LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Juozas Grigas
Molekulinė ir serologinė Hepatito E viruso diagnostika
Lietuvos kiaulių ir laukinių gyvūnų populiacijose
Molecular and serological diagnosis of Hepatitis E virus in
Lithuanian pig and wild animal populations
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Arūnas Stankevičius
2 DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Molekulinė ir serologinė Hepatito E viruso diagnostika Lietuvos kiaulių ir laukinių gyvūnų populiacijose“.
1. Yra atliktas mano paties;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2016-12-01 Juozas Grigas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2016-12-01 Juozas Grigas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 8 Tikslas ... 9 Uždaviniai ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1. Hepatito E viruso charakteristika ... 10
1.1.1. Viruso klasifikacija ir filogenezė ... 10
1.1.2. Viruso genomas ir koduojami baltymai ... 10
1.1.3. Viruso replikacija šeimininko ląstelėje... 11
1.2. Hepatito E viruso perdavimas ... 12
1.2.1. Antropozoonotinis perdavimas ... 12
1.2.2. Vidurūšinis ir tarprūšinis perdavimas gyvūnų tarpe ... 13
1.3. Hepatito E epidemiologija ... 14
1.3.1. Paplitimas pasaulyje ... 14
1.3.2. Paplitimas Centrinėje ir Rytų Europoje ... 16
1.4. Hepatitas E ligos charakteristika ... 17
1.4.1. Hepatito E viruso lokalizacija organizme ir patogenezė ... 17
1.4.2. Klinikiniai ir patologiniai anatominiai hepatito E požymiai ... 18
1.4.3. Hepatito E diagnostika ... 20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 21
2.1. Mėginių rinkimas ... 21
2.2. HEV antikūnų tyrimas ... 21
2.3. PGR analizė ... 22
2.4. Statistinė analizė ... 25
3. TYRIMŲ REZULTATAI... 26
3.1. HEV specifinių antikūnų tyrimo imunofermentine analize rezultatai ... 26
3.2. Atvirkštinės transkripcijos PGR tyrimų rezultatai ... 28
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32
4.1. Hepatito E viruso paplitimas kiaulių populiacijoje ... 32
4.2. Hepatito E viruso paplitimas šernų ir kitų laukinių gyvūnų populiacijose ... 33
4.3. Hepatito E viruso paplitimo palyginimas tarp kiaulių ir laukinių gyvūnų... 35
IŠVADOS ... 37
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 38
4
SANTRAUKA
Molekulinė ir serologinė Hepatito E viruso diagnostika Lietuvos kiaulių ir
laukinių gyvūnų populiacijose
Juozas Grigas
Magistro baigiamasis darbas
Hepatitas E yra virusinė zoonotinė liga. Hepatito E viruso (HEV) rezervuarais gali būti tiek naminiai, tiek laukiniai gyvūnai. Lietuvoje iki šiol nebuvo tirtas hepatito E viruso paplitimas tiek gyvūnų, tiek žmonių populiacijose. Hepatito E viruso paplitimui Lietuvos kiaulių ir laukinių gyvūnų populiacijose nustatyti buvo atlikta organų mėginių polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizė viruso RNR nustatymui, ir imunofermentinė (ELISA) kraujo mėginių analizė antikūnų, susidariusių prieš hepatito E virusą, nustatymui.
Kiaulių (n=98), šernų (n=153), stirnų (n=9) ir briedžių (n=1) mėginiai buvo paimti iš skirtingų Lietuvos rajonų 2014 – 2016 metų laikotarpiu. Mėginiai buvo ištirti komerciniu netiesioginiu ELISA testu (Idvet) ir lizdine PGR analize. 56,7 proc. kiaulių ir 52,6 proc. šernų mėginių buvo nustatyti antikūnai prieš hepatito E virusą. 19,4 – 48,4 proc. kiaulių ir 17,2 – 41,0 proc. mėginių buvo nustatyta virusinės RNR. Visi stirnų mėginiai buvo teigiami HEV RNR ORF1 atžvilgiu, o briedžio kraujo mėginys – neigiamas. Visose tirtose populiacijose kepenų ir plaučių mėginiuose buvo nustatoma daugiausia virusinės RNR, lyginant su kitais organais. Vinareikšmiški duomenys dėl HEV nustatymo priklausomybės nuo amžiaus grupės nebuvo gauti. Nustatytas didelis kiaulių ir šernų užsikrėtimas HEV įrodo, jog šios gyvūnų rūšys yra viruso rezervuarai Lietuvoje. Atitinkamai, maisto produktai, pagaminti iš šių gyvūnų mėsos, gali būti potencialus užsikrėtimo šaltinis žmonėms. Maža stirnų ir biredžių imtis neleidžia daryti išvados apie šių gyvūnų rūšių epidemiologinį aktualumą HEV atžvilgiu, tačiau duomenys, gauti iš tirtų stirnų mėginių, leidžia įtarti galimą šios rūšies vaidmenį viruso pernešime.
5
SUMMARY
Molecular and serological diagnosis of Hepatitis E virus in Lithuanian pig
and wild animal populations
Juozas Grigas
Master‘s Thesis
Hepatitis E is a viral zoonotic disease. Both domestic and wild animals can be reservoirs of hepatitis E virus (HEV). Until now, the prevalence of hepatitis E virus was not investigated in Lithuania among animal or human populations. To assess the prevalence of hepatitis E virus among the Lithuanian swine and wildlife populations a polymerase chain reaction analysis (PCR) of organ samples for viral RNA and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of blood samples for antibodies against hepatitis E virus were performed.
Pig (n=98), wild boar (n=153), roe deer (n=9) and elk (n=1) samples were collected from different Lithuanian counties throughout the years 2014 – 2016. Samples were analyzed with commercial indirect ELISA tests (IDvet) and nested PCR analysis. Seroprevalence of swine and wild boar samples were 56,7% and 52,6% respectively. 19,4 – 48,4% and 17,2 – 41,0% of the tested samples were positive for HEV RNA among pigs and wild boar respectively. All of the tested roe deer samples were positive for HEV RNA ORF1, while the tested blood samples of the elk was negative. Among all of the tested animal populations, liver and lung samples were most frequently tested as positive, compared to other organ samples. Aligned data for correlation of infection rate and animal age group was not found. High number of infected pigs and wild boars suggests that both animal species are relevant HEV reservoirs in Lithuania. Accordingly, food products made of meat from these species can potentially be dangerous for human consumption. Insufficient sample size of roe deer and elk organs prevents from drawing definite conclusions about the epidemiological relevance of these species as HEV reservoirs, but unexpectedly high number of positive roe deer samples suggests a possible role in viral transmission.
Key words: Hepatitis E; Zoonosis; Hepatitis E Virus; RNA; Swine; Wild Boar; Roe Deer; Elk.
6
SANTRUMPOS
°C – laipsniai Celsijaus
ALT – alanino aminotransferazė angl. – angliškai
AST – aspartato aminotransferazė bp – bazių poros
cDNR – komplementari deoksiribonukleorūštis CNS – centrinė nervų sistema
DNR – deoksiribonukleorūgštis dNTPs – deoksinukleotidai
EAVLD – Europos veterinarinės laboratorinės diagnostikos asociacija ELISA – imunofermentinė analizė
ESCRT – endosominiai paskirstymo kompleksai, reikalingi transportavimui g – gramai
GGT – gama gliutamiltransferazė HEV – hepatito E virusas.
IFN-α – interferonas alfa Ig – imunoglobulinas IL - interleukinas
iRNR – informacinė ribonukleorūgštis JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos. JK – Jungtinė Karalystė
Lent. – lentelė
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
M/TK% – procentinis mėginio koreguoto OT ir teigiamos kontrolės OT santykis MAPK – mitogeno aktyvuojama proteinkinazė
MgCl2 – magnio chloridas
n – mėginių (imties) skaičius NK – natūralūs žudikai NKT – T natūralūs žudikai
NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas ORF – atviro nuskaitymo seka
OT – optinis tankis
7 PGR – polimerazės grandininė reakcija.
PI – patikimumo intervalas proc. - procentai
RNR – ribonukleorūgštis.
sgRNR – subgenominė ribonukleorūgštis
TBE - Tris/Borato/etilendiamintetraacetatinės rūgšties UTR – netransliuojami regionai
W - Vatai
8
ĮVADAS
Hepatito E virusas (HEV) priklauso Hepeviridae šeimos Orthohepevirus RNR virusų genčiai. Virusas sukelia ūmų arba lėtinį hepatitą žmonių ir gyvūnų tarpe. Dėl galimybės užkrėsti žmones ir gyvūnus, bei sukelti kliniškai pasireiškiančią ligą, HEV yra aktualus patogenas. Pirmą kartą hepatito E protrūkis užregistruotas 1978 metais Kašmyre Indijoje (1). Nors HEV yra endemiškas besivystančiose šalyse (Indijoje, Pietryčių ir Centrinėje Azijoje, Artimuosiuose Rytuose bei Vakarinėje ir Šiaurinėje Afrikos dalyse), gyvūnų ir žmonių populiacijose hepatito E atvejų yra registruojama ir JAV, Europoje, Japonijoje, Australijoje ir Pietų Korėjoje (2).
Europoje antikūnai prieš HEV yra registruojami Viduržemio pakrantėje (Italija, Ispanija, Graikija), Vakarų Europoje (Prancūzija, Vokietija, Nyderlandai, Danija), Didžiojoje Britanijoje bei kai kuriose Centrinės ir Rytų Europos šalyse (Čekija, Lenkija, Vengrija) (3). Lietuvoje iki šiol nebuvo atlikti tyrimai HEV paplitimui nustatyti žmonių ir gyvūnų populiacijose. Tačiau duomenys iš kaimyninių šalių leidžia daryti prielaidą, jog Lietuvoje galėtų būti registruojama žmonių hepatito E atvejų ir nustatomi HEV rezervuarai naminių ir laukinių gyvūnų populiacijose. HEV teigiamų atvejų buvo aptikta šernų ir kiaulių bei žmonių populiacijose Estijoje (4) ir Lenkijoje (5). Duomenys apie hepatito E atvejus Ukrainoje ir Rusijoje yra riboti, tačiau juose yra aprašyti ligos protrūkiai žmonių tarpe. Iki šiol nėra paskelbta duomenų apie HEV paplitimą Latvijoje ir Baltarusijoje.
