LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Indrija Šidlauskaitė
Erkinio encefalito viruso molekulinė diagnostika ožkų piene
Molecular diagnostics of tick – borne encephalitis virus in goat
milk
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: prof. dr. Arūnas Stankevičius
DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas ,, Erkinio encefalito viruso molekulinė diagnostika ožkų piene”.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui.
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
________________________________________________________________________ (vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SANTRUPOS ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 ĮVADAS... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Viruso charakteristika ... 10 1.2. Viruso sandara ... 11 1.3. Viruso rezervuarai ... 121.4. Viruso perdavimo būdai ... 13
1.5. Klinikiniai požymiai... 15
1.6. Patogenezė ... 15
1.7. Laboratorinė diagnostika ... 16
1.8. Epidemiologija ... 17
2. TYRIMŲ MEDŽIAGOS IR METODAI ... 20
2.1. Tyrimų vieta... 20
2.2. Ožkų pieno mėginiai ... 21
2.3. RNR medžiagos ekstrakcija... 21
2.4 Lizdinė atvirkštinės transkripcijos (AT) polimerazinė grandininė reakcija (PGR) ... 22
2.4.1. I PGR ... 22
2.4.2. II PGR ... 24
2.5. Elektroforezė ... 26
2.6. Realaus laiko TaqMan polimerazinė grandininė reakcija ... 27
2.7. Statistinė duomenų analizė ... 28
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 29
3.1. Lizdinės AT-PGR ir realaus laiko TaqMan PGR rezultatai ... 29
3.1.1. Oligonukleotidinių pradmemnų palyginimas ... 29
3.1.3. EEV gautų teigiamų mėginių priklausomybė nuo ūkio dydžio ... 32
3.1.4. EEV tyrimo rezultatai ožkų pieno mėginiuose skirtingais ganymo mėnesiais ... 33
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 34
IŠVADOS ... 36
PADĖKA ... 37
SANTRUPOS
AT–PGR – atvirkštinė polimerazinė grandininė reakcija bp – bazių poros
C – EEV kapsidės struktūrinis baltymas (angl. capsid)
CI% – statistinis patikimumo intrervalas (angl. Confidence interval) Ct - ciklo slenkstis (angl. Cycle threshold)
DC – dendritinės ląstelės (angl. dendritic cells) DNR – deoksiribonukleino rūgštis
EE – erkinis encefalitas
EEV – erkinio encefalito virusas
HASR – hemagliutinacijos stabdymo reakcija IFA – imunofermentinė analizė
kDNR – komplementari deoksiribonukleino rūgšties grandinė M – EEV membraninis struktūrinis baltymas
n – mėginių skaičius
NR – EEV nekoduojantys regionai p – statistinis patikimumas
PGR – polimerazinė grandininė reakcija
prM – EEV priešmembraninis struktūrinis baltymas proc. – procentai
ERKINIO ENCEFALITO VIRUSO MOLEKULINĖ DIAGNOSTIKA OŽKŲ PIENE
Indrija Šidlauskaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Erkinio encefalito virusas (EEV) yra ypač auganti grėsmė, nes susirgimų erkiniu encefalitu daugėja ir šis virusas geografiškai greitai plinta. Didelis pavojus užsikrėsti EE žmonėms yra vartojant užkrėstą nepasterizuotą ožkų pieną ir jo produktus. EE liga sukelia neurologinius sutrikimus, kurie gali išlikti visą likusį žmogaus gyvenimą. Svarbu paminėti tai, jog šis virusas yra zoonotinis, tačiau klinikiniai požymiai gali pasireikšti tik kai kurioms gyvūnų rūšims. Ši sritis Lietuvoje dar nebuvo tyrinėta, todėl buvo labai svarbu atlikti žvalgomuosius EEV paplitimo tyrimus ožkų piene. Šio darbo tikslas – molekuliniais metodais įvertinti žmonėms pavojingo erkinio encefalito viruso žvalgomąją epidemiologinę situaciją Lietuvoje laikomų ožkų piene. Iš viso buvo surinkti ir molekuliniais tyrimais ištirti 283 ožkų pieno mėginiai. Šio tyrimo objektai - 8 privatūs ožkų ūkiai, kurie pasiskirstę po visą Lietuvą. Mėginiai rinkti nuo birželio iki spalio mėnesio, ganykliniu laikotarpiu, laktacijos periodu. Tyrimams naudoti bendri jungtiniai (iš bendros pieno talpos) ožkų pieno mėginiai, kurie buvo imti periodiškai kas keturias dienas iš kiekvieno ūkio. Taikant konvensinės ir realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos metodus bei skirtingus oligonukleotidinius pradmenis (NS3, NS5, NCR5) ištirti ožkų pieno mėginiai bei gauti preliminarūs rezultatai. Teigiamų RNR viruso mėginių nustatyta 15 (5,3 proc. [CI% 3,00-8,59]), rezultatai gauti panaudojus NS5, NCR5 oligonukleotidinius pradmenis. Atlikus tyrimus su NS3 oligonukleodiniais pradmenimis įvertinta, kad diagnostikoje šie pradmenys netinka (p<0,001). Ištyrus jungtinius ožkų pieno mėginius nustatyta koreliacija tarp teigiamų mėginių skaičiaus ir ūkio dydžio. Mažesniuose ūkiuose statistiškai nustatyta daugiau teigiamų erkinio encefalito viruso mėginių, nei dideliuose ūkiuose (p<0,05). Įvertinus teigiamų mėginių pasiskirstymą tarp skirtingų Lietuvos rajonų ir skirtingų laktacijos mėnesių, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta.
MOLECULAR DIAGNOSTICS OF TICK – BORNE ENCEPHALITIS VIRUS IN GOAT MILK
Indrija Šidlauskaitė
Master’s Thesis
SUMMARY
Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is an extremely rising threat because number of cases of tick-born encephalitis is increasing and this virus is spreading fast geographically. For humans, use of unpasteurized goat milk and its products poses a high risk of getting TBE. TBE causes neurological disorders which can remain for the whole lifetime. It is important to mention that this virus is zoonotic but clinical symptoms can manifest only in some animal species. In Lithuania, this field has not been researched previously, therefore it was very important to carry out an exploratory research of TBEV prevalence in goat milk. The purpose of this thesis is to evaluate the exploratory epidemiological situation of human-harming tick-borne encephalitis virus in Lithuanian goat milk using molecular diagnostic methods. In total, 283 samples of goat milk were collected and examined using molecular diagnostic methods. The objects of this research - 8 private goat farms which are distributed throughout Lithuania. Samples were collected during months since June till October (during grazing period). Conjoined (milk from general tank) samples of goat milk, which were collected every 4 days from each farm, were used for diagnostics. By applying both conventional and real-time TaqMan polymerase chain reaction methods and using different oligonucleotide primers (NS3, NS5, NCR5) all samples of goat milk were examined and preliminary results received. 15 samples were identified positive for RNA of the virus. (5,3 pct. [CI% 3,00-8,59]). Results were received using NS5, NCR5 oligonucleotide primers. After carrying out tests using NS3 oligonucleotide primers it was estimated that these primers are inexpedient in diagnostics of the virus (p<0,001). After the examination of the conjoined goat milk samples, a correlation between number of positive samples and the size of the farm was elucidated. It was statistically identified that there were more TBEV-positive samples in smaller farms than in the bigger farms (p<0,05). By evaluating distribution of positive samples between different regions of Lithuania and different periods of lactation, no statistically significant differences were found.
ĮVADAS
Per pastarąjį dešimtmetį apie erkinį encefalitą (EE) vis dažniau kalbama visuomenėje. Tai yra viena svarbiausių virusinių ligų, kuri gali žmonėms sukelti neurologinius sutrikimus bei liekamuosius reiškinius visam gyvenimui [42]. Gyvūnams lyginant su žmonėmis ši liga būna besimptomė, dažniausiai jie yra tik kaip tarpiniai viruso šeimininkai [41].
EE susirgimą sukelia erkinio encefalito virusas (EEV), kuris priklauso arbovirusams,
Flaviviridae šeimai ir Flavivirus genčiai [5]. Remiantis genomo sekų analize, yra aprašyti keli
skirtingi EEV subtipai: Tolimųjų Rytų potipis, kuris aptinkamas Tolimųjų Rytų Rusijoje bei Kinijos ir Japonijos miškų regionuose, taip pat Sibiro potipis, kuris yra endeminis Uralo regione, Sibire, Rusijos rytinėje dalyje ir kai kuriose šiaurės rytų Europos vietose, Europinis potipis, kuris yra endeminis Vidurio, Rytų ir Šiaurės Europos kaimų ir miškų rajonuose [9]. Taip pat visai neseniai buvo pasiūlyti du nauji potipiai: Baikalo potipis, cirkuliuojantis Baikalo ežero regione [10], ir Himalajų potipis [11].
Ixodes ricinus - erkės yra veiksmingos virusų nešiotojos: užsikrėtus virusas išlieka visą likusį
erkės gyvenimo laiką, todėl gali būti perduodamas daugelį metų po pirminio užsikrėtimo [73]. Žinoma, kad erkės didžiąją gyvenimo dalį praleidžia aplinkoje, todėl klimatas turi labai didelę įtaką jų gyvavimui. Šių voragyvių aktyvumas (vystymasis, maitinimasis, judėjimas ir kt.) suaktyvėja, kuomet aplinkos temperatūra būna nuo 5 °C, o drėgmės lygis 92 proc. [74]. Todėl nemažą įtaką viruso plitimui turi vis šiltėjantis klimatas, taip erkės gali išlikti aktyvios ilgesnį laiko tarpą.
