikitake Y, 2005). Una comune caratteristica di questi topi è che dopo la nascita crescono apparentemente in salute e fertili (Shimizu Y, 2005). Inoltre è stato dimostrato che non c’è una iperespressione compensatoria di ROCK1 in topi knockout per ROCK2 e viceversa.

Un recente studio ha dimostrato che in topi ROCK1+/- è presente un’ipertrofia cardiaca ma la fibrosi cardiaca diminuisce in risposta a trattamento con angiotensina II. Topi ROCK1-/- _{mostrano una} ipertrofia cardiaca ma la fibrosi cardiaca si riduce in risposta a sovraccarico di pressione. Queste osservazioni suggeriscono che ROCK1 ha un ruolo nello sviluppo della fibrosi cardiaca ma non della

ipertrofia (Rikitake Y, 2005). Al contrario, la fibrosi renale non viene ridotta dalla perdita di ROCK1 suggerendo che la presenza di ROCK2 compensa la perdita di ROCK1 nella fibrosi renale (Fu P, 2006).

Altri studi in vivo condotti su topi knockout ROCK1-/- _{hanno rilevato il ruolo importante di} ROCK1 nell’apoptosi dei cardiomiociti che è un fattore critico nella progressione dell’insufficienza cardiaca. Infatti, la delezione di ROCK1 previene lo sviluppo della cardiomiopatia in molti modelli patologici (Foo RS, 2005).

Questi studi suggeriscono che ROCK1 e ROCK2 hanno delle funzioni in vivo che non possono essere interscambiate.

1.6 Conclusioni

Le proteine ROCK1 e ROCK2, oltre ad avere funzioni sovrapponibili si compensano a vicenda per sopperire alla mancanza di funzione di una delle due isoforme. Inoltre le due proteine esplicano funzioni specifiche a livello di alcuni tessuti e questo è dimostrato dal fatto che hanno una localizzazione tissutale ben precisa, hanno una determinata posizione subcellulare, vengono attivate da specifici segnali e interagiscono con selettive molecole effettrici a valle.

CAPITOLO 2

LA PROTEINA Rho NELLA PATOLOGIA ASMATICA

2.1 La patologia asmatica

Figura 2.1 Effetti della patologia asmatica a livello delle vie respiratorie

L’asma allergica è una malattia infiammatoria delle vie aeree caratterizzata da una riduzione del calibro delle vie respiratorie in seguito all’esposizione ad un allergene seguita poi dall’infiltrazione e dall’attivazione delle cellule infiammatorie (Bousquet J, 2000) (Figura 2.1). Il soggetto asmatico sviluppa poi una iperesponsività (AHR) ad una ampia gamma di stimoli inclusi i neurotrasmettitori e i mediatori dell’infiammazione che sono stati rilasciati durante la reazione allergica. Lo sviluppo di AHR è determinato dall’alterazione del controllo neurogenico e non-neurogenico della muscolatura liscia e da cambiamenti fisiologici, come il danno dello strato epiteliale e il rimodellamento delle vie aeree. Quest’ultimo processo è caratterizzato da cambiamenti strutturali permanenti delle vie aeree come l’aumento della deposizione delle matrice extracellulare e l’ispessimento della muscolatura liscia (Cockcroft DW, 2006).

L’evento cruciale della contrazione della muscolatura liscia delle vie respiratorie è rappresentato dalla fosforilazione della catena leggera di 20 kDa della miosina (MLC20) ad opera della specifica chinasi Ca2+_{\calmodulina-dipendente, denominata myosin light chain kinase (MLCK). In seguito alla} fosforilazione a livello della serina 19 la MLC20 subisce una modificazione conformazionale responsabile di due eventi: lo smascheramento, a livello della testa miosinica, del sito di attacco per l’actina e l’attivazione della funzione ATPasica intrinseca. La conseguente scissione dell’ATP genera l’energia necessaria per assicurare il movimento coordinato di trazione e flessione delle teste miosiniche che provoca lo spostamento in senso centripeto dei filamenti di actina (Amano M, 1996).

La contrazione della muscolatura liscia è sottoposta a complessi meccanismi di regolazione. L’attivazione della MLCK è drasticamente ridotta dalla fosforilazione dell’enzima ad opera di varie chinasi. Eccessivi aumenti della concentrazione citosolica di Ca2+ libero si associano all’attivazione della Ca2+_{/calmodulina chinasi II, che è in grado di fosforilare la MLCK riducendone così l’attività. Tale} fenomeno è espressivo di un meccanismo dualistico finalizzato a limitare gli effetti negativi conseguenti al sovraccarico di tensione muscolare. La MLCK può anche essere fosforilata dalla chinasi cAMP-dipendente (PKA), con analoga riduzione dell’attività (Amano M, 1996).

