LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Austėja Armonaitė
Erkinio encefalito viruso paplitimas epidemiologinei
stebėsenai tinkamoje žirgų populiacijoje Lietuvoje
Prevalence of tick-borne encephalitis virus in equine
population suitable for epidemiological monitoring in
Lithuania
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Algirdas Šalomskas
1 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Erkinio encefalito viruso paplitimas epidemiologinei stebėsenai tinkamoje žirgų populiacijoje Lietuvoje“:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
2 TURINYS SANTRUMPOS ... 4 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Erkinio encefalito viruso charakteristika... 10
1.1.1. Erkinio encefalito viruso struktūra ... 10
1.1.2. Erkinio encefalito viruso klasifikacija ... 10
1.1.3. Erkinio encefalito viruso replikacija šeimininko ląstelėje ... 11
1.1.4. Erkinio encefalito viruso lokalizacija organizme ir ligos patogenezė ... 11
1.2. Erkinio encefalito viruso epidemiologija ... 12
1.2.1. Geografinis su vektoriais susijęs paplitimas ... 12
1.2.2. Registruojami erkinio encefalito atvejai Europoje ... 13
1.2.3. Erkinio encefalito epidemiologija Lietuvoje ... 14
1.3. Erkinio encefalito perdavimas ... 14
1.3.1. Erkių vystymosi ciklo įtaka viruso perdavimui, erkių užsikrėtimas ... 14
1.3.2. Rezervuariniai šeimininkai ... 15
1.3.3. Atsitiktiniai, galutiniai šeimininkai ... 15
1.4. Erkinio encefalito viruso paplitimo tyrimai ... 16
1.4.1. Žmonių atvejų registravimas ... 16
1.4.2. Erkių žemėlapio sudarymas ... 17
1.4.3. Erkinio encefalito viruso paplitimo stebėjimui galimai tinkamos rūšys ... 17
1.5. Erkinio encefalito viruso charakteristika žirgams ... 20
1.5.1. Žirgų įtaka artropodiniams vektoriams... 20
1.5.2. Erkinio encefalito pasireiškimas žirgams ... 20
1.5.3. Žirgų, kaip erkinio encefalito viruso paplitimo stebėjimo rūšies, privalumai ir trūkumai ... 20
1.6. Erkinio encefalito viruso diagnostika ... 21
2. TYRIMŲ MEDŽIAGOS IR METODAI ... 23
3
2.2. Tyrimų medžiagos ... 23
2.3. Specifinių erkinio encefalito viruso antikūnų tyrimas ... 23
2.4. Žmonių sergamumo erkiniu encefalitu duomenys ... 25
2.5. Statistinė duomenų analizė ... 25
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 26
3.1. Žirgų gyvenimo anamnezės duomenys ... 26
3.2. Erkinio encefalito viruso specifinių antikūnų tyrimo imunofermentine analize rezultatai ... 27
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36
IŠVADOS ... 38
PADĖKA ... 39
4
SANTRUMPOS
EE– erkinis encefalitas
EEV – erkinio encefalito virusas TBE – tick-borne encephalitis TBEV– tick-borne encephalitis virus TBE-Fe – tolimųjų rytų EEV subtipas TBE-Sib – Sibiro EEV subtipas TBE-Eu – Europos EEV subtipas TBE-Bkl – Baikalo EEV subtipas TBE-Him – Himalajų EEV subtipas
ES/EEE – Europos sąjunga / Europos ekonominė erdvė DNR – deoksiribonukleorūgštis
RNR – ribonukleorūgštis
E – EEV nukleokapsidės proteinas (membraninis glikoproteinas) DIII – 3 rekombinantinis membraninio glikoproteino E domenas prM – prekursorius M (membraninis glikoproteinas)
NS1 – EEV membraninis glikoproteinas NS2A, NS2B – EEV membraninis proteinas NS3 – EEV membraninis glikoproteinas
NS4A, NS4B – EEV membraninis glikoproteinas NS5– EEV membraninis glikoproteinas
INF – interferonas kb – kilobazė
PGR – polimerazės grandininė reakcija IFA – imunofermentinė analizė
CNS – centrinė nervų sistema Ak – antikūnai
NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
ULSVIS – Užkrečiamųjų ligų ir jų sukėlėjų valstybės informacinė sistema VMVT – Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba
5 p – statistinis patikimumas
PI – pasikliautinis intervalas proc. – procentai
OT – optinis tankis
RKT – rezultato kokybinė transformacija
6 ERKINIO ENCEFALITO VIRUSO PAPLITIMAS EPIDEMIOLOGINEI STEBĖSENAI
TINKAMOJE ŽIRGŲ POPULIACIJOJE LIETUVOJE Austėja Armonaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Erkinio encefalito virusas (EEV) yra plačiai žinomas patogenas dėl savybės žmonėms sukelti centrinės nervų sistemos pažeidimus su sunkiomis pasekmėmis (1). 2017 metais Lietuvoje buvo užfiksuota daugiausiai EE atvejų (16,6 atvejo 100 000 žmonių) Europoje (2). Nors iki šiol EEV paplitimui vertinti naudojamas žmonių EE atvejų registravimas, pradėta ieškoti alternatyvių šios židininės gamtinės infekcijos epidemiologijos tyrimo būdų, pasitelkiant įvairias gyvūnų rūšis kaip objektyvesnius ir specifiškesnius EEV paplitimo indikatorius. Siekiant įvertinti Lietuvos žirgų populiacijos tinkamumą EEV paplitimo stebėsenai, buvo atliktas tyrimas, analizuojantis žirgų sergamumą EE ir jo ryšius su žmonių EE atvejais skirtinguose Lietuvos rajonuose.
Žirgų kraujo serumo mėginiai (n=301) buvo ištirti konkurencinės imunofermentinės analizės metodais: specifiniai antikūnai buvo nustatyti 124 iš 301 tirto mėginio (41,2 proc.). Didesnis žirgų skaičius arklidėje, kraujasiurbių vabzdžių kiekis aplinkoje ir ilgesnis laikas, praleidžiamas ganyklose, buvo teigiamai susijęs su EEV serologiniu paplitimu žirgų populiacijoje (p<0,05). Mišrūnų žirgų grupėje seroteigiamų individų buvo daugiau nei tarp veislinių žirgų (p<0,001). Subkliniškai EE sergančių žirgų buvo rasta net 15 iš 19 tirtų Lietuvos rajonų, o EEV serologinis paplitimas rajonuose svyravo 0 proc. iki 100 proc. EEV infekcijos paplitimas žmonių ir žirgų populiacijose tuose pačiuose rajonuose nebuvo statistiškai patikimai susijęs, tačiau EEV antikūnus žirgų populiacijoje buvo galima aptikti beveik keturis tūkstančius kartų dažniau, lyginant su užregistruotais EE atvejais žmonių populiacijoje (p<0,001). Tuo remiantis buvo priimta išvada, kad žirgų serologiniai tyrimai daug geriau atspindi EEV paplitimą gamtinėse teritorijose nei žmonių sergamumo vertinimas. Taip pat šie gyvūnai gali padėti identifikuoti naujus gamtinius EEV židinius ir nustatyti viruso epidemiologiją mažesniu nei rajoniniu lygiu, todėl yra tinkami EEV paplitimo stebėsenai vykdyti.
7 PREVALENCE OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS IN EQUINE POPULATION
SUITABLE FOR EPIDEMIOLOGICAL MONITORING IN LITHUANIA Austėja Armonaitė
Master’s Thesis
SUMMARY
TBEV is a well-known pathogen due to its ability to cause significant damage of central nervous system in humans with severe consequences (1). Lithuania had the highest number of TBE cases (16.6 per 100,000 people) in Europe according to the data for 2017 (2). Although the registration of human TBE cases remains the principal epidemiological method estimating the prevalence of TBEV, alternative approaches using different animal species as more specific and reliable indicators are being investigated. In order to evaluate the suitability of the Lithuanian equine population for monitoring of the prevalence of TBEV, a study was carried out assessing equine TBE morbidity and its relation with human TBE cases in different districts of Lithuania.
Equine blood serum samples (n = 301) were assessed by competitive immunoassay (ELISA): specific antibodies were detected in 124 of the 301 samples tested (41.2%). Higher number of horses in the stables, higher amount of blood-sucking insects in the environment and longer time spent in pasture were all positively associated with the equine TBE subclinical morbidity (p<0.05). Horses of mixed breed were more likely to be affected than horses with defined pedigree (p<0.001). Positive samples for TBEV antibodies were detected in 15 out of 19 tested districts of Lithuania, with equine seropositivity ranging from 0% to 100%. The prevalence of TBEV in human and equine populations in the same areas did not correlate significantly, although TBEV detection in the equine population was almost four thousand times more frequent than the TBE registered cases in human population (p<0.001). Therefore, it was concluded that in natural areas horses are able to represent the prevalence of TBEV more specifically than humans. Horses can also help to localize new natural TBEV foci and detect viral epidemiology at sub-regional levels, making the species suitable for monitoring of prevalence of TBEV.
8
ĮVADAS
Erkinio encefalito virusas (EEV), priklausantis Flaviviridae šeimai, Flavivirus genčiai, yra plačiai žinomas patogenas dėl savybės žmonėms sukelti centrinės nervų sistemos pažeidimus su sunkiomis pasekmėmis ar net mirtiną encefalitą (1). 2017 metų duomenimis, erkinio encefalito atvejus užregistravo 25 Europos Sąjungos ir Europos ekonominės erdvės šalys, iš kurių Lietuvoje buvo užfiksuota daugiausiai EE atvejų (2).
