LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Jolita Pakalnienė
GENŲ, KODUOJANČIŲ PENKTĄ
C
HEMOKINO IR TREČIĄ TOLL-LIKE
RECEPTORIUS, POLIMORFIZMŲ
REIKŠMĖ ERKINIO ENCEFALITO
VIRUSO INFEKCIJOS METU
Daktaro disertacijaBiomedicinos mokslai, medicina (06B)
Disertacija rengta 2009–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijoje
Mokslinė vadovė:
prof. dr. Auksė Mickienė (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Me-dicinos akademija, biomeMe-dicinos mokslai, medicina – 06B)
Konsultantas:
prof. dr. Lars Lindquist (Karolinska universitetas (Švedija), biomedici-nos mokslai, medicina – 06B)
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 7
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
2. DARBO AKTUALUMAS IR MOKSLINIS NAUJUMAS ... 10
3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
3.1. Erkinio encefalito etiologija ... 12
3.2. Erkinio encefalito epidemiologija ... 12
3.3. Erkinio encefalito patogenezė ... 13
3.4. Erkinio encefalito klinikos ypatumai ... 21
3.5. Erkinio encefalito sunkumą lemiantys veiksniai... 23
3.6. CCR5 ir jo reikšmė EEV infekcijos metu ... 24
3.6.1. CCR5 ir jo funkcijos ... 24
3.6.2. CCR5 32 bazių porų iškrita (CCR5Δ32), jos paplitimas bei sąsajos su EE ir kitomis virusinėmis CNS infekcijomis. ... 28
3.6.3. CCR5Δ32 polimorfizmo reikšmė sergant kitomis ligomis ... 32
3.7. TLR3 ir jo reikšmė EEV infekcijos metu ... 33
3.7.1. TLR3 ir jo funkcijos ... 33
3.7.2. Vieno nukleotido pakaitos TLR3 gene, jų paplitimas ir sąsajos su EE ir kitomis virusinėmis CNS infekcijomis ... 35
3.7.3. TLR3 rs3775291 polimorfizmo reikšmė sergant kitomis ligomis ... 39
4. TIRTASIS KONTINGENTAS IR TYRIMO METODAI ... 41
4.1. Tyrimo vieta, laikas ir etikos aspektai ... 41
4.2. Tiriamieji ... 41
4.2.1. Erkiniu encefalitu sirgę pacientai ... 41
4.2.1.1. EE sirgusių vaikų imtis (EE1) ... 42
4.2.1.2. Sunkiu EE sirgusių suaugusiųjų imtis (EE2) ... 43
4.2.1.3. EE sirgusių suaugusiųjų imtis (EE3) ... 43
4.2.2. Kontroliniai tiriamieji ... 43
4.2.2.1. Sveikų kontrolinių asmenų imtis (C1) ... 43
4.2.2.2. Aseptiniu meningoencefalitu (AME) sirgusių pacientų imtis (C2) ... 44
4.2.3. Sudėtinės imtys ... 44
4.2.3.1. EE sirgusių vaikų ir suaugusiųjų imtis (EE1 + EE3) ... 44
4.2.3.2. Visų EE sirgusių pacientų imtis (EE1 + EE2 + EE3) ... 45
4.2.3.3. Visų EE sirgusių suaugusiųjų imtis (EE2 + EE3) ... 45
4.2.3.4. Visų kontrolinių asmenų imtis (C1 + C2) ... 45
4.3. Tyrimo metodai ... 45
4.3.1. Tiriamoji medžiaga ... 45
4.3.2. DNR išskyrimas ... 46
4.3.3. CCR5, TLR3 genų polimorfizmų tyrimo metodika ... 46
4.4. Statistinė analizė ... 49 3
5. REZULTATAI ... 51
5.1. Imčių demografinė ir klinikinė charakteristika ... 51
5.1.1. EE sirgusių pacientų imtys ... 51
5.1.2. Sudėtinės EE sirgusių pacientų imtys ... 52
5.1.3. EE sirgusių suaugusiųjų (EE3), sveikų kontrolinių asmenų (C1), AME sirgusių pacientų (C2) ir visų kontrolinių asmenų (C1 + C2) imčių CCR5 ir TLR3 genotipavimo duomenys ... 54
5.2. CCR5 geno polimorfizmas ... 56
5.2.1. EE sirgusių vaikų imtis (EE1) ... 57
5.2.2. Sunkiu EE sirgusių suaugusiųjų imtis (EE2) ... 58
5.2.3. EE sirgusių vaikų ir suaugusių imtis (EE1 + EE3) ... 59
5.2.4. Visų EE sirgusių pacientų imtis (EE1 + EE2 + EE3) ... 60
5.3. TLR3 geno polimorfizmas ... 61
5.3.1. EE sirgusių vaikų imtis (EE1) ... 62
5.3.2. Sunkiu EE sirgusių suaugusiųjų imtis (EE2) ... 62
5.3.3. EE sirgusių vaikų ir suaugusiųjų imtis (EE1 + EE3) ... 63
5.3.4. Visų EE sirgusių pacientų imtis (EE1 + EE2 + EE3) ... 65
5.4. CCR5 ir TLR3 genų polimorfizmų sąsajos su klinikinėmis EE formomis ... 66
5.4.1. EE sirgusių vaikų imtis (EE1) ... 66
5.4.2. Visų EE sirgusių suaugusiųjų imtis (EE2 + EE3) ... 67
5.5. Sąsajos tarp demografinių, laboratorinių duomenų, genų polimorfizmų ir EE sunkumo formų ... 70
5.5.1. EE sirgusių vaikų imtis (EE1) ... 70
5.5.2. Visų EE sirgusių suaugusiųjų imtis (EE2 + EE3) ... 73
5.5.3. Visų EE sirgusių pacientų imtis (EE1 + EE2 + EE3) ... 76
6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 81
IŠVADOS ... 87
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 88
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 89
PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ... 98
PRIEDAI ... 99 1 priedas ... 99 2 priedas ... 100 3 priedas ... 101 4 priedas ... 102 5 priedas ... 103 6 priedas ... 104 PADĖKA ... 105 4
SANTRUMPOS
Ag – antigenasAk – antikūnai
AME – aseptinis meningoencefalitas
APC – antigeną pateikianti ląstelė (angl. antigen presenting cell) CCR5 – chemokino receptorius 5
CCR5 – CCR5 genas
CCR5Δ32 – 32 bazių porų iškrita CCR5 gene
CD – diferenciacijos žymuo (angl. cluster of differentiation) CD4+ – T limfocitai pagalbininkai
CD8+ – citotoksiniai T limfocitai CNS – centrinė nervų sistema
DC – dendritinės Langerhanso ląstelės (angl. dendritic cells) DNR – deoksiribonukleorūgštis
dsRNR – dvigrandė RNR (angl. double stranded RNA) EE – erkinis encefalitas
EEV – erkinio encefalito virusas GS – galimybių santykis
HEB – hematoencefalinis barjeras IFN – interferonas
Ig – imunoglobulinas (IgM ir IgG klasės antikūnai) IL – interleukinas
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos
KMU – Kauno medicinos universitetas (nuo 2010 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademija) lls – laisvės laipsnių skaičius
mut – mutavęs alelis n – imties dydis
NK – ląstelės – natūralieji žudikai (angl. natural killers) NS – nestruktūriniai baltymai
p – reikšmingumo lygmuo
PGR – polimerazinė grandininė reakcija (angl. polymerase chain
reaction)
PI – 95 proc. pasikliautinasis intervalas
RITS – reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyrius RNR – ribonukleorūgštis
rs3775291 – vieno nukleotido pakaitos TLR3 gene identifikacinis numeris (angl. Reference SNP (refSNP))
SN – standartinis nuokrypis 5
TCR – antigenui specifinis T limfocitų receptorius (angl. T cell receptor)
Th – T limfocitas pagalbininkas (angl. T helper)
TNF-α – naviko nekrozės veiksnys-α (angl. tumor necrosis factor-α) TLR3 – transmembraninis atpažinimo receptorius 3
(angl. Toll-like receptor 3)
TLR3 – TLR3 genas
VNE – Vakarų Nilo encefalitas VNP – vieno nukleotido pakaita
(angl. single nucleotide polymorphism, SNP) VNV – Vakarų Nilo virusas
vs. – palyginti su (angl. versus) ŽIV – žmogaus imunodeficito virusas
wt – laukinio tipo alelis (angl. wild-type allele)
DNR bazių nomenklatūra A – Adenozinas C – Citozinas G – Guaninas T – Timinas 6
ĮVADAS
Erkinis encefalitas (EE) – pati dažniausia ir sunkiausia virusinė nervų sistemos infekcija Lietuvoje. Ja per pastaruosius penkiolika metų vidutiniš-kai suserga 400 žmonių kasmet (11,88 iš 100 tūkst. gyventojų) [1]. 9 proc. persirgusiųjų lieka sunkių, neįgalumą sukeliančių, 22 proc. – vidutinio sunkumo liekamųjų reiškinių, neigiamai veikiančių EE persirgusių žmonių gyvenimo kokybę [2].
Užsikrėtus EE virusu (EEV), galima besimptomė arba klinikinius požymius sukelianti ligos eiga, turinti platų požymių spektrą – nuo lengvos, meningitinės ligos formos iki sunkaus encefalito. Lietuvoje cirkuliuoja tik vienas EE viruso potipis [3–5], todėl neaišku, kodėl užsikrėtę identiško virulentiškumo virusu, vieni žmonės perserga besimptome arba lengva EE forma, o kitiems atsiranda sunkus nervų sistemos pažeidimas. Manoma, kad didelę reikšmę turi žmogaus genetiniai veiksniai. Jų reikšmė virusinių nervų sistemos infekcijų metu, ypač sukeltų flavivirusų grupės virusų, kuriai priklauso EEV, šiuo metu labai aktyviai tyrinėjama, ypatingas dėmesys skiriamas trims genetiniams veiksniams – chemokino receptoriaus 5 (CCR5), Toll-like receptoriaus 3 (TLR3) ir 2'-5'-oligoadenilato sintetazės (OAS) genų polimorfizmui [6–14].
Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV) atlikti tyrimai parodė, kad polin-kis sirgti Vakarų Nilo encefalitu (VNE) – tos pačios flavivirusų grupės, kaip ir EEV, sukelta nervų sistemos infekcija – priklauso nuo CCR5 polimor-fizmo. Nustatytas reikšmingai didesnis CCR5 polimorfizmo – 32 bazių porų iškritos (CCR5Δ32) – paplitimas tarp sirgusių VNE nei tarp nesirgusių šia infekcija asmenų ir sąsaja tarp CCR5 homozigotinio mutavusio genotipo (Δ32/ Δ32) bei mirtinų VNE formų dažnio [6-9]. Labai panaši Vakarų Nilo viruso (VNV) ir EEV struktūra, ligos kilimo ir vystymosi mechanizmai, iškėlė hipotezę, kad tie patys genetiniai veiksniai gali turėti įtakos polinkiui sirgti EE bei skirtingoms EE sunkumo formoms išsivystyti.