Žinoma, kad erkiniu encefalitu galima užsikrėsti per infekuotos EEV erkės įkandimą, tačiau retai kada susimąstome, kad EE galima užsikrėsti ir alimentiniu keliu, vartojant nepasterizuotą ožkų pieną bei jo produktus [36]. Iki šiol buvo tirti tik ožkų kraujo serumai nustatant antikūnus hemagliutinacijos stabdymo reakcijos (HASR) ir imunofermentinės analizės (IFA) metodais [6]. Lietuvoje dar niekada nebuvo tirtas ožkų pienas ieškant erkinio encefalito viruso (EEV), todėl yra labai svarbu ištirti molekuliniais metodais ožkų pieną, bei išsiaiškinti EEV žvalgomąją epidemiologinę situaciją Lietuvoje laikomų ožkų pieno mėginiuose.
Darbo tikslas : Molekuliniais metodais įvertinti žmonėms pavojingo erkinio encefalito viruso žvalgomąją epidemiologinę situaciją Lietuvoje laikomų ožkų piene.
Darbo uždaviniai :
1. Įvertinti skirtingų oligonuekleotidinių pradmenų tinkamumą EE diagnostikai ožkų piene. 2. Įvertinti konvencinės ir realaus laiko polimerazinės grandininės reakcijos tinkamumą diagnostikai.
3. Atlikti žvalgomuosius erkinio encefalito viruso paplitimo tyrimus Lietuvos ožkų pieno mėginiuose.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Viruso charakteristika
Sąvoka „arbovirusas“ apibūdina virusų grupes, kurios yra suskirstytos pagal jų perdavimo būdą. Virusams pavyko pritaikyti replikacijos ciklą prie žinduolių šeimininkų ir nariuotakojų viruso pernešėjų [1]. Erkinio encefalito virusas (EEV) yra vienas pagrindinių arbovirusų Eurazijoje, cirkuliuojančių tarp kraujasiurbių erkių ir stuburinių šiltakraujų gyvūnų [2]. Erkinis encefalitas (EE) pirmą kartą buvo aprašytas 1931 m. Austrijoje [3] ir pirmą kartą išskirtas 1937 m. Rusijoje [4].
Šis virusas priklauso Flaviviridae šeimai ir Flavivirus genčiai. Visi flavivirusai yra palyginti nestabilūs aplinkoje, todėl juos lengvai inaktyvuoja karštis ir įprastos dezinfekavimo priemonės [5]. Tačiau buvo atlikti tyrimai ir nustatyta, jog EEV gali išgyventi piene bei pieno produktuose. Laikant užkrėstą pieną šaldytuve, viruso titras per dvi savaites nepakito, o grietinėje ir svieste virusas buvo randamas net po dviejų mėnesių [6].
Šioje gentyje galima išskirti kelias virusų grupes, kurios yra suskirstytos pagal vektorių ir (arba) šeimininką. Kiekvienoje grupėje rūšys yra apibrėžiamos atsižvelgiant į viruso savybes (pvz.: genomą, antigenus, geografiją, ekologiją, vektorius, šeimininkus) bei sukeliamą klinikinę išraišką [7]. Erkinio encefalito virusas yra virusų rūšis, priklausanti žinduolių erkinio viruso ir EEV serokomplekso grupei, kuriuose yra ir kitų artimai susijusių genetinių virusų rūšių (pvz.: Gadget Gully virus (GGYV), Kadamo virusas (KADV), Omsko hemoraginės karštinės virusas (OHFV), Karališkasis virusas (RFV) ir kt.). EEV, LIV ir POWV sukelia encefalitą žmonėms ir gyvūnams; OHFV ir KFDV variantas Alkhurma hemoraginės karštinės virusas (AHFV) sukelia hemoraginį karščiavimą; o GGYV, LGTV ir RFV nėra patogeniški žmonėms [8].
Remiantis genomo sekų analize, yra aprašyti trys klasikiniai EEV subtipai: (I) EEV-FE Tolimųjų Rytų potipis (buvęs Rusijos pavasario-vasaros encefalito virusas), kuris yra endeminis Tolimųjų Rytų Rusijoje bei Kinijos ir Japonijos miškų regionuose ir kurio pagrindinis erkių vektorius yra I. persulcatus. (II) EEV-Sib Sibiro potipis (buvęs Vakarų Sibiro encefalito virusas), kuris yra endeminis Uralo regione, Sibire, Rusijos rytinėje dalyje ir kai kuriose šiaurės rytų Europos vietose ir kurio pagrindinis erkių vektorius yra I. persulcatus. (III) EEV-Eu Europinis potipis (buvęs Vidurio Europos encefalito virusas), kuris yra endeminis Vidurio, Rytų ir Šiaurės Europos kaimų ir miškų rajonuose ir kurio pagrindinis erkių vektorius yra I. ricinus [9]. Tačiau, visai neseniai buvo pasiūlyti du nauji potipiai: Baikalo potipis (EEV-Bkl), cirkuliuojantis Baikalo ežero regione [10], ir Himalajų potipis (EEV-Him), kuris buvo išskirtas iš Himalajų graužikų (Marmota himalayana) [11]. EEV sugebėjo išlikti nepakitęs evoliucijos eigoje, sukurdamas savitą ekosistemą.
Šis virusas pritaikytas užkrėsti daugelį rūšių, o griežtos ribos buvo nubrėžtos atsižvelgiant į veiksnius, kurie vis dar nėra plačiai žinomi mokslo bendruomenei [12], tik vėliau buvo aptariama galima jautrių šeimininkų bei tam tikrų oro sąlygų įtaka viruso plitimui.
1.2. Viruso sandara
Kaip ir kiti flavivirusai, EEV yra sferinis, apgaubtas, teigiamo polio, viengrandis linijinis su ribonukleinine rūgštimi (RNR) virusas. Jis yra maždaug 50 nm skersmens [13], turi kapsidę, kurią sudaro vienas struktūrinis baltymas (baltymas C) ir jame yra nesuskaidytas RNR genomas, turintis maždaug 11 000 nukleotidų, koduojančius struktūrinius ir nestruktūrinius baltymus. Genomas koduoja vieną didelį poliproteiną, kuris yra proteolitiškai perdirbamas, kad gautų struktūrinius bei nestruktūrinius baltymus. Yra trys struktūrinai baltymai : kapsidės (C), priešmembraninis (prM)/membraninis (M) ir apvalkalo (E) bei septyni nestruktūriniai (NS) baltymai. NS baltymai suskaidomi po transliacijos į NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ir NS5 (14,15). Genomą riboja 5’ - pradžios ir 3’- pabaigos nekoduojantys regionai (NR) (16) (1 pav.).
1 pav. Flaviviruso genomo strukūra. Tai yra teigiamo polio, vienos grandinės RNR virusas,
susidedantis iš dviejų struktūrinių ir septynių nestruktūrinių baltymų
C baltymas svarbus virionams sutelkti į vieną vietą. Jis suriša virusinę RNR, kad sudarytų sferinį nukleokapsidą, įterptą į šeimininko gaunamą lipidų dvisluoksnį, įrėmintą viruso prM ir E baltymais [17]. M baltymas, kaip minėta anksčiau, susidaro iš pirmtako baltymo - prM, modifikuoto kaip nesubrendę virionai išskiriami per ląstelės Goldžio kompleksą (tinklą), paliekant c galinę baltymo dalį, įterptą į subrendusio viriono apvalkalą [18]. Pr fragmentas M yra suskaidomas furinų
trans Goldžio komplekso tinkle, kad būtų galima išskirti subrendusius virionus iš užkrėstų ląstelių. Taip pat baltymas M gali dalyvauti viruso replikacijoje [19]. Natūralus baltymas E išsiskiria tik dėl prM baltymo. Nesubrendusių viruso dalelių prM baltymas apsaugo E baltymą nuo priešlaikinio membranos suliejimo. Šis imunodominantinis virusinis E baltymas egzistuoja virione kaip β-klostuotas sluoksnis, išdėstytas nuo galvos iki uodegos, o distaliniai galai tvirtinami membranoje. Šis baltymas yra dimerinis, susijungęs kartu tarpmolekuliniais disulfido ryšiais ir guli priešais lipidų dvisluoksnį. Taip pat E baltymas yra svarbus jungiantis prie receptorių ligando ir suliejant jį su ląstelėmis – šeimininkėmis [20]. Trumpai tariant, baltymas E yra pagrindinis viruso paviršiaus komponentas ir vaidina pagrindinį vaidmenį apsaugant po infekcijos, sukeldamas virusus neutralizuojančius antikūnus, nuo jo priklauso viruso virulentiškumas [21]. NS baltymai flavivirusuose sudaro kompleksus ant modifikuotų endoplazminių retikulinių membranų. Kompleksai yra struktūriškai ir funkciškai panašūs: jie dalyvauja viruso RNR replikacijoje bei perdirbant poliproteinus [19]. Glikoproteinas NS1 būtinas viruso funkcijai ir yra svarbus ląstelių aktyvacijai kaip viruso sintezės dalis. Jis būna ant ląstelių - šeimininkių membranų ir šiame procese turi sąveikauti su NS4A, skatindamas antikūnų gamybą ląstelėse šeimininkėse [22]. Baltymai NS2A ir NS2B susidaro suskaidžius visą ilgį NS2. Dėl šio baltymo C - galo pokyčių prarandamas viruso gebėjimas daugintis. NS2A, NS2B , NS4A, NS4B yra T cititoksinių limfocitų taikiniai [23]. NS3 baltymas yra vienintelis nepakitęs ir išsilaikęs tarp flavivirusų. Jis N gale koduoja serino proteazę. Šio baltymo C gale yra sekos, būdingos RNR helikazėms ir trifosfatazėms [24]. Manoma, kad NS4b baltymas blokuoja antivirusinius citokinus [25]. NS5 baltymas yra būtinas viruso replikacijai, formuojant „dangtelį“ 5’ genomo gale. NS5 yra didžiausias NS baltymas ir labiausiai konservuotas tarp flavivirusų. Jis koduoja N-galo metiltransferazę (MTazę) ir nuo C-galo RNR priklausomą RNR polimerazę (RdRP), reikalingą viruso RNR replikacijai. Mokslininkai įrodė, kad NS5 taip pat vaidina svarbų vaidmenį slopinant priimančiojo interferono (IFN) reakcijas. Tačiau NS baltymų vaidmuo viruso ir šeimininko sąveikoje vis dar yra mažai suprantamas [26]. 5` nekoduojantis regionas (NR) dalyvauja reguliuojant transliaciją ir yra svarbus matricinės RNR stabilumui. Manoma, kad EEV virulentiškumą gali lemti 3` NR mutacijos ir delecijos. Į ląsteles EEV patenka per specifinius receptorius, endocitozės būdu. Vykstant EEV replikacijai, baltymų sintezė ir šeimininko RNR nenutrūksta. Viruso sintezė vyksta maždaug 3 – 4 dienas [27].