Nors EE atvejų registravimas ir pagal tai apskaičiuojamas EEV paplitimas šalyje yra tradicinis epidemiologinis metodas, jis ne visada objektyviai atspindi viruso pasklidimą teritorijoje, nes žmonių susirgimams gali turėti įtakos aktyvios prevencinės programos ir pasikeitę socioekonominiai faktoriai (3,4). Todėl imta ieškoti alternatyvių EEV epidemiologijos įvertinimo tyrimų. Erkės, laukiniai medžiojamieji gyvūnai, naminiai šunys ir atrajotojai yra plačiai aprašyti literatūroje kaip EEV stebėjimui galimai tinkamos rūšys, tačiau duomenų apie žirgų galimybes viruso paplitimo įvertinimui trūksta (5).
1995 metais mokslininkas H. J. Gerth (6) pateikė EEV monitoringui idealios gyvūnų rūšies reikalavimus: sukuria ilgai išliekantį imuninį atsaką į natūralią infekciją, gyvena apibrėžtoje namų teritorijoje ir iš jos galima surinkti didelį skaičių mėginių. Žirgai dažniausiai gyvena arklidėse nuo 2 iki 20 individų, laikomi ganyklose, aptvertoje teritorijoje, ir yra reguliariai jodinėjami netolimoje aplinkoje, taip pat išlaiko imuninį atsaką daugiau nei 9 mėnesius (5).
Lietuvoje EEV paplitimo stebėsenai arkliai iki šiol nebuvo naudojami, taip pat nėra duomenų apie EEV serologinį paplitimą žirgų populiacijoje. Kitose šalyse arklių EEV infekcijos tyrimai buvo atliekami tik fragmentiškai. Atsižvelgus į ligos epidemiologiją ir viruso keliamas grėsmes, buvo atliktas tyrimas, įvertinantis žirgų potencialą atspindėti realų EE viruso paplitimą endeminėse gamtinėse teritorijose Lietuvoje.
Tikslas : Išsiaiškinti EEV paplitimą tikslinėje Lietuvos žirgų populiacijoje bei įvertinti jos galimybes EEV epidemiologinei stebėsenai vykdyti.
9 Uždaviniai :
1. Išsiaiškinti EEV paplitimą epidemiologinei stebėsenai tinkamoje žirgų populiacijoje Lietuvoje taikant imunofermentinės analizės tyrimus.
2. Ištirti EEV serologinį paplitimą lemiančius veiksnius žirgų populiacijoje.
3. Palyginti EEV serologinį paplitimą žirgų populiacijose su žmonių sergamumu EE tuose pačiuose rajonuose.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Erkinio encefalito viruso charakteristika
1.1.1. Erkinio encefalito viruso struktūraEEV yra 50 nm dydžio RNR apvalkalėtasis virusas, kurio šerdinė dalis sudaryta iš kapsidės (C) ir 11 kb genomo, koduojančio 3400 amino rūgščių poliproteiną, sudarantį tris struktūrinius (C, prM, ir E) ir septynis nestruktūrinius (NS1, NS2A ir B, NS3, NS4A ir B, NS5) baltymus (1).
Kapsidė ir virusinė RNR yra apsupta dvisluoksnio lipidinio apvalkalo, kuriame yra 2 paviršiaus baltymai: prekursorius M (prM) ir proteinas E. Gerai struktūrizuotos, tridimensinės formos baltymas E turi ligandą haparano sulfatui, pagrindiniui šeimininko ląstelės receptoriui (7) ir yra atsakingas už membranų susiliejimą (8), patekimą į endosomas, šeimininko ląstelę ir galiausiai už infekcinio virusinio genomo išleidimą iš šeimininko ląstelės citoplazmos.
Nestruktūriniai baltymai turi daugelį funkcijų. Pavyzdžiui, nuo RNR priklausomą RNR polimerazės ir proteazės veiklą, apdorojant poliproteiną (9), ar interferonui (IFN) antagonistinę NS5 veiklą, trikdant įgimto imuniteto atsaką (10).
1.1.2. Erkinio encefalito viruso klasifikacija
EEV priklauso Flavivirus genčiai, Flaviviridae šeimai. Ši gentis susideda iš daugiau nei 80 rūšių virusų, kurių dauguma yra patogeniškos žmonėms (11). Flavivirusai, kaip ir dauguma RNR virusų, pasižymi dažnomis mutacijomis, todėl turi didelį kitimo potencialą, tačiau EEV yra išskirtinai stabilus natūraliomis sąlygomis ir nerodo didelės antigeninės variacijos (12). Tarptautinis virusų taksonomijos komitetas EEV skirsto į 3 subtipus: Tolimųjų Rytų (TBE-Fe), Sibiro (TBE-Sib) ir europinį (TBE-Eu) (13), kurie buvo pavadinti pagal jų vyraujantį geografinį paplitimą (14). Be pagrindinių 3 EEV subtipų, 2001 metais buvo identifikuoti dar 4 ir 5 subtipai Rusijos Irkutsko regione (15), tačiau jų geografinį paplitimą ir klinikinę išraišką dar reikia ištirti detaliau. Neseniai Baikalo regione buvo atrastos naujos padermės, kurias buvo pasiūlyta išskirti į atskirą, Baikalo, subtipą (TBE-Bkl) (16), o naujas padermes, izoliuotas iš Himalajinių švilpikų, išskirti į Himalajų subtipą (TBE-Him) (17).
Apvalkalo glikoproteino E genų sekoskaita pagrįsti molekuliniai EEV tyrimai atskleidė, kad TBE-Eu subtipo didžiausias amino rūgščių nukrypimas buvo 2,2 proc., o nukrypimas tarp subtipų 5,6 proc., ir tai patvirtina europinio EEV antigeninį homogeniškumą (18). Filogenetine analize paremti tyrimai rodo, kad lėtas EEV kitimas gali būti priklausomas nuo erkių ilgaamžiškumo ir dėl to, priešingai nei uodų perduodamų flavivirusų atvejais, EEV nenustatoma aktyvios genetinės
11 rekombinacijos (19). Visgi literatūroje yra paminimos EEV genomo taškinės mutacijos ir koegzistuojančios daugybinės viruso kvazirūšys (ang.k. „quasispecies“), kurios leidžia skirtingo virulentiškumo erkinio encefalito virusams išlikti vienoje teritorijoje, ir tai rodo alternatyvias EEV prisitaikymo savybes (1).
1.1.3. Erkinio encefalito viruso replikacija šeimininko ląstelėje
Visi flavivirusai yra apvalkalėti ir viengubos +RNR grandinės genomo, kuris šeimininko ląstelėje veikia kaip informacinė RNR. EEV patenka į ląstelę nuo klatrino priklausomos endocitozės būdu, panaudodamas proteiną E prisitvirtinimui prie ląstelės receptoriaus. Heparano sulfatas yra pirmasis identifikuotas EEV atpažinimo receptorius (7), tačiau manoma, kad ne tik šis receptorius dalyvauja EEV perėjime per ląstelės plazminę membraną. Proteino E DIII domeno ir heparano sulfato sąveika taip pat padeda sukoncentruoti virusą ant plazminės membranos (8). Flavivirusas yra pernešamas į pirmines endosomas, kuriose žemas pH paskatina proteiną E susijungti su endosomine membrana ir taip nukleokapsidė išleidžiama į citozolį (20,21). Nebrandžių erkinio encefalito virionų surinkimas yra vykdomas endoplazminiame tinkle, iš kurio virusinės dalelės yra pernešamos į Goldžio aparatą. Šeimininko ląstelės fermentas furinas rūgščioje Goldžio aparato terpėje pertvarko apvalkalo proteiną, pašalina prM ir taip subrandina virionus, kurie sekrecijos keliu yra išskiriami iš ląstelės. Visgi tyrimai rodo, kad absoliutus prM pašalinimas nėra privalomas, kad patogenas būtų virulentiškas (22).
Įdomu yra tai, kad infekcijos metu gali būti kartu išskiriami ir nesubrendę proteinas E ir prM, kurie suformuoja mažas, nekapsidines, ikosaedro formos 30 nm dydžio daleles. Jos yra neinfekcinės, nes neturi struktūrinio C baltymo ir RNR, tačiau pasižymi dideliu antigeniškumu. Tokiu būdu nuo EEV klinikinės infekcijos apsisaugo gyvūnai (1).
Kitas svarbus antigenas humoralinio imuniteto prieš EEV formavimui yra struktūrinis baltymas NS1, kuris yra išskiriamas iš infekuotų žinduolių ląstelių heksamerinių kompleksų forma. Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad gyvūnai, imunizuoti rekombinantiniu virusu, gebančiu dideliais kiekiais išskirti NS1 analogą, buvo atsparūs užkrėtimui EEV (23).
1.1.4. Erkinio encefalito viruso lokalizacija organizme ir ligos patogenezė
EEV, su erkių seilėmis patekęs į organizmą, pirmiausia replikuojasi odoje ir yra randamas dendritinėse ląstelėse, su kuriomis patenka į limfinius mazgus. Dendritinių ląstelių ir EEV ryšys ligos patogenezėje yra labai glaudus, nes jos yra ne tik pirminės virusą pagausinančios ląstelės, bet ir
12 dalyvauja pateikiant antigeną T ląstelėms limfiniame audinyje, dėl to EE sergantiems pacientams pasireiškia ribotas T ląstelių atsakas į infekciją (24).
Vėliau virusas patenka į kraują ir sukelia vireminę infekcijos fazę, išplinta po įvairius organus, replikuojasi retikuloendotelinėse ląstelėse. Šiame etape EEV gali pereiti į centrinę nervų sistemą (CNS), tačiau tikslus migracijos mechanizmas nėra žinomas. Manoma, kad virusas patenka į smegenis sukeldamas uždegiminių citokinų bangą, kuri padidina endotelio ląstelių pralaidumą arba pereina hematoencefalinį barjerą užkrėsdamas endotelio ląsteles arba migruodamas su dendritinėmis, T ląstelėmis ir neutrofilais (25). Naujausi tyrimai rodo, kad EEV nepaveikia žmogaus kapiliarų endotelio tarpląstelinių jungčių, o veikiau pasitelkia ląstelių migraciją per hematoencefalinį barjerą (26).