2005–2007 m. Kauno medicinos universiteto ir Švedijos, Stokholmo Karolinska universiteto Infekcinių ligų klinikų atliktas tyrimas nustatė, kad
CCR5Δ32 paplitimas yra didesnis tarp sergančių EE, negu tarp sergančių
kitos kilmės virusiniais meningoencefalitais ir sveikų kontrolinių asmenų [11]. Tai pirmoji publikacija apie genetinių veiksnių svarbą EE išsivysty-mui. Šiame darbe buvo stebėta tendencija, tačiau negauta statistiškai reikš-mingo CCR5Δ32 paplitimo skirtumo tarp skirtingomis EE formomis sirgu-sių pacientų.
Pastaruoju metu aktyviai tyrinėjama TLR3, kuris dalyvauja atpažįstant ribonukleorūgšties (RNR) virusus ir OAS, kuri aktyvina fermentą ribonuk-leazę, suskaldantį RNR, genų polimorfizmų reikšmė flavivirusų sukeltų ner-vų sistemos infekcijų patogenezei. Naujausi darbai parodė šių įgimto imu-niteto veiksnių svarbą VNE ir EE patogenezei [10, 12–14]. Deja, iki šiol publikuotų tyrimų duomenis palyginti ir pagrįstas išvadas daryti labai sunku, nes jie atlikti tiriant skirtingas etnines grupes ir skirtinguose geogra-finiuose regionuose, kur cirkuliuoja skirtingo virulentiškumo Sibiro potipio EEV [11, 12, 14, 15].
Iki šiol nepakanka duomenų apie genetinių veiksnių svarbą EE pato-genezei, o apie jų reikšmę skirtingoms amžiaus grupėms visiškai nėra. Nesant specifinio antivirusinio EE gydymo, šios sunkios centrinės nervų sistemos (CNS) infekcijos patogenezės ir genetinių rizikos veiksnių tyrimai yra ypač svarbūs, siekiant nustatyti galimas veiksmingo gydymo paieškos kryptis ateityje.
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslasNustatyti CCR5 ir TLR3 genų polimorfizmų paplitimą tarp EE sirgusių asmenų ir šių genų polimorfizmų reikšmę polinkiui sirgti EE bei skirtin-goms EE klinikinėms formoms išsivystyti.
Uždaviniai
1. Nustatyti CCR5 geno polimorfizmo, 32 bazių porų iškritos (CCR5Δ32), paplitimą tarp EE sirgusių vaikų ir suaugusiųjų ir tarp EE nesir-gusių asmenų, gyvenančių tame pačiame regione.
2. Nustatyti TLR3 geno polimorfizmo, vieno nukleotido pakaitos (TLR3 rs3775291), paplitimą tarp EE sirgusių vaikų ir suaugusiųjų ir tarp EE nesirgusių asmenų, gyvenančių tame pačiame regione. 3. Nustatyti CCR5 ir TLR3 genų polimorfizmų paplitimą skirtingomis
EE formomis sirgusių vaikų ir suaugusiųjų grupėse.
4. Nustatyti demografinių, laboratorinių ir genetinių veiksnių reikšmę skirtingų EE klinikinių formų išsivystymui.
2. DARBO AKTUALUMAS IR MOKSLINIS NAUJUMAS
Kasmet EE pasaulyje suserga 5–9 tūkst. žmonių, iš jų apie 3 tūkst. – Europoje. Per pastaruosius tris dešimtmečius sergamumas EE Europoje padidėjo keturis kartus [16, 17]. 2001–2010 m. didžiausias sergamumas EE Europoje registruotas Estijoje (12,9 iš 100 tūkst. gyventojų), Slovėnijoje (12,8), Lietuvoje (11,5) ir Latvijoje (11,3) [18]. Lietuvoje registruoti EE atvejai sudarė 15 proc. visų 2001–2010 m. Europoje nustatytų EE atvejų.Erkinis encefalitas (EE) yra dažniausia ir sunkiausia virusinė nervų sistemos infekcija Lietuvoje. 1999–2013 metais mūsų šalyje šia liga sirgo 5981 asmuo, 535 (8,94 proc.) iš jų buvo vaikai iki 18 metų amžiaus. Di-džiausias sergamumo EE rodiklis Lietuvoje – 21,9 iš 100 tūkst. gyventojų – registruotas 2003 m. [1].
Mirštamumas nuo Europos potipio EEV sukelto EE svyruoja nuo 0,5 iki 2 proc. [15, 17]. Svarbiausia su EE susijusi problema yra ilgai trunkantis sveikimo laikotarpis ir ilgalaikiai liekamieji reiškiniai, kurie būdingi 26–46 proc. persirgusiųjų [2, 19, 20].
EE nesukurtas specifinis priešvirusinis gydymas. Vienintelė veiksminga šios ligos profilaktikos priemonė yra vakcinacija. Deja, Lietuvoje bent viena EE vakcinos doze 2009 m. buvo pasiskiepiję tik 9 proc. šalies gyventojų [21, 22]. Tokia nedidelė vakcinacijos apimtis negali turėti jokios įtakos ser-gamumui EE mūsų šalyje, sergamumas EE nuo 1999 m. išlieka vienas didžiausių Europoje ir turi stabilią didėjimo tendenciją. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) rekomenduoja visuotinę gyventojų vakcinaciją nuo EE tuose Europos regionuose, kuriuose sergamumas EE yra didesnis nei 5 iš 100 tūkst. gyventojų [23]. Deja, dėl ribotų finansinių galimybių valstybės dotuojama EE vakcinacija nėra įtraukta į Nacionalinę imunoprofilaktikos 2014–2018 metų programą, patvirtintą Lietuvos Respublikos sveikatos ap-saugos ministro 2014 m. sausio 3 d. įsakymu Nr. V-8. Todėl nėra jokio pagrindo tikėtis kad šios ligos aktualumas mūsų šalyje artimiausiu metu galėtų sumažėti.
Nesant specifinio antivirusinio EE gydymo, šios sunkios CNS infek-cijos patogenezės ir genetinių rizikos veiksnių tyrimai yra ypač svarbūs, siekiant nustatyti galimas veiksmingo gydymo paieškos kryptis ateityje.
Šis darbas yra didžiausias iki šiol atliktas genetinių veiksnių reikšmės EE viruso infekcijos metu tyrimas, kuriame dalyvavo 349 šia liga sirgę pacientai, ir pirmasis tokio pobūdžio vaikų tyrimas, atliktas didelėje, 117 EE sirgusių vaikų imtyje. Šio tyrimo rezultatai patvirtino hipotezę, kad nefunk-cionuojantis CCR5 ir funknefunk-cionuojantis TLR3 yra reikšmingi simptominės EE formos išsivystymo veiksniai, užsikrėtus EEV. Šiame darbe pirmą kartą
nustatyta, kad CCR5 ir TLR3 reikšmė skirtingoms amžiaus grupėms yra nevienoda – nefunkcionuojantis CCR5 lemia EE išsivystymą nepriklauso-mai nuo amžiaus, o funkcionuojantis TLR3 – tik vyresniems nei 18 m. asmenims. Šiame darbe nustatyta, kad ne tik visiškas, bet ir dalinis CCR5 ir TLR3 receptorių funkcijos netekimas turi įtakos polinkiui susirgti EE, ir kad EE sunkumas nuo CCR5 geno polimorfizmo nepriklauso, o TLR3 geno poli-morfizmas galimai turi įtakos sunkaus EE išsivystymui suaugusiesiems.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Erkinio encefalito etiologijaEE sukėlėjas yra erkinio encefalito virusas (EEV), priklausantis
Flavi-viridae šeimai, Flavivirus genčiai. Be EEV, kiti šiai genčiai priklausantys
žmonėms CNS infekcijas sukeliantys virusai yra VNE, Japoniškojo ence-falito, Šv. Luiso encefalito, Murray slėnio encefalito. Europoje cirkuliuo-jantys žmogui patogeniški šios šeimos atstovai yra EE ir VNE virusai. EEV genomas yra viengrandė linijinė viruso ribonukleorūgštis (RNR). EEV yra sudarytas iš nukleokapsidės ir apvalkalo. Virusą sudaro trys struktūriniai (kapsidės (angl. capsid) baltymas C, membraninis (angl. membrane) balty-mas M ir apvalkalo (angl. envelope) glikoproteinas E) ir septyni nestruktū-riniai baltymai. Baltymas E yra pagrindinis viruso paviršiaus komponentas, kuris indukuoja apsauginį imunitetą, dalyvauja jungiantis su ląstelės receptoriais ir nulemia audinių bei ląstelių tropizmą, nuo jo priklauso viruso virulentiškumas [15, 24, 25].
Pagal molekulinę filogenezę, pagrįstą E baltymo nukleotidų sekos nu-statymu, EEV skirstomas į tris potipius: Europos, Tolimųjų Rytų ir Sibiro. EEV potipio E baltymo aminorūgščių sudėtis skiriasi 2 proc. Dėl labai pa-našios antigeninės struktūros tarp skirtingų virusų potipių yra kryžminė apsauga [15, 17, 26]. Lietuvoje iš žmogaus kraujo iki šiol išskirtas tik vienas EEV izoliatas, priklausantis Europos EEV potipiui. Visi iki šiol iš erkių Lietuvoje išskirti EEV taip pat priklauso Europos EEV potipiui [3–5]. Estijoje ir Latvijoje paplitę Tolimųjų Rytų, Sibiro ir Europos EEV potipiai.
Europos potipio EEV perneša Ixodes ricinus, Tolimųjų Rytų ir Sibiro –
Ixodes persulcatus rūšies erkės. Eksperimentais su gyvūnais nustatyta, kad
skirtingų EEV potipių neuroinvaziškumas ir neurovirulentiškumas skiriasi [3, 15, 17, 27, 28].
3.2. Erkinio encefalito epidemiologija
Kasmet EE pasaulyje suserga 5–9 tūkst. žmonių, iš jų apie 3 tūkst. – Europoje [16, 17]. Didžiausias sergamumas – 37–72,5 iš 100 tūkst. gyven-tojų – registruojamas Rytų ir Vakarų Sibire. Per pastaruosius tris dešimt-mečius bendras sergamumas EE Europoje padidėjo keturis kartus [15–17, 29, 30]. Apie pusę Europoje kasmet registruojamų EE atvejų sudaro atvejai užregistruojami Rusijoje. 2001–2010 metais didžiausias sergamumas EE Europoje registruotas Estijoje (12,9 iš 100 tūkst. gyventojų), Slovėnijoje
(12,8), Lietuvoje (11,5) ir Latvijoje (11,3) [18]. Bendrasis sergamumas EE Lietuvoje svyruoja 4,6 (1999) – 21,9 (2003) iš 100 tūkst. gyventojų [1].