Žmonės hepatitu E gali užsikrėsti per vandenį, fekaliniu-oraliniu būdu nuo kitų žmonių, kraujo perpylimo ir organų transplantacijos atvejais nuo užkrėsto donoro, transplacentiniu bei zoonotinio perdavimo būdu. Pagrindiniai viruso rezervuarai, keliantys infekcijos pavojų žmonėms, yra naminės kiaulės (Sus domesticus), šernai (Sus scrofa) ir galimai dėmėtieji elniai (Cervus
nippon) (6). Šernai ir dėmėtieji elniai priklauso Lietuvos miškų laukinei faunai, o naminės kiaulės
yra svarbus produkcijos gyvūnas, kurio mėsa yra plačiai naudojama žmonių maistui. Atitinkamai Lietuvos gyventojams kyla rizika užsikrėsti hepatitu E visais galimais zoonotinio HEV užsikrėtimo būdais: suvartojus užkrėsto gyvūno mėsos produktus, turint tiesioginį kontaktą su užkrėstu gyvūnu ir užkrėsto gyvūno fekalijomis užterštais objektais.
Hepatitas E yra plačiai paplitusi ir kai kuriais atvejais mirtina žmonėms liga, todėl didžioji dalis duomenų apie ligą ir HEV yra skirta nagrinėjant pasireiškimą ir atvejus žmonių populiacijoje. Hepatitas E yra svarbesnis kaip visuomeninės sveikatos, o ne ekonominė problema, todėl duomenų apie klinikinę ligos išraišką ir patogenezę gyvūnų tarpe yra mažiau. HEV užsikrėtusioms kiaulėms ir laukiniams gyvūnams, skirtingai nei žmonėms, paprastai nėra būdingi klinikiniai požymiai, todėl šiuo atžvilgiu ligą pastebėti kiaulių ūkiuose yra sunku (7). Diagnostiką dar labiau apsunkina nežymūs ir nespecifiniai makroskopiniai ir mikroskopiniai patologiniai požymiai (nestipriai
9 padidėję pasaito ir kepenų limfiniai mazgai, kartais pasireiškiantis limfoplazmocitinis hepatitas ir silpna hepatocitų nekrozė). Todėl realiausiais hepatito E diagnostikos metodais lieka serologiniai ir molekuliniai (polimerazės grandininė reakcija (PGR)) tyrimai.
Atsižvelgiant į anksčiau minėtas priežastis, ir siekiant išsiaiškinti realią HEV paplitimo situaciją Lietuvos kiaulių ir laukinių gyvūnų populiacijose, buvo atlikti serologiniai ir molekuliniai patogeno tyrimai.
Tikslas
Išsiaiškinti hepatito E viruso paplitimą Lietuvos kiaulių ir laukinių gyvūnų populiacijose.
Uždaviniai
1. Imunofermentinės analizės metodu ištirti hepatito E virusui specifinius antikūnus Lietuvos kiaulių populiacijoje.
2. Imunofermentinės analizės metodu nustatyti hepatito E virusui specifinių antikūnų pasiskirstymą Lietuvos laukinių gyvūnų populiacijose.
3. Tiesiogiai nustatyti hepatito E viruso paplitimą Lietuvos kiaulių populiacijoje taikant atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją.
4. Tiesiogiai nustatyti hepatito E viruso paplitimą Lietuvos laukinių gyvūnų populiacijose taikant atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją. 5. Reminatis gautais imunofermentinės analizės ir molekulinių tyrimų rezultatais įvertinti
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Hepatito E viruso charakteristika
1.1.1. Viruso klasifikacija ir filogenezėYra išskiriami 7 HEV genotipai: genotipai HEV-1 ir HEV-2 hepatitą sukelia tik žmonėms, genotipai HEV-3 ir HEV-4 – žmonėms ir kiaulėms, genotipai HEV-5 ir HEV-6 – šernams ir genotipas HEV-7 – vienkupriams kupranugariams (Camelus dromedarius) (1). Visi minėti genotipai yra priskiriami Orthohepevirus A rūšiai, būdingai žinduoliams. Orthohepevirus B yra taip pat Orthohepevirus genčiai priklausanti rūšis, kuriai priklauso 3 skirtingi genotipai, galintys užkrėsti paukščius, tačiau pasižymi mažesne įvairove, nei Orthohepevirus A (8). Orthohepevirus C priklauso du genotipai, galintys užkrėsti žiurkes ir šeškus. Yra nustatytas tik vienas Orthohepevirus
D rūšies viruso genomas, kuris buvo izoliuotas šikšnosparnio organizme.
1.1.2. Viruso genomas ir koduojami baltymai
Viruso genomas yra ~7200 bazių porų turinti viengubos grandinės teigiamo poliariškumo RNR, kurios 5` ir 3` galuose dėstosi netransliuojami regionai (angl. untranslated region (UTR)) ir trys persidengiančios atviro nuskaitymo sekos (angl. open reading frame (ORF)) – ORF1, ORF2 ir ORF3 (9).
ORF1 koduoja poliproteiną, turintį 4 domenus, pasižyminčius metiltransferazės, į papainą panašios cisteino proteazės, RNR helikazės ir nuo RNR priklausančios RNR polimerazės aktyvumu. Nustatyta, jog metiltransferazės domenas, taip pat pasižymintis guanililtransferaziniu aktyvumu, funkcionuoja kaip gaubiantysis fermentas (angl. capping enzyme), kuris katalizuoja 5`gaubto prisitvirtinimą prie informacinės RNR (iRNR) molekulės jos sintezės metu pirmajame genų ekspresijos etape (10). RNR polimerazė yra būtina viruso replikacijos iniciacijai, prisitvirtinant prie 3` genomo galo, dalyvaujant vietiniams šeimininko ląstelės kofaktoriams (11). Nors tiksli cisteino proteazės funkcija kol kas nėra tiksliai žinoma, yra manoma, jog ji yra atsakinga už ORF1 koduojamo poliproteino apdorojimą (12). RNR helikazės domenas tvirtinasi ir hidrolizuoja nukleotidų trifosfatus bei pasižymi RNR trifosfatazės aktyvumu, dėl kurio yra suardomos 5` galo γ-β fosfoanhidridinės iRNR jungtys, todėl gali būti pritvirtinamas 5` gaubtas po molekulės transkripcijos (13).
ORF2 transliuojamas nuo subgenominės iRNR (sgRNR) (14). iRNR paprastai yra transkribuojama nuo šabloninės genominės RNR nuo 3` galo link 5` galo nuo pradžios iki galo. sgRNR yra pradedama transliuoti nuo 3` galo, tačiau įvairiose vietose pakeliui 5` galo įvyksta šuolis
11 (delecija), praleidžiama dali nukleotidų, ir transkripcija užbaigiama paskutiniais 5` galo nukleotidais. Atitinkamai yra gaunama trumpesnė iRNR, kurios ilgis priklauso nuo to, kurioje vietoje įvyko delecija, tačiau turi 3` pradžią ir 5` pabaigą identišką pilnai genominei iRNR. Ši savybė leidžia nuo vienos genominės RNR transliuoti daugiau skirtingų iRNR. sgRNR transliacija yra būdinga daugumai teigiamo poliariškumo RNR virusų. HEV genome tai sąlygoja ORF2 ir ORF3 persidengimą. ORF2 koduoja struktūrinius viruso kapsidės baltymus.
ORF3 koduoja baltymą VP13, kuris tarpininkauja šeimininko genų ekspresijoje ir virionų formavimesi (15). VP13 geba prisijungti prie neaktyvios mitogeno aktyvuojamos proteinkinazės (MAPK) fosfatazės, ją aktyvuoti ir atitinkamai aktyvuoti MAPK. MAPK yra signalinė molekulė, reguliuojanti genų ekspresiją. Nustatyta, jog be VP13 baltymo naujai susiformavęs HEV virionas negali palikti užkrėstos šeimininko ląstelės (16).
1.1.3. Viruso replikacija šeimininko ląstelėje
Kol kas nėra tikslių duomenų, apibūdinančių pilno viruso ciklo šeimininko ląstelėje molekulinę schemą. Yra žinomi kai kurie viruso replikacijos mechanizmo aspektai. HEV yra neapvalkalėtasis virusas, kurio genomą dengia sujungtų polipeptidų grandinės, suformuojančios kapsides, tačiau buvo nustatyta, jog virusai, izoliuoti iš kraujo arba ląstelių kultūrų, buvo padengti ląsteline membrane, panašiai kaip apvalkalėtieji virusai (17). Patekus į šeimininko ląstelės vidų, neapvalkalėtųjų virusų kapsidės pašalinimas (“nurengimas”) vyksta trim galimais būdais: viruso kapsidės baltymams prisijungus prie tam tikrų šeimininko ląstelės receptorių ir iššaukiant proteazių aktyvumą, virusui esant endosomoje “nurengimą” iššaukiant žemai pH arba esant oksidoreduktazių aktyvumui, ir, dalyvaujant šeimininko ląstelių molekuliniams varikliams, keletas jų prisitvirtinusių skirtingose viruso kapsidės vietose ir judančių skirtingomis kryptimis “nurengia” virusą dėka mechaninio krūvio (18). Nors galima įtarti, jog vienas iš šių mechanizmų yra būdingas HEV kapsidės pašalinimui, nėra duomenų, apibrėžiančių tikslų šio proceso mechanizmą.
HEV yra RNR virusas, todėl jam patekus į ląstelės citoplazmą prasideda RNR transkripcija ir transliacija. Pirmiausia yra transliuojamas ORF1, kurio koduojamas polipeptidas yra būtinas struktūrinių baltymų (koduojamų ORF2) ir virionų formavimuisi (reikalingi baltymai koduojami ORF3). ORF1 koduojama nuo RNR priklausoma RNR polimerazė yra svarbi sgRNR transkripcijai, kuri sąlygoja ORF2 ir ORF3 transkripciją nuo pirminės genominės RNR (15).