Oltre che dall’attività della MLCK la contrazione della muscolatura liscia può anche essere regolata da altri sistemi enzimatici. La proteina ROCK è in grado di fosforilare MLC20 con azione sinergica a quella di MLCK. Ciò si traduce in una condizione di sensitizzazione dell’apparato contrattile al calcio, per cui ad una determinata concentrazione di calcio libero citosolico la forza di contrazione risulta più elevata.

Quindi, in condizioni normali la sensitizzazione al Ca2+ _{mediata dalla via Rho/ROCK} contribuisce alla contrazione della muscolatura liscia delle vie aeree (Figura 2.2).

Allo stato attuale la patologia asmatica viene curata mediante l’utilizzo di broncodilatatori β2 adrenergici e glucocorticoidi. I glucocorticoidi sono impiegati per prevenire il rimodellamento delle vie aeree ma non sono efficaci nel risolvere i cambiamenti strutturali, mentre i β2 agonisti hanno mostrato avere minimi effetti sul fenomeno del rimodellamento delle vie aeree  ( Bateman ED, 2008).

Risulta quindi necessario individuare nuovi targets per rendere più efficace il trattamento della patologia asmatica. Come già detto, le Rho-chinasi hanno un ruolo centrale nello sviluppo dell’asma e quindi sono i nuovi bersagli su cui vanno ad agire nuovi composti con potenziale effetto antiasmatico. In particolare la proteina G monomerica RhoA è stata identificata come il principale attivatore delle Rho chinasi a livello delle vie aeree. Infatti l’isoforma RhoA risulta essere altamente espressa a livello della muscolatura liscia delle vie aeree. Studi condotti su modelli animali di cavia hanno evidenziato valori alti della proteina RhoA dopo l’esposizione all’allergene (Schaafsma D, 2008 A).

Un altro attivatore di RhoA a livello delle vie respiratorie è risultato essere l’acido arachidonico che va ad attivare ROCK in modo indipendente da RhoA, poiché va a legarsi alla porzione C terminale del dominio coiled-coil di ROCK il quale agisce come dominio auto inibitorio.

Da uno studio in vitro è risultato che ROCK regola il rapporto tra actina G e F a livello delle vie aeree (Schaafsma, 2008).

È stato inoltre dimostrato che a livello della muscolatura liscia della trachea bovina l’effetto contrattile degli agonisti muscarinici, totali o parziali, che agiscono a livello del recettore M3, dipendono in modo differente da ROCK (Schaafsma D, 2006 A). La contrazione indotta da basse concentrazioni di entrambi i tipi di agonisti dipendono in maniera diretta dall’attivazione di ROCK, mentre alle massime concentrazioni la presenza di ROCK influenza solo l’azione degli agonisti parziali. Questi dati indicano che il contributo funzionale di ROCK a livello della contrazione indotta dagli agonisti muscarini dipende dalla capacità di mobilizzare il calcio dalle riserve intracellulari (Schaafsma D, 2006 B) (Figura 2.3).

Figura 2.3 I recettori muscarinici mediano la contrazione nella patologia dell’asma in seguito all’attivazione di RhoA

È stato identificato un ruolo recettore-dipende per ROCK nella regolazione della contrazione della muscolatura liscia delle vie aeree. Nella muscolatura liscia della trachea di cavia la contrazione indotta dalla prostaglandina F2α, che agisce attraverso l’interazione con il recettore FP accoppiato alla

proteina Gq\11, viene diminuita dalla presenza di ROCK, mentre la contrazione indotta in seguito alla stimolazione con istamina, a livello del recettore H1, è totalmente indipendente dall’attivazione di ROCK (Schaafsma D, 2004). Un così diverso coinvolgimento di ROCK nella ostruzione delle vie respiratorie indotta dalle prostaglandine e dall’istamina è stata osservata anche in vivo. Inoltre, la contrazione indotta dalle metacolina e da KCl (depolarizzazione della membrana, recettore indipendente) diminuisce parzialmente sotto l’effetto di ROCK (Gosens R, 2004 B).