1999–2013 m. Lietuvoje EE sirgo 5981 asmuo, 535 (8,94 proc.) iš jų buvo vaikai iki 18 metų amžiaus (3.2.1 pav.) [1].
3.2.1 pav. EE sirgusių žmonių skirstinys pagal amžių
Lietuvoje 1999–2013 m.
Dažniausiai EE Lietuvoje serga mokyklinio amžiaus vaikai ir paaugliai. Ikimokyklinio amžiaus vaikams, ypač jaunesniems nei 3 m., EE yra reta liga. Šios amžiaus grupės vaikams nedidelio endemiškumo teritorijose EE nustatomas tik išskirtiniais atvejais. Lietuvoje 1999–2013 m. iš viso registruoti 23 EE atvejai vaikams iki 3 m. Tai sudarė 4,3 proc. visų vaikų EE. Per tą patį laikotarpį 4–6 m. vaikų EE sudarė 11,2 proc., 7–18 m. – 85,5 proc. visų EE sirgusių vaikų [1].
Europos šalyse vaikai sudaro 6–20 proc. sergančių EE žmonių. Mažo ir vidutinio endemiškumo šalyse vaikų sergamumas EE yra daug mažesnis negu suaugusiųjų [31–33]. Mažesnį vaikų nei suaugusiųjų sergamumą EE lemia dvi priežastys – retesnė ekspozicija erkėms ir didesnis vaikų besimp-tomių ligos formų dažnis [34]. Pastarųjų metų epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad erkės vaikams įsisiurbia taip pat dažnai kaip ir suaugusie-siems, bet klinikinės infekcijos formos jiems būna daug rečiau nei suaugu-siesiems [32, 34–36].
3.3. Erkinio encefalito patogenezė
EEV dažniausiai užsikrečiama įsisiurbus užsikrėtusiai erkei. Įsisegusi erkė pradeda maitintis po maždaug 12 val., tačiau EEV šeimininkui per-duoda su seilėmis iš karto, kai tik įsisiurbia, nes EEV yra erkės seilių liaukose. Daug rečiau EEV užsikrečiama per maistą – vartojant termiškai neapdorotą karvių, ožkų, avių pieną arba jo produktus. Aprašyti pavieniai ligos atvejai perpilant infekuoto EEV kraujo arba maitinant kūdikį užsikrė-tusios motinos pienu. Dirbant laboratorijoje su EEV izoliatais, galima užsikrėsti per orą (aerozolinis užsikrėtimo būdas) [25, 30, 37].
EEV infekcijos vystymosi schema žmogaus organizme pateikta 3.3.1 pav.
3.3.1 pav. EEV infekcijos vystymosi schema žmogaus organizme. Adaptuota
pagal [25]. Paaiškinimas tekste
CNS – centrinė nervų sistema, HEB – hematoencefalinis barjeras, IFN – interferonas.
Su erkės seilėmis patekęs į odą, EEV pradeda daugintis odos epidermio germinatyviniame sluoksnyje esančiose dendritinėse Langerhanso ląstelėse (angl. dendritic cells; DC), keratinocituose, neutrofiluose. DC veikia kaip antigeną pateikiančios ląstelės (angl. antigen presenting cell; APC) ir per antigenui savitus T limfocitų receptorius (angl. T cell receptor; TCR) patei-kia EEV antigeną nesubrendusioms T ląstelėms bei skatina jų diferenciaciją į T limfocitus pagalbininkus (angl. helpers; CD4+: Th1, Th2) ir citotoksi-nius T limfocitus (angl. cytotoxic T cells; CD8+) (3.3.2 pav.).
3.3.2 pav. Antigeno pateikimas ir T ląstelių diferenciacija. Adaptuota
pagal http://en.wikipedia.org/wiki/File:Antigen_presentation.svg
TCR – T limfocitų receptorius, MHC – pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas Šiame etape didelę įtaką turi ne tik EEV (viruso kiekis ir virulentišku-mas), bet ir imunomoduliuojamųjų savybių turintis erkių seilių liaukų sek-reto poveikis (slopina fagocitozę, uždegimą skatinančių citokinų gamybą makrofaguose (TNF-α, IL-6), NK ląstelių aktyvumą, DC brendimą, sutrikdo antigeno pateikimą, mažina IFN poveikį aplinkinėms ląstelėms, skatina prieš-uždegiminį atsaką – taip didindamas EEV replikaciją odoje), bet ir įgimtas imunitetas. Įgimto imuniteto ląstelės išskiria citokinų: DC – IL-1, IL-6, TNF-α, IFNαβ, makrofagai – TNF-TNF-α, IL-1, IL-6, IFNαβ ir azoto monoksido (NO). IFNαβ aktyvina makrofagus ir NK ląsteles, kurių išskirti perforinas ir granzimas yra toksiški virusams. NO slopina viruso replikaciją ir taip kontroliuoja infekciją. TNF-α aktyvina neutrofilus ir skatina fagocitozę. Greitas ir pakankamas makrofagų, DC ir NK atsakas šiame etape gali sustabdyti viruso replikaciją jau infekuotose ir šalia esančiose ląstelėse. Odos DC yra pirmosios ląstelės taikiniai žmogaus organizme. Jose EEV dauginasi ir jų pagalba pasiekia drenuojančius limfmazgius [25, 38–43].
Odoje pasidauginęs virusas įcentrinėmis limfagyslėmis pasiekia regio-ninius limfmazgius ir ten pradeda replikuotis. Po kito replikacijos ciklo regioniniuose limfmazgiuose virusas patenka į kraują, krauju EEV pasiekia tarpinius organus (kepenis, blužnį, kaulų čiulpus ir kt.), kuriuose vyksta to-lesnė viruso replikacija [37, 41, 44]. Maždaug 2/3 infekuotųjų EEV imuninė sistema sustabdo infekciją šioje stadijoje: pasigamina EEV antikūnų, o virusas pašalinamas iš organizmo. Endeminiuose Europos regionuose 1–20 proc., Lietuvoje – 3 proc. sveikų žmonių turi EEV antikūnų, nors niekada nesirgo EE. Svarbiausias imuninio atsako veiksnys virusams pašalinti iš organizmo viremijos metu ir virusų plitimui organizme sustabdyti yra hu-moralinis imunitetas. Jeigu humoralinis imuninis atsakas nepakankamas ir EEV pirminės viremijos metu iš organizmo nepašalinamas, pasidauginęs tarpiniuose organuose, virusas antrą kartą patenka į kraują [37, 41, 45].
Maždaug 20–30 proc. užkrėstų asmenų antrinės viremijos metu EEV pereina hematoencefalinį barjerą (toliau – HEB) ir pasiekia smegenis. Tiks-lus mechanizmas, kaip EEV pereina HEB, nėra žinomas. Yra kelios EEV patekimo į CNS hipotezės (3.3.1 pav.):
• EEV pirmiausia infekuoja CNS kraujagyslių endotelio ląsteles, jose pasidaugina ir patenka į smegenų medžiagą;
• EEV patekimą į smegenis lemia uždegimą skatinančių citokinų (TNF-α, IL-6) bei chemokinų sukeltas HEB pralaidumo sutrikimas ir EEV difuzija tarp kapiliarų endotelio ląstelių;
• EEV pereina HEB migruojančių dendritinių ląstelių, neutrofilų, monocitų, makrofagų bei T ląstelių viduje („Trojos arklio“ mecha-nizmas);
• patekęs į nosies gleivinę, EEV infekuoja bipolines uoslės nervo ląsteles, o toliau per uoslės nervą (n. olfactorius) ir uoslės laidą (tractus olfactorius) patenka į smegenis. Dirbant su EEV labora-torijoje užsikrečiama per orą (aerozolinis užsikrėtimas) [25, 37, 41, 46, 47].
Į smegenų ląsteles EEV patenka endocitozės būdu. Patekęs į CNS, EEV plinta tiesiogiai iš neurono į neuroną, aksonais bei tarpląsteliniais tarpais ir infekuoja neuronus, daug mažiau neuroglijos ląsteles. Mikroglijos ląstelių EEV neinfekuoja. Viruso replikacija neuronuose sukelia ląstelės mirtį apop-tozės arba nekrozės būdu. Neuronų apoptozę sukelia viruso replikacija. Neu-ronų mirtį nekrozės būdu lemia neurotoksinių medžiagų – glutamato, reak-tyviųjų deguonies formų (angl. reactive oxygen species; ROS), azoto mo-noksido (NO) ir uždegiminių citokinų (IL-1, IL-6, TNF-α) išsiskyrimas uždegimo vietoje. Smegenų ląstelių irimo produktus fagocituoja mikroglijos ląstelės (neurofagija) [25, 47].
EE patogenezė nėra visiškai aiški. EE metu viruso RNR smegenų skys-tyje randama ypač retai [48–51], todėl manoma, kad lemiama reikšme šios ligos patogenezei yra ne tiesioginis viruso poveikis, o jo sukeltas žmogaus imuninis atsakas [47, 52]. EEV RNR visada randama mirusiųjų nuo EE smegenyse [53, 54]. Nustatyta, kad sergant EE smegenų skystyje vyrauja T limfocitai pagalbininkai (CD4+), išskiriantys citokinus, kuriais reguliuoja-mas imuninis atsakas. EE patogenezei labai svarbi pusiausvyra tarp pirmojo ir antrojo tipo T limfocitų pagalbininkų (Th1 ir Th2) – vyraujant Th1 limfo-citų sukeltam ląsteliniam imuniniam atsakui ir per mažai aktyvinant Th2 limfocitus, sergama sunkiu EE. Skirtingų imuninio atsako ląstelių įtaką EE metu galima nustatyti pagal jų išskiriamus citokinus kraujyje ir smegenų skys-tyje (IL-10, IL-12, IL-15, IL-18 CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13 [41, 53, 55–58].
Lenkijoje atlikus tyrimą nustatytas chemokinų CXCL10, CXCL11, CXCL12 ir CXCL13 kiekis smegenų skystyje ir kraujyje EE sirgusiems ir kontrolinės grupės asmenims. EE sirgusiems pacientams nustatytas reikš-mingai didesnis CXCL10, CXCL11, CXCL12 ir CXCL13 chemokinų kiekis smegenų skystyje, palyginti su kontroline grupe. Šie chemokinai yra geri EEV sukelto CNS uždegimo biologiniai žymenys. Tyrimas nustatė reikš-mingus chemokinų koncentracijų pokyčius – CXCL10 smegenų skystyje ir CXCL13 kraujo serume – pacientams sveikstant. Šių chemokinų kiekio matavimas gali būti pacientų sveikimo žymuo sergant EE [58].
Kitame tyrime buvo nustatyta, kad sergant EE smegenų skystyje aptin-kama chemokinų (CXCL10, CXCL11) ir interleukinų (IL-12/IL-23, IL-18, IL-15). Nustatyta, kad CXCL10 kiekis smegenų skystyje padidėja daugiau negu kraujyje. Vadinasi, EE metu neuronų išskiriamas CXCL10 turi didelę įtaką pritraukiant CXCR3 turinčias CD8 ir Th1 ląsteles į CNS [57].