Kitas EEV patekimo į CNS būdas yra per uodžiamąjį nervą (n. olfactorius): patekęs į nosies gleivinę, EEV infekuoja bipolines uodžiamojo nervo ląsteles ir per nervinius laidus pasiekia smegenis. Centrinėje nervų sistemoje virusas plinta tiesiogiai iš neurono į neuroną aksonais bei tarpląsteliniais tarpais, sukelia išsėtinį pilkosios galvos ir nugaros smegenų medžiagos ir dangalų uždegimą, ląstelių lizę ir disfunkciją. Smegenų parenchima pažeidžiama, žuvus neuronams dėl viduląstelinio EEV dauginimosi ir išsivysčiusio uždegiminio atsako (27).
1.2. Erkinio encefalito epidemiologija
1.2.1. Geografinis su vektoriais susijęs paplitimasErkinio encefalito geografinis paplitimas užima didžiulę teritoriją nuo Norvegijos pietų vakaruose iki Hokaido salos Japonijoje rytuose. Geografinis pasiskirstymas priklauso nuo pagrindinių vektorių populiacijos: I.persulcatus, pernešančios TBE-Sib ir TBE-Fe subtipą, bei I.ricinus, pernešančios TBE-Eu subtipą. I.ricinus paplitimo zona driekiasi beveik per visą Europą iki Turkijos, šiaurės Irano, pietryčių Kaukazo. I.persulcatus paplitusi nuo rytų Europos per Kiniją iki Japonijos. Abi erkių rūšys užima bendrą teritoriją šiaurės rytų Europoje, Rusijos Karelijoje, iki Estijos ir Latvijos pietuose. Erkinio encefalito viruso subtipų paplitimas atitinka vektorių išsidėstymą, tačiau kartais randami ektopiniai židiniai, tokie kaip TBE-Sib subtipas iš I.persulcatus rūšies erkės vakarų Suomijoje (14,28).
Iš viso daugiau nei 22 erkių rūšys gali pernešti EEV. Kai kurių erkių rūšių svarba neįvertinama, nes jos nepasižymi žmonių tropizmu, nors reikšmingai prisideda prie viruso cirkuliacijos gamtoje.
Dermacentor reticulatus yra lengvai prisitaikanti erkių rūšis, kurios paplitimas driekiasi per visą
13 medžiojamiems ir naminiams gyvūnams. Tokiu būdu šios erkės prisideda prie EEV išplitimo ir pagausinimo aplinkoje (29).
EEV infekuotų erkių pasiskirstymas endeminėse srityse yra labai fragmentiškas, o EEV židiniai gali nesiekti 0,5 km2. Yra manoma, kad EEV židiniai sudaryti iš viruso palaikymo centro, kur randama
daug infekuotų erkių, ir aplinkinės zonos, kur erkių užkrėstumas daug mažesnis. Remiantis Bavarijoje atliktu tyrimu, EEV židinio centras (ang.k. „microfoci“) buvo 2500m2, kur virusas cirkuliavo tarp mažų
graužikų ir erkių, o į maždaug 1 km spindulio aplinkinę zoną (ang.k. „macrofoci“) erkes, manoma, pernešdavo stambesnieji laukiniai gyvūnai (30). Kokie veiksniai lemia viruso išlikimą griežtai apribotose zonose, nepaisant pernešančių ir atsitiktinių rūšių judrumo, nėra žinoma. Taip pat yra pastebima, kad EEV nėra randamas kai kuriose teritorijose, nors artropodiniai vektoriai jose yra plačiai paplitę.
1.2.2. Registruojami erkinio encefalito atvejai Europoje
Per paskutiniuosius dešimtmečius EEV tapo augančia visuomenės sveikatos problema. Iš viso visame pasaulyje per metus užregistruojama 10 - 15 tūkst. žmonių klinikinių atvejų, tačiau manoma, kad realus ligos dažnis yra dar didesnis, nes ne visose šalyse EEV infekcija yra registruojama liga ir nėra universalių registravimo kriterijų (31).
2012 metų rugsėjį Europos ligų prevencijos ir kontrolės centras įtraukė EE į registruojamų ligų sąrašą kaip didelį sergamumą turinčią ligą, kuriai sukurtos paprastos prevencinės priemonės.
Europoje erkinis encefalitas yra registruojama liga 18 – oje valstybių. EEV atvejų skaičius auga. Yra manoma, kad pagrindiniai šį fenomeną veikiantys faktoriai yra tobulėjantys diagnostiniai ir ligos registravimo metodai, pasikeitę žmonių laisvalaikio praleidimo būdai ir besikeičiančios klimatinės sąlygos, veikiančios erkių populiacijos gausumą (3,32).
2017 metais ES/EEE šalyse buvo užregistruota daugiau nei 3000 EEV atvejų, iš kurių 2550 patvirtinti (0,5 atvejo 100000 gyventojų). Iš 2419 atvejų su žinoma ligos baigtimi 9 ligoniai mirė (mirštamumas – 0,3 proc.). Didžiausias užregistruotų atvejų skaičius buvo Lietuvoje (16,6 atvejo 100000 gyventojų), Čekijoje ir Estijoje. Graikija, Airija, Liuksemburgas, Ispanija ir Didžioji Britanija neužregistravo nė vieno EE atvejo (2).
Vertinant EEV paplitimą daugelyje šalių, yra pastebimas ryškus EE atvejų skaičiaus svyravimas skirtingais metais. Priežastys, lemiančios tokį ligos pasireiškimo nepastovumą, nėra iki galo išaiškintos. Klimato kaitos faktorius buvo patraukęs daugelio mokslininkų dėmesį, tačiau dėl skirtingų duomenų tarp šalių, kuriose buvo fiksuojami panašūs meteorologiniai parametrai, klimato kaita negali visiškai pagrįsti svyravymų (32), tačiau daro tiesioginę įtaką žmonių elgesiui, jie daugiau laiko praleidžia
14 gamtoje. Besikeičiantys žmonių laisvalaikio įpročiai yra laikomi tiesiogiai susijusiais su EEV infekcijos atvejų gausėjimu (4).
1.2.3. Erkinio encefalito epidemiologija Lietuvoje
Lietuvoje kasmet užregistruojama 300 – 600 ligos atvejų.Vidutinis šalies sergamumo EE rodiklis 2013–2017 m. buvo 15,68/100 tūkst. gyventojų. Didžiausias sergamumo EE rodiklis užregistruotas 2003 m. – 21,95/100 000 gyventojų (763 ligos atvejai). Vyrai dažniau serga EE nei moterys (1,1 – 1,4 karto). Lietuvoje EE atvejai registruojami nuo balandžio iki gruodžio mėn. Pirmasis sergamumo pakilimas būna birželio mėnesį, didžiausias sergamumas užregistruojamas liepos – rugsėjo mėnesiais, net 49 – 60 proc. EE atvejų, užregistruojamų per metus (33).
Apie EEV epidemiologiją gyvūnų populiacijose Lietuvoje nėra daug žinoma. 2003 metais Lietuvoje atliktas EEV paplitimo tyrimas naminių gyvūnų populiacijoje atskleidė, kad iš 1715 kraujo serumo mėginių, paimtų iš penkių rūšių gyvulių, tik 8,6 proc. buvo seroteigiami. Daugiausia EEV buvo užsikrėtę galvijai (10,1 proc.), mažiausiai – arkliai (7,4 proc.) (34). Po dvejų metų atliktas dar vienas tyrimas, analizavęs naminių gyvulių užkrėstumą Lietuvoje, parodė dar mažesnius rezultatus: iš 1102 tirtų gyvūnų tik 19 (1,7 proc.) buvo seroteigiami EEV (35).
1.3. Erkinio encefalito perdavimas
1.3.1. Erkių vystymosi ciklo įtaka viruso perdavimui, erkių užsikrėtimas
Europoje paplitusių iksodinių erkių vystymosi ciklas yra nuoseklus, tarpfazinis brendimas iš kiaušinėlio į lervą, iš lervos į nimfą ir iš nimfos į suaugusią erkę. Kiekvienoje fazėje erkės patenkina maisto medžiagų poreikį pasimaitindamos krauju. Lervos vidutiniškai maitinasi 2-4 dienas, nimfos 3-5 dienas, o suaugusios erkių patelės 6-10 dienų. Suaugę erkių patinai maitinasi keletą kartų arba nesimaitina visai (1). Lietuvoje aktyvusis erkių periodas trunka nuo kovo pabaigos iki lapkričio vidurio, kai aplinkos temperatūra siekia +5 – +7oC, o dregmė 70 proc. (33). Kiekvienos erkių fazės
subrendimas užtrunka apie 1 metus, tai lemia 3 m. (2-6 m.) erkių gyvenimo trukmę (36). Iksodinės erkės gali maitintis įvairių stuburinių krauju, tačiau kiekviena fazė turi savo dažniausiai pasirenkamas rūšis: lervos ir nimfos maitinasi ant smulkių graužikų, gyvenančių žemuosiuose arduose, suaugusios erkės renkasi stambesnius gyvūnus (elnius, briedžius, galvijus, arklius). Smulkieji žinduoliai gali ir pagausinti erkių populiaciją, ir perduoti virusą neinfekuotoms erkėms, o stambieji gyvūnai tik prisideda prie erkių gausėjimo, nes jiems po užsikrėtimo neišsivysto ryški viremija (37). Nustatyta, kad apie 100 rūšių gyvūnų gali būti EEV šeimininkai. EEV retai sukelia ligą gyvūnams, tačiau susiformavęs
15 poinfekcinis imunitetas apsaugo nuo pakartotinės infekcijos visam gyvenimui. Žmogus yra atsitiktinis šeimininkas ir toliau infekcijos neperduoda (1).