La contrazione della muscolatura liscia può anche essere regolata da processi di fosforilazione\defosforilazione di alcune proteine regolatrici associate all’actina, in particolare il caldesmone e la h1 calponina. Nella forma defosforilata queste proteine sono legate ad alta affinità all’actina ed ostacolano lo scorrimento dei filamenti sottili su quelli spessi. La fosforilazione della calponina e del caldesmone riducono l’affinità per l’actina facilitandolo scorrimento dei filamenti di miosina su quelli di actina. E’ stato di recente documentato che le Rho GTPase sono in grado di

fosforilare il caldesmone e la calponina facilitando la risposta contrattile della muscolatura liscia tracheo-bronchiale (Schaafsma D, 2008 B).

In modelli di cavia è stato dimostrato che ROCK è coinvolto nell’aumento di resistenza delle vie aeree indotta da molti agonisti come l’acetilcolina, PGF2α e l’istamina e che l’inalazione di un inibitore di ROCK (Y-27632) può causare una considerevole bronco protezione in condizioni basali.

Da questi dati si può concludere che ROCK è coinvolto nello sviluppo della patologia dell’asma (Schaafsma D, 2008 B).

2.1a L’infiammazione delle vie aeree

L’infiammazione delle vie aeree è associata ad un aumento dell’infiltrazione e dell’attivazione delle cellule infiammatorie a livello delle vie respiratorie. Le proteine G monomeriche e i loro effettori sono stati identificati come mediatori importanti in molte fasi del processo infiammatorio tra cui la migrazione delle cellule infiammatorie, la chemiotassi e l’infiltrazione all’interno delle vie aeree (Jeffery PK, 1998).

In particolare è stato identificato il ruolo principale svolto dalla via di trasduzione del segnale Rho/ROCK nel processo infiammatorio a livello delle vie respiratorie. Studi in vitro (Schaafsma, 2008) hanno dimostrato il ruolo cruciale di RhoA e ROCK nella chemiotassi degli enosinofili in risposta a eotaxin. In supporto a questi dati recenti ricerche svolte su modello animale hanno evidenziato il ruolo di ROCK nelle eosinofilia polmonare. Inoltre è emerso che ROCK determina la liberazione di chemochine e citochine (IL5 e Il3) anche se il preciso meccanismo che sta alla base di questo effetto deve essere ancora stabilito (Schaafsma D, 2008 B).

La riduzione dell’integrità della barriera endoteliale è un evento importante coinvolto nel processo infiammatorio delle vie aeree del soggetto asmatico. La riduzione delle funzioni della barriera endoteliale è determinata dalla contrazione, mediata dall’actomiosina, delle cellule endoteliali in quanto determina l’infiltrazione di cellule a livello del tessuto.

Uno studio (Saito, 2002) ha dimostrato che nelle cellule endoteliali HUVEC la riduzione della fosforilazione della miosina attraverso l’inibizione di Rho o MLCK aumenta l’integrità della barriera endoteliale e previene il transito delle cellule infiammatorie. Inoltre, è stato recentemente trovato che l’effetto protettivo di HGF (hepatocyte growth factor) sulla iperpermeabilità dello strato endoteliale indotta dalla trombina è mediato attraverso l’inibizione dell’attivazione di Rho, dall’associazione di Rho

con il fattore di scambio dei nucleotidi p115-RhoGEF e la fosforilazione della catena leggera della miosina (Birukova AA, 2007).

Sebbene tutti questi studi siano stati condotti utilizzando modelli in vitro, questi effetti possono essere importanti anche in vivo. Da studi condotti su modello di topo asmatico è emerso che l’inibizione di ROCK attenua sia l’edema che la migrazione dei neutrofili a livello polmonare mediante la modulazione della contrazione delle cellule endoteliali, indotta dai mediatori dell’infiammazione, e mediante la regolazione del sequestro dei neutrofili (Tasaka S, 2005) (Figura 2.4).