EE metu smegenų skystyje nustatomas padidėjęs TNF-α, IL-1 ir IL-6 kiekis. IL-1α ir TNF-α veikdami sinergistiškai aktyvina uždegimo tarpininkų grandinę (mediatorių kaskadą), kurios taikinys – endotelis [59].
Limfocitų chemotaksinio citokino – CCL5 chemokino (RANTES, angl.
Regulated upon Activation, Normal T cell Expressed and Secreted) – kiekis
smegenų skystyje sergant EE taip pat būna padidėjęs [60].
Nustatyta, kad sergant sunkiu EE smegenų skystyje nustatomas daug mažesnis dešimtojo interleukino (IL-10) kiekis, nei sergant lengva ligos forma [55]. IL-10 yra uždegimą slopinantis citokinas, kurį išskiria antrojo tipo T limfocitai pagalbininkai (Th2), atsakingi už B limfocitų aktyvinimą ir humoralinį imuninį atsaką. IL-10 slopina uždegimą skatinančių citokinų (IL-1, TNF-a, IL-6) gamybą, ir taip apsaugo neuronus ir glijos ląsteles. Esant mažam IL-10 kiekiui, dominuoja nuo Th1 priklausantis ląstelinis imu-ninis atsakas, sutrinka uždegiminio ir priešuždegiminio atsako pusiausvyra.
Sunkaus encefalito išsivystymą sukelia galbūt padidėjusi uždegiminė CNS reakcija, kurią lemia padidėjusi IFN-γ gamyba arba per mažai skatinama neutralizuojančių antikūnų gamyba [37, 55].
Smegenų parenchimoje vyrauja citotoksiniai T limfocitai (CD8+). Nuo EE mirusių asmenų uždegimo pokyčių smegenų audinyje ir EEV infekuotų neuronų vieta skiriasi – 41 proc. CD8+ limfocitų nustatoma šalia morfo-logiškai nepakitusių neuronų [52, 53, 56, 61]. Tai taip pat sustiprina prielaidą apie imuninio atsako svarbą šios ligos patogenezei. CD8+ limfo-citų įtaka EE patogenezei neginčijamai įrodyta eksperimentiniais tyrimais. Nustatyta, kad transgeninės CD8–/– pelytės, užkrėstos EEV poodinės injekcijos būdu, išgyvena daug ilgiau nei imunokompetentinės pelytės [62]. Manoma, kad pernelyg ryškus CD8+ imuninis atsakas, EEV pasiekus CNS, lemia neuronų pažeidimą ir yra sunkaus encefalito rizikos veiksnys. Todėl manoma, kad uždegiminis imuninis atsakas turi didesnę įtaką ligos patoge-nezei negu viruso replikacija neuronuose [37, 41, 53, 62].
Imuninis atsakas centrinėje nervų sistemoje EE metu būna stiprus ir ilgai trunka. Dviejų nespecifinių imuninio atsako žymenų – neopterino ir β-2 mikroglobulino – kiekis smegenų skystyje EE metu būna labiau padidėjęs nei sergant kitų virusų sukeltomis CNS infekcijomis. Neopterinas, atspin-dintis intratekalinį T ląstelių aktyvinimą veikiant gama interferonui (IFN-γ), yra jautresnis imuninio atsako intensyvumo žymuo EE metu nei β-2 mikro-globulinas [63].
Holtze ir kt. paskelbė, kad sergant EE, padidėja kinureno rūgšties (KYNA) – nepakeičiamosios aminorūgšties triptofano fermentinio metabo-lizmo produkto – kiekis smegenų skystyje. Imuninę sistemą aktyvinantys veiksniai sukelia triptofano apykaitos fermentinę grandinę, vadinamą „kinu-renino keliu“. Tyrimo metu nustatyta, kad KYNA kiekio smegenų skystyje padidėjimas susijęs su ligos sunkumu. Tai pirmasis tyrimas, iškėlęs prielai-dą, kad infekcijos metu pakinta kinurenino apykaita ir kad triptofano fer-mentinio metabolizmo produktai galbūt reguliuoja pusiausvyrą tarp imuni-nės sistemos aktyvinimo ir slopinimo. Eksperimentiniais tyrimais nustatyta, kad KYNA yra svarbi reguliuojant kognityvinę funkciją, kurios sutrikimas yra dažna EE sirgusių suaugusiųjų pasekmė. Padidėjęs KYNA kiekis sme-genų skystyje buvo nustatytas ir sergant kitomis ligomis (ŽIV-1, šizofrenija, depresija), sukėlusiomis kognityvinės funkcijos sutrikimą [64].
Neseniai paskelbta, kad sergant EE būna padidėjęs žmogaus devintos matrikso metaloproteinazės (MMP-9) kiekis smegenų skystyje. MMP-9 yra proteolizinis fermentas, skaidantis užląstelinio matrikso kolageną. MMP-9 sukelia HEB pažeidimą, neuronų apoptozę, dalyvauja vystantis, išsaugojant ir regeneruojantis CNS. Nustatyta, kad MMP-9 kiekio padidėjimas smegenų skystyje yra susijęs su EEV IgG patekimu į CNS iš kraujo (ekstravazacija)
ir koreliuoja su šeštojo interleukino (IL-6) kiekio padidėjimu smegenų skys-tyje. Visiems nuo EE mirusiems pacientams buvo nustatyta padidėjusi MMP-9 koncentracija smegenų skystyje [65]. Anksčiau atliktame tyrime koreliacija tarp IL-6 kiekio kraujo serume ir EE sunkumo formos nebuvo nustatyta [66].
Sveikstant svarbus ir ląstelinis, ir humoralinis imunitetas. Infekuotus neuronus tirpdo NK ir citotoksiniai T limfocitai (CD8+), astrocitus – CD8+. Antikūnai ardo neuronus per nestruktūrinį baltymą NS1, dalyvaujant komp-lementui. Neutralizuojantys antikūnai, susijungę su apvalkalo E baltymu, stabdo EEV patekimą į dar neužkrėstas ląsteles [37].
Tyrimuose su laboratorinėmis pelytėmis nustatyta, kad ankstyvas didelio neutralizuojančių antikūnų kiekio atsiradimas gali užkirsti kelią EEV patekti į CNS. Atsparių EEV pelyčių atmainai buvo nustatyta mažesnė ir
vė-lyva viremija, ne tokia intensyvi virusų replikacija smegenyse ir citokinų / chemokinų gamyba, bet didelis neutralizuojančių antikūnų kiekis. Imlių EEV pelyčių atmainai nustatyta sutrikusi neutralizuojančių antikūnų gamy-ba, tačiau stiprus citokinų / chemokinų atsakas smegenyse. Po EEV inoku-liacijos į smegenis ilgiau išgyveno atsparios atmainos pelytės, palyginti su imlia atmaina. Vadinasi, organizmo atsparumas / imlumas bei citokinai ir che-mokinai turi didelę įtaką EE patogenezei [67].
Kadangi audinių makrofagai ir kraujo monocitai turi antiflavivirusinių antikūnų Fc receptorių (receptorius antikūno Fc fragmentui; angl. fragment
crystallisable), EEV, kaip ir kitiems šios šeimos virusams, in vitro būdingas
imunopatologinis mechanizmas, vadinamas nuo antikūnų priklausomu in-fekcijos sustiprinimu (angl. antibody dependent enhancement, ADE). Jei už-sikrėtimo EEV metu organizme yra savitųjų antikūnų, kurių titras yra ma-žesnis negu reikia neutralizacijai, susidaro viruso ir antikūno kompleksas. Jis per Fc receptorių viruso adsorbciją, penetraciją ir replikaciją monoci-tuose / makrofaguose padidina 5–7 kartus. Manoma, tačiau neįrodyta, kad šis fenomenas galėjo lemti sunkius EE atvejus po pasyviosios profilaktikos savituoju imunoglobulinu. Mirtiną baigtį EE metu lemia funkciškai svar-biausių smegenų struktūrų pažeidimas ir uždegiminio atsako stiprumas pa-žeidimo vietoje. Persirgus EE imunitetas susidaro visam gyvenimui, pakar-totinai nesergama [37, 44, 68].
3.4. Erkinio encefalito klinikos ypatumai
Užsikrėtus EEV, galima besimptomė arba klinikinius požymius suke-lianti – CNS pažeidžianti – infekcijos forma [17,69].
Pirmoji ligos stadija, kurią sukelia pirminė viremija, pasireiškia į gripą panašiais požymiais: karščiavimu (99 proc.), nuovargiu (63 proc.), bendruo-ju silpnumu (62 proc.), kaulų, raumenų ir galvos skausmais (54 proc.) [15, 37].
Po pirmosios EE stadijos eina tariamojo pasveikimo laikotarpis, kuris atitinka EEV dauginimąsi tarpiniuose organuose ir vidutiniškai trunka 5–7 dienas. Europos potipio EEV sukelto EE metu dvibangė ligos eiga nusta-toma 72–87 proc. pacientų. Nustatyta, kad dvibangė ligos eiga retesnė iki-mokyklinio amžiaus vaikams, palyginti su mokyklinio amžiaus vaikais ir suaugusiaisias [15, 37].
Antroje ligos stadijoje, kuri išsivysto dėl viruso replikacijos ir imuninio atsako CNS, atsiranda nervų sistemos pažeidimo požymių. Pagal smegenų dangalų, parenchimos, nugaros smegenų ir šaknelių bei nugarinių nervų pa-žeidimo požymius, EE klinika klasifikuojama į meningitinę, encefalitinę, en-cefalomielitinę ligos formas. Meningitas laikomas lengva EE forma, encefa-litas ir encefalomieencefa-litas vidutinio sunkumo ir / ar sunkia EE forma [25, 37].
Suaugusiųjų EE klinika ūminėje ligos fazėje ir pasekmės ištirti dauge-lyje retrospektyviųjų ir keturių perspektyviųjų tyrimų [2, 19, 20, 70].
Slovėnijoje atlikto perspektyviojo tyrimo duomenimis, EE meningitine forma pasireiškė 49 proc. suaugusių pacientų, encefalitine – 41 proc. ir encefalomielitine – 10 proc. [19].
Vokietijoje atlikto perspektyviojo tyrimo duomenimis, EE ūminėje fa-zėje 49 proc. pacientų pasireiškė meningitu, 41 proc. – encefalitu ir 10 proc. – encefalomielitu. Per tris mėnesius visiškai pasveiko 35 proc. EE sir-gusių pacientų [70].
Guntherio ir kt. Švedijoje atliktame perspektyviajame tyrime lengva EE forma nustatyta 55,3 proc., vidutinio sunkumo – 36,5 proc. ir sunki – 8,2 proc. pacientų. Per 6 savaites nuo ligos pradžios visiškai pasveiko 20 proc. EE sirgusių pacientų. Liekamieji reiškiniai po 1 metų nustatyti 40 proc. pa-cientų [20].