EEV perdavimas erkėse vyksta vireminiu, nevireminiu, transovariniu ir transfaziniu būdu. Pagrindinis EEV plitimas gamtoje vyksta vireminiu būdu, kai erkė užsikrečia viremišku smulkiųjų graužikų krauju. Užsikrėtusi erkė infekciją turi visą gyvenimą (tarpfazinis perdavimas) ir užkrečia naujus šeimininkus kito maitinimosi metu bei perduoda virusą savo kiaušinėliams (transovarinis perdavimas). Yra manoma, kad iš infekuotų kiaušinėlių gali išsivystyti suaugusios erkės, irgi dedančios EEV infekuotus kiaušinėlius, tačiau šis būdas nėra pakankamas EEV cirkuliacijos palaikymui gamtoje. Labai svarbus EEV perdavimo būdas yra nevireminis, kai infekuota erkė ilgą laiką maitinasi vienu žinduoliu kartu su neinfekuotuomis erkėmis ir perduoda virusą per leukocitus, migruojančius odoje. Tokiu būdu net atsparūs gyvūnai, turintys susiformavusį imunitetą EEV, tiesiogiai prisideda prie viruso perdavimo kaip tiltai tarp infekuotos ir sveikos erkės (38,39).
1.3.2. Rezervuariniai šeimininkai
Tobulas rezervuarinis šeimininkas lengvai užsikrečia, išlaiko viremiją ilgą laiką be stiprių simptomų ir susilaukia daug užkrėtimui neatsparių palikuonių. Tokį EEV rezervuarinio šeimininko apibrėžimą atitinka smulkieji graužikai, kurių aukštas reprodukcijos lygis ir trumpa gyvenimo trukmė lemia tai, kad aplinkoje yra daug jaunų, imlių šeimininkų, galinčių pagausinti virusą. Europoje paplitę
Myodes ir Apodemus genčių graužikai nėra jautrūs aplinkos sąlygoms, prieauglį veda ankstyvą
pavasarį, erkių sezoninio aktyvumo pradžioje, ir išlaiko viremiją 4-9 dienas po infekcijos, todėl yra lengvi nimfų ir lervų taikiniai, prisidedantys prie EEV plitimo viremijos būdu. Dažniausiai artropodiniai vektoriai prisitvirtina mažame plote už graužiko ausų, todėl ir nevireminis erkių užsikrėtimas yra gana dažnas (38).
Tyrimai rodo, kad eksperimentiškai užkrėsti pelėnai gali perduoti infekciją palikuonims. Toks vertikalus perdavimas leidžia virusui nenutrūkstamai cirkuliuoti graužikų populiacijoje ir taip išlaikyti infekcijos židinį toje pačioje endeminėje teritorijoje ilgą laiką. Vis dėlto nėra aišku, kaip toks perdavimas paveikia patį virusą ir ar taip infekuoti graužikai gali užkrėsti erkes (40).
1.3.3. Atsitiktiniai, galutiniai šeimininkai
Nuolatinei I.ricinus populiacijai palaikyti reikalingi stambūs stuburiniai gyvūnai (elniai, briedžiai, kiškiai, šunys), nes suaugusios erkių patelės retai maitinasi ant smulkių stuburinių gyvūnų. Iksodinių erkių patinai taip pat dažniau renkasi stambesnius žinduolius, todėl šie tampa ne tik maisto medžiagų šaltiniu, bet ir erkių poravosi vieta (41).
16 Kadangi stambių laukinių gyvūnų ekologinės buveinės sutampa su I. ricinus buveinėmis, jie yra nepakeičiami erkių populiacijos maitintojai ir transportiniai šeimininkai. Tyrimai JAV įrodė, kad elnių populiacijos gausumas turi tiesioginę įtaką erkių populiacijos dydžiui (42). Norvegijoje atlikto tyrimo rezultatai patvirtina, kad erkių pasiskirstymas aplinkoje turi stiprų ryšį su elnių takais, todėl manoma, kad elniai gali išnešioti erkes savo judėjimo perimetre (43).
Nors ant laukinių stambiųjų žinduolių galima rasti dešimtis įsisiurbusių erkių, šie gyvūnai neišvysto reikšmingos viremijos, todėl nėra laikomi rezervuarinėmis rūšimis. Žmogus yra atsitiktinis šeimininkas, nes tiesiogiai neprisideda nei prie viruso platinimo, nei prie erkių populiacijos pagausinimo (38).
1.4. Erkinio encefalito viruso paplitimo tyrimai
1.4.1. Žmonių atvejų registravimasTradiciškai autochtoninių EEV atvejų skaičius žmonių populiacijoje nustato rizikos lygį žinomoje vietovėje ir tai yra pagrindinė epidemiologinė viruso apskaita Lietuvoje. Asmens sveikatos priežiūros įstaigų darbuotojai, įtarę asmenį, sergantį EE, taip pat mirties nuo šios ligos atvejį, registruoja informaciją Užkrečiamųjų ligų ir jų sukėlėjų valstybės informacinėje sistemoje (ULSVIS) ne vėliau kaip per 24 val. Vėliau užregistruoti duomenys papildomi pagal epidemiologinio ir mikrobiologinio tyrimo rezultatus. Surenkama epidemiologinė anamnezė: informacija apie asmenį, rizikos veiksniai, tiksli ar galima užsikrėtimo vietovė. Jei užsikrėtimo vietovėje EE atvejų anksčiau nebuvo užregistruota, yra rekomenduojama organizuoti erkių surinkimą ir ištyrimą dėl infekuotumo EEV bei naujo gamtinio EE židinio nustatymo, tačiau tai atliekama retai (33).
EEV paplitimo vertinimo metodas pagal žmonių EE sergamumo atvejus nėra tikslus, nes realų aplinkos užkrėstumą gali maskuoti naudojamos prevencinės priemonės (vakcinacija). Ligos inkubacinis periodas trunka 8 dienas (4-28 d.), o erkės įkandimo nepastebi 32 proc. žmonių (44), todėl surinkti tikslius epidemiologinius duomenis ne visada pavyksta. Rizikos zonų apskaičiavimas remiantis klinikiniais atvejais vietovėje nėra tikslingas ir dėl labai netolygaus židininio EEV geografinio pasiskirstymo, ypač jeigu rezultatai yra apskaičiuojami visam rajonui. Žmonių judumas vietovėje taip pat gali veikti rezultatus. Populiari gamtinė teritorija su EEV židiniu gali sukelti daugiau susirgimų lyginant su retai lankoma teritorija, net jei pastarojoje būtų daugiau infekuotų vektorių.
17 1.4.2. Erkių žemėlapio sudarymas
Alternatyva EEV epidemiologijos vertinimui pagal žmonių sergamumą yra infekuotų erkių kiekio nustatymas aplinkoje, tačiau nuo 2000 metų Lietuvoje erkės nėra ištiriamos dėl EEV, registruojama tik jų gausa.
Nustatant iksodinių erkių paplitimą, aktyvumą ir gausumą Lietuvoje kasmet didžiausio erkių aktyvumo metu vertinami 7 erkių stebėjimo stacionarai, kurie yra išdėstyti skirtinguose administraciniuose rajonuose, nuolatiniai ir lokalizuoti mažiausiai žmogaus veiklos paliestoje vietoje. Erkės renkamos standartine vėliavėle, braukiant ja žemaūgės augmenijos paviršiumi. Vėliavėlė kas 10 žingsnių apžiūrima ir surenkamos prikibusios erkės. Erkių gausos rodikliu laikomas surinktų erkių skaičius vieno kilometro atkarpoje. Stebėjimo stacionare erkių gausumas tiriamas kovo – lapkričio mėnesiais kartą per 10 dienų.
Entomologiniai tyrimai, vertinantys erkių užkrėstumą molekuliniais metodais, gali patvirtinti jau žinomus EEV židinius ir surasti naujus gamtinius EEV centrus aplinkoje, tačiau tyrimai rodo, kad nėra tiesioginės priklausomybės tarp erkių gausos teritorijoje ir žmonių sergamumo (45). Taip pat erkių populiacijos didumas nėra tiesiogiai susijęs su EEV infekuotų erkių kiekiu. 2004-2014 metais 23 tyrimai, atlikti teritorijose, kur dažnai pasitaiko EEV atvejų, rodo, kad virusinė RNR yra aptinkama tik labai mažoje visų surinktų erkių dalyje (<1 proc.). Visos šalies masto EEV paplitimo tyrimas Šveicarijoje atskleidė, kad iš 62 343 tirtų erkių tik 0,46 proc. turėjo EEV RNR (46). 2013 metais Vokietijoje, endeminėse EEV teritorijose, buvo ištirti 8897 erkių mėginiai, tačiau visi 2289 jungtiniai mėginiai (angl.k. „pool“) buvo neigiami (47).
Dėl daug žmogiškųjų resursų reikalaujančio tyrimo pobūdžio ir dažnai netenkinančių rezultatų erkių užkrėstumo aplinkoje tyrimas yra pripažintas nejautriu EEV epidemiologijos tyrimo metodu.
1.4.3. Erkinio encefalito viruso paplitimo stebėjimui galimai tinkamos rūšys
Smulkieji žinduoliai yra EEV rezervuariniai šeimininkai, kurie įvairiuose organuose virusinę RNR gali išlaikyti iki 168 dienų, tačiau kliniškai serga retai ir sugeba produkuoti labai aukštus antikūnų titrus (48). Serologiniai ir polimerazės grandininės reakcijos (PGR) tyrimai Slovėnijoje ir kitur atskleidė, kad smulkiųjų graužikų audinių mėginių tyrimų rezultatai koreliuoja su žmonių EE atvejų duomenimis tiek endeminėse vietovėse, tiek ir zonose be EEV rizikos (49).
Nors nėra žinoma, ar laukiniai paukščiai yra tinkami rezervuariniai šeimininkai, jie yra svarbūs infekuotų erkių pernešime į neužterštas teritorijas. Paukščių migracijai svarbūs geografiniai taškai gali tapti naujais EEV gamtiniais židiniais dėl potencialių šeimininkų įvairovės ir gausos (50).