In letteratura è descritto uno studio che ha lo scopo di valutare il ruolo di ROCK nel processo infiammatorio asmatico. Lo studio è stato condotto in vivo su una popolazione di 25 topi di sesso femminile che è stata divisa in 3 gruppi: 1 gruppo di controllo, i gruppo asmatico e un gruppo trattato. Il gruppo asmatico e il gruppo trattato sono stati sensibilizzati con ovalbumina mediante un’iniezione intraperitoneale (25 microg) mentre i controllo è stato trattato con una soluzione salina. Agli animali del gruppo trattato è stata somministrata intraperitonealmente una dose di 10 mg\kg di fasudil 1 ora prima della sensibilizzazione. Gli animali sono stati poi sacrificati ed è stato raccolto il fluido di lavaggio broncoalveolare al fine di poter contare le cellule infiammatorie e gli eosinofili ivi presenti. Le citochine e le chemochine sono state valutate mediante saggio ELISA, l’espressione di ROCK è stata valutata mediante PCR ed è stata poi effettuata anche l’analisi istologica del tessuto polmonare. I risultati ottenuti mostrano che l’ovalbumina causa un aumento delle cellule dell’infiammazione e degli eosinofili a livello del fluido broncoalveolare. Dopo somministrazione di fasudil si registra una significativa diminuzione del numero delle cellule dell’infiammazione e degli eosinofili; nel dettaglio il numero di eosinofili varia da (0,52±0,06)×109_{/l a (0,20±0,40) ×10}9 _{/ l. Lo studio ha inoltre dimostrato che l’ovalbumina induce il} rilascio di IL-5 (157±23 ng/l) e IL-3 (429±46 ng/l) nel fluido broncoalveolare, dopo somministrazione di fasudil si registra una diminuzione di tali valori che passano rispettivamente a ±14 ng/l e 254±28 ng/l. inoltre, l’ovalbumina determina l’infiltrazione delle cellule infiammatorie nelle vie respiratorie e nei vasi sanguigni, l’applicazione di fasudil determina una significativa diminuzione del fenomeno dell’infiltrazione. I livelli espressivi di ROCK-1 sono più alti nel gruppo asmatico rispetto al controllo e tali valori di attenuano dopo il trattamento con fasudil. Lo studio ha infine dimostrato che l’espressione di ROCK-1 è strettamente correlata con il numero degli eosinofili e con i livelli di IL-3 e IL-5. Quindi da questi dati si può affermare che ROCK-1 è coinvolto nel processo infiammatorio asmatico e che fasudil può essere un potenziale farmaco per la cura della patologia asmatica (Wu et al, 2009).

2.1 b Il rimodellamento delle vie aeree

Le vie aeree infiammate cronicamente sono soggetto al processo del rimodellamento che determina la perdita delle funzioni polmonari nel soggetto asmatico (Hirst SJ, 2000). Tale processo fisiologico prevede un aumento del numero delle cellule della muscolatura liscia e dei miofibroblasti che contribuiscono all’ispessimento delle vie aeree (Schaafsma D, 2008 B).

In generale, la proliferazione della muscolatura liscia può essere indotta principalmente da: fattori di crescita, agonisti della contrazione e citochine pro-infiammatorie (Gosens R, 2003) (Figura 2.5).

Figura 2.5 Proliferazione cellulare nell’asma

L’aumento della massa della muscolatura liscia delle vie aeree è dovuto, almeno in parte, da un aumento della proliferazione della muscolatura liscia dovuta all’effetto sinergico ed additivo da parte di numero elevato di fattori di crescita, di mediatori dell’infiammazione e di neuro trasmettitori (Gosens R, 2003). I fattori di crescita come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), il fattore di crescita dell’epidermide (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) sono gli induttori più efficaci della proliferazione delle cellule mesenchimali e possono avere un ruolo importante nell’asma.

Recenti studi condotti sulla muscolatura liscia umana suggeriscono un ruolo chiave di Rho e ROCK nella proliferazione indotta da siero fetale bovino (FBS) (Takeda N, 2006). È stato visto che la simvastatina previene la proliferazione indotta da FBS attraverso l’inibizione della geranilgeranilazione e quindi l’attivazione di Rho (Ediger TL, 2003).

Un altro possibile meccanismo che porta alla crescita della massa della muscolatura delle vie aeree può essere dovuto alla migrazione della muscolatura liscia. Sebbene il significato funzionale di

questo fenomeno non sia ancora ben stato compreso si pensa che la migrazione sia importante per il processo di riparazione dei tessuti e sembra che contribuisca al rimodellamento delle vie aeree. I segnali cellulari che stanno alla base del processo della migrazione sembrano includere le vie di trasduzione del segnale Rho/ROCK e quella di PI3K. È stato infatti dimostrato che l’inibizione della via che coinvolge PI3 previene la migrazione delle cellule della muscolatura liscia in risposta allo stimolo di PDGF. Il meccanismo secondo il quale PI3 è coinvolto nella migrazione cellulare non è ancora stato capito ma sembra che coinvolga l’attivazione di Cdc42, Rac1 e PAK1 (Schaafsma D, 2008 A).

Il meccanismo secondo il quale la via Rho/ROCK influenza la migrazione cellulare coinvolge la modulazione della fosforilazione di MLC (Figura 2.6).