Nors HEV yra daugiausia traktuojamas kaip neapvalkalėtasis virusas, viriono formavimasis ir išsiskyrimas iš ląstelės yra panašesnis į apvalkalėtuosius virusus su tam tikrais skirtumais. Apvalkalėtieji virusai paprastai išsiskiria iš ląstelės pumpuravimosi būdu (19). HEV skirtingai nei neapvalkalėtieji virusai suformuoja su membrana susijusį apvalkalą, tačiau skirtingai nei apvalkalėtieji virusai apvalkalą suformuoja ląstelės citoplazmoje, o ne ant ląstelės membranos (20).
12 Idant suformuotų apvalkalą ir iš ląstelės išsiskirtų pumpuravimosi būdu, virusas, tikėtina, pasinaudoja endosominiais paskirstymo kompleksais, reikalingais transportavimui (angl. endosomal
sorting complexes required for transport (ESCRT)). Šiuo atveju yra tikėtina, jog ORF3 koduojamas
baltymas VP13 sąveikauja su trans-Goldžio kompleksu ir tokiu būdu patenka į pūsleles, kurios, ESCRT mechanizmo dėka, transportuoja virionus citoplazmoje membranos link ir iš ląstelės išsiskiria pumpuravimosi būdu.
1.2. Hepatito E viruso perdavimas
1.2.1. Antropozoonotinis perdavimasŽmonių užsikrėtimas nuo gyvūnų suvartojus užsikrėtusio gyvūno mėsą, turint tiesioginį kontaktą su užsikrėtusiu gyvūnų arba gyvūno fekalijomis užkrėstu objektu yra vienas iš viruso perdavimo būdų. Azijoje, Afrikoje ir Pietų Amerikoje zoonotinis perdavimo būdas nėra reikšmingas (1). Taip yra todėl, kad čia nėra paplitę gyvūnus ir žmones galintys užkrėsti genotipai – HEV-3 ir HEV-4 (2). Išimtis, šiuo atveju, būtų sporadiniai žmonių užsikrėtimai HEV-4 genotipu rytinėje Kinijos dalyje, Taivane, pietinėje Japonijos (21) dalyje ir Vietname, bei HEV-3 genotipu Argentinoje, kur hepatito atvejai galėjo būti sąlygoti zoonotinio perdavimo būdo (22). Nustatyti zoonotinius užsikrėtimus besivystančiose šalyse taip pat sunku, nes dominuoja užsikrėtimas per užterštą vandenį (2). Vienas iš vandens taršos šaltinių gali būti užsikrėtusių gyvūnų fekalijos, tačiau tai nustatyti ir patvirtinti gali būti sudėtinga. Ligai taip pat yra būdingas ilgas inkubacinis periodas (2-10 savaičių), todėl gali būti sunku susieti ligos pasireiškimą su tam tikru suvartotu mėsos produktu (2).
Išsivysčiusiose šalyse galima įtarti dažnesnius zoonotinius užsikrėtimus, nes Europoje ir JAV dominuoja genotipo HEV-3 sukelti hepatitai (2). Vienas pagrindinių zoonotinių užsikrėtimo būdų Europoje yra vartojant nepakankamai termiškai apdorotą kiaulių ir šernų mėsa, ypač kepenis (23). Daugelis užsikrėtimų centrinėje Japonijos dalyje HEV-3 genotipu yra siejami su termiškai neapdorotos užkrėstos šernų mėsos (sašimi stiliumi) vartojimu (24). Nors Europoje žalia mėsa yra vartojama rečiau lyginant su Japonija, kai kurie tradiciniai patiekalai atskiruose Europos regionuose, gaminami iš termiškai neapdorotos mėsos, gali būti užsikrėtimo šaltinis. Vienas tokių pavyzdžių yra Frigatelli dešrelės iš Korsikos salos Prancūzijoje, kurios yra gaminamos iš termiškai neapdorotų kiaulių kepenų ir paprastai yra valgomos neapkeptos (25). Visi 7 Pietų Prancūzijoje tirti pacientai, kurių organizme buvo aptikta HEV RNR arba antikūnai prieš virusą, buvo valgę termiškai neapdorotų Frigatelli dešrelių. Vokietijoje kiaulių kepenys yra naudojamos dešrų gamyboje arba yra kepamos ant griliaus ir buvo nustatytos kaip svarbus autochtoninio HEV užsikrėtimo šaltinis šalyje kartu su šernų mėsa (26). Duomenų apie koreliaciją tarp hepatito E
13 pasireiškimo ir užkrėstos mėsos suvartojimo kitose Europos šalyse kol kas nėra, tačiau yra duomenų apie HEV RNR kiaulienos produktuose iš skirtingų Europos valstybių (5 proc. Čekijoje, 6 proc. Italijoje ir 3 proc. Ispanijoje), kas gali potencialiai sąlygoti žmonių užsikrėtimus šiose šalyse (27). Be kiaulienos ir šernienos, kitų užkrėstų laukinių gyvūnų termiškai neapdorota mėsa taip pat gali būti užsikrėtimo šaltinis. Yra duomenų apie žmonių užsikrėtimus Japonijoje valgant žalią stirnieną sašimi stiliumi (28).
Zoonotinis žmonių užsikrėtimas oraliniu būdu gali būti būdingas ir neesant užkrėstų mėsos produktų vartojimo. Tiesioginis kontaktas su užkrėstais gyvūnais bei jų organais gali būti žmonių užsikrėtimo šaltinis, todėl į rizikos grupę patenka medžiotojai, skerdyklų darbuotojai, veterinarijos gydytojai, mėsininkai, tyrimų laboratorijų darbuotojai. Skerdyklos darbuotojų užsikrėtimai genotipo HEV-3 potipiu 3f buvo nustatyti Ispanijoje (29). Minėtas potipis yra registruojamas 97,3 proc. visų užkrėstų Ispanijos kiaulių. JK buvo registruoti mėsininkų užsikrėtimai HEV su išreikštais hepatito E klinikiniais požymiais ir nustatyti antikūnai prieš virusą darbuotojo kraujo serume (30). Pastarieji duomenys buvo pateikti atvejo ataskaitos būdu, todėl nėra nustatyta statistinė sąsaja. Abiem atvejais tikėtina, jog užsikrėtimai įvyko oraliniu būdu po manipuliacijų kiaulių organais ir tinkamų higienos normų nesilaikymo darbo vietoje. Vokietijoje HEV atžvilgiu buvo tirta medžiotojų imtis, tačiau statistiškai reikšminga koreliacija tarp užsiėmimo ir teigiamų atvejų, lyginant su kontroline grupe, nebuvo gauta (31). Italijoje tiriant medžiotojų imtį buvo rasta statistiškai patikima koreliacija tarp medžiojimo ir teigiamo PGR rezultato HEV atžvilgiu (15 proc. užsikrėtusių) (32). Dar vieno tyrimo, atlikto Vokietijoje, metu buvo tirti veterinarijos gydytojai, skerdyklų darbuotojai ir mėsos inspektoriai, tačiau statistiškai reikšminga koreliacija tarp darbovietės ir antikūnų prieš HEV buvo įrodyta tik skerdyklos darbuotojų tarpe (41,7 proc. užsikrėtusių) (33). Įdomūs rezultatai buvo gauti tyrimo Prancūzijoje metu, kur buvo tirti eiguliai, miškininkai ir medkirčiai. Statistiškai patikima koreliacija buvo rasta tarp medkirčio profesijos ir antikūnų prieš HEV (37,2 proc. užsikrėtusių) (34). Tikėtina, jog didesnė rizika yra būdinga dėl medkirčių kontakto su užkrėstų gyvūnų išmatomis užterštais objektais, išmatomis užteršto upių ar vietinių šulinių vandens vartojimo.
Kol kas nėra duomenų apie gyvūnų užsikrėtimus nuo žmonių. 1.2.2. Vidurūšinis ir tarprūšinis perdavimas gyvūnų tarpe
Nors yra nemažai duomenų, aprašančių žmonių užsikrėtimus HEV-3 ir HEV-4 genotipais nuo gyvūnų, nėra daug informacijos apie viruso perdavimo būdus tarp skirtingų gyvūnų rūšių. Europoje yra įtariamas HEV-3 genotipo perdavimas tarp laukinių šernų ir kiaulių populiacijų fekaliniu - oraliniu būdu (35). Tyrimo metu laukinių šernų grupė buvo eksperimentiškai užkrėsta HEV intraveniniu būdu, išskyrus vieną šerną, kuris buvo neužkrėstas, tačiau laikomas viename garde su užkrėstais šernais. Į neužkrėstų miniatiūrinių paršelių gardą buvo periodiškai pernešamos
14 išmatos iš užkrėstų šernų gardo. Nustatyta, jog 1 iš 3 miniatiūrinių paršelių užsikrėtė fekaliniu oraliniu būdu. Neužkrėstas šernas taip pat užsikrėtė fekaliniu oraliniu būdu, o jo audiniuose buvo nustatyta gerokai didesnė virusinės RNR koncentracija. Manoma, jog silpnesnį kiaulių užsikrėtimą per išmatas, lyginant su šernais, galima paaiškinti pastoviu ir tiesioginiu šernų kontaktu su išmatomis gardo viduje.
Daugiau tyrimų yra atlikta nustatant HEV perdavimą tarp tos pačios rūšies gyvūnų – ypač kiaulių. Nors oralinis-fekalinis perdavimo būdas yra labiausiai paplitęs lauko sąlygomis, eksperimentiniu būdu užkrėstų kiaulių tarpe didesni antikūnų titro kiekiai yra gaunami iš kiaulių, kurios buvo užkrėstos intraveniniu būdu, lyginant su oraliniu (36). Idant įvyktų kiaulės užsikrėtimas fekaliniu-oraliniu būdu, pastaroji turi turėti pakartotiną kontaktą su didele viruso doze. Neužsikrėtusių kiaulių, laikomų viename garde su užsikrėtusiomis kiaulėmis, audiniuose ilgainiui aptinkama viruso RNR bei antikūnai prieš HEV, bei vyksta viruso platinimas per išmatas (37). Taip pat nustatyta, jog užsikrėtimai tarp dviejuose atskiruose aptvaruose esančių gyvūnų yra reti, todėl kiaulių grupavimas fermose yra reali priemonė bandant sumažinti viruso plitimą.