18 Šunys greitai imunologiškai reaguoja į EEV virusą ir sugeba išlaikyti EEV IgG antikūnus ilgau nei 9 mėnesius, o kartais ir visą gyvenimą (51). Yra užfiksuota nemažai šunų klinikinių atvejų, kurių klinika ir patologija primena žmonių EE, nes nustatomi neurologiniai simptomai, hipertermija, stiprus encefalitas (52). Laboratorinis EEV infekcijos atvejo šunims patvirtinimas remiasi EEV IgM antikūnų buvimu kraujo serume arba keturis kartus didesniu EEV IgG antikūnų kiekiu tarp dviejų serumo mėginių, paimtų su 2-4 savaičių pertrauka (53). Serologiniai tyrimai Belgijoje, Danijoje, Vokietijoje ir Norvegijoje atskleidė, kad seroteigiamų rezultatų neužkrėstose vietovėse beveik nėra, o endeminėse teritorijose šunų teigiami mėginiai atspindi žmonių EE atvejų ir laukinės faunos tyrimų rezultatus (54-56). Vertinant šunų serologinių tyrimų rezultatus labai svarbu atsižvelgti į šunų kelionių istoriją, nes kaip žmonių kompanionai, jie dažnai keliauja ir turi didelę riziką kontaktuoti su virusu endeminėse teritorijose (56).
Lapės yra gausiai paplitusios ir surenka didelį kiekį iksodinių erkių, todėl galėtų būti rezervuariniai ar transportiniai šeimininkai, tačiau jų rolė EEV atžvilgiu nėra aiški (57). Lapės maitinasi smulkiais graužikais, todėl jų buvimas aplinkoje gali neigiamai veikti EEV gamtinį židinį (58).
Šernai yra svarbūs erkių populiacijos maitintojai. Čekijoje atliktame 8 metų laikotarpio tyrime šernų populiacijos dydis teigiamai koreliavo su žmonių EE atvejų skaičiumi (59). Autoriai pabrėžė svarbią laukinių šernų rolę EEV infekcijos atvejų skaičiaus didėjimui.
Elniniai gyvūnai EEV perdavimo cikle daugiausiai tarnauja kaip transportiniai šeimininkai ir gali platinti erkes net 30 km2. Šių stambių žinduolių viremija yra trumpa ir žemo lygio, todėl jie neplatina
viruso, tačiau duoda imuninį atsaką, kuris gali būti patikimai pamatuojamas serologiniais metodais (6). Deja, medžiojamų gyvūnų kraujo mėginiai dažnai būna prastos kokybės dėl didelio užteršumo ir hemolizės (60). Įvairios studijos iš skirtingų šalių rodo, kad elninių šeima turi įtakos aplinkos formavimui, smulkiųjų stuburinių ekologijai, erkių populiacijos dydžiui, nevireminiam EEV perdavimui, EEV infekuotų graužikų skaičiui, tačiau vienareikšmiška išvada dėl elninių šeimos įtakos EE atvejų skaičiui ir EEV paplitimui nėra priimta (6,59,61).
Atrajotojai duoda ilgalaikį imuninį atsaką į EEV infekciją, tačiau kliniškai serga retai (62). Nepasterizuoti pieno produktai iš ožkų, avių ir karvių gali sukelti alimentines EEV infekcijas žmonėms (63). EEV specifiniai antikūnai gali būti randami daugiau nei 28 mėnesius po infekcijos kraujo serumo mėginiuose, be to, labai maži Ak kiekiai randami ir piene (64). Nors galvijai, avys ir ožkos buvo įvertinti kaip EEV monitoringui tinkamos rūšys, atliekant tyrimus reikia atsižvelgti į EEV ir kitų
19 flavivirusų galimas kryžmines reakcijas bei ilgai išliekantį imuninį atsaką (apie 7 metus ir daugiau), nes šie veiksniai gali klaidinti vertinant tyrimo rezultatus (62).
1 lentelė. Įvairių gyvūnų, kaip EEV paplitimo stebėjimo rūšies, privalumai ir trūkumai (5)
Gyvūnai Privalumai Trūkumai
Erkės Didelė populiacija. Aptinkamas EEV paplitimas retai viršija
<1 proc.; erkių populiacijos didumas labai nevienodas skirtingais metais; daug laiko ir darbo reikalaujantis erkių surinkimas ir ištyrimas.
Smulkūs žinduoliai
Didelė populiacija; ribota buveinė; RNR aptinkamumas audiniuose; ilgai
išliekantys EEV specifiniai Ak.
Daug laiko ir darbo reikalaujantis didelio kiekio surinkimas ir ištyrimas; teisiniai sunkumai dėl spąstų statymo ir gyvūnų apsaugos.
Laukiniai paukščiai
Pernešantys šeimininkai?; RNR ir proteino E antigeno aptinkamumas audiniuose.
Nepastovi buveinė; kryžminės reakcijos su kitais flavivirusais.
Naminiai šunys
Ilgai išliekantys EEV specifiniai Ak; kontroliuojama, limituota buveinė; savininkas gali pateikti epidemiologinius duomenis.
Sunku sukaupti daug mėginių; sudėtinga kooperacija su savininkais ir gydančiais veterinarais; kelionės į skirtingas EEV rizikos zonas.
Medžiojami gyvūnai
Gausus užkrėstumas erkėmis; RNR aptinkamumas audiniuose; ilgai išliekantys EEV specifiniai Ak (žemas titras); lengva surinkti mėginius pagal kitų ligų paplitimo stebėjimo programas.
Prastos kokybės serumo mėginiai (užteršti, hemolizuoti); buveinės gali būti didesnės nei 30 km2.
Atrajotojai Ilgai išliekantys EEV specifiniai Ak kraujo ir pieno mėginiuose (žemas titras); ribota buveinė; didelė populiacija.
Nepastovi koreliacija tarp serologinio paplitimo atrajotojuose ir žmonių EEV atvejų.
20
1.5. Erkinio encefalito viruso charakteristika žirgams
1.5.1. Žirgų įtaka artropodiniams vektoriams
Žirgai yra atsitiktiniai EEV šeimininkai, nes negali viruso pagausinti, tačiau prisideda prie artropodinių vektorių populiacijos didinimo kaip maitintojai, suaugusių erkių poravimosi vieta ir galimai transportinės rūšys.
Nyderlanduose, kur arkliai kartais naudojami miškų priežiūroje, yra pastebėta, kad žirgai gali veikti erkių populiacijos gausumą modifikuodami gamtines buveines (65).
Žirgai, kaip ir elninių šeimos atstovai, EEV paplitimą gali veikti neigiamai, nes infekuotų erkių maitinimasis ant atsitiktinių, o ne rezervuarinių šeimininkų lemia tai, kad mažėja vireminių gyvūnų aplinkoje ir taip gali būti sutrikdytas EEV ciklas (66).
1.5.2. Erkinio encefalito pasireiškimas žirgams
Daugelis tyrimų nustatė, kad žirgai EEV dažniausiai serga subkliniškai (67-69), tačiau pasitaiko ir klinikinių susirgimų. Erkinio encefalito simptomai žirgams yra daugiau ar mažiau nespecifiniai: prasta bendra išvaizda, anoreksija, nervingumas, ataksija, staigūs raumenų spazmai, epileptiniai priepuoliai, kaklo ir peties raumenų paralyžius. Ligos eiga gali būti žaibinė, ūminė arba poūmė (67-71). Remiantis Vokietijoje atliktu tyrimu, žirgams po klinikinės infekcijos gali likti nervinių simptomų, tokių kaip padidėjęs nervingumas, staigumas (68).
Žirgų EE viremija yra trumpa, tačiau imunologinis atsakas į infekciją labai stiprus, duodantis aukštą EEV antikūnų titrą, kuris gali būti aptinkamas praėjus 9-19 mėnesių po infekcijos (64,68). Eksperimentiškai komercine žmonių vakcina suvakcinuotas žirgas taip pat parodė ilgai išliekantį aukštą Ak titrą (72).
2011 metais žirgų EEV infekcijos tyrimas Austrijoje nustatė, kad iš 67 EEV teigiamų gyvūnų 50 buvo vyriškos lyties. Taip pat daugiau užsikrėtusių žirgų buvo jaunesnio amžiaus – 5.9 ±4.2 metų (67).
1.5.3. Žirgų, kaip EEV paplitimo stebėjimo rūšies, privalumai ir trūkumai
Žirgai dažniausiai gyvena žirgynuose, kuriuose būna nuo kelių iki keliolikos žirgų, todėl nėra sudėtinga surinkti daug mėginių. Taip pat, pagal Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos (VMVT) reikalavimus, dalyvaujantys varžybose žirgai kartą per metus turi būti ištirti dėl infekcinės arklių anemijos. Tokiu būdu, bendradarbiaujant su žirgų veterinarijos gydytojais ir pasitelkus efektyvią komunikaciją su žirgų savininkais, galima surinkti mėginius iš daugelio šalies rajonų, skirtingų žirgų.
21 Žirgų laikymo sąlygos yra skirtingos kiekviename žirgyne, tačiau dažniausiai arklidės teritorijoje yra ganyklų, į kurias žirgai pradedami leisti nuo kovo iki lapkričio mėnesio, sezoniniu erkių aktyvumo laikotarpiu. Ganyklų plotas, landšaftas ir augmenija skiriasi, tačiau žirgų savininkai neretai skundžiasi, kad žirgai parsineša erkių į arklides.
Priklausomai nuo žirgo paskirties, žirgas gali būti judus netolimoje arklidžių aplinkoje treniruočių metu. Vidutiniškai žirgai treniruojami 1-2 val. per dieną ir gali nubėgti 10-15 km atstumus. Žirgų treniravimui šiltuoju sezonu dažniausiai yra naudojama lauko aikštelė, pievų, miškų takai. Pagal C. Klaus atliktus tyrimus (68), seroteigiamų žirgų aplinkoje surinktos erkės turi daug didesnį EEV RNR kiekį palyginti su erkėmis, surinktomis endeminėse EEV teritorijose neatlikus serologinių tyrimų gyvūnams. Tai rodo, kad žirgai gali užsikrėsti infekuotomis erkėmis ir taip atspindėti aplinkos užterštumą EEV.