Lietuvoje atliktame perspektyviajame tyrime EE ūminėje fazėje 43,6 proc. pacientų pasireiškė meningitu, 43,6 proc. encefalitu ir 12,8 proc. ence-falomielitu. Nustatyta, kad trečdalis pacientų visiškai pasveiksta per tris mė-nesius nuo EE pradžios, trečdalis – per per vienus metus, trečdaliui persir-gusiųjų lieka liekamųjų reiškinių. Liekamieji reiškiniai, neigiamai veikian-tys EE persirgusių žmonių gyvenimo kokybę, nustatyti 29,9 proc. EE sirgu-sių pacientų [2].
Daugumos tyrimų duomenimis, pagrindiniai suaugusiųjų liekamieji EE reiškiniai yra neurokognityvinio pobūdžio poencefalitiniai skundai.
Daug mažiau žinoma apie vaikų EE klinikinių požymių ypatumus, ligos eigą ir liekamuosius reiškinius.
Europoje atlikti devyni retrospektyvieji vaikų EE tyrimai. Šių tyrimų duomenimis, dažniausia vaikų EE forma yra meningitas, nustatomas 64,9 proc. atvejų. Encefalitinė EE forma nustatyta 34,2 proc., encefalomielitinė – 0,9 proc. vaikų. Analogiškų aštuoniolikos suaugusiųjų EE tyrimų duomeni-mis, suaugusiesiems EE meningitu pasireiškia rečiau nei vaikams – 46,3 proc. atvejų, o encefalitinė ir encefalomielitinė EE formos yra dažnesnės, nustatomos atitinkamai 46,2 proc. ir 7,5 proc. suaugusiųjų (3.4.1 pav.) [33].
3.4.1 pav. Vaikų ir suaugusiųjų EE klinikinių formų dažnis
Europos retrospektyviųjų tyrimų duomenimis
Europoje atlikti tik du perspektyvieji tyrimai, į kuriuos įtraukti vaikai ir suaugusieji bei tiesiogiai palyginti EE klinikiniai požymiai ūminėje ligos fazėje vaikų ir suaugusiųjų grupėse. Tiesioginis EE klinikinių požymių pa-lyginimas tarp vaikų ir suaugusiųjų grupių patvirtino retrospektyviųjų tyri-mų išvadas, kad vaikai EE serga lengviau [70, 71].
3.5. Erkinio encefalito sunkumą lemiantys veiksniai
Kas lemia skirtingų EE formų išsivystymą nėra visiškai aišku, tačiau neabejojama, kad labai svarbus veiksnys yra sergančių žmonių amžius [15, 32].
Lietuvoje atlikto perspektyviojo EE klinikos ir pasekmių tyrimo metu nustatyta reikšminga amžiaus įtaka EE ligos sunkumui: 80 proc. suaugusių pacientų, sirgusių encefalitine (vidutinio sunkumo ir sunkia) EE forma, buvo vyresni nei 45 m., o beveik 70 proc. jaunesnių pacientų sirgo menin-gitine (lengva) EE forma [2]. Amžiaus įtakos EE sunkumui tendencija ste-bėta ir Vokietijoje atliktame tyrime [70].
Šis dėsningumas išlieka ir vaikų kohortose – daugiau nei 85 proc. vaikų, sergančių encefalitine ligos forma yra vyresni nei 7 m., daugiau nei pusė iš jų – vyresni nei 10 m. [32,72]. Vaikai iki trejų metų amžiaus EE serga labai retai, tačiau literatūroje aprašyti penki pirmaisiais gyvenimo metais sunkiu EE sirgę vaikai – 4 kūdikiai ir 17 dienų amžiaus naujagimis [68,73-76]. Tai aiškiai rodo, kad amžius yra svarbus, bet ne vienintelis sunkaus EE išsivystymo rizikos veiksnys.
Dar vienas su EE sunkumu siejamas veiksnys yra vienbangė ligos eiga arba trumpas besimptomis intervalas [32]. Tai netiesiogiai patvirtina EE sunkumo sąsajas su neutralizuojančių antikūnų kiekiu kraujyje: juo trumpes-nis laikas tarp viremijos ir CNS pažeidimo, juo silpnesnis humoralinis imu-ninis atsakas tikėtinas antrosios ligos bangos pradžioje. Vokietijoje atlikto tyrimo duomenimis, dvibangė ligos eiga rečiau stebėta sergant encefalomie-litine (59 proc.) negu meningitine (76 proc.) arba encefaencefalomie-litine (75 proc.) EE forma (p = 0,01) [70]. Vienbangės ligos eigos koreliacija su ligos sunkumu nustatyta Lietuvoje atlikto EE tyrimo [2]. Slovėnijoje sunkia EE forma sir-gusiems pacientams dvibangė ligos eiga nustatyta rečiau (48,4 proc.) nei įprastai [77].
Kaiserio atlikto tyrimo metu nustatyta smegenų skysčio pokyčių kore-liacija su ligos sunkumu ir pasekmėmis: encefalomielitine forma sirgusių pacientų smegenų skysčio citozė ir bendrojo baltymo kiekis buvo didesni, negu sirgusių encefalitine ar meningitine forma pacientų. Citozė > 300 × 106/l ir bendrojo baltymo kiekis > 0,6 g/l smegenų skystyje koreliavo su ilgalaikėmis pasekmėmis [70].
Slovėnijoje atliktas tyrimas, kuriame tiesiogiai palyginti smegenų skys-čio laboratorinai duomenys tarp EE sirgusių vaikų ir suaugusiųjų grupių. Nustatyta, kad smegenų skysčio bendrojo baltymo kiekis buvo reikšmingai didesnis suaugusiųjų grupėje [71].
Vokietijoje atlikto tyrimo duomenimis, didesnė smegenų skysčio citozė ir mažesnis neutralizuojančių antikūnų kiekis kraujyje koreliavo su sunkia EE forma [56].
Įrodyta, kad sunkios EE formos ir blogos prognozės rizikos veiksnys yra mažas neutralizuojančių antikūnų kiekis kraujyje ir mažas imunoglo-bulino M (IgM) kiekis smegenų skystyje ūminėje ligos fazėje. Manoma, kad mažas neutralizuojančių antikūnų kiekis kraujyje lemia didesnę viremiją ir didesnį EEV išplitimą CNS [44, 61].
Imuninis atsakas neabejotinai turi reikšmės šios ligos patogenezei, todėl pastarųjų metų EEV infekcijos moksliniais tyrimais imta ieškoti genetinių veiksnių, koduojančių tam tikras imuninio atsako grandis, ir jų sąsajų su polinkiu sirgti EE, ligos sunkumu ir prognoze [11–14, 78].
3.6. CCR5 ir jo reikšmė EEV infekcijos metu 3.6.1. CCR5 ir jo funkcijos
Chemotaksiniai citokinai, vadinami chemokinais – tai trumpi polipepti-dai, sudaryti iš 70–90 aminorūgščių. Jie, veikiant cheminiams dirgikliams, ska-tina chemotaksį – neutrofilų, monocitų, limfocitų, eozinofilų judėjimą [79]. Chemokinai, atsižvelgiant cisteino liekanų struktūrą ligande, skiriami į 4 šeimas: CXC, CC, C ir CX3C. CC chemokinų dviejų aminogalų cisteino liekanos, sudarančios disulfidines jungtis, yra šalia viena kitos. Kita chemo-kinų klasifikacija atspindi funkcinį jų aktyvumą. Skiriami uždegiminiai ir homeostaziniai chemokinai. Uždegiminiai citokinai gaminami aktyvintų ląs-telių kaip atsakas į patekusią infekciją arba audinių pažeidimą. Nedideliais kiekiais homeostaziniai chemokinai gaminami nuolatos, pagrindinė jų funk-cija – dalyvauti ląstelių migracijoje, kuri reikalinga normaliam imuninės sistemos darbui. Uždegimo patogenezei CC chemokinai turi tam tikrą įta-ką – skatina monocitų, limfocitų ir eozinofilų chemotaksį. Chemokinai vei-kia savo ląsteles taikinius, prisijungdami prie jų membranoje esančių atitin-kamų receptorių [80]. Šiuo metu nustatyta daugiau kaip 50 chemokinų, vei-kiančių skirtingas ląsteles per savituosius G baltymo sujungtus receptorius (angl. G protein-coupled receptor, GPCR) ir 20 chemokinų receptorių. Che-mokino receptoriai priklauso septynių transmembraninių G baltymo sujung-tų receptorių šeimai. Receptorių nomenklatūra remiasi jų prijungiamais chemokinais: CC chemokinai susijungia su CC receptoriais (CCR), CXC chemokinai su CXCR ir t. t. [81, 82]. Chemokino receptorių raiška ir akty-vacija dažniausiai susijusi su leukocitų migravimu į uždegimo židinį. Che-mokinų ir jų receptorių funkcijos neapsiriboja vien dalyvavimu sukeliant imuninį atsaką. Jie siejami su autoimuninėmis ligomis (psoriaze,
diniu artritu, išsėtine skleroze, Sjogreno sindromu) [81, 83, 84], astma, vėži-nėmis ligomis (angiogeneze, metastazių susidarymu) arba transplantato at-metimo reakcijomis [80–82, 84, 85].
CCR5 yra ląstelių paviršiaus baltymas, veikiantis kaip chemokino re-ceptorius. Į CCR5 struktūrą įeina septyni panašūs į spirales transmembra-niniai domenai tarpusavyje susijungę užmembraninėmis kilpomis, užląste-linis N-galo (prijungiantis signalinę molekulę) domenas bei ląstelės viduje esantis C-galo domenas (3.6.1.1 pav.). N-galo domenas lemia receptoriaus specifiškumą [79,80,86].
CCR5 nustatomas atminties ir efektorinių T ląstelių (Th1), NK ląstelių, monocitų, makrofagų ir nesubrendusių dendritinių ląstelių paviršiuje [79, 81, 87, 88]. Smegenyse CCR5 nustatomas mikroglijos ląstelių, astrocitų ir neuronų citoplazmoje ir ląstelių paviršiuje. CCR5 pasiskirstę ir neuronų kūnuose, ir ataugose [79].
CCR5 ligandai yra β chemokinai:
• CCL3 (angl. macrophage inflammatory protein, makrofagų uždegi-mo baltymas-1α, MIP-1α),
• CCL4 (MIP-1β),
• CCL5 (angl. regulated on activation, normal T cell expressed and
secreted, RANTES),
• CCL8 (angl. monocyte chemoattractant protein, monocitų chemo-taksinis baltymas-2, MCP2),
• CCL11 (eozinofilų chemoatraktantas – eotaksinas),
• CCL14a (angl. hemofiltrate chemokine, hemofiltrato chemokinas-1, HCC-1) ir
• CCL16 (HCC-4) [79, 86].