Kiti laukiniai gyvūnai taip pat gali būti svarbūs viruso pernešimo vektoriai tiek vidurūšinių, tiek tarprūšinių užsikrėtimų atžvilgiu. Japonijoje buvo nustatyti tarprūšiniai dėmėtųjų elnių ir laukinių šernų užsikrėtimai (28). Filogenetinė analizė atskleidė, jog gautos iš abiejų rūšių virusinės RNR nukleotidų tapatumas lygus 99,7 proc. Europoje tokio pobūdžio tyrimas buvo bandytas atlikti Nyderlanduose, tačiau tarprūšinės viruso pernašos tarp tauriųjų elnių (Cervus elaphus) ir šernų nepavyko nustatyti (38). Nors skirtingų HEV genotipų yra aptinkama įvairių gyvūnų rūšių populiacijose, kol kas nėra duomenų, paaiškinančių daugelio jų vidurūšinio ar tarprūšinio perdavimo mechanizmus ir galimybes. Galimai aktualus HEV vektorius yra laukinės žiurkės (Rattus spp.), kurių audiniuose yra aptinkama HEV-3 genotipo RNR, kuris gali užkrėsti žmones ir kitus laukinius gyvūnus bei kiaules, o dažnas tiesioginis ir netiesioginis kontaktas su žmonių populiacija (ypač miestuose) bei plačios rūšies paplitimo ribos gali sąlygoti svarbą HEV platinime žmonių ir gyvūnų populiacijose (39).
1.3. Hepatito E epidemiologija
1.3.1. Paplitimas pasaulyjePagal hepatito E paplitimą geografinės teritorijos gali būti skirstomos į: hiperendemines zonas, endemines zonas, sporadines zonas ir išskirtines zonas (1). Hiperendeminėmis yra apibūdinamos zonos, kur hepatito E protrūkiai įvyksta dažnai (kas kelerius metus), užsikrečia keli šimtai ar tūkstančiai žmonių, ir gali trukti nuo kelių savaičių iki ilgiau nei metų. Hiperendeminė zona apima didžiąją dalį Afrikos žemyno (šiaurinėje ir pietinėje Afrikos dalyje dominuoja HEV-1
15 genotipas, o centrinėje dalyje – HEV-2 genotipas), Braziliją (dominuoja HEV-1), Meksiką (HEV-2), Centrinę (Bangladešas, Indija, Butanas, Nepalas, Kazachstanas) ir Pietryčių Aziją (Indonezija, Tailandas, Vietnamas) (HEV-1) (40). Centrinėje ir Pietryčių Azijoje hepatitas E yra svarbiausia ūmų hepatitą sukelianti žmonių ligą (41).
Epideminėms zonoms priklauso teritorijos, kuriose yra įvykę hepatito E protrūkiai. Epideminė zona apima Saudo Arabiją (dominuoja HEV-1 genotipas) (42), Kiniją (didžiausias ligos protrūkis įvyko 1986–1988 metais šiaurės vakarų dalyje, kur buvo registruota 119 280 atvejų ir virš 700 mirčių; dominuoja HEV-4 genotipas) (43) ir kai kurias Pietų Amerikos šalis (Argentina, Ekvadoras) (1).
Sporadinėms zonoms priskiriama dauguma išsivysčiusių šalių. Čia hepatito E atvejai pasitaiko retai ir dažniausiai nėra susiję su konkrečiu epidemiologiniu veiksniu. Sporadinei zonai yra priskiriama Europa, Australija, Japonija, Kanada bei JAV (40). Visose šiose šalyse dominuoja HEV-3 ir HEV-4 genotipai.
HEV-3 ir HEV-4 genotipais užsikrėtę šernai ir naminės kiaulės kaip viruso rezervuarai yra aktualūs besivystančiose šalyse. Japonijoje nustatyta, jog 93 proc. šalies kiaulių ūkių yra aptinkama antikūnai prieš HEV, o šernų populiacijoje serologiškai teigiamų gyvūnų yra 4,5 – 34,3 proc. priklausomai nuo tirto regiono (44). Kiti mažiau reikšmingi viruso rezervuarai šalyje yra elniai (1,7 – 2,6 proc. serologiškai teigiamų) ir mangustai (8,3 – 21 proc.). Kanadoje skerdžiamų kiaulių tarpe 41,2 proc. gyvūnų išmatų buvo aptikta HEV-3 genotipo RNR (45). Pagrindinis viruso rezervuaras laukinėje Kanados faunoje yra baltauodegiai elniai (Odocoileus virginianus) (8,8 proc. serologiškai teigiamų), juodauodegiai elniai (Odocoileus hemionus) (4,5 proc.) ir šiaurės elniai (Rangifer
tarandus) (3,2 proc.) (46). Serologiškai teigiamų kiaulių yra registruojama ir didelėje dalyje JAV
ūkių (23). Šiaurinėje, pietinėje ir vakarinėje Europos dalyse pagrindiniai HEV rezervuarai yra naminės kiaulės ir šernai, o viruso paplitimas gyvūnų populiacijose yra gerai ištirtas Ispanijoje, Nyderlanduose, Italijoje, Prancūzijoje, Vokietijoje, Austrijoje ir Vengrijoje, ir serologiškai teigiamų šernų kiekis svyruoja tarp 17 – 50,3 proc. (23). Kai kuriose besivystančiose šalyse taip pat yra registruojama HEV užkrėstų naminių kiaulių. Laose, priklausomai nuo tirtos kiaulių grupės, serologiškai teigiamų gyvūnų registruojama 15,3 – 51,2 proc. (47). Brazilijoje tyrimai buvo atlikti dviejuose kiaulių ūkiuose, kur buvo nustatyta 81 – 88,4 proc. serologiškai teigiamų paršelių (48). Brazilijoje ir Laose atlikti tyrimai su nedidele imtimi, todėl negalima daryti išvadų apie HEV paplitimą kiaulių populiacijose šalies mastu. Tyrimai Nigerijoje parodė, jog 47,2 proc. kiaulių iš tirtų regionų buvo serologiškai teigiami HEV-3 genotipo atžvilgiu (49). Tai pirmasis tokio masto kiaulių populiacijos tyrimas Afrikoje. Anksčiau atlikti tyrimai Konge ir Kamerūne nebuvo patikimi dėl mažio imties.
16 Nors HEV padermių, būdingų atrajotojams, kol kas nėra nustatyta, kai kuriose besivystančiose šalyse yra aptinkama serologiškai teigiamų HEV atžvilgiu gyvūnų (21,6 proc. tirtų galvijų) (50). Laukiniai ir naminiai triušiai taip pat gali būti aktualus HEV rezervuaras. HEV-3 genotipo RNR buvo aptikta Prancūzijos, JAV ir Kinijos fermose auginamų triušių audiniuose, o Prancūzijoje buvo nustatyta, jog 23 proc. laukinių triušių yra serologiškai teigiami (23). Be minėtų rūšių, laukinio viruso rezervuaro funkcija gali būti būdinga paukščiams, žiurkėms, šeškams, šikšnosparniams bei žuvims. Pastarųjų geografinis paplitimas ir epidemiologinė reikšmė viruso plitimui, išskyrus paukščius, dar nėra pakankama ištirta.
1.3.2. Paplitimas Centrinėje ir Rytų Europoje
Bulgarijoje hepatitas E buvo diagnozuotas 2,48 proc. visų ūmų hepatitą turėjusių žmonių pacientų (51). Manoma, jog pagrindinis užsikrėtimo šaltinis šalyje yra nepakankamai termiškai apdorota kiauliena (ypač Sudjuk dešros, gaminamos prikemšant kiaulių žarnas vidaus organais (tame tarpe kepenimis), džiovinant ir vartojant termiškai neapdorojus), tačiau HEV paplitimas kiaulių ir laukinių gyvūnų populiacijose šalyje nėra nustatytas.
Čekijoje 98 proc. pacientų su ūmiu hepatitu buvo serologiškai teigiami HEV-3 genotipo atžvilgiu, įtariant zoonotinį užsikrėtimą vartojant termiškai neapdorotą kiaulieną bei esant kontaktui su kiaulių išmatomis (52). Nors buvo nustatyta, jog 5 proc. šalies kiaulienos produktų yra randama HEV RNR (27), tiriant kiaulių išmatų mėginius fermose Čekijoje nebuvo gauti patikimi rezultatai (53). Duomenų apie HEV paplitimą laukinėje faunoje kol kas nėra.
Panašiai kaip Bulgarijoje, Serbijoje 15 proc. tirtų kraujo donorų buvo serologiškai teigiami HEV atžvilgiu ir labiausiai tikėtinu užsikrėtimo būdu yra laikoma termiškai neapdorota paršelių mėsa (54). Taip pat nustatyta, jog 16 proc. skerdžiamų šalyje kiaulių kepenyse yra randama HEV RNR. Duomenų apie viruso paplitimą laukinėje Serbijos faunoje kol kas nėra.
Lenkijoje buvo nustatyta, jog 15,9 proc. ligoninės pacientų yra serologiškai teigiami antikūnų prieš HEV atžvilgiu (5). Nors straipsnio autoriai teigia, jog 77 proc. antikūnus turinčių pacientų yra vartoję žalią mėsą ir/arba jūros gėrybes, klausimas nėra tiksliai apibrėžtas, todėl jo nauda aiškinantis užsikrėtimo priežastis yra ribota. Duomenys apie užsikrėtimus per jūros gėrybes yra riboti ir mažai reikšmingi Europoje (55). Turint omenyje Lenkijos kultūrinius kulinarijos ir mitybos aspektus, yra labiau tikėtina, jog atsakydami į minėtą klausimą pacientai atsakė teigiamai sutikdami su antrąja klausimo dalimi dėl jūros gėrybių. Todėl tyrimas negali būti laikomas kaip įrodantis hepatito E priežastingumą Lenkijoje. Šalyje taip pat buvo tirti medžiotojai, kurių tarpe 25 proc. buvo serologiškai teigiami HEV atžvilgiu, kas gali indikuoti apie kontaktą su laukiniais gyvūnais turinčių asmenų didesnę riziką užsikrėsti (56). HEV atžvilgiu buvo tyrinėti ir laukinės faunos mėginiai, tačiau teigiami rezultatai gauti tik iš šernų, iš kurių 44,4 proc. buvo serologiškai teigiami (57).