Žirgų, kaip EEV paplitimo stebėjimo rūšies, trūkumas yra galimas ilgalaikis atsparumas po EEV infekcijos. Nėra atlikta tyrimų, vertinančių antikūnų ilgalaikiškumą žirguose. Kadangi žirgai retai nugyvena visą gyvenimą vienoje vietovėje, kelionės į EEV endemines ir ten gauta infekcija gali klaidinti tyrėją. Taip pat nėra ištirta žirgų populiacijos sergamumo ir žmonių EE atvejų koreliacija neendeminėse vietovėse.
1.6. Erkinio encefalito viruso diagnostika
Erkinio encefalito viruso paplitimo diagnostika remiasi keletu skirtingų tyrimų metodų: serologinėmis technikomis (imunoperoksidazės, netiesioginės imunofluorescencijos, imunofermentinės analizės viruso neutralizacijos reakcijos metodais), viruso izoliavimu, įvairių modifikacijų PGR (73).
Imunofermentinės analizės metodas (IFA) yra pagrįstas formalinu inaktyvuotų EE virionų (arba struktūrinių E ir prM baltymų) ir EEV specifinių antikūnų susijungimu (74). Dauguma komercinių IFA testų yra sukurti žmonių EE serologinei diagnostikai ir jų pritaikomumas gyvūnams yra nagrinėtas nedaug. 2011 metais su avimis ir ožkomis atlikti imunofermentinių diagnostikumų tyrimai atskleidė, kad visoms gyvūnų rūšims tinkamos IgG IFA jautrumas buvo 57 proc., o modifikuotos žmonių IgM antikūnų frakciją tiriančios IFA – 89 proc. (72).
Dėl gerai žinomų kryžminių reakcijų su kitais flavivirusais teigiamo rezultato patvirtinimui yra reikalingos viruso neutralizacijos reakcijos. Jų metodas pagrįstas viruso ir tiriamojo serumo inkubacija, po kurios šiuo tirpalu yra užkrečiamos ląstelių kultūros. Esant pakankamam antikūnų kiekiui serume, visas viruso kiekis yra neutralizuojamas ir ląstelės neužsikrečia. Jei serume antikūnų nėra arba jų kiekis
22 nepakankamas neutralizacijai, ląstelės yra infekuojamos viruso ir rodo citopatinį efektą arba ląstelių pažaida išryškinama panaudojant imunofluorescentinį dažymą (75).
Imunofermentinė analizė ir viruso neutralizacijos reakcija kartu yra laikomos 100 proc. patikimu metodu, nustatančiu EEV infekciją gyvūno organizme (72,73,75).
Norint aptikti virusą tiriamuosiuose gyvūnuose, gali būti naudojami viruso izoliacijos ir įvairių modifikacijų PGR metodai. Viruso izoliacijos metodas nėra patogus EEV paplitimui gyvūnų populiacijose tirti, nes mėginių ištyrimui reikalinga skirti daug laiko ir darbo išteklių. Todėl dažniau yra naudojami PGR metodai, kurie tiksliai ir sąlyginai greitai nustato EEV nukleorūgštį tiriamoje medžiagoje (1).
23
2. TYRIMŲ MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1. Tyrimų vieta
Tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedros Virusologijos laboratorijoje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto (NMVRVI) Serologinių tyrimų skyriuje ir įvairių Lietuvos rajonų žirgynuose 2019 metais (1 pav.).
.
1 pav. EEV paplitimo tikslinėje Lietuvos žirgų populiacijoje ir jo ryšio su EE atvejų skaičiumi žmonių
populiacijoje įvertinimo tyrimo eiga.
2.2. Tyrimų medžiagos
EEV paplitimui Lietuvos žirgų populiacijoje ištirti buvo surinktas 301 žirgų kraujo serumo mėginys 2019 metais gegužės mėnesį, didžiausio erkių aktyvumo laikotarpiu. Žirgai buvo įtraukti į tiriamąją grupę, jeigu: daugiau nei 4 valandas per dieną praleisdavo ganykloje ir žirgų gyvenamojoje aplinkoje buvo randama erkių.
Žirgų kraujo serumo mėginių (n=301) ir žirgų gyvenimo anamnezės
rinkimas iš 32 žirgynų
Kraujo serumo atskyrimas ir mėginių užšaldymas LSMU Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedros Virusologijos
laboratorijoje
Mėginių ištyrimas konkurencinės imunofermentinės analizės metodu NMVRVI Serologinių tyrimų
skyriuje
Žmonių sergamumo erkiniu encefalitu duomenų analizė
24 Žirgų mėginiai surinkti iš 32 žirgynų, esančių 19 rajonų, 8 apskrityse (Telšių, Utenos, Vilniaus, Alytaus, Kauno, Marijampolės ir Šiaulių) (2 pav.).
2 pav. Žirgų kraujo mėginių rinkimo vietos. Raudonai pažymėtos vietos, kuriose rasti seroteigiami
žirgai, mėlynai – seroneigiami, geltonai – abejotini žirgų kraujo serumo mėginiai
Prieš imant mėginius, buvo surinkta žirgų gyvenimo anamnezė apie amžių, veislę, žirgo paskirtį, treniravimą, šėrimą, ligas ir laikymo sąlygas. Žirgų laikytojai taip pat buvo apklausti apie kraujasiurbių vabzdžių kiekį aplinkoje, kurį įvertino pasirinkdami atsakymų variantus: „daug“, „vidutiniškai“, „mažai“.
Kraujo serumo mėginiai buvo renkami laikantis gyvūnų gerovės reikalavimų (76) iš jungo venos (v. jugularis) į sandarius, sterilius serumo mėgintuvėlius su krešėjimą aktyvinančiu geliu. Mėginiai buvo laikomi šaldytuve iki 48 h, centrifuguojami 10 minučių 4 tūkst. apsisukimų per minutę greičiu. Tada biosaugos spintoje, panaudojant sterilias priemones, iš supernatanto buvo surinktas kraujo serumas, užšaldytas -20ºC temperatūroje steriliuose mėgintuvėliuose. Užšaldyti mėginiai su lydraščiu buvo išsiųsti į NMVRVI Serologinių tyrimų skyrių.
2.3. Specifinių erkinio encefalito viruso antikūnų tyrimas
Specifiniai antikūnai EE virusams buvo nustatomi konkurencinės imunofermentinės analizės metodu. Tyrimams buvo naudojami komerciniai rinkiniai TestLine EIA TBEV Ig (TestLine Clinical
25 Diagnostics s.r.o.). Rinkiniai buvo validuoti atrinktais kontroliniais serumų mėginiais su specifiniais antikūnais.
Tyrimai buvo atliekami vadovaujantis detaliomis gamintojų metodikomis: atitinkamai atskiesti serumo mėginiai buvo išpilstyti į plokštelės duobutes po 50 µl. Tada pagal rinkinio instrukciją pridėta komercinio pelių EEV antikūnų tirpalo po 50 µl ir plokštelės inkubuotos 60 min 37 °C temperatūroje. Po inkubacijos plokštelės buvo plaunamos 4 kartus specialiu plovimo buferiniu tirpalu, po to veikiamos konjugatu (kiaulių anti-pelių antikūnais pažymėtais peroksidaze) ir pakartotinai inkubuojamos 60 min 37°C temperatūroje. Šio proceso metu kiaulių anti-pelių antikūnai prisijungė prie antigeno ir pelių EEV specifinių antikūnų kompleksų. Praėjus inkubacijos laikui, plokštelės buvo vėl plaunamos buferiniu tirpalu, veikiamos 100 µl chromogeninio substrato (TMB, H2O2) tirpalu ir inkubuojamos 15 min
kambario temperatūroje. Reakcija buvo sustabdoma sieros rūgšties tirpalu (H2SO4).
Spalvinė mėginio išraiška buvo neigiamai proporcinga tiriamojo serumo EEV antikūnų kiekiui. Spalvos intensyvumas buvo vertinamas optiniu tankiu (OT), kuris buvo nustatomas spektrometru 450 nm bangos ilgio šviesos pagalba. Rezultatų vertinimo tikslu OT išraiška buvo perskaičiuota pagal rezultato kokybinės transformacijos (RKT) formulę: mėginiai buvo laikomi seroteigiamais, jei tiriamojo serumo optinio tankio ir neigiamo kontrolinio mėginio optinio tankio santykio (NK/M) procentinė išraiška buvo NK/M > 200 proc.; abejotinais, jei 150 proc.≤ NK/M ≤ 199 proc.; seroneigiamais, jei NK/M < 150 proc.
2.4. Žmonių sergamumo erkiniu encefalitu duomenys
Norint palyginti EEV antikūnų turinčių žirgų populiaciją su žmonių sergamumu tuose pačiuose rajonuose buvo remtasi Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centro 2018 metų ataskaita apie užregistruotus erkinio encefalito atvejus žmonėms pagal rajoną (77). Kadangi ne visi rajonai buvo pateikti pagal naujausią Lietuvos administracinį suskirstymą, ne visuose tirtuose rajonuose buvo galima palyginti EEV paplitimą žmonių ir žirgų populiacijose.
2.5. Statistinė duomenų analizė
Aprašomoji statistinė duomenų analizė ir duomenų grafinis pateikimas atliktas naudojant Microsoft Office Excel (2013) ir IBM SPSS Statistics 25 programas. Duomenys įvertinti apskaičiuojant imčių vidurkius, jų standartinius nuokrypius ir paklaidas, minimalias ir maksimalias reikšmes, pasiklautinius intervalus. Duomenų skirtumams įvertinti naudotas T (Stjudento) testas ir ANOVA dispersinė analizė. Duomenys laikyti patikimais, jei p<0,05.