Ligandams susijungus su receptoriais ląstelių paviršiuje, aktyvinimo signalas per ląstelės viduje esantį domeną perduodamas G baltymui. G bal-tymą sudaro 3 subvienetai: alfa (α), beta (β), gama (γ). G baltymas yra pagrindinė grandis, reguliuojanti ląstelės atsaką ir perduodanti signalą nuo receptorių iki veikiančio baltymo. Skirtingos signalų perdavimo grandinės lemia aktyvaciją ir proliferaciją. Receptoriaus aktyvintas G baltymas skyla į dvi dalis: α ir βγ subvienetus (3.6.1.1 pav.).
3.6.1.1 pav. CCR5 receptoriaus struktūra ir molekuliniai pokyčiai,
atsirandantys veikiant CCR5 receptorių (signalo perdavimo kelias). Adaptuota pagal [79]
β chemokinai (juodi apskritimai) susijungia su receptoriaus užląsteliniu N-galo domenu (NH2), skatinami konformaciniai pokyčiai ir aktyvinimas. Svarbios cisteino liekanos
(pažymėtos C raidėmis) formuoja disulfidines jungtis (brūkšninės linijos) reikalingas erdvinei receptoriaus struktūrai palaikyti. Viduląsteliniame C-galo domene (COOH) esančios cisteino liekanos yra svarbios įtvirtinant C-galą prie ląstelės membranos (M). Paryškintas segmentas antrojoje aminorūgščių viduląstelinėje klipoje žymi sąveikos su G baltymo α,β,γ subvienetais vietą (DRYLAVHA – konservatyviosios aminorūgštys). Prisijungus ligandui G baltymas skyla ir aktyvina tam tikrus signalo perdavimo tarpininkus (žr. paaiškinimą tekste).
G α subvienetas slopina adenililciklazę (AC), signalas pasibaigia. G βγ-subvieneto kompleksas aktyvina fosfolipazę Cβ (PLCβ) ir fosfoinozitido 3-kinazę (PI-3K). Veikiant fosfolipazei Cβ (PLCβ) gaminamas inozitoltri-fosfatas (InsP3) ir diacilglicerolis (DAG). InsP3 skatina Ca2+išsiskyrimą iš ląstelės saugyklų, todėl padidėja Ca2+ kiekis ląstelės citoplazmoje. DAG ir Ca2+ aktyvina nuo jų priklausomą proteinkinazę C (PKC), kuri fosforilina receptorių ir vykdo internalizaciją (endocitozės būdu receptorius įtraukia-mas į vidų, taip ribojami membranos signalai). Ca2+ aktyvina daug prolino turinčią tirozino kinazę 2 (PYK2), kuri atsakinga už ląstelių judrumą ir mig-ravimą, bei mitogeno aktyvintas baltymo (MAP) kinazes (p38, ERK1/2 ir JNK), kurios yra svarbios T limfocitų proliferacijai ir citokinų ekspresijai. PI-3K aktyvina proteinkinazę B (Akt/PKB), susijusią su ląstelių išlikimu, ir Rho šeimos guanozintrifosfatazes (Rho GTPazės), reguliuojančias aktino gi-jų persitvarkymą ląstelės citoskelete, ląstelės adheziją, poliškumą ir judrumą [79].
CCR5 raiškos ląstelės paviršiuje reguliavimas apima desensitizaciją, in-ternalizaciją, receptoriaus recirkuliaciją / resensitizaciją arba irimą (degrada-ciją). Šiuos procesus sukelia receptoriaus / ligando komplekso fosforilini-mas PKC arba GPCR kinazės. Fosforilintas kompleksas susiriša su regu-liuojančiu baltymu β-arestinu, kuris inicijuoja CCR5 receptoriaus interna-lizaciją: receptorinės endocitozės būdu receptorius įtraukiamas į vidų ir su-sidariusi pūslelė apgaubiama klatrinu. Pūslelei susidarius klatrinas atsiskiria. Toliau pūslelė keliauja endosomos / lizosomos keliu. Kai ligandas atskyla ar degraduoja, CCR5 baltymai yra perdirbami peribranduolinėse endosomose. Pūslelės membrana kartu su defosforilintais membraniniais receptoriais grąžinami į paviršių (recirkuliacija ir resensitizacija). Tačiau kartais recepto-riaus ir ligando komplekso endocitozė gali vykti nepriklausomu nuo β-ares-tino / klatrino keliu. Tais atvejais receptorius atiduodamas į lizosomas, kad kartu su ligandu suirtų (degraduotų), ir negali būti grąžintas į ląstelės memb-raną. Įvykusi receptoriaus internalizacija sutrikdo receptoriaus gebą prisi-jungti ligandą [79, 80, 85, 86, 89, 90].
CNS β-chemokinus gamina mikroglijos ląstelės ir astrocitai, šiek tiek mažiau neuronai. Esant CNS uždegimui padidėja β chemokinų gamyba, pri-traukiamos ir aktyvinamos CCR5 ekspresuojančios ląstelės. CNS vyksta aktyvinto CCR5 reguliuojami procesai: mikroglijos aktyvinimas ir chemo-taksis, monocitų / makrofagų chemotaksis, limfocitų chemotaksis (telkiamos CCR5 receptorių ekspresuojančios imuninės ląstelės: CD4+, CD8+ limfo-citai ir NK ląstelės) [6, 79, 91].
Sveiko organizmo HEB yra nepažeistas, ir ląstelės iš sisteminės kraujo-takos retai patenka į smegenų audinį. Jei uždegimas yra pažeidęs HEB vien-tisumą, į smegenų parenchimą iš sisteminės kraujotakos patenka T atminties
ląstelių ir monocitų. Prieš patekdamos į smegenų parenchimą, šios ląstelės – daugiausiai CCR1+ ir CCR5+ ekspresuojantys monocitai, mažiau efektori-nės T ląstelės ekspresuojančios CXCR3 – aptinkamos perivaskuliniuose infiltratuose. Smegenų parenchimoje uždegiminiai makrofagai slopina CCR1, išsaugodami CCR5. Fiziologiškai imuninį atsaką CNS valdo HEB perėję T atminties ląstelės. Sveikų asmenų smegenų skystyje daugiau kaip 75 proc. ląstelių sudaro CD4+ atminties ląstelės, ekspresuojančios CCR7, palengvinančio jų grįžimą atgal į limfmazgius, ir CXCR3, rodančio Th1 ląstelių atsaką [81].
3.6.2. CCR5 32 bazių porų iškrita (CCR5Δ32), jos paplitimas bei sąsajos su EE ir kitomis virusinėmis CNS infekcijomis
CCR5 koduojantis genas yra 3 chromosomos trumpojo peties 21 lokuso 31 ruože (3p21.31) (3.6.2.1 pav.). Geną sudaro 4 koduojančios (egzonai) ir 2 nekoduojančios (intronai) dalys. Genas koduoja iš 352 aminorūgščių susi-dedantį baltymą. Geno raišką didina IFNα, ciklinis adenozino monofosfatas (cAMP), IL-15, IL-4 kartu su IL-10, slopina IL-1β [85].
3.6.2.1 pav. CCR5 geno vieta 3 chromosomoje (3p21.31) (rodo rodyklė).
Adaptuota pagal http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CCR5
CCR5 1996 m. buvo nustatytas kaip žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) koreceptorius [92]. Iki šiol yra aprašytos mažiausiai 74 šio geno mu-tacijos. Skirtingose populiacijose yra identifikuota keletas CCR5 geno ale-linių variantų. Geriausiai žinomas ir labiausiai tyrinėjamas CCR5 geno po-kytis – 32 bazių porų iškrita (CCR5Δ32). Dėl CCR5 įvykusios 32 bazių porų iškritos pasislinkus skaitymo rėmeliui, pasikeičia CCR5 kodonų skaitymo tvarka. Naujoje kodonų sekoje susidaro naujas baigmės kodonas – ties ku-riuo sustoja baltymo sintezė. Antrojoje aminorūgščių užląstelinėje kilpoje nutrūkusi baltymo sintezė (352 a.r. (wt) → 215 a.r. (Δ32)) lemia CCR5 receptoriaus struktūros ir funkcijos pokyčius [92–95]. Trumpesnis baltymas lemia trijų transmembraninių domenų bei citoplazminio C-galo domeno praradimą ir funkciškai neaktyvų CCR5 receptorių CCR5 homozigotinį mutavusį genotipą (Δ32/Δ32) turintiems asmenims bei sumažėjusį receptoriaus aktyvumą heterozigotams (wt/Δ32) (3.6.2.2 pav.) [94–96].
3.6.2.2 pav. CCR5 32 bazių porų iškritos nulemti struktūrinai CCR5
receptoriaus pokyčiai. Adaptuota pagal [92, 95, 97].
A. CCR5 geno dalies, apimančios Δ32 iškritą, nukleotidų ir jų koduojamų baltymų
aminorūgščių sekos. Pilkas fonas žymi Δ32 iškritą. B. CCR5 laukinio tipo alelio (wt) koduojamo receptoriaus struktūra. LM – ląstelės membrana. Rodyklė antroje aminorūgščių užląstelinėje kilpoje žymi Δ32 iškritos pradžią. C. CCR5 mutavusio alelio (Δ32) koduojamo pakitusio receptoriaus struktūra. Kiti paaiškinimai tekste
Libertas ir kt. ištyrė CCR5Δ32 polimorfizmo paplitimą aštuoniolikoje Europos populiacijų (n = 2668). CCR5 mutavusio alelio (Δ32) paplitimas tarp Europiečių siekia 10,1 proc. Tiriant CCR5 mutavusio alelio (Δ32) paplitimą nustatytas ryškus Pietų ir Šiaurės gradientas: tarp Afrikos ir Azijos gyventojų ši mutacija nustatoma ypač retai, o Europos šiaurės rytuose (Suomija) apie 16 proc. gyventojų turi CCR5 mutavusį alelį (Δ32) [97–100]. Liberto ir kt. duomenimis, CCR5 mutavusio alelio (Δ32) paplitimas tarp Lietuvos gyventojų siekia 11,5 proc. [97].
JAV atlikti genų polimorfizmų tyrimai, sergant Vakarų Nilo encefalitu (VNE) – tos pačios flavivirusų grupės kaip ir EEV viruso sukelta nervų sistemos infekcija, kurios patogenezė yra labai panaši į EE. Skirtingai nei EEV, Vakarų Nilo virusą (VNV) perneša uodai. Užsikrėtus VNV galima subklinikinė (80 proc.) arba klinikinius požymius sukelianti (20 proc.) ligos eiga, turinti platų požymių spektrą – nuo lengvos febrilinės iki neuroinva-zinės ligos formos, pasireiškiančios meningitu, encefalitu ir / ar vangiu paralyžiumi. JAV atlikti tyrimai parodė, kad polinkis sirgti VNE priklauso nuo CCR5Δ32 polimorfizmo [7–9].