17 Riziką Lenkijos gyventojam užsikrėsti kelia didėjantis šernų skaičius. Tyrime taip pat parodoma, jog Podlaskie regione, kuris ribojasi su Lietuvos siena, nebuvo aptikta užsikrėtusių laukinių gyvūnų. Duomenų apie HEV pasireiškimą naminių kiaulių populiacijoje šalyje nėra.
Paskutiniai tyrimai apie hepatitą E Baltarusijoje yra atlikti tik 1997 metais (58). Straipsnyje aprašyti hepatito E atvejai ŽIV užsikrėtusių žmonių populiacijoje, tačiau internetu prieinama yra tik straipsnio santrauka.
Neseniai Estijoje atlikti tyrimai parodė, jog 22,9 proc. šalies kiaulių išmatose ir 16,0 proc. šernų mėsos yra randama HEV-3 genotipo RNR, o 61,6 proc. kiaulių buvo serologiškai teigiamos HEV atžvilgiu (4). Tame pačiame tyrime taip pat buvo nustatyta, jog 13,4 proc. kiaulių fermų darbuotojų ir 4,2 proc. medžiotojų šalyje buvo serologiškai teigiami HEV atžvilgiu.
Rusijoje buvo atlikti tyrimai nustatant HEV paplitimą Maskvos ligoninėje gulinčių vaikų tarpe ir nustatyta, jog 18,2 proc. jų buvo serologiškai teigiami HEV atžvilgiu (59). Gyvūnų tarpe HEV buvo tyrinėtas tik paukščių HEV (Orthohepevirus B) atžvilgiu, tačiau tai nebuvo epidemiologinis tyrimas (60).
Slovakijoje, Ukrainoje ir Latvijoje domenų apie HEV paplitimą žmonių ar gyvūnų tarpe nėra.
1.4. Hepatitas E ligos charakteristika
1.4.1. Hepatito E viruso lokalizacija organizme ir patogenezė
Hepatito E patogenezė kol kas nėra pilnai suprasta. Pagrindinė viruso replikacijos vieta yra kepenys, tačiau virusas pagrinde plinta fekaliniu-oraliniu būdu, todėl nežinoma, kokiu būdu HEV patenka į kepenis. Be kepenų viruso RNR taip pat aptinkama tulžyje, aklojoje žarnoje, gaubtinėje žarnoje, limfiniuose mazguose ir blužnyje, rečiau – centrinėje nervų sistemoje (CNS), raumenyse bei gimdoje (35). Tikėtina, jog prieš patenkant į kepenis viruso replikacija vyksta virškinamajame trakte ir limfiniuose organuose.
Viruso patekimas į hepatocitus yra sąlygojamas jo ORF2 koduojamo kapsidės baltymo sąveikos su sindekanais, priklausančiais ant ląstelės paviršiaus esančių heparano sulfato proteoglikanų grupei (61). Kaip ir daugelis virusų, HEV į ląstelę patenka dviem etapais: pirmuoju etapu vyksta didelio kiekio virusų kapsidžių molekulių prisitvirtinimas prie sindekanų nedideliu afinitetu, o antruoju etapu jau prisitvirtinusios prie ląstelės kapsidės molekulės sąveikauja su didelio afiniteto receptoriais, kurie, HEV atžvilgiu, dar nėra nustatyti. Tačiau pastarojo tyrimo duomenimis sindekanas yra esminis veiksnys viruso patekimui į hepatocito citoplazmą, nes heparinazės pagalba suardžius sindekanus ląstelės paviršiuje labai stipriai pasunkėjo viruso pernaša į ląstelę. Patekęs į hepatocito vidų HEV pradeda replikaciją citoplazmoje.
18 Po replikacijos iš hepatocitų nauji replikonai patenka į tulžį ir kraują, ir atitinkamai yra išskiriami su išmatomis (62).
HEV turi savybę slopinti interferono alfa (IFN-α) signalinę sistemą ORF3 koduojamu baltymu ir tokiu būdu slopinti IFN-α sąlygotą antivirusinį atsaką (63). Tyrimo metu virusu užkrėtus epitelines ląsteles taip buvo nustatyta, jog HEV iššaukia stiprią uždegiminių citokinų (interleukino – 6 (IL-6), IL-8 ir navikų nekrozės faktoriaus alfa) reakciją (64). T natūralūs žudikai (NKT) ir natūralūs žudikai (NK) yra svarbi ląstelinio imuniteto atsako dalis į HEV. Nustatyta, jog pacientų, užsikrėtusių ūmiu hepatitu E kraujyje yra randama mažesnis kiekis NK ir NKT lyginant su kontroline grupe (65). Tikėtina, jog taip yra todėl, kad kepenys yra pagrindinė viruso replikacijos vieta ir didžioji dalis minėtų ląstelių iš kraujo migruoja į kepenis. Ištyrus kepenų biopsijas šių ląstelių atžvilgiu buvo nustatyta, jog citotoksinių T limfocitų hepatito E pacientų kepenyse buvo nustatyta gerokai daugiau, lyginant su NK ląstelėmis, todėl autorių teigimu, NK ląstelės tikriausiai vaidina mažesnį vaidmenį atsako į HEV atvejais, lyginant su citotoksiniais T limfocitais kepenyse (66). Nepaisant to, išmatavus glikoproteino CD69 kiekį NK ląstelių paviršiuje, buvo nustatytas didesnis kraujyje cirkuliuojančių NK ląstelių citotoksiškumas pacientų kraujyje, lyginant su kontroline grupe (65). Duomenys, jog hepatitu E užkrėstame organizme yra padidėjęs NK ląstelių aktyvumas, nesutinka su duomenimis apie HEV savybę slopinti IFN-α, nes pastarasis yra esminė antivirusinio atsako dalis, be kitų funkcijų aktyvinanti NK ląsteles, todėl reikia tolimesnių tyrimų ląstelinio imuniteto rolei antivirusiniam atsakui prieš HEV nustatyti. Pats hepatito E virusas nepasižymi citotoksiškumu, o pažeidimai kepenyse atsiranda citotoksinių T limfocitų ir NK ląstelių atsako į HEV pasekoje (62).
HEV kapsidės baltymo domenas E2 funkcionuoja kaip epitopas, į kurį susidaro specifinis humoralinis imuninis atsakas (domenas kol kas nustatytas tik HEV-1 genotipo kapsidės baltymuose) (67). Aktyvus humoralinis imunitetas, susidarantis prieš HEV, daugiausiai tirtas nagrinėjant vakcinų prieš HEV poveikį. Nustatyta, jog natūraliai įgautas imunitetas arba vakcina sumažina riziką užsikrėsti pakartotinai, o antikūnai, susidarę prieš HEV, išlieka apie 12 mėnesių (68). Taip pat nustatytas pasyvaus imuniteto poveikis HEV kiaulių tarpe. Per motinos krekenas gautų antikūnų pusamžis paršelių organizme yra 12,1 diena (69). Paršeliai, įgavę pasyvų imunitetą prieš HEV, turi 13 kartų mažesnę riziką užsikrėsti hepatitu E, lyginant su suaugusiais individais po motininių antikūnų suirimo.
1.4.2. Klinikiniai ir patologiniai anatominiai hepatito E požymiai
Hepatito E eiga ir klinikinė išraiška žmonių tarpe nesiskiria tarp endeminių ir sporadinių zonų, ir dažniausiai pasireiškia kaip ūmus virusinis hepatitas (70). Priklausomai nuo eigos, hepatitas gali pasireikšti ūmiu arba poūmiu kepenų nepakankamumu, kuris paprastai būna mirtinas, arba
19 silpnu kepenų pažeidimu su nespecifiniais klinikiniais požymiais. Pirmieji klinikiniai požymiai paprastai pasireiškia apie 30-36 dienos po viruso patekimo į organizmą: bendras silpnumas, pilvo srities skausmas, pykinimas, vėmimas, anoreksija, šlapimo patamsėjimas, karščiavimas ir hepatomegalija (71). Ilgainiui pasireiškia gelta, pakyla alanino aminotransferazės (ALT) ir aspartato aminotransferazės (AST) parametrai. Ūmaus kepenų nepakankamumo atveju liga komplikuojasi hepatine encefalopatija, kuri savo ruožtu pasireiškia neurologiniais simptomais: dėmesio sutrikimu, nesiorientavimu aplinkoje, sutrikimu, sutrikusia kalbėsena, susilpnėjusiu atsaku į aplinkos dirgiklius ir galiausiai sąmonės praradimu (70). Ūmaus kepenų nepakankamumo atvejais dažnai reiškiasi kraujo krešėjimo sutrikimai ir atitinkami kraujavimai įvairiose organizmo vietose. Nors kiekvienais metais priskaičiuojama apie 20 milijonų žmonių užsikrėtimų HEV, 3,3 milijonai iš jų pasireiškia klinikiniais požymiais (72).
Kiaulių tarpe natūrali ir eksperimentinė hepatito E infekcija dažniausiai pasireiškia subklinikine forma (73). Daliai užkrėstų kiaulių yra būdingas padidėjęs ALT ir AST fermentų kiekis, tačiau kol kas nėra duomenų, palyginančių užkrėstų kiaulių ALT ir AST kiekius su kontroline grupe. Tikėtina, jog infekcija pasireiškia produkcijos parametrų kitimais (augimo greitis, pašaro įsisavinamumas), tačiau kol kas nėra tyrimų šia tema. Vieninteliai klinikiniai požymiai, pasireiškę HEV užkrėstų laukinių šernų tarpe, buvo silpna depresija, silpnas viduriavimas, sumažėjęs apetitas, padidėjęs tulžies rūgščių, ALT ir gama gliutamiltransferazės (GGT) kiekis kraujyje (35). Nėra duomenų apie klinikinę hepatito E išraišką elnių tarpe.