26
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Žirgų gyvenimo anamnezės duomenys
Tyrime dalyvavusiuose žirgynuose buvo laikoma nuo 2 iki 70 žirgų (vidurkis 19,5 ±0,84). Gyvūnai buvo naudojami įvairioms reikmėms: žirginiam sportui (konkūrui, ištvermės jojimui), mėgėjiškam jojimui, veisimui, turizmui ar tiesiog laikomi ganyklose. Tirti žirgai kiekviename žirgyne vasaros sezonu buvo šeriami skirtingai, tačiau jų racioną daugiausia sudarė įvairios sudėties koncentruoti pašarai, duodami kelis kartus per dieną, taip pat šienas, šienainis, šviežiai pjauta ar ganyklose nuganoma žolė. Gyvūnų aktyvumas priklausė nuo jų panaudojimo, amžiaus ir šeimininko poreikių: sveikų, jaunesnio amžiaus žirgų aktyvumas (jodinėjimas, vaikymas, darbas nuo žemės) svyravo apie 1-3 val. per dieną, o su vyresniais, sveikatos sutrikimų turinčiais žirgais buvo užsiimama rečiau, 1–4 val. per savaitę. Kai kuriuose žirgynuose žirgais visai nebuvo jodinėjama, jie buvo laikomi didelėse ganyklose ir laisvai judėdavo 24 val. per parą. Visi tirti žirgai vasaros sezonu buvo treniruojami lauko aikštelėse, jodinėjami laukų, pievų, miško takeliais.
Visi tirti žirgai mėginių ėmimo metu buvo kliniškai sveiki, tačiau jų sveikatos istorijos nebuvo aiškios, nes gyvūnai buvo pakeitę savo šeimininkus keletą kartų per gyvenimą. Žirgų laikytojai dažniausiai galėjo pateikti tik kelerių metų informaciją apie žirgo sveikatą. Buvo nurodyti įvairūs tiriamųjų žirgų susirgimai: diegliai, peršalimo simptomai, skrandžio opaligė, laminitas, konjunktyvitas, traumos, staigus svorio kritimas dėl nežinomų priežasčių. Kai kurie tiriamieji žirgai buvo persirgę infekcinėmis ligomis (leptospiroze, pažandėmis, babezioze, borelioze). Žirgų laikytojai nurodė, kad, kai kurie žirgai turi astmą, alergiją dulkėms, žiedadulkėms, vabzdžių įkandimams.
Renkant duomenis apie žirgų neurologinę sveikatą, neadekvataus, pakitusio žirgų elgesio dauguma laikytojų neišskyrė, tačiau per pastaruosius metus buvo pastebėta kai kurių žirgų didesnė agresija, nervingumas, staigumas arba atvirkščiai – apatija, hipoaktyvumas. Pusiausvyros, judėjimo sutrikimų turėjo tik keletas tirtų žirgų (n=7): laikytojai buvo pastebėję lengvos ar vidutinės ataksijos požymių, galvos sukimą į šoną, dažną žirgo suklupimą.
Dauguma tirtų žirgų kas metus ar kas pusę metų buvo vakcinuojami nuo arklių gripo ir stabligės. Žirgų savininkai nebuvo skiepiję žirgų nuo kitų ligų.
27
3.2. Erkinio encefalito viruso specifinių antikūnų tyrimo imunofermentine
analize rezultatai
Žirgų kraujo serumo mėginius ištyrus komerciniais konkurencinės imunofermentinės analizės rinkiniais, specifiniai EEV antikūnai buvo nustatyti 124 iš 301 tirto mėginio (41,2 proc.), 172 mėginiai buvo neigiami EEV antikūnų atžvilgiu (57,1 proc.), o 5 mėginiai buvo abejotini (1,7 proc.). Mėginių kokybinė išraiška buvo paskaičiuota pagal OT ir RKT (2 lentelė).
2 lentelė. Teigiamų, neigiamų ir abejotinų EEV Ak atžvilgiu mėginių optinio tankio (OT) ir rezultato
kokybinės transformacijos (RKT) duomenys
Optinis tankis RKT (proc.)
Vidurkis PI 95 proc. Vidurkis PI 95 proc.
Teigiami mėginiai 0,29±0,01 0,26-0,32 617,27±36,87 544,3-690,25 Neigiami mėginiai 1,06±0,01 1,05-1,07 117,75±0,98 115,83-119,68 Abejotini mėginiai 0,70±0,06 0,55-0,85 173,73±10,20 145,41-202,04
Iš viso tyrime dalyvavo 145 kumelės, 136 kastratai ir 20 eržilų. Priklausomybės tarp seroteigiamumo EEV ir žirgų lyties nebuvo nustatyta. Tiek kastratų, tiek kumelių tiriamosiose grupėse seroteigiami ir seroneigiami mėginiai statistiškai reikšmingai nesiskyrė, tačiau eržilų tiriamojoje grupėje seroteigiamų žirgų buvo žymiai daugiau nei seroneigiamų (p<0,05) (3 pav.). Statistiškai patikimas ryšys tarp žirgo lyties ir kraujo serumo tyrimo OT bei RKT duomenų nebuvo nustatytas (3 lentelė).
3 pav. Teigiamų, neigiamų ir abejotinų EEV Ak atžvilgiu mėginių skaičius procentais pagal lytį
46,2% 39,0% 20,0% 52,4% 58,8% 80,0% 1,4% 2,2% 0,0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
Kumelės Kastratai Eržilai
Se ro te ig ia m ų, s er on ei gi am ų ir ab ej ot in ų m ėg in ių s ka ič iu s (p ro c. )
28
3 lentelė. Teigiamų, neigiamų ir abejotinų EEV Ak atžvilgiu mėginių optinio tankio (OT) ir rezultato
kokybinės transformacijos (RKT) duomenys pagal žirgų lytį
Tyrime dalyvavo žirgai nuo 1,5 mėnesio iki 28-erių metų amžiaus. Daugiausia žirgų buvo 5-erių (n=26; 8,6 proc.), 7-erių (n=22; 7,3 proc.) ir 10-ties (n=23; 7,6 proc.) metų amžiaus (4 pav.). EEV Ak turinčių žirgų amžiaus vidurkis buvo 9,95 ±0,485 metų (PI 8,99-10,91). Žirgų, neturėjusių EEV Ak, amžiaus vidurkis buvo 9,65 ±0,445 metų (PI 8,77-10,52). Žirgų, kurių kraujo serumo mėginiai buvo abejotini EEV Ak atžvilgiu, amžiaus vidurkis buvo 15 ±3,114 metų (PI 6,35-23,65). Statistinės analizės metu buvo nustatyta, kad amžius ir mėginių statusas EEV Ak atžvilgiu bei OT ir RKT statistiškai reikšmingo ryšio neturėjo.
4 pav. Žirgų, ištirtų dėl EEV, amžiaus pasiskirstymas
0,3 3.64.0 2.7 7.0 8.6 7.07.3 6.6 5.3 7.6 4.7 3.7 5.66.0 2.3 1.3 4.7 4.0 1.7 1.7 1.0 0.71.0 0.30.70.3 0.3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tirtų žirgų amžius
Ž ir gų s kaičiu s (p roc .)
Žirgų skaičius (proc.)
Teigiami mėginiai Neigiami mėginiai Abejotini mėginiai
Kumelės Optinio tankio vidurkis 0,28±0,02 1,05±0,01 0,65±0,07
RKT (proc.) vidurkis 622,50±44,80 120,86±1,4 180,42±17,94
Kastratai Optinio tankio vidurkis 0,31±0,02 1,07±0,01 0,73±0,08
RKT (proc.) vidurkis 620,82±65,23 114,54±1,4 169,26±14,65
Eržilai Optinio tankio vidurkis 0,29±0,03 1,08±0,02 –
29 Tyrime dalyvavo 26 veislių ir mišrūnai žirgai, iš kurių daugiausia buvo mišrūnų (n=85; 28,2 proc.), Baltijos hanoverių (n=52; 17,3 proc.), žemaitukų (n=30; 10 proc.) ir Lietuvos jojamųjų (n=30; 10 proc.).
Tyrimo statistinės analizės metu buvo nustatytas statistiškai patikimas ryšys tarp žirgo veislės ir mėginių statuso EEV Ak atžvilgiu bei OT ir RKT (p<0,001) (5 pav.). Daugiausia seroteigiamų žirgų (daugiau nei 30 proc.) buvo mišrūnai, poni mišrūnai, žemaitukai ir Lietuvos jojamieji. Mažiausiai seroteigiamų žirgų buvo arabų veislės (4 lentelė).
4 lentelė. Tirtų veislių statuso EEV Ak atžvilgiu duomenys
Žirgų veislė Tirti mėginiai Teigiami mėginiai Neigiami mėginiai Abejotini mėginiai
Žemaitukas Skaičius 17 13 0 Procentas 56,7% 43,3% 0,0% Baltijos hanoveris Skaičius 14 37 1 Procentas 26,9% 71,2% 1,9% Mišrūnas Skaičius 50 33 2 Procentas 58,8% 38,8% 2,4% Lietuvos jojamasis Skaičius 10 20 0 Procentas 33,3% 66,7% 0,0%
Arabų arklys Skaičius 2 9 0
Procentas 18,2% 81,8% 0,0%
Trakėnas Skaičius 4 13 0
Procentas 23,5% 76,5% 0,0%
Poni mišrūnas Skaičius 3 6 0
Procentas 33,3% 66,7% 0,0% Ristūnas Skaičius 4 10 2 Procentas 25,0% 62,5% 12,5% Kiti veisliniai žirgai Skaičius 20 31 0 Procentas 38,8% 61,2% 0,0%
Suskirsčius tiriamus gyvūnus į veislinių ir neveislinių žirgų grupes gauta statistiškai patikima priklausomybė tarp veisliškumo ir mėginių statuso EEV Ak atžvilgiu bei OT ir RKT (p<0,001). Mišrūnų žirgų grupės (n=140) RKT vidurkis buvo 418,35 ±35,96 proc., OT vidurkis 0,63 ±0,04, o veislinių žirgų grupės (n=161) RKT vidurkis buvo 242,82 ±21,03 proc., OT vidurkis 0,82 ±0,03 (p<0,001).