Apsauginė funkciškai aktyvaus CCR5 įtaka patvirtinta gyvūnų mode-liuose. Užkrėtus VNV, 60 proc. CCR5+/+ genotipą turinčių pelyčių išgyve-no, o visos CCR5–/– pelytės mirė. Glassas su bendraautoriais paskelbė, kad CCR5 yra svarbus antivirusinis ir išgyvenamumą lemiantis VNV užkrėstų pelyčių modelio veiksnys, sąlygojantis leukocitų migraciją į infekuotas sme-genis [6].
Nustatytas reikšmingai didesnis CCR5 homozigotinio mutavusio geno-tipo (Δ32/Δ32) paplitimas tarp sirgusių VNE, negu tarp nesirgusių šia infek-cija asmenų ir sąsaja tarp CCR5 homozigotinio mutavusio genotipo (Δ32/ Δ32) paplitimo ir mirtinų VNE formų dažnio [7,8].
Glasso ir kt. atliktas tyrimas nustatė, kad mutavęs CCR5 alelis (Δ32) yra reikšmingas simptominės ligos formos išsivystymo rizikos veiksnys, užsikrėtus VNV, ir kad funkciškai aktyvų CCR5 turintys asmenys yra atspa-rūs simptominės ligos formos išsivystymui. Tyrimas parodė, kad vystantis neuroinvazinei ligos formai t. y. sunkėjant VNV infekcijai, didėja CCR5 homozigotinio mutavusio genotipo (Δ32/Δ32) paplitimo dažnis. Pacientams, kuriems vien karščiavimu pasireiškė VNV infekcija, CCR5 homozigotinis mutavęs genotipas (Δ32/Δ32) nustatytas 6,2 proc., meningitu – 4,0 proc., encefalitu – 7,1 proc. (p > 0,05); tarp mirusių nuo neuroinvazinės VNV in-fekcijos asmenų – 25 proc. Šiame tyrime taip pat buvo nustatyta reikšminga
CCR5 homozigotinio mutavusio genotipo (Δ32/Δ32) paplitimo sąsaja su
mirtina VNV infekcijos baigtimi – minėtą genotipą turintiems asmenims galimybė mirti nuo VNE buvo reikšmingai didesnė (GS = 13,2; 95 proc. PI 1,9–89,9; p = 0,03), negu CCR5Δ32 polimorfizmo neturintiems pacientams [7]. Tą pačią hipotezę patvirtino Diamondas su bendraautoriais [101]. Šis tyrimas pateikė pirmuosius įrodymus, kad mutavęs CCR5 alelis (Δ32) yra rizikos veiksnys vystantis simptominei ligos formai, užsikrėtus VNV, o funkciškai aktyvų CCR5 turintys asmenys atsparūs simptominės formos išsivystymui [7]. Priešingai, žinoma, kad CCR5 homozigotinį mutavusį ge-notipą (Δ32/Δ32) turintys asmenys yra neimlūs ŽIV [92]. Šie radiniai turi svarbią reikšmę naujų vaistų, blokuojančių CCR5, naudojamų ŽIV/AIDS gydyti, vartojimui. Pacientai, gyvenantys VNE endeminėse vietovėse ir vartojantys šiuos vaistus, turi griežtai saugotis uodų įkandimų, norėdami iš-vengti simptominės VNE formos išsivystymo [7].
Limas su bendraautoriais 2008 m. publikavo 4 kohortų (n = 619) meta-analizę, kurioje įvertino sąsają tarp CCR5 homozigotinio mutavusio geno-tipo (Δ32/Δ32) paplitimo ir rizikos susirgti simptomine VNV ligos forma. Visose kohortose (n = 619) CCR5 homozigotinio mutavusio genotipo (Δ32/ Δ32) paplitimas buvo reikšmingai didesnis tarp VNV infekcija sirgusių žmonių (4,0 proc.) negu tarp sveikų kontrolinių kraujo donorų (0 proc.). Nustatyta, kad CCR5Δ32 polimorfizmą turintiems asmenims galimybė
sirgti VNE yra keturis kartus didesnė (GS = 4,2; 95 proc. PI 2,1–8,3; p < 0,001), nei jos neturintiems žmonėms. GS tarp atskirų kohortų svyravo tarp 3–5. Ši keturių nepriklausomų kohortų (n = 619) metaanalizė neabejotinai patvirtino hipotezę, kad funkciškai aktyvus CCR5 yra svarbus organizmo gynybinis veiksnys, užsikrėtus VNV infekcija [8].
Vėliau paskelbtuose darbuose Limas su bendraautoriais įrodė, kad CCR5 trūkumas per se nėra VNV infekcijos rizikos veiksnys, tačiau už-sikrėtus VNV, CCR5 trūkumas yra ir ankstyvųjų, ir vėlyvųjų ligos požymių atsiradimo rizikos veiksnys ir nuo jo priklauso ligos sunkumas. CCR5 mutavusių homozigotų (Δ32/Δ32), heterozigotų (wt/Δ32) ir laukinio tipo homozigotų (wt/wt) vidutinis ligos simptomų skaičius ankstyvosios VNV infekcijos metu skyrėsi reikšmingai (atitinkamai 5,47 vs. 2,81 vs. 3,05; p = 0,002) [9]. Šie rezultati rodo, kad nefunkcionuojantis CCR5, užsikrėtus VNV, lemia ryškesnius ankstyvuosius klinikinius ligos požymius [102].
Kindberg ir kt. 2008 m. paskelbta publikacija buvo pirmoji apie gene-tinių veiksnių svarbą EE išsivystymui. Nustatyta, kad CCR5 homozigotinio mutavusio genotipo (Δ32/Δ32) paplitimas yra didesnis tarp sergančių EE nei tarp sergančių kitos kilmės virusiniais meningoencefalitais ir sveikų kontrolinių asmenų. Šį genotipą turintys asmenys nustatyti tik sirgusių EE grupėje. Be to, šis tyrimas nustatė, kad mutavęs CCR5 alelis (Δ32) galbūt yra simptominės EEV infekcijos rizikos veiksnys (GS = 1,58; 95 proc. PI 0,96–2,58; p = 0,065). Šie duomenys leidžia manyti, kad ne tik homozi-gotinis (Δ32/Δ32), bet ir heterozigotinis (wt/Δ32) CCR5 geno pokytis lemia polinkį sirgti EE. Nustatyta, kad sunkėjant ligai, didėjo mutavusio CCR5 alelio (Δ32) paplitimas [11]. Šiame darbe stebėta didesnio CCR5 mutavusio alelio (Δ32) paplitimo, sunkėjant ligai, tendencija, tačiau negauta statistiškai reikšmingo skirtumo tarp EE sunkumo formų ir mutavusio CCR5 alelio (Δ32) paplitimo. Tyrėjų grupei iš Rusijos nepavyko nustatyti CCR5Δ32 polimorfizmo sąsajų su polinkiu sirgti EE [14].
Engman su bendraautoriais pirmieji atliko nedidelės vaikų imties
CCR5Δ32 polimorfizmo paplitimo tyrimą. Mutavusio CCR5 alelio (Δ32)
paplitimas reikšmingai nesiskyrė tarp tiramųjų (EE, neuroborelioze sirgusių) ir kontrolinės vaikų grupių [103]. Daugiau mokslinių tyrimų, siekiančių pa-tikrinti šią hipotezę tarp vaikų kohortų, iki šiol nėra atlikta.
3.6.3. CCR5Δ32 polimorfizmo reikšmė sergant kitomis ligomis 1996 m. pranešta, kad CCR5 yra žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) koreceptorius, padedantis ŽIV-1 įsiskverbti į ląsteles taikinius [92]. CCR5 savo paviršiuje ekspresuoja CD4+ ląstelės, monocitai. ŽIV-1 apvalkalo glikoproteinas gp 120 jungiasi su ląstelės receptoriumi CD4 ir CCR5. ŽIV-1, kurie jungiasi prie CD4 ląstelės per CCR5 koreceptorių, vadinami R5 virusais. Nustatyta, kad CCR5 mutavusį homozigotinį genotipą (Δ32/Δ32) turintys asmenys nuolat susidurdami su R5 ŽIV yra genetiškai neimlūs ŽIV, o heterozigotams ŽIV infekcijos progresavimas į AIDS yra daug lėtesnis, nei funkciškai aktyvų CCR5 turintiems asmenims. Akivaizdu, kad ši mutacija turi apsaugos funkciją organizmui susidūrus su ŽIV [92]. Minėtos sąsajos paskatino naujų antiretrovirusinių vaistų – koreceptorių antagonistų – sukūrimą. Koreceptorių antagonistai selektyviai prisijungia prie CCR5 re-ceptoriaus, ir jį blokuoja. Šie vaistai labiau veikia žmogaus imlumą ŽIV, negu patį virusą. CCR5 antagonistų vartojimo saugumo klausimas yra labai svarbus, problemiškas flavivirusų endeminėse vietovėse [9,102,104,105].
Sorce su bendraautoriais straipsnyje apžvelgė CCR5 įtaką CNS sergant ŽIV infekcija. ŽIV infekcijos metu, nepaisant poveikio imuninei sistemai, virusas prasikverbia į smegenis ir sukelia patologinį atsaką. Tikėtiniausia, kad viruso infekuotos ląstelės (monocitai ir CD4+ limfocitai) prasiskverbia per HEB. Virusas dauginasi mikrogijos ląstelėse ir makrofaguose, nulemia smegenų infekciją. Taip pat manoma, kad astrocitai ir neuronai yra ŽIV ląstelės taikiniai. Iš vienos pusės, CCR5 – kaip ŽIV koreceptorius – paleng-vina viruso patekimą į smegenų ląsteles, ir priešingai, smegenyse esančio CCR5 aktyvinimas savitaisiais chemokinais sukelia neuronų apsaugos poveikį, kuris lemia neuronų išlikimą sergant su ŽIV susijusia demencija [79].
Guergnonas ir Combadiere'as apžvelgė chemokinų polimorfizmo įtaką sergant tam tikromis ligomis. Nustatytos mutavusio CCR5 alelio (Δ32) sąsajos su mažesnio laipsnio kepenų fibroze ir mažiau išreikštu (peri)portiniu uždegimu sergant hepatito C viruso sukelta infekcija. Tačiau kitas tyrimas nenustatė reikšmingo mutavusio alelio paplitimo skirtumo tarp atvejo ir kontrolinės grupių. Nustatyta apsauginė mutavusio CCR5 alelio (Δ32) įtaka citomegalo viruso (CMV) reaktyvacijai po transplantacijų. Apie apsauginę mutavusio CCR5 alelio (Δ32) funkciją pranešama tiriant reumatoidiniu artritu (RA) sergančius pacientus. Jo paplitimas buvo reikš-mingai mažesnis tarp lengva RA forma sirgusių pacientų, palyginti su sun-kia forma sirgusiais pacientais (17 proc. vs. 4 proc.) [84].