Didžioji dalis tyrimų apie hepatito E sukeliamus mikroskopinius ir makroskopinius patologinius anatominiu pakitimus yra atlikti kiaulių tarpe. Makroskopiniai patologiniai pokyčiai pastebimi retai, dažniausiai pasireiškia vidutiniškai padidėjusiais kepenų ir pasaito limfiniais mazgais (7). Kai kurių šernų, užkrėstų HEV, tarpe buvo aptikta folikulinė hiperplazija limfoidiniame storosios žarnos audinyje ir nestipri kepenų limfinių mazgų hiperplazija (35).
Hepatitu E užkrėstoms kiaulėms būdingi mikroskopiniai patologiniai pokyčiai buvo lokalizuoti kepenyse, dažniausiai pasireiškiantys periportaline limfoplazmocitine infiltracija ir Kupferio ląstelių proliferacija (35). Šernų tarpe dažniausiai reiškiasi ryškesni mikroskopiniai patologiniai požymiai: hepatocitų vakuolizacija bei degeneracija, susijusi su limfoplazmocitine ir Kupferio ląstelių infiltracija. Nėra duomenų apie viruso sukeltus patologiniu pokyčius kituose organuose. Daugiau duomenų apie hepatitui E būdingus patologinius požymius kitų gyvūnų rūšių ir žmonių tarpe beveik nėra. Tačiau yra aprašyti eksperimentiniu būdu užkrėstų Mongolijos smiltpelių (Meriones unguiculatus) patologiniai požymiai. Panašiai kaip ir kiaulių atveju makroskopinių patoloiginių požymių nebuvo aptikta, o mikroskopiškai nustatyta periportalinė limfoplazmocitinė infiltracija kepenyse (74).
20 1.4.3. Hepatito E diagnostika
Tiek individuali, tiek bandos atžvilgiu, hepatito E diagnozė kiaulių tarpe gali būti sudėtinga dėl subklinikinės eigos ir nežinomo poveikio produkcijai. Bandant diagnozuoti ligą privalu atsižvelgti į epidemiologinius šalies ir regiono duomenis. Esant įtarimui, ypač individualių užsikrėtimų atveju, galima taikyti biocheminius kraujo tyrimus kepenų fermentų (ALT, AST, GGT) atžvilgiu, nes šių parametrų vertės ligos atveju dažnai būna pakilusios (35).
Daugeliu atveju hepatito E diagnostikai yra taikomi komerciškai prieinami imunofermentine analize paremti testai prieš imunoglobuliną G (IgG) ir IgM, tačiau visi jie sąveikauja tik su prieš HEV-3 genotipą susidariusiais antikūnais, todėl jų pritaikymas yra ribotas norint diagnozuoti kitus HEV genotipus (15). Tačiau tiriant vakciną prieš HEV buvo nustatyta, jog Orthohepevirus A priklauso vienam serotipui, nepaisant to, jog rūšiai būdingi 7 genotipai (68). Žmonių diagnostikai taikomi serologiniai tyrimai nėra tikslūs dėl galimo kryžminio reaktyvumo su Epšteino-Baro virusu ir citomegalovirusu, kas gali lemti klaidingus teigiamus tyrimo rezultatus (75). Dėl šios priežasties serologiniais tyrimais paremta diagnozė turi būti tikslinama biocheminių kraujo tyrimų rezultatais, epidemiologine analize ir PGR analize. Kiaulių diagnostikoje panašus kryžminis reaktyvumas kol kas nėra aprašytas.
HEV RNR gali būti diagnozuojama PGR pagalba tiriant išmatų, kraujo (tik viremijos atveju, dažniausiai esant ūmiam hepatitui) ar kepenų mėginius, tačiau kol kas nėra standartizuotų PGR analize paremtų diagnostinių testų (76).
21
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Mėginių rinkimas
Tyrimui buvo surinkti 98 kiaulių mėginiai, iš kurių 71 buvo kraujo, 24 kepenų, 2 išmatų ir 1 plaučių mėginys. Mėginiai surinkti iš 21 Lietuvos rajono, 2014 – 2016 metų laikotarpiu. Kraujo mėginiai buvo renkami skirtingų administracinių regionų veterinarijos gydytojų, privalomai infekcinių ligų stebėsenos programai. Kraujo mėginiai, priklausomai nuo veterinarijo gydytojo pasirinkimo, buvo imami iš ausies venų, jungo venos arba uodegos venos. Organų mėginiai buvo renkami iš paskerstų ir gaišusių gyvūnų, grupinės atsitiktinės imties sudarymo principu. Viruso RNR ekstrakcijai buvo imamas 30 mg jungtinis mėginys iš skirtingų organo vietų. Buvo surinkta informacija apie kiekvieno gyvūno, iš kurio buvo imamas mėginys, lytį, amžių (suskirstant į 3 amžiaus grupes: <3 mėnesių amžiaus, nuo 3 mėnesių iki 1 metų amžiaus ir vyresni nei 1 metų amžiaus), kilmės bandos dydį ir rajoną.
Surinkti 153 šernų mėginiai, iš kurių 79 buvo kraujo, 40 kepenų, 17 plaučių, 17 kepenų ir plaučių mišinio mėginiai. Mėginiai surinkti iš 30 Lietuvos rajonų, 2014 - 2016 metų laikotarpiu. Mėginiai buvo surinkti iš sumedžiotų šernų medžiotojų pagalba, ir atrinkti atsitiktinės imties sudarymo principu. Kraujo mėginiai buvo imami iš įvairių organizmo vietų (pagrinde širdies ir krūtinės ląstos) priklausomai nuo medžiotojo sprendimo. Kaip ir kiaulių mėginių rinkimo atveju viruso RNR ekstrakcijai buvo imamas 30 mg jungtinis mėginys iš skirtingų organo vietų. Buvo rinkta informacija apie kiekvieno gyvūno, iš kurio imtas mėginys, lytį, amžių (suskirstant į 3 amžiaus grupes: <3 mėnesių amžiaus, nuo 3 mėnesių iki 1 metų amžiaus ir vyresni nei 1 metų amžiaus), mišką, kuriame gyvūnas buvo nušautas, ir rajoną, kuriam priklauso miškas, tačiau pilną informaciją surinkti pavyko ne visais atvejais.
Be šernų taip pat buvo surinkti 9 sumedžiotų stirnų (Capreolus capreolus) mėginiai, iš kurių 4 buvo kraujo ir 5 kepenų mėginiai. Visos stirnos, iš kurių paimti mėginiai, buvo sumedžiotos Pagėgių savivaldybės teritorijoje 2014 metais. Gautas ir vienas briedžio (Alces alces) kraujo mėginys iš Zarasų rajono. Mėginių paėmimo ir apdorojimo kriterijai buvo tokie patys, kaip šernų. Visi laukiniai gyvūnai buvo sumedžioti medžioklės sezono metu (77).
2.2. HEV antikūnų tyrimas
Į laboratoriją atgabenti kraujo mėginiai buvo iškart centrifuguojami, gautas serumas užšaldytas -20°C. Serologinė mėginių analizė buvo atliekama komercinio ELISA (angl.
enzyme-linked immunosorbent assay) (netiesioginė imunofermentinė analizė) testo (ID Screen® Hepatitis E; IDvet) pagalba. Kraujo mėginių tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto
22 Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto (NMVRVI) serologinių tyrimų skyriuje. ELISA testu buvo ištirti 86 kraujo serumo mėginiai. ELISA testas yra pritaikytas kiaulių antikūnams prieš HEV aptikti, tačiau gali būti taikomas ir kitų gyvūnų serumo arba plazmos tyrimams HEV antikūnų atžvilgiu (78). Reakcijos lėkštelės lyginiais skaičiais pažymėti šulinėliai yra padengti rekombinantiniu HEV-3 genotipo kapsidės baltymo antigenu, o nelyginiais – nepadengti. Į šulinėlius supiltas serumas, jame esant antikūnų prieš HEV, reaguoja su antigenu ir sudaro antikgeno-antikūno kompleksą. Toliau į šulinėlius yra supilamas krienų peroksidazės konjugatas, kuris susijungia su susidariusiu kompleksu ir suformuoja antigeno-antikūno-konjugato kompleksą. Išplovus nesusijungusį konjugatą į šulinėlius yra supilamas substrato tirpalas, kurio skilimą katalizuoja krienų peroksidazė, o to pasekoje susidaro spalvinė reakcija. ELISA testas atliktas pagal gamintojo nurodymus (78).
Susidariusios spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas antikūnų kiekiui mėginyje. Intensyvumas yra vertinamas optiniu tankiu (OT), kuris yra nustatomas spektrometru 450nm bangos ilgio šviesos pagalba. Gavus visų reakcijos lėkštelės šulinėlių OT vertes yra apskaičiuojamas koreguotas OT iš poriniais skaičiais pažymėtų šulinėlių OT atėmus neporiniais skaičiais pažymėtų šulinėlių OT. Galiausiai yra apskaičiuojamas procentinis mėginio koreguoto OT ir teigiamos kontrolės OT santykis (M/TK%) kiekvienam mėginiui. Tai yra vertinimo kriterijus, pagal kurį nustatoma, ar mėginys buvo neigiamas (M/TK% lygus arba mažiau nei 60 proc.), abejotinas (M/TK% tarp 60 proc. ir 70 proc.) ar teigiamas (M/TK% yra lygus arba didesnis nei 70 proc.).
2.3. PGR analizė
Atvirkštinės transkripcijos PGR metodu buvo ištirti 124 mėginiai. Prieš atliekant PGR analizę, atliekama kraujo serumo ir organų mėginių RNR ekstrakcija, naudojant RNR išgryninimo rinkinį (GeneJET RNA Purification Kit; Thermo Scientific). Mėginių RNR ekstrakcija buvo atlikta LSMU Veterinarijos akademijos Anatomijos ir fiziologijos katedros Imunologijos laboratorijoje. Rinkinio pagalba RNR galima išgryninti iš žinduolių audinių, ląstelių kultūrų, vabzdžių, mielių ir bakterijų (79). Serumo ir organų mėginiai yra lizuojami ir homogenizuojami lizavimo buferio, kuriame yra guanidino tiocianato, kuris apsaugo RNR nuo ribonukleazių poveikio, pagalba. Gautas lizatas yra sumaišomas su etanoliu ir perkeliamas į specialias surinkimo kolonėles su silikono dioksido membranomis. Guanidino tiocianato ir etanolio mišinys priverčia RNR nusistovėti ant membranos, pro ją tekant lizatui. Pašalinės medžiagos pašalinamos kolonėlę plaunant specialiais plovimo buferiais. Galiausiai RNR nuo kolonėlės membranos yra išplaunama į surinkimo mėgintuvėlį naudojant nukleazių neturintį vandenį. Mėginių RNR ekstrakcija buvo atlikta pagal gamintojo nurodymus (79).