30
5 pav. Tirtų veislių duomenys pagal RKT rezultatus
Taip pat statistinės analizės metu buvo rastas patikimas ryšys tarp kraujasiurbių vabzdžių kiekio žirgų aplinkoje ir mėginių RKT (p<0,05) (6 pav.).
6 pav. Tirtų žigų kraujo serumo mėginių RKT pagal vabzdžių kiekį aplinkoje
Net 5 žirgynuose EEV Ak rasti visuose tirtuose žirguose (100 proc.), o 5 žirgynuose teigiamų EEV Ak atžvilgiu mėginių nebuvo rasta. Net vienuolikoje žirgynų RKT vidurkis buvo išskirtinai aukštas seroteigiamiems mėginiams – didesnis nei 500 proc. (5 lentelė).
480.4 234.4 464.5 219.2 250.3 247.7 206.2 176.2 263.8 0 100 200 300 400 500 600 K ra u jo s er u m o m ėg in ių R K T (p ro c. )
Tirtos žirgų veislės
389.54 259.05 237.83 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Daug Vidutiniškai Mažai
K rau jo s er um o m ėgi ni ų R K T (p ro c.)
31
5 lentelė. EEV paplitimas žirgynuose ir žirgynų mėginių RKT vidurkis
Žirgyno numeris
Serologinis EEVpaplitimas žirgyne (proc.)
Teigiamų mėginių RKT vidurkis (proc.) 1 57,14 435,04±116,14 2 10,00 215,42±0,0 3 42,00 368,33±30,41 4 0 0 5 33,33 455,76±230,11 6 25,00 369,44±124,06 7 0 0 8 16,67 233,66±26,27 9 75,00 516,07±75,24 10 28,57 575,83±45,36 11 17,65 488,1±98,02 12 50,00 202,21±0,0 13 66,67 699,28±201,61 14 100,00 1138,49±43,72 15 38,46 374,2±63,71 16 25,00 351,72±84,78 17 100,00 434,08±78,56 19 45,00 444,3±66,83 20 0 0 21 64,29 521,14±88,11 22 20,00 312,85±41,05 23 33,33 230,03±12,68 24 35,29 619,7±157,05 25 100,00 832,85±85,18 26 76,47 537,31±81,29 27 0 0 28 0 0 29 38,46 1117,11±339,57 30 100,00 215,7±3,75 31 80,00 1363,44±485,92 32 100,00 615,41±97,72
Vertinant žirgynų įtaką žirgų užsikrėtimui buvo rastas stiprus ryšys tarp žirgyne laikomų žirgų skaičiaus ir teigiamų žirgų kraujo serumo mėginių EEV antikūnų atžvilgiu (p<0.05) (7 pav.). Taip pat statistiškai reikšmingas veiksnys žirgų užsikrėtimui EEV buvo laikas, kurį gyvūnai praleisdavo lauke
32 vasaros sezonu (p<0,05). Žirgai, turėję EEV Ak, vidutiniškai lauke praleisdavo daugiau laiko (19,03±0,59 val.) per parą, o Ak neturėję žirgai laiko lauke praleisdavo mažiau – 16,45±0,59 val. per parą.
7 pav. Žirgyne laikomų žirgų skaičiaus įtaka seroteigiamų gyvūnų skaičiui (proc.)
Teigiamų žirgų kraujo serumo mėginių EEV antikūnų atžvilgiu buvo nustatyta 15 iš 19 tirtų Lietuvos rajonų. Skirtinguose Lietuvos rajonuose teigiamų EEV antikūnų atžvilgiu žirgų skaičius svyravo nuo 0 proc. iki 100 proc. Didžiausias seroteigiamų mėginių skaičius buvo nustatytas Palangos miesto savivaldybėje, Utenos, Kauno, Vilniaus, Šiaulių, Trakų ir Marijampolės rajonuose, kuriuose daugiau nei 50 proc. visų tirtų žirgų mėginių buvo teigiami EEV atžvilgiu. Mažiausias EEV paplitimas žirgų populiacijoje nustatytas Alytaus, Jonavos, Kaišiadorių ir Ukmergės rajonuose, kuriuose teigiamų žirgų kraujo serumo mėginių EEV antikūnų atžvilgiu nebuvo rasta (8 pav.).
R² = 0.4804 R² = 0.4093 R² = 0.8968 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 1-10 11-20 21-30 31-100 S er ot ei gi am ų , s er on ei gi am ų ir a b ej ot in ų m ėg in ių s ka ič iu s (p ro c. )
Žirgyne laikomų žirgų skaičius
Teigiami mėginiai Neigiami mėginiai Abejotini mėginiai Teigiamų mėginių krypties linija Neigiamų mėginių krypties linija Abejotinų mėginių krypties linija
33
8 pav. EEV paplitimas žirgų populiacijoje skirtingose Lietuvos savivaldybėse
Tyrimo statistinės analizės metu buvo nustatytas statistiškai patikimas ryšys tap mėginių statuso EEV Ak atžvilgiu ir Lietuvos rajono, kuriame žirgas buvo laikomas (p<0,001). Skirtingos Lietuvos savivaldybės turėjo ir statistiškai reikšmingai besiskiriančius EEV Ak titrus tirtuose mėginiuose, kurie buvo įvertinti remiantis OT ir RKT rodikliais (p<0,001). Didžiausia RKT reikšmė nusatyta Kauno rajono savivaldybėje: net 632,28 ±242,39 proc. (PI 92,20-1172,37 ), o mažiausia RKT reikšmė – Ukmergės rajono savivaldybėje: tik 111,36 ±7,54 proc. (PI 93,54-129,19) (6 lentelė).
0 20 40 60 80 100 120
Alytaus rajono savivaldybė Lazdijų rajono savivaldybė Jonavos rajono savivaldybė Kaišiadorių rajono savivaldybė Kauno rajono savivaldybė Prienų rajono savivaldybė Palangos miesto savivaldybė Marijampolės rajono savivaldybė Joniškio rajono savivaldybė Šiaulių miesto savivaldybė Šiaulių rajono savivaldybė Anykčių rajono savivaldybė Molėtų rajono savivaldybė Utenos rajono savivaldybė Trakų rajono savivaldybė Ukmergės rajono savivaldybė Vilniaus rajono savivaldybė Rietavo savivaldybė Kazlų Rūdos rajono savivaldybė
Seroteigiamų mėginių skaičius (proc.)
Li etu vo s savi val dy bė s
34
6 lentelė. Tirtų savivaldybių duomenys pagal RKT rezultatus
Rajonai RKT vidurkis (proc.) PI (95 proc.)
1 Kauno rajono savivaldybė 632,28±242,39 92,20-1172,37
2 Alytaus rajono savivaldybė 132,19±3,29 124,75-139,63
3 Trakų rajono savivaldybė 440,77±54,82 329,89-551,66
4 Vilniaus rajono savivaldybė 578,31±77,85 420,72-735,91
5 Palangos miesto savivaldybė 330,80±48,39 231,14-430,45
6 Utenos rajono savivaldybė 310,71±42,62 223,78-397,64
7 Lazdijų rajono savivaldybė 500,94±185,91 95,87-906,02
8 Kazlų Rūdos rajono savivaldybė 615,41±97,72 304,43-926,40
9 Marijampolės rajono savivaldybė 215,71±3,74 168,08-263,33
10 Jonavos rajono savivaldybė 111,02±1,67 106,73-115,31
11 Kaišiadorių rajono savivaldybė 110,71 –
12 Molėtų rajono savivaldybė 147,53±17,91 110,17-184,89
13 Ukmergės rajono savivaldybė 111,36±7,54 93,54-129,19
14 Anykčių rajono savivaldybė 194,03±28,08 136,09-251,98
15 Rietavo savivaldybė 148,42±12,12 121,76-175,09
16 Prienų rajono savivaldybė 152,27±25,82 96,89-207,66
17 Joniškio rajono savivaldybė 224,81±31,74 158,13-291,50
18 Šiaulių miesto savivaldybė 119,76±10,69 95,59-143,94
19 Šiaulių rajono savivaldybė 300,30±88,96 82,63-517,96
Norint įvertinti žirgų tinkamumą EEV stebėjimui, buvo palygintas seroteigiamų žirgų skaičius ir užregistruotų žmonių EE atvejų skaičius tuose pačiuose Lietuvos rajonuose. Gauta koreliacija buvo silpna (0,353) ir statistiškai nepatikima (p=0.178). Atliekant satistinę duomenų analizę, buvo palygintos žmonių ir žirgų populiacijų galimybės užsikrėsti EE gamtiniuose EEV infekcijos židiniuose pagal šansų santykį (7 lentelė). EE atvejų skaičius 100000 rajone laikomų žirgų ir EE atvejų skaičius 100000 rajono gyventojų labiausiai skyrėsi Joniškio, Vilniaus, Šiaulių ir Kauno rajonų savivaldybėse: šansų santykis buvo daugau nei 7500. Alytaus, Jonavos, Kaišiadorių ir Ukmergės rajonų savivaldybėse šansų santykio nebuvo galima apskaičiuoti, nes tyrimo metu nebuvo gauta EEV seroteigiamų žirgų kraujo serumo mėginių. Kazlų Rūdos ir Marijampolės rajonų bei Rietavo savivaldybės šansų santykis nebuvo apskaičiuotas, nes Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centro 2018 metų ataskaitoje apie užregistruotus erkinio encefalito atvejus žmonėms pagal rajoną (77) nebuvo pateikta šių savivaldybių duomenų. Visų apskaičiuotų rajonų šansų santykio vidurkis buvo 3972,6 (p<0,001).