3.7. TLR3 ir jo reikšmė EEV infekcijos metu 3.7.1. TLR3 ir jo funkcijos
Toll like receptoriai (angl. Toll-like receptors; TLR) yra žinduolių
ląstelėse ekspresuojami Toll baltymo (drozofilos Toll geno koduojamas baltymas) homologai, kurių išoriniai domenai atpažįsta patogenų (bakterijų, virusų, grybų arba pirmuonių) ligandus ir užtikrina organizmo nespecifinį imunitetą per ląstelės viduje esančio domeno sukeltą atsaką. Šiuo metu žmogaus organizme identifikuota 11 TLR receptorių, kurie dalyvauja nespecifiniame imuniniame atsake ir turi didelę įtaką pradinei uždegiminio atsako fazei. Skirtingų TLR receptorių lokalizacija ląstelėje skiriasi. TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 nustatomi ląstelių sienelės plazminėje memb-ranoje, TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 – endosomose [106,107]. TLR3 mRNR aptinkama žmogaus plaučiuose, placentoje, kasoje, širdyje ir smegenyse [108] bei kvėpavimo takų, gimdos, makšties, ragenos, tulžies ir žarnų epitelinėse ląstelėse [109].
TLR3 yra įterptas į membraną baltymas, sudarytas iš 904 aminorūgščių. TLR3 sudaro trys ląstelės išorėje esantys domenai – ligandą atpažįstantis pasagos formos receptorinis domenas iš pasikartojančių sekų, kuriose daug leucino liekanų (angl. leucine-rich repeat domain; LRR) ir du daug cisteino liekanų turintys domenai (Cap); transmembraninis domenas (TM); du vidu-ląsteliniai signalo perdavimo domenai – citoplazminis (CYT) ir homolo-giškas IL-1 receptoriui (Toll-IL-1R - TIR domenas) (3.7.1.1 pav.) [110].
3.7.1.1 pav. TLR3 sandara. Adaptuota pagal [110]
TLR3 receptoriai nustatomi makrofagų, B limfocitų, NK ląstelių, dend-ritinių ląstelių [107], epitelinių ląstelių [111] endosomose, bei gausiai nusta-tomi smegenyse: neuronų [108, 112], astrocitų, mikroglijos ir oligo-dendrocitų [109, 113], Švano ląstelių [114] endosomose. Jie dalyvauja atpažįstant virusų dvigrandę ribonukleorūgštį (dsRNR). ssRNR, dsDNR virusai gamina dsRNR replikacijos ciklo metu [115]. Šias dsRNR taip pat atpažįsta TLR3. Eksperimentiniuose modeliuose kaip TLR3 ligandai naudojami sintetiniai dsRNR analogai – poly(I:C) (angl.
polyinosinic-poly-cytidylic acid) ir PIC (angl. poly-riboinosinicribocytidylic acid) [109, 116].
Virusų dsRNR susijungus su TLR3 per signalo adapterį (TRIF), akty-vinami transkripcijos veiksniai (NF-κB, IRF3), indukuojama I tipo inter-ferono (IFN), uždegiminių citokinų (navikų nekrozės veiksnio α (TNF-α), IL-1 ir IL-6), chemokinų (CCL-5, CXCL-10) ir kitų uždegimą skatinančių mediatorių gamyba [106, 108, 110, 112, 116, 117]. TLR3 signalo perda-vimo kelias pateiktas 3.7.1.2 pav.
3.7.1.2 pav. TLR3 signalo perdavimo kelias. Adaptuota pagal [108, 117]
TRIF – citozolio adapteris reaguojantis į Toll-like receptoriaus aktyvinimą (angl.
TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β); TRAF6 – su tumoro nekrozės veiksnio receptoriumi susijęs 6 veiksnys (angl. TNF receptor-associated factor 6); NF-κB – baltymų kompleksas, kontroliuojantis DNR transkripciją (angl. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells); TNF – naviko nekrozės veiksnys; TBK1 – (angl. TANK binding kinase 1); IRF3 – interferoną reguliuojantis 3 veiksnys (angl. interferon regulatory factor 3); IFN – interferonas.
TNF-α, IL-6 ir I tipo IFN padidina hematoencefalinio barjero pralaidu-mą, todėl flavivirusai lengviau patenka į CNS.
TLR3 įtaka sergant virusinėmis CNS infekcijomis šiuo metu aktyviai tyrinėjama. Jacksonas ir kiti nustatė, kad CNS virusinių infekcijų (pasiut-ligės, HSV-1) metu nebūtina tiesioginė viruso infekcija, kad padidėtų TLR3 raiška neuronuose. Tirpūs imuniteto veiksniai taip pat gali būti svarbūs su-keliant TLR3 raišką. Šio tyrimo metu, tiriant mirusių žmonių smegenėlių žievės TLR3 raišką imunohistocheminiu būdu, nustatyta, kad TLR3 ekspre-suojami žmogaus smegenų neuronuose in vivo ir kad neuronai gali turėti didelę įtaką uždegiminei reakcijai sergant tam tikromis nervų sistemos ligo-mis (pasiutlige, Herpes simplex 1 viruso (HSV-1) sukeltu encefalitu, šonine amiotrofine skleroze, insultu, Alzheimerio liga) [118].
Prehaudo ir kt. atlikto tyrimo duomenimis, TLR3 yra nustatomi žmo-gaus neuronuose. Tiriant žmožmo-gaus pomitozinius neuronus (NT2-N ląstelių kultūra), nustatyta, kad TLR3 indukuotą nespecifinį imuninį atsaką į pasiut-ligės virusą (RABV) ir dsRNR [poly(I:C)] lydi stiprus IFN-β, chemokinų ir
uždegiminiųcitokinų gamybos stimuliavimas [108].
TLR3 geno išjungimas sumažina atsparumą virusinėms infekcijoms,
imuninės sistemos ląstelių aktyvinimą, citokinų ekspresiją.
3.7.2. Vieno nukleotido pakaitos TLR3 gene, jų paplitimas ir sąsajos su EE ir kitomis virusinėmis CNS infekcijomis
TLR3 genas yra 4 chromosomos ilgojo peties 35 lokuse (4q35) (3.7.2.1
pav.).
3.7.2.1 pav. TLR3 geno vieta 4 chromosomoje (4q35) (rodo rodyklė).
Adaptuota pagal http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TLR3&snp = 466#snp
Žmonių populiacijoje yra identifikuotos daugiau kaip 136 vieno nukleo-tido pakaitos (VNP) (angl. single nucleotide polymorphisms; SNP) TLR3 gene. Vieno nukleotido pakaitos priskiriamos prie mažųjų (taškinių) genų mutacijų. Pagal tai, kaip VNP pakeičia kodoną, mutacija gali būti missense (klaidingos prasmės – jai vykstant pakinta aminorūgštis), nonsense (bepras-mė – kodonas virsta beprasmiu (nekoduoja jokios aminorūgšties) arba baig-mės kodonu) ir tylioji (jai vykstant aminorūgštis nepakinta). Devynios VNP pakeičia TLR3 baltymo kodavimo seką, bet tik penkios VNP – lemia ami-norūgšties pakaitą – N284I, Y307D, L412F ir S737T [119, 120] (3.7.2.1 lentelė). Vieno nukleotido pakaitų (VNP), lemiančių aminorūgščių pakaitą, vietos TLR3 pateiktos 3.7.2.2 pav.
3.7.2.1 lentelė. Vieno nukleotido pakaitos (VNP) TLR3 gene. Adaptuota pagal
[119, 121, 122]
Nukleotido pokytis, kodonas (padėtis triplete)
Aminorūgštis (vienaraidis simbolis), kodonas → pakitusi aminorūgštis (vienaraidis simbolis)
mut alelio dažnis bendroje populiacijoje
G612A (3) Leu (L) 204 0,5
A851T (2) Asn (N) 284→Ile (I) 0,43
T919G (1) Tyr (Y) 307→Asp (D) 0,056
C1234T (1) Leu (L) 412→Phe (F) 19,97 T1377C (3) Phe (F) 459 – T2208A (1) Ser (S) 737→Thr (T) 0,70 C2664T (3) Ala 888 0,6 C1660T Pro (P) 554→ Ser (S) – G2236T Glu (E) 746 → X –
Rodyklė reiškia aminorūgšties pakaitą.
Nukleotidai: A – adenozinas, C – citozinas, G – guaninas, T – timinas; aminorūgštys: Leu (L) – leucinas, Asn (N) – asparaginas, Ile (I) – izoleucinas, Tyr (Y) – tirozinas, Asp (D) – aspartatas, Phe (F) – fenilalaninas, Ser (S) – serinas, Thr (T) – treoninas, Ala (A) – alaninas, Pro (P) – prolinas, Glu (E) – glutamo rūgštis, X – baigmės kodonas.
3.7.2.2. pav. Vieno nukleotido pakaitų (VNP), lemiančių aminorūgščių
pakaitą, vietos TLR3. Adaptuota pagal [119]. Rodyklė rodo tirtos VNP (TLR3 rs3775291) vietą.
Molekuliniai modeliai iškėlė prielaidą, kad dvi VNP – N284I ir L412F – galimai pakeičia TLR3 pasikartojančių leucino liekanų (LRR) san-darą. Europoje L412F mutavusį alelį turi 30,1 proc. populiacijos, Azijoje – 26,97 proc., Afrikoje – 0,88 proc. Apskritai L412F mutavusio alelio papli-timas žmonių populiacijoje – 19,97 proc., jo paplipapli-timas dažnesnis tarp astma sergančių žmonių – 41,67 proc. Kad būtų patikrinta, ar šios keturios VNP veikia TLR3 funkciją, kiekviena VNP buvo klonuota ir išbandyta jos geba aktyvinti TLR3 raišką ląstelių kultūrose. VNP N284I ir L412F reikšmingai sumažino TLR3 raišką (funkcinį aktyvumą), palyginti su laukinio tipo TLR3 (p < 0,001). VPN Y307D ir S737T, palyginti su laukinio tipo TLR3, raiškos nepakeitė. Jei šių tyrimų duomenys būtų ekstrapoliuoti žmogui, šios dvi VNP greičiausiai nepažeistų normalios heterozigotinio asmens TLR3 funkcijos. Šia prasme L412F alelis yra ypač įdomus, nes jis yra gausiai paplitęs tarp astma sergančių asmenų. Ši sąsaja turi būti toliau nagrinėjama, kad būtų įrodyta mutavusio L412F alelio įtaka ligoms išsivystyti [119,123].
Sergant Vakarų Nilo encefalitu (VNE) – tos pačios flavivirusų grupės, kaip ir EEV, sukelta nervų sistemos infekcija, funkcionuojančio TLR3 įtaka yra prieštaringa.
Apsauginė nefunkcionuojančio TLR3 funkcija flavivirusinių infekcijų metu pirmą kartą buvo nustatyta Wango ir kt. modeliuose su laboratori-nėmis pelytėmis. Turinčios nefunkcionuojantį TLR3 (TLR3(–/–)) pelytės, sušvirkštus VNV į jų pilvaplėvės ertmę, mirė rečiau, negu funkcionuojantį