1.3. Viruso rezervuarai
Ixodes ricinus kraujasiurbės erkės gali maitintis daugiau nei 300 skirtingų rūšių laukinių ir
naminių žinduolių, paukščių ir roplių krauju [28]. Tokia potencialių šeimininkų įvairovė leidžia išlaikyti erkių populiaciją įvairiomis aplinkos sąlygomis. Įvairių rūšių stuburinių šeimininkų
jautrumas erkinio encefalito virusui skiriasi. Pavyzdžiui, ežiukai, laukiniai mėsėdžiai, graužikai turi didelę viremiją, todėl vaidina svarbų vaidmenį perduodant EEV erkėms. Kai kurios graužikų rūšys, gali būti virusui kaip rezervuarinis šeimininkas (pvz.: raudonasis volelis - Myodes rutulus), gali perduoti virusą savo palikuoniams vertikaliai iš kartos į kartą [29; 30]. Taip pat yra žinoma, jog rudojo pelėno (Myodes glareolus) smegenyse EEV gali išgyventi penkis – šešis mėnesius [31; 32]. Kitos gyvūnų rūšys (pvz.: šikšnosparniai, galvijai, ožkos, stirnos, kiškiai, kiaulės ir kai kurie paukščiai), kurios po užsikrėtimo EEV turi mažą viremiją arba neturi jos visai, netiesiogiai dalyvaus palaikydamos virusą, tačiau bus prieglobstis EEV pernešančioms erkėms [33; 34]. Retu atveju, kai kuriems atsitiktiniams šeimininkams (pvz.: žmonėms, avims ir šunims) gali išsivystyti didelė viremija, tačiau kadangi šie atvejai yra ypač reti, jie nevaidina svarbaus epidemiologinio vaidmens perduodant EEV [35].
1.4. Viruso perdavimo būdai
Erkės užsikrečia EEV daugiausia ankstyvose vystymosi stadijose (lervos, nimfa) misdamos užkrėstu graužikų ar vabzdžių krauju, kai maitinasi šalia užkrėstos erkės arba esant dideliam viruso kiekiui gyvūno kraujyje (2 pav.). Erkių organizme virusas aptinkamas seilių liaukose bei seilėse. EEV išlieka visose vėlesnėse erkės vystymosi stadijose ir perduodamas transovariniu būdu - iš erkės suaugelės į kiaušinėlius. Nors stambūs žinduoliai ir paukščiai palaiko užkrėstas ir jautrias erkių populiacijas, šie gyvūnai neperduoda EEV dėl mažo viremijos lygio. Nepaisant to, kad erkių įkandimai išlieka pagrindiniu žmonių infekcijos šaltiniu, nepasterizuoti pieno produktai iš užkrėstų atrajotojų pieno gali perduoti EEV žmonėms [36] (3 pav.). EEV plitimas per erkes yra glaudžiai susijęs su erkių biologija ir taip pat priklauso nuo ekosistemos. Pavyzdžiui, I. ricinus gyvenimo ciklas trunka nuo dvejų iki šešerių metų ir kiekvienas etapas vidutiniškai trunka vienerius metus [28].
2pav. Erkių mitybos ypatumai. Smulkūs žinduoliai, ypač graužikai, laikomi EEV rezervuaro šeimininkais. Užkrėstos erkės perduoda virusą gyvūnui šeimininkui (1) ir sukelia viremiją (2). Neužsikrėtusios erkės įgyja EEV vartodamos užkrėsto šeimininko kraują (3). Viremijai pasibaigus, šis viruso perdavimo būdas yra nebeveiksnus, dėl cirkuliuojančių antikūnų (4). Bendras mitybos šaltinis leidžia erkėms perduoti EEV viena kitai, nereikalaujant jau užkrėsto šeimininko. Kai neužkrėstos erkės maitinasi arti užkrėstos erkės, gyvūno šeimininkas veikia kaip perdavimo tiltas (5). Tai gali įvykti net tada, kai šeimininkas turi antikūnų prieš EEV (6) [37].
3pav. Erkinio encefalito viruso (EEV) perdavimo būdai. Užkrėstos erkės perduoda virusą įvairiems mažiems ir dideliems gyvūnams, taip pat žmonėms (3). Be to, žmonės gali užsikrėsti vartodami nepasterizuotus pieno produktus, gautus iš užkrėstų gyvūnų (6). Įtariama, kad užkrėsti paukščiai yra viruso pernešimo į naujus endeminius židinius sukėlėjai. (5). EEV plinta erkių populiacijoje daugiausia per stadijas (1) ir retkarčiais per kiaušinėlius (2). Sėkmingam viruso plitimui reikia erkių populiacijos. Tai pasiekiama, kai neužkrėstos erkes, maitinasi užkrėstų gyvūnų krauju (4) [37].
1.5. Klinikiniai požymiai
Vis dėlto serologinis paplitimas tarp šunų ir arklių tam tikrose vietovėse yra didelis, o po infekcijos kartais gali būti stebimi ir klinikiniai požymiai. Veterinarijoje EE atvejai yra aptinkami retai, tačiau šunims buvo užregistruota infekcija su pasireiškusiais neurologiniais simptomais [38 – 40]. Taip pat buvo pasireiškusi klinika ne tik arkliams [41], bet ir beždžionėms [42]. Gyvūnams pasireiškę neurologiniai pokyčiai dažniausiai būna nespecifiniai, išreikšti lengva ar sunkia forma: bendru organizmo silpnumu, anoreksija, epilepsijos priepuoliais, raumenų paralyžiumi [40 – 42]. Dar vis nėra žinoma, ar EEV užkrečia kates. Nepaisant jų nuolatinio kontakto su erkėmis ir infekuotais graužikais, atrodo, jog katės yra gana atsparios artimai susijusiam virusui - Powassan virusui [43]. Paukščiai taip pat gali būti užkrėsti, tačiau neaiškus jų, kaip rezervuaro, vaidmuo. Taip pat žinoma, kad jie perneša virusą dideliais atstumais (pernešdami užsikrėtusias erkes ar būdami užsikrėtę patys) [44; 45]. Ožkų populiacijoje EE klinikiniai požymiai dažniausiai lieka nepastebimi. Todėl pagrindinis būdas šioms infekcijoms nustatyti – laboratoriniai tyrimai [46].
Žmonės yra atsitiktiniai, galutiniai viruso šeimininkai. Kaip minėta anksčiau, užsikrėsti gali erkės įkandimo metu arba vartodami nepasterizuotus EEV užkrėstus pieno produktus. Yra ištirta, jog virusas yra labai atsparus skrandžio rūgštingumui [47]. Žalias pienas ir sūris, pagaminti iš nepasterizuoto pieno, gali būti perdavimo šaltiniai [48 – 53]. Apie tokį perdavimo būdą pranešta Albanijoje, Vengrijoje, Latvijoje, Lietuvoje, Lenkijoje, Rusijoje ir Slovakijoje, bet ne Vakarų Europoje. 2014m. buvo ištirta, jog galvijų ir smulkių atrajotojų bandose serologinis paplitimas gali svyruoti nuo 1,1 proc. iki 42,8 proc. [54]. Nors viremija yra nedidelė ir trumpalaikė, virusą galima aptikti piene praėjus 18 dienų po užsikrėtimo [55]. Šalyse, kuriose yra nustatytas EE, daugėjant smulkiųjų ūkininkų - gamintojų, kurie parduoda nepasterizuotą pieną ir pieno produktus, padidėja viruso perdavimo rizika ir susirgimų tikimybė žmonėms [56]. Apie 80 proc. atvejų žmonėms ligos eiga būna dvifazė. Pirmos bangos požymiai yra nespecifiniai (bendras organizmo silpnumas, pakilusi temperatūra ir kt.), antros pažeidžiantys CNS. Persirgus galima pasveikti visiškai pilnai arba gali pasireikšti liekamieji reiškiniai (miego sutrikimai, dėmesio koncentracijos sutrikimai) [42]. Persirgus įgyjamas imunitetas. Mirštamumas nuo EE siekia 0,5-4% [57].