23 HEV yra RNR virusas, todėl atliekant genetinės medžiagos gausinimą deoksiribonukleorūgščių (DNR) gausinimui skirtu rinkiniu būtinas papildomas žingsnis, kuriuo atliekama atvirkštinė RNR transkripcija į DNR. PGR analizė ir gelio elektroforezė buvo atlikta LSMU Veterinarijos akademijos Imunologijos laboratorijoje. Pirmajai PGR reakcijai ir atvirkštinei transkriptazei paruošti buvo naudojamas Dream Taq Green PCR master mix (Thermo Scientific) mišinys, susidedantis iš DNR polimerazės ir polimerazės buferio, magnio chlorido (MgCl2) (Taq
DNR polimerazės kofaktorius (80)), bromfenolio mėlynojo (dažas) ir laisvų deoksinukleotidų (dNTPs). Priklausomai nuo amplifikuojamos ORF, pirmojoje reakcijoje ORF1 amplifikacijai buvo naudojami HEV-s GCCATGTTCCAGACDGTRTTCCA-3′) priekiniai ir HEV-as (5′-TCGCGCATCACMTTYTTCCARAA-3′) atvirkštiniai pradmenys (81), o ORF2 amplifikacija – 3156F (5′-AATTATGCYCAGTAYCGRGTTG-3′) priekiniai ir 3157R (5′-CCCTT RTCYTGCTGMGCATTCTC-3′) atvirkštiniai pradmenys (82). Atvirkštinei transkripcijai įvykdyti taip pat buvo naudojamas RNR inhibitorius (RiboLock; Thermo Scientific), apsaugantis RNR nuo ribonukleazių poveikio iki 55 °C temperatūros, bei atvirkštinė transkriptazė (RevertAid;
ThermoScientific), kurios poveikyje iš RNR grandinės yra susintetinama komplementari DNR
(cDNR) grandinė. Į paruoštą mišinį su visais minėtais komponentais dedamas mėginių RNR ekstraktas. Reakcijos mišinys buvo paruoštas naudojant Eppendorf Research® plus (Eppendorf) mikropipetes. Medžiagų koncentracijos ir kiekiai naudojami atsižvelgiant į gamintojų nurodymus (83). PGR reakcijoms atlikti buvo naudojamas Eppendorf® Mastercycler (Eppendorf) termocikleris. Pirmajai reakcijai atlikti nustatomas 7 žingsnių termociklerio rėžimas. Termociklerio dangtis įkaitinamas iki 104 °C, todėl į reakcijos mėgintuvėlį nereikia pilti mineralinio aliejaus (83). Pirmuoju žingsniu mėgintuvėlis kaitinamas 42 °C temperatūra 30 minučių aktyvuojant atvirkštinę transkriptazę (84). Šio žingsnio metu įvyksta atvirkštinė RNR transkripcija į cDNR. Antruoju žingsniu temperatūra pakeliama iki 95 °C išlaikant 5 minutes, kad būtų aktyvuojama DNR polimerazė ir denatūruotų susidariusi cDNR. Trečiasis denatūracijos etapas vykdomas 94 °C temperatūroje 1 minutę amplifikuojant ORF2 (82), arba 30 sekundžių – ORF1 (81), kurios metu suardomo vandenilinės jungtys ir vyksta DNR denatūracija. Ketvirtasis etapas yra hibridizacijos, temperatūra nuleidžiama iki 50 °C laikant 30 sekundžių ORF1 amplifikacijos atveju (81), arba 60 °C 1 minutę – ORF2 atveju (82). Šio etapo metu pradmenys prisijungia prie komplementarios DNR šablono vietos. Penktasis etapas yra pailginimo fazė, temperatūra pakeliama iki 72 °C ir ORF1 amplificakijos atveju išlaikoma 45 sekundes, o ORF2 atveju – 1 minutę. Šio etapo metu yra aktyvuojama DNR polimerazė, kuri sintetina naują komplementarią DNR šablonui DNR grandinę, prie šablono nukleotidų prijungiant dNTPs 5` 3` kryptimi. Paskutiniai 3 etapai kartojami 40 kartų. Paskutinis etapas praėjus visiems ciklams yra galutinis prailginimas 72 °C išlaikant 10 minučių užtikrinant, jog visos DNR grandinės yra pilnai susintetintos.
24 Antroji lizdinė PGR reakcija (angl. nested PCR) yra vykdoma pakartotinai pagausinti naujai susintetintą virusinę DNR. Antroji reakcija yra atliekama panašiai, kaip pirmoji, neatliekant atvirkštinės transkripcijos, todėl į reakcijos mišinį nebededama atvirkštinės transkriptazės ir ribonukleazių inhibitoriaus. Į reakcijos mišinį dedamas pirmosios PGR reakcijos metu gautas produktas. Taip pat naudojami kiti lizdinei PGR skirti pradmenys: ORF1 amplifikacijos atveju naudojami HEVfn TGTTGCCCTGTTTGGCCCCTGGTTTAG-3′) priekiniai ir HEVrn (5′-CCAGGCTCACCRGARTGYTTCTTCCA-3′) atvirkštiniai pradmenys (81), o ORF2 atveju – 3158Fn (5′-GTWATGCTYTGCATWCATGGCT-3′) priekiniai ir 3157Rn (5′-AGCCGACGAAATCAATTCTGTC-3′) atvirkštiniai pradmenys (82). Keičiasi ir termociklerio temperatūros rėžimas: atvirkštinė transkriptazė antrojoje reakcijoje nedalyvauja, todėl nebereikalingas 42 °C temperatūros išlaikymas prieš denatūracijos etapą. Tiek ORF1, tiek ORF2 amplifikacijos atveju antrojoje PGR reakcijoje keičiasi hibridizacijos etapo temperatūra, priklausomai nuo naudojamų pradmenų: ORF1 amplifikacijos atveju 50 °C temperatūra išlaikoma 30 sekundžių (81), o ORF2 atveju – 55 °C temperatūra išlaikoma 1 minutę (82). PGR analizė atlikta pagal gamintojo nurodymus (83).
Rezultatų interpretacija atliekama agarozės gelio elektroforezės ir ultravioletinių spindulių šaltinio pagalba. Agarozės gelis gaminamas iš 1x Tris/Borato/etilendiamintetraacetatinės rūgšties (TBE) buferio ir agarozės miltelių. Į pašildytą ir homogenizuotą agarozės gelio mišinį dedamas etidžio bromidas, kuris sąlygoja nusistovėjusio gelyje DNR vizualizaciją (85). Į agarozės gelyje esančias akutes dedamas lizdinės PGR reakcijos metu gautas produktas ir 100bp žymuo
GeneRuler™ (Thermo Scientific), pagal kurį yra matuojamas gauto produkto molekulinis svoris
(86). Elektroforezė atliekama Mupid One System (TaKaRa) prietaisu. Elektroforezė vykdoma nustačius 130W 55 minučių rėžimą. Elektroforezės metu mėginys migruoja pro agarozės gelį nuo anodo (teigiamo krūvio), esančio ties akutėmis, link kitame gale esančio katodo (neigiamo krūvio). Skirtingos medžiagos geliu juda skirtingu greičiu, priklausomai nuo jų elektroforetinio judrumo, kuris priklauso nuo medžiagos krūvio ir masės. Po elektroforezės agarozės gelis yra apšviečiamas ultravioletinių spindulių lempa, tokiu būdu išryškinant produktą. Bromfenolio mėlynasis sugeria ultravioletinę ir mėlyną šviesą bei atspindi geltoną, todėl produktas matomas geltonos švytinčios juostelės pavidalu. HEV ORF1 fragmentas nusistovi ties 254bp žyme (81), o ORF2 fragmentas – ties 347bp žyme (82). Švytinti juostelė ties 254bp riba ORF1 atžvilgiu arba ties 347bp riba ORF2 atžvilgiu reiškia, jog mėginys teigiamas HEV atžvilgiu. Jei juostelės nėra arba ji yra ne ties minėtomis ribomis – mėginys neigiamas hepatito E viruso atžvilgiu. Juostelės švytėjimo intensyvumas vertinamas 5 pliusų sistema. Jei juostelės ryškumas yra apibūdinamas vienu arba dviem pliusais, rezultatas vertinamas kaip abejotinas. Jei juostelės ryškumas yra trys arba daugiau pliusų, rezultatas yra teigiamas HEV RNR atžvilgiu.
25
2.4. Statistinė analizė
Visi statistiniai skaičiavimai buvo atlikti Microsoft Excel 2010 programa. Teigiamų ELISA ir PGR analizės atžvilgiu gyvūnų paplitimas buvo apskaičiuotas procentine išraiška, taikant 95% patikimumo intervalą (PI). Jeigu imtis buvo n<= 5 arba jeigu teigiamų atvejų imtyje skaičius buvo 0 (p = 0) arba p ~ n, vietoj įprasto populiacijos proporcijos patikimumo intervalo buvo taikyta trijų taisyklė patikimumo riboms apskaičiuoti. χ 2
testas buvo pasirinktas skirtingų kriterijų (rūšies, amžiaus) poveikio statistiniam patikimumui įvertinti, lyginant tirtų bei tikėtinų nenumatytų atvejų lentelių rezultatus. Lyginami kriterijai laikomi turinčiais įtakos rezultatui, jeigu gauta vertė p<0,05. Kitais atvejais laikoma, jog kriterijai neturi įtakos gautam rezultatui. Dvipusis Fišerio testas buvo taikomas kaip pagalbinis metodas patikrinant χ 2 testo rezultatų patikimumą palyginant abiejų testų rezultatus. Rezultatų tikrinimas abiem testais buvo pagrįstas egzistuojančiu nesutarimu dėl vieno iš abiejų testų pasirinkimo atskirais atvejais ir analizės tikslumo priklausomai nuo šių atvejų (87).