1.6. Patogenezė
Po erkės įkandimo EEV pirmiausia dauginasi odos ląstelėse, Langerhanso ląstelėse, kuriose yra dendritinės ląstelės (DC), makrofaguose ir neutrofiluose [36]. Įgimtos imuninės sistemos atpažįstamas virusas sukelia dendritinių ląstelių (DC) migraciją į pirminę infekcijos vietą. Šios ląstelės suaktyvinamos po EEV infekcijos ir per limfinę sistemą virusą perneša į regioninius
limfinius mazgus. Labai panašus mechanizmas vyksta, kuomet EEV patenka į pieną. Prieš perduodant dendritinėms ląstelėms, replikacija iš pradžių vyksta žarnų epitelio ląstelėse [58]. Po naujos replikacijos DC, makrofaguose ir, T limfocituose [58; 59] , atsiranda viremija ir virusas plinta į kitus organus, ypač į retikuloendotelinę sistemą (blužnį, kepenis ir užkrūčio liauką). Čia vyksta tolimesnė viruso replikacija. Aukšti viruso titrai yra būtini tam, kad virusas galėtų patekti pro kraujo ir smegenų barjerą [60]. Taigi EEV būdingas mažas neuroinvaziškumas [61]. Nepaisant to, sergantiems, kurių EEV specifinių neutralizuojančių antikūnų titrai yra nepakankami (kad būtų išvengta CNS infekcijos) neuronai yra neabejotinai infekcijos taikiniai. Viruso replikacija sukelia nervinius pažeidimus bei simptomus dėl uždegiminio proceso, ląstelių lizės, nekrozės ir apoptozės [34; 61]. Dėl neuronų užkrėtimo mikroglia ir EEV specifiniai T limfocitai migruoja į CNS, pilkąją medžiagą. Citotoksinis T-limfocitų atsakas yra būtinas norint pašalinti virusą, tačiau taip pat gali sukelti imunopatogenezę nukreipdamas juos į užkrėstus neuronus [62; 63]. Žmonėms dažniausiai mirtį sukeliantys meningitas ir polioencefalomielitas yra lokalizuoti nugaros smegenyse, galvos smegenyse ir smegenėlėse bei yra susiję su uždegiminių ir limfocitinių ląstelių infiltracija [61].
1.7. Laboratorinė diagnostika
Dažniausiai naudojami metodai nustatyti EEV virusą yra Imunoglobulinų M (IgM) fiksavimas ELISA diagnostikos metodu, kurio substratas yra kraujas ar smegenų skystis. Taip pat virusinę RNR galima aptikti konvencinės ir realaus laiko polimerazinės grandininės reakcijos metodu. Tačiau viremija gali sumažėti iki žemo arba neaptinkamo jau lygio, kol pasireiškia neurologiniai simptomai [64].
Žmonėms esančią kliniką reikia patvirtinti laboratorinės diagnostikos būdu, nes klinikiniai simptomai nėra pakankamai konkretūs, kad būtų galima diagnozuoti EEV [65]. Pirmos klinikinės fazės metu virusas ir jo RNR gali būti aptinkami izoliuojant EEV ląstelių kultūroje ir atitinkamai naudojant kraujyje arba smegenų skystyje atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją [66 – 69]. Siekiant atskirti EEV potipius, taip pat buvo sukurti multipleksiniai PGR [70]. Vėlesniuose ligos etapuose virusas gali būti nebeįmanoma aptikti organizmo skysčiuose [66; 71], bet gali būti aptinkamas audiniuose, surinktuose po mirties [67; 20].
Gyvūnams, išskyrus šunis ir arklius, EE diagnozavimas paprastai nėra atliekamas, nes po infekcijos patekimo, klinikiniai požymiai dažnai nepasireiškia. Tačiau veterinarinėje medicinoje yra komercinių netiesioginių su fermentais susijusių imunosorbento tyrimų (ELISA), skirtų nustatyti EEV specifinius IgG ir IgM antikūnus. Šie tyrimai gali būti naudojami siekiant aptikti EEV specifinius antikūnus daugelyje rūšių dėl kryžminių antikūnų atpažinimo pagal baltymą G. Atliekant šiuos bandymus, galima pamatyti, įvairioms rūšims jų riba skiriasi. Ši riba buvo nustatyta
remiantis kontrolinių serumų virusus neutralizuojančių titrų rezultatais: ištyrus arklius, galvijus, avis, ožkas, kiaules, peles, šunis, triušius ir beždžiones [72].
Lietuvoje paskutiniu metu ypač rūpinamasi dėl termiškai neapdoroto ožkų pieno ir jo produktų vartojimo. Tačiau anksčiau pieno tyrimai, nustatant EEV, nebuvo atliekami. Iki šiol buvo tirtas tik ožkų kraujo serumas nustatant antikūnus hemagliutinacijos stabdymo reakcijos (HASR) ir imunofermentinės analizės (IFA) metodais [6].
1.8. Epidemiologija
Erkės yra veiksmingos virusų nešiotojos: nes užsikrėtus virusas išlieka visą likusį erkės gyvenimo laiką, todėl gali būti perduodamas daugelį metų po pirminio užsikrėtimo [73]. Kadangi erkės nemažą gyvenimo dalį praleidžia aplinkoje, klimatas turi didelę įtaką jų gyvavimui. Šių voragyvių aktyvumas (vystymasis, maitinimasis, judėjimas ir kt.) prasideda, kai aplinkos temperatūra pasiekia aukštesnę kaip 5 °C ir joje yra pakankamas drėgmės lygis (optimalus yra 92 proc.). Vidutinio klimato zonose, atsižvelgiant į temperatūrą ir drėgmę, geriausios sąlygos erkėms plisti yra pavasaris arba vasaros pradžia (tai gali tęstis iki vasaros pabaigos ar rudens). Didžiausias aktyvumas pasireiškia šio laikotarpio pradžioje ir pabaigoje [74]. Kai kuriose šiltesnėse vietose (pvz.: Pietiniame Viduržemio jūros regione) erkės daugiausia aktyvios nuo lapkričio iki sausio mėnesio [75]. Tinkamiausia aplinka erkėms plisti ir išgyventi yra mišrūs ir lapuočių miškai, aukštos žolės. Čia erkėms yra gera miško paklotė ir pakankamai drėgmės [76].
Erkinio encefalito virusas yra endeminis Centrinėje, Šiaurės ir Rytų Europoje, Rusijoje ir Tolimuosiuose Rytuose, įskaitant Mongoliją, šiaurinę Kinijos dalį ir Japoniją [34]. Apie virusą pranešta 28 pasaulio šalyse, o didžiausias klinikinių atvejų paplitimas nustatytas Baltijos šalyse, Slovėnijoje ir Rusijoje [77; 78]. Tačiau kai kuriose iš šių šalių ligos atvejų pasitaiko nedaug, nes didelė dalis gyventojų yra paskiepyti (pvz., Austrijoje) arba dėl to, kad TBE yra tik ribotose vietose [78]. Šalyse, kuriose yra virusas, klinikinės ligos atvejų pasiskirstymas yra labai nevienodas. Iš 28 Europos Sąjungos šalių, 20 įdiegė EE stebėjimo sistemą. Aštuoniolikoje iš šių šalių vykdoma išsami EE ligos priežiūra, o 16-oje EE nurodoma kaip liga, apie kurią reikia pranešti [79]. Mažiausiai virulentiškas virusas cirkuliuoja Vakaruose, Europoje, o labiausiai virulentiškas yra Rytuose, rytų Sibire bei Japonijoje. 65 proc. – žmonių, užsikrėtę Europiniu potipiu, įprastai perserga lengva forma. Tuo tarpu 35 proc. pacientų gali progresuoti iš lengvos formos į truputį sunkesnę. Mirštamumas siekia 1 – 2 proc. Užsikrėtus Sibiro ar Tolimųjų Rytų erkinio encefalito potipiu, klinikiniai simptomai šiek tiek sunkesni. Sibiro potipiu užsikrėtus mirštamumas siekia nuo 6 iki 8 proc., o Tolimųjų Rytų - net 20 – 60 proc. Išgyvenusiems dažnai pasireiškia liekamieji reiškiniai (neurologiniai sutrikimai) [64].
Lietuva yra viena iš šalių, kurioje užfiksuotų EEV atvejų yra daugiausiai Europoje. Šis virusas cirkuliuoja visoje Lietuvoje, tačiau šiaurinės bei rytinės šalies dalys laikomos EEV židiniais [86]. 2016 m. Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras (ULAC) pastebėjo itin didelę EE sergamumo tendenciją Lietuvoje. Surinkus bei išanalizavus duomenis nustatyta, jog 2016 m. EE sirgo – 633 asmenys. Palyginus susirgimų dažnumą su 2015 m., EE susirgimų rodikliai išaugo net 91 proc. 2015 - 2016 m. didžiausias užregistruotas sergamumas EE buvo Utenos apskrityje [80]. 2017 m. - stebimas sumažėjęs sergamumas. Sausio-rugpjūčio mėnesiais buvo užregistruoti 214 EE atvejai. Daugiausia, net 72 atvejai, aptikti Vilniaus apskrityje. Taip pat didelis sergamumas nustatytas Utenos, Trakų, Elektrėnų, Zarasų, Kauno bei Šiaulių rajonuose. Nors sergamumas 2017 m. sumažėjo, tačiau Lietuva kartu su Estija, Latvija bei Slovėnija vis dar išlieka Europos šalių sąraše, kaip daugiausiai EE susirgimų registruojančios šalys. 2017 m. pabaigoje užfiksuoti iš viso 474 atvejai, vienas – mirties [81]. 2018m., liepos mėnesį Lazdijų rajone, buvo užregistruotas EE protrūkis. Susirgo keturi toje pačioje šeimoje gyvenantys asmenys. Kadangi įsisiurbusios erkės nepastebėjo, įtariama, jog galėjo užsikrėsti gerdami nepasterizuotą ožkų pieną. 2018 m. Lietuvoje susirgo - 384 asmenys, iš jų du mirė [82]. Preliminariais duomenimis 2019 m. sausio - birželio mėnesiais fiksuoti 99 susirgimai. Tai kur kas daugiau (net trečdaliu, 61 susirgimas), nei buvo fiksuota 2018 m. tuo pačiu laikotarpiu. Šiais metais, liepos mėnesį, dėl infekuotos erkės įkandimo nuo EE mirė du žmonės. Vienas Šiaulių apskrityje, kitas Vilniaus mieste.
Pasak ULAC atstovės I. Janavičiūtės 2019 m. sausio - rugsėjo mėn. užregistruoti 526 EE atvejai, mirė 6 žmonės [84] (1 lentelė).