26
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. HEV specifinių antikūnų tyrimo imunofermentine analize rezultatai
38 iš 67 tirtų kiaulių mėginių (56,7 proc.; 95 proc. PI: 44,9 - 68,6) buvo teigiami HEV antikūnų atžvilgiu (Lent. 1). Skirtinguose Lietuvos rajonuose teigiamų HEV antikūnų atžvilgiu kiaulių skaičius svyravo nuo 0 proc. iki 100 proc. Teigiamų kiaulių mėginių HEV antikūnų atžvilgiu buvo nustatyta 11 iš 19 tirtų Lietuvos rajonų. Didžiausias teigiamų mėginių skaičius buvo nustatytas Biržų, Elektrėnų, Jonavos, Joniškio, Panevėžio ir Pasvalio rajonuose, kur visų tirtų kiaulių mėginiai buvo teigiami HEV atžvilgiu. Alytaus, Kėdainių, Kelmės, Kupiškio, Šalčininkų, Telšių, Trakų ir Vilniaus rajonuose teigiamų mėginių nebuvo nustatyta. Teigiamų mėginių skaičiaus skirtumai tarp skirtingų regionų buvo labai statistiškai patikimi (p<0,001), todėl egzistuoja ryšys tarp antikūnų prieš HEV susidarymo ir rajono, kiaulių tarpe. Vyresnių nei 1 metų amžiaus kiaulių grupėje buvo nustatyta daugiausia teigiamų mėginių HEV antikūnų atžvilgiu (64,0 proc.; 95 proc. PI: 45,2 - 82,8), tačiau nuo 3 mėnesių iki 1 metų amžiaus grupėje buvo nustatytas panašus teigiamų mėginių skaičius (58,9 proc.; 95 proc. PI: 42,3 - 75,4) (Lent. 2). Nebuvo nustatytas priežastinis ryšys tarp teigiamų antikūnų HEV atžvilgiu ir amžiaus grupės (p>0,05).1 lent. Teigiamų antikūnų prieš hepatito E virusą kiaulių ir šernų mėginiuose paplitimas
skirtinguose Lietuvos rajonuose.
Rajonas
Kiaulių serumai Šernų serumai
Teigiami mėginiai/tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95 proc.] Teigiami mėginiai/tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95 proc.] Alytaus 0/4 0 [0 - 75,0]* - - Anykščių 1/2 50,0** - - Biržų 1/1 100** - - Elektrėnų 2/2 100** - - Jonavos 3/3 100** 2/2 100** Joniškio 3/3 100** - - Kaišiadorių 5/7 71,4 [38,0 - 100] - - Kalvarijos 1/6 16,7 [0 - 46,5] - - Kauno - - 0/2 0** Kėdainių 0/1 0** 0/1 0** Kelmės 0/3 0** - - Kupiškio 0/1 0** - - Lazdijų - - 2/2 100** Molėtų 5/6 83,3 [53,5 - 100] - - Panevėžio 4/4 100 [25,0 - 100]* - - Pasvalio 4/4 100 [25,0 - 100]* - - Radviliškio 9/12 75,0 [50,5-99,4] - - Rietavo - - 1/1 100** Skuodo - - 1/2 50,0 **
27 1 lent. tęsinys. Teigiamų antikūnų prieš hepatito E virusą kiaulių ir šernų mėginiuose paplitimas
skirtinguose Lietuvos rajonuose.
Rajonas
Kiaulių serumai Šernų serumai
Teigiami mėginiai/tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95 proc.] Teigiami mėginiai/tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95 proc.] Šalčininkų 0/2 0** 1/1 100** Telšių 0/2 0** - - Trakų 0/1 0** - - Utenos - - 2/4 50,0 [12,5 - 87,5]* Varėnos - - 1/1 100** Vilniaus 0/3 0** 0/1 0** Zarasų - - 0/2 0** Viso 38/67 56,7 [44,9 - 68,6] 10/19 52,6 [30,2 - 75,1]
* Buvo taikyta trijų taisyklė
** Per maža imtis patikimumo intervalui ir trijų taisyklei pritaikyti
10 iš 19 tirtų šernų mėginių (52,6 proc.; 95 proc. PI: 30,2 - 75,1) buvo teigiami HEV antikūnų atžvilgiu (Lent. 1). Skirtinguose Lietuvos rajonuose teigiamų HEV antikūnų atžvilgiu šernų skaičius svyravo nuo 0 proc. iki 100 proc. Teigiamų šernų mėginių HEV antikūnų atžvilgiu buvo nustatyta 7 iš 11 tirtų Lietuvos rajonų. Didžiausias teigiamų mėginių skaičius buvo nustatytas Jonavos, Lazdijų, Rietavo, Šalčininkų ir Varėnos rajonuose, kur visų tirtų šernų mėginiai buvo teigiami HEV antikūnų atžvilgiu. Kauno, Kėdainių, Vilniaus ir Zarasų rajonuose teigiamų mėginių nebuvo nustatyta. Nebuvo nustatytas priežastinis ryšys tarp teigiamų antikūnų HEV atžvilgiu ir atskirų rajonų. Panašus teigiamų mėginių HEV antikūnų atžvilgiu skaičius nustatytas nuo 3 mėnesių iki 1 metų (60,0 proc.; 95 proc. PI: 29,6 - 90,4) ir vyresnių nei 1 metų (44,4 proc.; 95 proc. PI: 12,0 - 76,9) amžiaus grupėse (Lent. 2). Kaip ir kiaulių atveju, nebuvo nustatytas priežastinis ryšys tarp teigiamų antikūnų HEV atžvilgiu ir amžiaus grupės. Taip pat nebuvo nustatytas priežastinis ryšys tarp gyvūno rūšies (kiaulių ir šernų) ir teigiamų mėginių skaičiaus; būdinga vienoda tikimybė rasti antikūnus prieš HEV tiek šernų, tiek kiaulių serumuose (p>0,05).
2 lent. Teigiamų antikūnų prieš hepatito E virusą kiaulių ir šernų mėginiuose paplitimas tarp
skirtingų amžiaus grupių.
Amžiaus grupė
Kiaulių serumai Šernų serumai
Teigiami mėginiai/tirti mėginai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95 proc.] Teigiami mėginiai/tirti mėginai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95 proc.] <3 mėnesių 2/8 25,0 [0 - 55,0] - - 3 mėnesiai - 1 metai 20/34 58,9 [42,3 - 75,4] 6/10 60,0 [29,6 - 90,4] >1 metų 16/25 64,0 [45,2 - 82,8] 4/9 44,4 [12,0 - 76,9] Viso 38/67 56,7 [44,9 - 68,6] 10/19 52,6 [30,2 -75,1]
28
3.2. Atvirkštinės transkripcijos PGR tyrimų rezultatai
Iš 31 tirto kiaulių mėginio HEV RNR atžvilgiu PGR analizės metodu buvo nustatyta, jog 6 mėginiai (19,4 proc.; 95 proc. PI: 5,5 – 33,3) buvo teigiami HEV ORF1 atžvilgiu, lyginant su ORF2 (48,4 proc.; 95 proc. PI: 30,8 – 66,0), nustačius statistiškai patikimą (p<0,05) priklausomybę nuo tiriamo atviro nuskaitymo fragmento. Teigiamų kiaulių mėginių skaičius skirtinguose Lietuvos rajonuose svyravo nuo 0 proc. iki 65,0 proc. (Lent. 3).
3 lent. Hepatito E viruso RNR kiaulių mėginiuose paplitimas skirtinguose Lietuvos rajonuose.
*Buvo taikyta trijų taisyklė.
Didžiausias teigiamų mėginių skaičius buvo nustatytas Kėdainių rajone, kur 31 iš 20 (65,0 proc.; 95 proc. PI: 44,1 – 85,9) tirtų mėginių buvo teigiami HEV ORF2 atžvilgiu. Nei vienas ORF2 atžvilgiu teigiamas mėginys nebuvo nustatyta Šilutės rajone. Didžiausias teigiamų mėginių skaičius HEV ORF2 atžvilgiu buvo nustatytas Kėdainių ir Jurbarko rajonuose, kur 1 iš 5 ir 4 iš 20 (20,0 proc.; 95 proc. PI: 0 – 55,1 ir 2,5 – 37,5) tirtų mėginių buvo teigiami. Mažiausiai teigiamų mėginių ORF1 atžvilgiu nebuvo nustatyta Šilutės rajone, kur užsikrėtusių nustatytas 1 iš 6 (16,7 proc.; 95 proc. PI: 0 – 46,5) mėginių. Nustatyta tegiamų HEV atžvilgiu mėginių procento priklsausomybė nuo skirtingo Lietuvos rajono buvo statistiškai patikima (p<0,005). Įvairiuose kiaulių organuose dažniausiai HEV RNR ORF2 atžvilgiu buvo nustatomas kepenų mėginiuose (58,3 proc.; 95 proc. PI: 38,6 – 78,1), o mažiausias – plaučių ir kraujo mėginiuose (0 proc.; 95 proc. PI: 0 – 75,0) (Lent. 4). Panaši tendencija buvo gauta tuos pačius mėginius tiriant ORF1 atžvilgiu. Nustatomas HEV RNR dažnis priklausomai nuo tirto organo buvo statistiškai patikimas (p<0,00001). Didžioji dalis tirtų PGR metodu kiaulių buvo vienodo amžiaus, todėl nebuvo įvertintas HEV užsikrėtimų dažnio pasiskirstymas tarp skirtingų kiaulių amžiaus grupių.
Rajonas Kiaulių mėginiai ORF1 ORF2 Teigiami mėginiai/tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95 proc.] Teigiami mėginiai/tirti mėginiai Nustatytas paplitimas (proc.) [PI 95 proc.] Jurbarko 1/5 20,0 [0- 55,1] 2/5 40 [0 - 82,9] Kėdainių 4/20 20,0 [2,5 - 37,5] 13/20 65,0 [44,1 - 85,9] Šilutės 1/6 16,7 [0 - 46,5] 0/6 0 [0 - 50,0]* Viso 6/31 19,4 [5,5 - 33,3] 15/31 48,4 [30,8 - 66,0]