1 lentelė. Remiantis ULAC duomenimis, žmonių sergamumas erkiniu encefalitu (EE) Lietuvoje 2015 – 2019 m. laikotarpiu Metai EE susirgimų skaičius Mirties atvejų skaičius 2009 605 1 2010 612 3 2011 365 0 2012 495 3 2013 501 2 2014 353 1 2015 336 2 2016 633 1 2017 474 2 2018 384 2 2019 526 6
Taigi, galime teigti, jog sergamumas erkiniu encefalitu kasmet tendencingai didėja. Išaugusį EE sergančių žmonių skaičių lemia mažas besiskiepijančių žmonių skaičius, išaugęs neapdorotų pieno ir jo produktų vartojimas bei klimato kaitos pokyčiai – šiltėjant klimatui, ilgėja erkių aktyvumo periodas.
2. TYRIMŲ MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1. Tyrimų vieta
Erkinio encefalito viruso molekulinės diagnostikos tyrimai ožkų piene buvo atliekami 2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Veterinarijos akademijos Anatomijos ir fiziologijos katedros Imunologijos laboratorijoje bei LSMU Mikrobiologijos ir virusologijos instituto virusologinių tyrimų laboratorijoje. EEV tyrimų etapai pateikti 4 pav.
2.2. Ožkų pieno mėginiai
Iš viso buvo surinkti ir molekuliniais tyrimais ištirti 283 ožkų pieno mėginiai. Šio tyrimo objektai - 8 privatūs ožkų ūkiai, kurie pasiskirstę po visą Lietuvą : Alytaus, Vilkaviškio, Vilniaus, Šilalės, du Šiaulių bei du Kauno rajone.
Molekuliniams tyrimams pieno mėginiai rinkti 2019 metais laktacijos periodu ganykliniu laikotarpiu. Tyrimo strategijoje buvo suplanuota imti mėginius - penkis mėnesius iš eilės, nuo birželio iki spalio mėnesio. Renkant sudaromas bendras – jungtinis melžiamų ožkų pieno mėginys, kuris imtas tyrimams periodiškai kas keturias dienas. Tačiau surinktų tirti mėginių skaičius ūkyje skirtingas (svyruoja nuo 30 iki 38 mėginių), nes vieni ūkio savininkai ožkas išleisdavo ganytis anksčiau, kiti vėliau. Taip pat skyrėsi ir ganomų ožkų parginimo į tvartus laikas.
Ūkio savininkai, laikydamiesi biologinės saugos reikalavimų, ožkų pieno bandinius kaupdavo į vienkartines sterilias 50 ml taras, jos iš karto būdavo patalpinamos į šaldiklį, kuriame palaikoma -20 °C temperatūra. Vėliau šie mėginiai surenkami bei transportuojami nenutraukiant temperatūrinio rėžimo į LSMU VA Anatomijos ir fiziologijos katedroje esančią Imunologijos laboratoriją, EEV diagnostiniams molekuliniams tyrimams atlikti.
2.3. RNR medžiagos ekstrakcija
Viruso RNR ekstrakcijai buvo imami jungtiniai ožkų pieno mėginiai. Išskyrimui naudojama instrukcija, kuri yra nurodyta „GeneJET RNA Purification Kit“ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) rinkinyje.
Iš šaldiklio išimami mėginiai, atšildomi kambario temperatūroje iki tokios konsistencijos, kad galima būtų imti mėginius RNR ekstrakcijos išskyrimui. Atsileidę mėginiai išmaišomi vartant. Paruošiami 1,5 ml vienkartiniai mėgintuvėliai, kurie paženklinami eilės tvarka. Naudojant mikropipetę imamas 300 µl ožkų pieno mėginys ir talpinamas į suruoštus mėgintuvėlius. Tuomet pasiruošiami reagentai tolimesniam darbui. Pirmausia lizavimo buferio tirpalas: 20 µl DTT (beta-merkaptoetanolio) sumaišoma su 300 µl lizavimo buferiu – tirpalas purtomas su „Vortex“ maišytuvu keletą sekundžių. Vėliau pasiruošiamas dar vienas Proteazės K tirpalas, kurį sudaro: 10 µl Protezė K bei 590 µl TE buferis. Jį taip pat keletą sekundžių išmaišome su „Vortex“ purtytuvu. Paruoštus tirpalus dedame į šoną, imame supilstytus mėginius ir į kiekvieną pilame 300 µl jau paruošto lizavimo buferio tirpalo, mėginiai supurtomi 10 sekundžių „Vortex“ putytuvu. Tuomet vadovaujantis instrukcija – užpilama 600 µl Proteinkinazės tirpalo ir vėl purtomi 10 sekundžių „Vortex“ putytuvu. Tuomet mėginiai 10 minučių paliekami kambario temperatūroje (15 - 25°C) nusistovėti. Praėjus inkubacijos periodui, mėginiai 10 minučių yra centrifuguojami 12 tūkstančių apsisukimų per minutę greičiu. Paruošiami nauji 1,5 ml mėgintuvėliai, sužymimi, į juos įpilama
450 µl 96 proc. etanolio. Tuomet centrifugato paviršinė frakcija mikropipete nusiurbiama ir perkeliama į mėgintuvėlius, kuriuose yra etanolis. Mėgintuvėlių turinys sumaišomas pipetuojant. 700 µl perkeliama į paruoštas specialiais talpas - kolonėles, kurios imtos iš „Gene JET RNA Purification“ rinkinio. Jos ypatingos tuo, jog turi specialią membraną, kuri sulaiko bandinio išskirtą RNR. Šios kolonėlės dedamos į centrifugavimo aparatą ir centrifuguojamos 1 minutę 12 tūkstančių apsisukimų per minutę greičiu. Po to procedūra yra kartojama dar kartą, tačiau prieš tai centrifugatą reikia nupilti. Nucentrifugavus antrą kartą, imami nauji mėgintuvėliai ir kolonėlių viršutinis sluoksnis, membrana, perkeliama į juos. Tuomet imamas iš rinkinio specialus plovimo buferis, kuris pažymėtas Nr. 1, ir įpylus į kolonėles 700 µl 1 minutę yra centrifuguojama 12 tūkstančių apsisukimų per minutę greičiu. Nucentrifugavus, dugne nusėdęs skystis nupilamas. Tuomet imamas iš rinkinio kitas buferinis tirpalas Nr. 2, pilama – 600 µl, ir vėl centrifuguojama anksčiau minėtu rėžimu, nupilamas gautas centrifugatas. Procedūra pakartojama tik su mažesniu Nr. 2 buferio kiekiu – 250 µl, tačiau šį kartą centrifuguojama 2 minutes, 12 tūkstančių apsisukimų per minutę greičiu. Iš rinkinio paimti nauji sterilius 1,5 ml mėgintuvėliai sužymėti. Nucentrifugavus kolonėlių viršutinė dalis, membrana, perkeliama į naujai paruoštus mėgintuvėlius. Imamas iš rinkinio specialus (be nukleazių) vanduo, tiesiai į kolonėlės membranos centrą mikropipete įpilama 60 µl. Centrifuguojama 1 minutę, 12 tūkstančių apsisukimų per minutę greičiu. Gauti RNR ekstrakcijos mėginiai dedami į šaldytuvą ir laikomi -20 °C temperatūroje tol, kol bus panaudoti kituose tyrimuose.
2.4 Lizdinė atvirkštinės transkripcijos (AT) polimerazinė grandininė
reakcija (PGR)
2.4.1. I PGR
Visų pirma atliekama atvirkštinė transkripcija. Jai mišinys ruošiamas anksčiau minėtu metodu, pridedant skirtingus EEV pradmenis. Šiame tyrime buvo naudoti trys skirtingi oligonukleotidiniai pradmenys: NS3, NS5, NCR5.
Laikantis biologinės saugos reikalavimų paruošiami specialūs vienkartiniai 0,2 ml mėgintuvėliai, suženklinami eilės tvarka. Į mėgintuvėlius pilama po 5 µl išgrynintos, paruoštos RNR, papildomai dedama 6,07 µl išgryninto specialaus be nukleazių vandens (Thermo Fisher Scientific), 12,5 µl reakcijos mišinio „DreamTaq“ (Thermo Fisher Scientific), 0,5 µl pradžios oligonukleotidinių pradmenų (Thermo Fisher Scientific), 0,5 µl pabaigos oligonukleotidinių pradmenų (Thermo Fisher Scientific), 0,3 µl atvirkštinės transkriptazės „Revert Aid“ (Thermo Fisher Scientific), 0,13 µl ribonukleazių inhibitorius „RiboLock“ (Thermo Fisher Scientific), viskas pipetuojant sumaišoma ir nešama į „Mastercycler personal“ termociklerį, amplifikacijai.
Skirtingiems pradmenims yra taikomi skirtingi temperatūriniai rėžimai. Visi naudoti pradmenys (2 lentelė) bei jų amplifikacijos temperatūriniai rėžimai (3 lentelė) pateikiamilentelėse.
2 lentelė. Oligonukleotidinių pradmenų sekos naudojant I PGR Ooligonukleoti-dinių pradmenų seka: NS3 NS5 NCR5 Pradžios 5’-G(A/G)AA(T/C)GG(C/ A)CT(A/G)AA(A/G)AC (T/C)AATGA-3’ [90] 5‘- GAGGCTGAACAAC TGCACG-3‘ [92] 5’-GCGTTTGCTTCG GA -3’[91] Pabaigos 5’-TGAGCTC(A/G)AC(T/ C)(T/C)(T/G)CCC(A/G) TCAA-3’ [90] 5‘- GAACACGTCCATT CCTGATCT-3‘ [92] 5’-CTCTTTCGACAC TCGTCGAGG -3’ [91]
3 lentelė. Temperatūriniai rėžimai taikomi skirtingiems oligonukleotidiniams pradmenims
amplifikuojant lizdinę atvirkštinę transkriptazę
NS5
Etapai Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
Atvirkštinė transkripcija 42 30 min 1
Pradinė denatūracija 96 5 min 1
Denatūracija 96 0,5 min 35
Hidrinimas 40 0,5 min 35
DNR sintezė 68 0,5 min 35
NS3
Atvirkštinė transkripcija 94 2 min 1
Denatūracija 55 1 min 40
Hidrinimas 68 1 min 40
DNR sintezė 68 5 min 40
NCR5
Atvirkštinė transkripcija 42 30 min 1
Pradinė denatūracija 96 5 min 1
Denatūracija 96 1 min 2 Hidrinimas 37 1 min 2 DNR sintezė 72 2 min 2 Denatūracija 92 1 min 38 Hidrinimas 37 1 min 38 DNR sintezė 72 2 min 38
Po atvirkštinės transkripcijos amplifikavimo gaunamas produktas yra komplementarios viengrandės DNR (kDNR) medžiaga. Kuri bus naudojama lizdinėje polimerazinėje grandininėje reakcijoje bei realaus laiko TaqMan polimerazinėje grandininėje reakcijoje. Iki tol gauti mėginiai laikomi šaldytuve +10°C temperatūroje.
2.4.2. II PGR
Antru etapu ruošiamas lizdinės atvirkštinės transkripcijos polimerazinės grandininės reakcijos mišinys, kuris susideda iš : 2,5 µl pirmos reakcijos metu gautos komplementarios viengrandės DNR (kDNR) medžiagos, 9 µl išgryninto specialaus be nukleazių vandens (Thermo Fisher Scientific), 12,5 µl reakcijos mišinio „DreamTaq“ (Thermo Fisher Scientific), 0,5 µl pradžios oligonukleotidinių pradmenų (Thermo Fisher Scientific), 0,5 µl pabaigos oligonukleotidinių
pradmenų (Thermo Fisher Scientific). Viskas pipetuojant sumaišoma ir nešama į „Mastercycler personal“ termociklerį, amplifikacijai. Skirtingiems pradmenims yra taikomi skirtingi temperatūriniai rėžimai. Visi naudoti pradmenys (4 lentelė) bei jų amplifikacijos temperatūriniai rėžimai (5 lentelė) pateikiami lentelėse.
4 lentelė. Oligonukleotidinių pradmenų sekos naudojant II PGR Ooligonukle otidinių pradmenų seka NS3 NS5 NCR5 Pradžios 5’-TA(T/C)GTCAGCAGCATTGCT CA-3’ [90] 5‘-ACGGAACGTGACA AGGCTAG-3‘ [92] 5’-CGGATAGCATTA GCAGCG-3’ [91] Pabaigos 5’-TTGATGTTTGT(T/C)C(T/G)G(T /C)TCCATCTAT-3’ [90] 5‘-GCTTGTTACCATCT TTGGAG-3‘ [92] 5’-CCTTTCAGGATG GCCTT-3’ [91]
5 lentelė. Temperatūriniai rėžimai taikomi skirtingiems oligonukleotidiniams pradmenims
amplifikuojant lizdinės atvirkštinės transkriptazės polimerazinę grandininę reakciją
NS5 (Pilnas gauto produkto dydis - 252 bp.)
Etapai Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 96 5 min 1
Denatūracija 96 0,5 min 35
Hidrinimas 40 0,5 min 35
DNR sintezė 68 0,5 min 35
NS3 (Pilnas gauto produkto dydis – 631 bp.)
Denatūracija 94 1 min 40
Hidrinimas 55 1 min 40
DNR sintezė 72 1 min 40
NCR5 (Pilnas gauto produkto dydis - 128 bp.)
Pradinė denatūracija 94 5 min 1
Denatūracija 94 1 min 40
Hidrinimas 55 1 min 40
DNR sintezė 72 1 min 40
2.5. Elektroforezė
Ji naudojama siekiant vizualizuoti lizdinės atvirkštinės polimerazinės grandininės reakcijos rezultatus bei nustatyti gauto produkto dydį.
Elektroforezei buvo ruošiamas specialus agarozės gelis. Imamos 3 x 0,5 g agarozės tabletės (Top vision Agarose, Thermo Fisher Scientific), dedamos į karščiui atsparią kolbutę, kurioje įpiltas 130 ml 1xTAE buferinis tirpalas (Thermo Fisher Scientific) ir šildoma 5 minutes, vis pamaišant, mikrobangų krosnelėje. Išėmus iš krosnelės, tirpalas paliekamas šiek tiek atvėsti (tačiau gelis negali sustingti). Naudojant traukos spintą, į atvėsusį gelį įpilama 13 µl, 1 µl/ml etidžio bromido (Life Technologies) ir išmaišoma. Gelis supilamas į specialią formelę – lovelį, įdedamos „šukutės”, kurios suformuoja „šulinėlius” PGR mėginiams. Gelis paliekamas apie 1 valandą sustingti. Sustingus geliui, „šukutės” išimamos, gelis perkeliamas į specialią elektroforezės vonelę, kuri būna užpildyta 1xTAE buferiniu tirpalu (gelis turi būti vos apsemtas). Tuomet imami iš antros polimerazinės grandininės reakcijos gauti mėginiai ir po 12 µl dedami iš eilės į kiekvieną gelio „šulinėlį”. Šalia tiriamųjų mėginių papildomai dedama 12 µl specialaus 50 bp dydžio molekulinės masės žymeklio (GeneRulerTM (Thermo Scientific), neigiama kontrolė (reakcijos mišinys be ekstrakcijos) ir teigiama kontrolė (naudojana Toro erkinio encefalito padermėm). Užpildžius „šulinėlius“ paleidžiama elektroforezės reakcija, kuri vyksta apie 1 valandą esant 120 V įtampos elektros srovei. Pasibaigus elektroforezei gelis išimamas iš vonelės ir dedamas vertinimui ant
specialios UV lempos (Herolab UVT – 14 LE). Rezultatų interpretacija vyksta pagal susidariusį fluorescencijos signalo intensyvumą bei susidariusio produkto molekulinės masės dydį. Vertinama neigiamai (-) arba teigiamai (+). Jei signalas labai stiprus dedama daugiau nei vienas pliusiukas, tai reiškia, jog signalas labai stiprus ir nėra abejotinas.
2.6. Realaus laiko TaqMan polimerazinė grandininė reakcija
Atliekant realaus laiko polimerazinę grandininę reakciją buvo vadovaujamasi gamintojo nurodymais. Reakcijos mišinys sudaromas iš : 5 µl anksčiau išgrynintos, paruoštos RNR, 3,5 µl išgryninto be nukleazių vandens (Thermo Fisher Scientific), 12,5 µl 2X reakcijos mišinio (Invitrogen, Carlsbad USA), 0,5 µl „SuperScript III Platinum One-Step Taq mix” (Invitrogen,USA), 1 µl pradžios oligonukleotidinių pradmenų (Thermo Fisher Scientific), 1 µl pabaigos oligonukleotidinių pradmenų (Thermo Fisher Scientific), 1,5 µl zondo. Viskas pipetuojant sumaišoma ir nešama į „Mastercycler Realplex S“ termociklerį, amplifikacijai. Amplifikacijos metu naudojami temperatūriniai rėžimai pateikiami 6 lentelėje.
Naudotos oligonukleotidinių pradmenų sekos: (EE E - genui specifiškas pradmuo) [90] Pradžios : 5’-GGGCGGTTCTTGTTCTCC-3’
Pabaigos: 5’-ACACATCACCTCCTTGTCAGACT-3’
Naudoto zondo seka : 5’-FAM-TGAGCCACCATCACCCAGACACA-TAMRA-3’ [90] 6 lentelė. Temperatūriniai rėžimai taikomi amplifikuojant realaus laiko TaqMan polimerazinę
grandininę reakciją
Etapai Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
Atvirkštinė
transkripcija 42 30 min 1
Pradinė denatūracija 94 10 min 1
Denaturacija 95 0,2 min 45
Hibridinimas 60 1 min 45
Gautų rezultatų vizualizacijai bei vertinimui naudojama Ct reikšmė, kuri parodo slenkstinį ciklą, pasireiškiantį sustiprėjusiu fluorescencijos impulsu. Jei Ct mažiau nei 36 ciklai, laikoma teigiamu rezultatu. Jei daugiau nei 36, rezultatas laikomas neigiamu.
2.7. Statistinė duomenų analizė
Visi statistiniai duomenys buvo apdoroti naudojant SPSS Statistics bei Microsoft Office Excel (2003) programas. Iš gautų duomenų buvo apskaičiuota: procentinis pasiskirstymas (%), taikant 95% CI patikimumo intervalą, mažiausia ir didžiausia reikšmė. Ar gauti rezultatai patikimi įvertinama p reikšme pagal Chi2 testą. Jei p<0,05 – duomenys laikomi statistiškai patikimi, jei p>0,05 – nepatikimi.
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Lizdinės AT-PGR ir realaus laiko TaqMan PGR rezultatai
3.1.1. Oligonukleotidinių pradmemnų palyginimasOžkų pieno mėginius (n=283) ištyrus lizdinės atvirkštinės polimerazinės grandininės reakcijos metodu ir pritaikius tris skirtingus oligonukleotidinius pradmenis : NS3, NS5, NCR5, ne su visais pradmenimis buvo gauti vienodi rezultatai. Ištyrus paaiškėjo, jog NS3 pradmuo ne toks veiksmingas. Iš visų tirtų mėginių, naudojant NS3 buvo gauta tik 3 (1,06 proc.) teigiamų, o panaudojus NS5 bei NCR5 pradmenis, užfiksuota penkis kartus daugiau teigiamų rezultatų – 15 (5,3 proc.) (p<0,001). Pritaikius realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodą, E geno pradmenis bei zondą, gauta 5,3 proc. teigiamų EEV mėginių. Svarbu paminėti tai, jog tiriant su NS5, NCR5, E oligonukleotidiniais pradmenimis visi teigiami rezultatai yra tarpusavyje identiški (7 lentelė) (5 pav.).
7 lentelė. Tyrimo rezultatai su skirtingais PGR oligonukleotidiniais pradmenimis
Tyrimo metodai Lizdinė AT-PGR Realaus laiko
TaqMan PGR Naudoti oligonukleotidiniai pradmenys NS3 NS5 NCR5 E Nustatytų teigiamų EEV ožkų pieno mėginių sk. (proc.)
5 pav. Ištirto ožkų pieno teigiamų mėginių pasiskirstymas naudojant skirtingus
oligonukleotidinius pradmenis bei taikant AT-PGR ir realaus laiko TaqMan PGR tyrimo metodus
Visus turimus ožkų pieno mėginius (n=283) ištyrus realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos metodu, iš viso buvo gauta 15 EEV teigimų mėginių, kurie sudaro 5,3 proc. visų tirtų mėginių. Atsižvelgiant į teigiamus mėginius, Ct verčių vidurkis lygus - 29,14 ciklui (6 pav.). Visi teigiami mėginiai buvo atrinkti ir paleisti vienu metu.
6 pav. Realaus laiko TaqMan PGR rezultatai. Gautų teigiamų mėginių Ct reikšmė – 29,14
ciklas 3 15 15 15 0 2 4 6 8 10 12 14 16 NS3 NS5 NCR5 E G au ti t ei gi am i m ėgi n iai Oligonukleotidiniai pradmenys
3.1.2. Žvalgomųjų tyrimų rezultatai pagal Lietuvos rajonus
Šiaulių bei Kauno rajonuose buvo ištirta po du ūkius, o Vilniaus, Alytaus, Šakių bei Šilalės rajonuose – po vieną ūkį. Šiauliuose, ištyrus abu ūkius, viename rasta 16,66 proc. teigiamų mėginių, kitame nerasta nė vieno. Tačiau išvedus vidurkį išaiškėjo, kad didžiausia dalis teigiamų EEV mėginių (8,3 proc.) aptikta Šiaulių rajone, o mažiausia – Šilalės rajone (5,55 proc.) (7 pav.). Apskaičiavus statistiškai, nustatyta, jog teigiamų mėginių pasiskirstymas skirtinguose Lietuvos rajonuose yra statistiškai nereikšmingas (p>0,05) (7 pav.).
7 pav. Lizdinės AT-PGR ir realaus laiko TaqMan PGR tyrimo metodais tirtų bei gautų
teigiamų mėginių (proc.) pasiskirstymas po Lietuvos rajonus. Rajonuose nurodytų skaičių reikšmė:
pirmasis skaičius rodo tirtų mėginių skaičių rajone, antrasis – rastų teigiamų mėginių skaičių bei procentinę jų dalį
3.1.3. EEV gautų teigiamų mėginių priklausomybė nuo ūkio dydžio
Atliekant statistinius skaičiavimus, ūkiai buvo suskirstyti į tris grupes, pagal melžiamų ožkų kiekį (<10, 10-50, >50) bei teigiamų mėginių pasireiškimą juose (9 pav.). Didžiausias ūkis, kuriame laikoma 112 melžiamų ožkų – tai sudaro 50 proc. visų tirtų ūkių. Šiame ūkyje teigiamų mėginių nebuvo rasta. Mažiausiame ūkyje laikomos 4 melžiamos ožkos – tai sudaro 1,78 proc.. Minėtame ūkyje rasta 16,66 proc. teigiamų mėginių (8 lentelė). Atsižvelgiant į melžiamų ožkų kiekį ūkyje, EEV pasireiškimo statistika tarp ūkių reikšmingai skiriasi (p<0,05).
9 pav. Teigiamų mėginių pasiskirstymas pagal ūkio dydį
8 lentelė. Melžiamų ožkų skaičiaus ir gautų teigiamų mėginių pasiskirstymas
Eilės nr. Melžiamų ožkų
skaičius ūkyje Gauta teigiamų
Teigiamų mėginių proc. [95 proc. CI] 1 51 0 0 [CI% 0-9,18] 2 6 3 8,1 [CI% 2,80-21,30] 3 112 0 0 [CI% 0-10,15] 4 7 3 7,89 [CI% 2,72-20,80] 5 4 5 16,66 [CI% 7,34-33,56] 6 6 2 6,25 [CI% 1,73-20-15] 7 20 0 0 [CI% 0-9,18] 8 18 2 5,55 [CI% 1,54-18,14]
Iš viso: 224 15 5,3 [CI% 3,00-8,59]
13 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 <10 10-50 >50 T ei gi m ų m ėgi n ių k ie k is , vn t
3.1.4. EEV tyrimo rezultatai ožkų pieno mėginiuose skirtingais ganymo mėnesiais Ištyrus ožkų pieno mėginius buvo gauta 15 (5,3 proc.) teigiamų mėginių. Per mėnesį aptiktų teigiamų mėginių skaičius variavo nuo 2 (tai sudaro 13,33 proc.) iki 4 (26,66 proc.). Birželio, rugsėjo mėnesiais buvo aptikta po 2, rugpjūtį – 3, liepą, spalį – po 4 teigiamus mėginius (9 lentelė). Duomenų gauti statistiškai patikimiems rezultatams neužtenka (p>0,05).
9 lentelė. Gautų teigiamų mėginių pasiskirstymas pagal mėnesius
Eilės nr. Mėnesiai Gauta teigiamų, proc.
1 Birželis 2 (13,33 proc.)
2 Liepa 4 (26,66 proc.)
3 Rugpjūtis 3 (20,00 proc.)
4 Rugsėjis 2 (13,33 proc.)
5 Spalis 4 (26,66 proc.)
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šio tyrimo metu, ištyrus ožkų pieno mėginius (n=283), konvensinės ir realaus laiko polimerazinės grandininės reakcijos metodais, buvo aptikta 15 (5,3 proc. [CI% 3,00-8,59]) teigiamų EEV mėginių. Tyrimo metu buvo naudoti skirtingi oligonukleotidiniai pradmenys: NS5, NCR5 ir NS3 viruso fragmentams specifiniai pradmenys konvencinės polimerazinės grandininės reakcijos metodui, ir E genui specifiniai pradmenys realaus laiko polimerazinės grandininės reakcijos metodui. Su visais pradmenimis gautas vienodas teigiamų mėginių skaičius (n=15), išskyrus NS3 pradmenis, kuriuos naudojant buvo aptikti tik 3 (1,06 proc.) teigiami mėginiai (p<0,001). Šis neatitikimas gali būti paaiškintas tuo, jog NS3 fragmento produktas yra ilgas, sudarantis 631 bp [90]. Dėl jungtinio pieno mėginio atsiskiedimo laipsnio, daugelyje pieno mėginių viruso koncentracija buvo nedidelė. Todėl dėl šios priežasties, pradinės RNR medžiagos, ilgo NS3 fragmento sintezei nepakako, ir daugelis teigiamų mėginių taikant šiuos pradmenis buvo neaptikti. Tai įrodo, jog diagnostikai tikslinga naudoti trumpesnius viruso fragmentus generuojančius pradmenis, o NS3 pradmenys tyrimams, kai tiriamoji medžiaga – ožkų pienas, naudoti neefektyvu.
Atlikti EEV tyrimai ožkų pieno mėginiuose parodė, kad mokslinėse publikacijose [90 – 92] paskelbtų oligonukleotidinių pradmenų sekos ne visada gali būti tinkamos diagnostikai pieno mėginiuose. Daugelis autorių NS5, NCR5, NS3, E pradmenis buvo išbandę panaudojant tik EEV izoliatus ląstelių kultūrose arba tiesiogiai virusus identifikuojant erkių jungtiniuose mėginiuose. Mūsų atlikti tyrimai rodo, kad diagnostikai naudojamus oligonukleotidinius pradmenis būtina išbandyti ir tiriant pieno mėginius.
Pieno mėginių žvalgomieji tyrimai taip pat parodė, kad nedideli amplifikavimo fragmentai NCR5 (128 bp), NS5 (250 bp), E (82 bp) gali būti sėkmingai panaudojami identifikuojant EEV jungtiniuose pieno mėginiuose, kuriuose virusinių dalelių koncentracija, dėl reikšmingo atskiedimo, būna nedidelė. Nors atliktas tyrimas neleido mums indentifikuoti mažiausią įmanomą EEV koncentraciją piene, tačiau sėkmingai išbandyti PGR metodai su NCR5, NS5 ir E oligonukleotidiniais pradmenimis leidžia gautus rezultatus toliau panaudoti tolimesniuose EEV epidemiologiniuose tyrimuose.
Kadangi Lietuvoje nėra duomenų apie esamą erkinio encefalito viruso paplitimą ožkų ūkiuose, buvo ištirti jungtiniai ožkų pieno mėginiai. Tyrimams bandiniai surinkti iš skirtingų dydžių ūkių. Nustatyta, ūkio dydžio ir teigiamų mėginių skaičiaus priklausomybė – mažesniuose ūkiuose aptikta daugiau teigiamų mėginių. Tai galima paaiškinti tuo, jog mažesniuose ūkiuose mažiau prasiskiedžia pieno mėginys ir virusą aptikti lengviau, nes jo koncentracija pieno mėginyje būna aukšta. Taip pat kuo daugiau melžiamų ožkų yra ūkyje, tuo labiau prasiskiedžia mėginys ir tampa sunkiau aptikti virusą jame. Atlikus statistinius skaičiavimus nustatyta, jog atsižvelgiant į melžiamų
ožkų kiekį ūkyje, EEV pasireiškimo statistika tarp ūkių reikšmingai skiriasi (p<0,05). Siekiant tiksliau įvertinti erkinio encefalito viruso paplitimą dideliuose ūkiuose, yra tikslinga padidinti viruso koncentraciją mėginiuose, taikant ląstelių kultūrų metodus. Atsižvelgiant į viruso patogenezės mechanizmus ir moksline literatūrą [88], būtų tikslinga tam panaudoti universalią VERO ląstelių liniją ir specifišką iš žmonių arba pelių išskirtą neuroblastomų ląstelių liniją. Taip pat, siekiant įvertinti viruso struktūrinius ypatumus ir užsikrėtimo pavojingumą, būtų tikslinga atlikti eksperimentus su laboratoriniais gyvūnais. Jie leistu įvertinti, ar iš pieno išskirtas virusas yra pilnos struktūros ir geba užkrėsti gyvą organizmą, kadangi yra žinoma, jog kai kuriais atvejais infekcijos metu yra išskiriami nesubrendę viruso fragmentai, neturintys C baltymo ir dalies RNR grandinės, ir nors pasižymi dideliu antigeniškumu, negali sukelti erkinio encefalito ligos [87].
Žvalgomiesiems EEV tyrimams buvo atrinkta nedidelis kiekis ūkių. Ištyrus Lietuvoje esančius aštuonis ūkius (po vieną ūkį: Alytaus, Vilkaviškio, Vilniaus, Šilalės, po du: Šiaulių bei Kauno rajonuose), beveik visuose ūkiuose buvo aptikti teigiami rezultatai. Didžiausia dalis teigiamų EEV mėginių (8,3 proc.) rasta Šiaulių rajone, o mažiausia – Šilalės rajone (5,55 proc.). Tačiau daryti apibendrinančias išvadas apie Lietuvos teritoriją, negalima. Norint praplėsti tyrimus reikia ištirti daugiau ūkių. Nes šiuo metu yra ištirta per mažai mėginių ir apžvelgta per mažai rajonų, kad būtų galima įvertinti Lietuvoje esančią EEV paplitimo bendrą situaciją. Todėl gauti rezultatai yra tik preliminarūs, tačiau net ir sąlyginai nedidelės apimties tyrimai įrodo EEV atžvilgiu nepalankę epidemiologinę situaciją Lietuvos ožkų populiacijoje.
Tiriant ožkų pieno mėginius, skirtingi ganymo mėnesiai neturėjo įtakos EEV tyrimo rezultatams. Kadangi erkės yra aktyvios ir gali būti užsikrėtusios erkinio encefalito virusu nuo kovo iki lapkričio mėnesio, arba išskirtiniais atvejais ir dar ilgesnį laiką, kai temperatūra laikosi +5 °C ir yra didelė drėgmė [89]. Visa šį periodą erkės potencialiai gali užkrėsti ožkas, taigi virusas ožkų piene gali būti aptinkamas visą laktacijos periodą. Norint detaliau įvertinti mėnesio įtaka erkinio encefalito viruso paplitimui ožkų piene, reikėtų ištirti didesnį mėginių skaičių, nes šiuo metu ištirtų mėginių nepakanka statistiškai reikšmingiems rezultatams gauti.
Gauti žvalgomųjų tyrimų rezultatai įrodo, jog erkinio encefalito virusas gali būti aptinkamas melžiamų ožkų piene ir gali kelti potencialią grėsmę nepasterizuoto ožkų pieno ir pieno produktų vartotojams. Siekiant detaliau įvertinti riziką, yra tikslinga atlikti viruso stabilumo tyrimus in vivo ir
in vitro, įvertinant laiko, temperatūros pokyčius, fizikinius ir cheminius parametrus. Tai leistų
tiksliai žinoti sąlygas, kurioms esant virusas išlieka stabilus arba sunyksta, o tai savo ruožtu padėtų įvertinti pieno ir jo produktų saugumą vartotojams.
IŠVADOS
1. Erkinio encefalito viruso RNR diagnostikai jungtiniuose ožkų pieno mėginiuose atrinkti NCR5 ir NS5 viruso genomo fragmentams specifiniai (p<0,001) oligonukleotidiniai pradmenys.
2. Naudojant NS3 erkinio encefalito viruso genomo fragmentui specifinius oligonukleotidinius pradmenis nustatyta 5 kartus mažiau teigiamų mėginių (p<0,001) nei su NCR5 ir NS5 pradmenimis. Tai įrodo, jog NS3 pradmenų naudojimas erkinio encefalito viruso diagnostikai jungtiniuose pieno mėginiuose yra neefektyvus.
3. Atlikus tyrimus taikant konvencinės ir realaus laiko polimerazinės grandininės reakcijos metodus įrodyta, kad abu metodai yra lygiaverčiai, nes juos taikant nustatyti tie patys teigiami mėginiai (p<0,001).
4. Ištyrus jungtinius ožkų pieno mėginius (n=283) buvo aptikta 5,3 proc. (CI% 3,00-8,59), erkinio encefalito viruso teigiamų mėginių, kurie įrodo, kad virusas yra išskiriamas per pieną ir yra pavojingas nepasterizuoto pieno vartotojams.
PADĖKA
Labai dėkoju magistrinio darbo vadovui prof. dr. Arūnui Stankevičiui už suteiktas žinias, supratingumą, pasitikėjimą, patarimus, palaikymą bei pasiūlymus rašant magistrinį darbą. Nuoširdžiai noriu padėkoti Arnoldui Pautieniui už bendradarbiavimą, suteiktą pagalbą, išmoktas naujas pamokas atliekant molekulinius tyrimus, pasitikėjimą, nuoširdumą, palaikymą tuomet, kai to labiausiai reikia. Taip pat dėkoju tyrime sutikusiems dalyvauti ūkininkams už geranoriškumą ir norą bendradarbiauti.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Gubler D.J. Human arbovirus infections worldwide. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001; 951:13–24.
2. Süss J. Tick-borne encephalitis in Europe and beyond—The epidemiological situation as of 2007. Euro Surveill. 2008; 13:717–727
3. Schneider H.– Über epidemische akcute ‘Meningitis serosa’. Wien. Klin. Wochenschr., 1931; 44, 350–352.
4. Gould E.A. & Solomon T. – Pathogenic flaviviruses. Lancet, 2008; 371 (9611), 500–509.
5. Internetinė prieiga:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123751560000369 , 2017. (žiūrėta: 2019.05.03)
6. Bagdonas J, Nekrošienė N, Bulsienė I. Gyvulių erkinio encefalito seroepizootiniai tyrimai. Seroepizootic survey of tick- borne encephalitis in animals. Vet Zootec. 2011; 24:5-13
7. Simmonds P., Becher P., Colett M., Gould E., Heinz F., Meyers G., Monath T., Pletnev A., Rice C., Stiasny K., Thiel H., Weiner A. & Bukh J. – Flaviviridae. In Virus taxonomy (A. King, M. Adams, E. Carstens & E. Lefkowitz, eds). Elsevier Academic Press, Waltham, Massachusetts, 2012; 1003–1020.
8. Amato-Gauci A. & Zeller H. – Tick-borne encephalitis joins the diseases under surveillance in the European Union. Eurosurveillance, 2012; 17 (42), 1–2.
9. Ecker M, Allison SL, Meixner T, Heinz FXJ Gen Virol. 1999; 80 (Pt 1):179-85.
10. Kovalev S.Y., Mukhacheva T.A. Reconsidering the classification of tick-borne encephalitis virus within the Siberian subtype gives new insights into its evolutionary history. Infect. Genet. Evol. 2017; 55:159–165.
11. Dai X., Shang G., Lu S., Yang J., Xu J. A new subtype of eastern tick-borne encephalitis virus discovered in Qinghai-Tibet Plateau, China. Emerg. Microbes Infect. 2018; 7:1–9.
12. Korenberg E.I. Natural focality of infections: Current problems and prospects of research. Biol. Bull. 2010; 37:665–676.
13. Simmonds P., Becher P., Colett M., Gould E., Heinz F., Meyers G., Monath T., Pletnev A., Rice C., Stiasny K., Thiel H., Weiner A. & Bukh J.– Flaviviridae. In Virus
taxonomy (A. King, M. Adams, E. Carstens & E. Lefkowitz, eds). Elsevier Academic Press, Waltham, Massachusetts, 2012; 1003–102
14. Mackenzie, 2005 - Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kunjin nonstructural proteins NS2A and NS4A. Virology. 1998; 245:203–215.
15. Bollati M., Alvarez K., Assenberg R., Baronti C. and etc. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design. 2010; 87 (2): 125-148.
16. Robertson J.S., Mitzel D.N., Taylor T.R., Best S.M.,Bloom M.E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. 2009; 43 (1-3): 172-186.
17. Colpitts TM, Barthel S, Wang P, et al: Dengue virus capsid protein binds core histones and inhibits nucleosome for- mation in human liver cells. PLoS One 2011; 6(9).
18. Brault JB, Kudelko M, Vidalain PO, et al: The interaction of flavivirus M protein with light chain Tctex-1 of human dynein plays a role in late stages of virus replication. Virology 2010; 417(2): 369–378.
19. Murray CL, Jones CT, Rice CM. Architects of assembly: roles of Flaviviridae non-structural proteins in virion morphogenesis. Nat Rev Microbiol. 2008; 6:699–708
20. Heinz F.X. Molecular aspects of TBE virus research. Vaccine. 2003; 21, S3– 10.
21. Heinz F.X. & Stiasny K.– Flaviviruses and flavivirus vaccines. Vaccine, 2012; 30 (29), 4301–4306.
22. Koschinski A, Wengler G, Repp H: The membrane pro- teins of flaviviruses form ion-permeable pores in the target membrane after fusion: identification of the pores and analysis of their possible role in virus infection. J Gen Virol 2003; 84(Pt 7):1711–1721.
23. Liu WJ, Chen HB, Wang XJ, et al: Analysis of adaptive mutations in Kunjin virus replicon RNA reveals a novel role for the flavivirus nonstructural protein NS2A in inhi- bition of beta interferon promoter-driven transcription. J Virol 2004; 78(22):12225– 12235.
24. Munoz-Jordan JL, Laurent-Rolle M, Ashour J, et al: Inhi- bition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J Virol 2005; 79(13):8004–8013.
25. Grun JB, Brinton MA: Dissociation of NS5 from cell frac- tions containing West Nile virus-specific polymerase activ- ity. J Virol 1987; 61(11):3641–3644.
