LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Arnoldas Pautienius
KRKSV molekulinis charakterizavimas ir paplitimas Lietuvos šernų
populiacijoje
Molecular characterization and prevalence of PRRSV in Lithuanian
wild boar population
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: prof. dr. Arūnas Stankevičius
2
DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „KRKSV molekulinis charakterizavimas ir paplitimas Lietuvos šernų populiacijoje“:
1. Yra atliktas mano paties.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) ________________________________________________________________________________ 2) ________________________________________________________________________________ (vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjųdarbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUPOS ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Viruso struktūra ... 101.2. Viruso genotipai ir subtipai ... 11
1.2.1. Genotipai ... 11
1.2.2. Subtipai... 12
1.3. KRKSV Paplitimas ... 12
1.4. Viruso perdavimas ir užsikrėtimas... 14
1.5. Imuninis atsakas ir klinikiniai požymiai ... 14
1.6. KRKSV diagnostikos ypatybės ... 15
2. TYRIMŲ MEDŽIAGOS IR METODAI ... 18
2.1. Tyrimų vieta ... 18
2.2. Laukinių šernų mėginiai ... 20
2.3. RNR medžiagos ekstrakcija ... 20
2.4 Atvirkštinės transkripcijos lizdinė polimerazinė grandininė reakcija ... 21
2.4.1. Atvirkštinė transkripcija ... 21
2.4.2. Lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazinė grandininė reakcija ... 22
2.4.3. Lizdinės AT-PGR rezultatų vizualizacija ... 22
2.5. Realaus laiko TaqMan polimerazinė grandininė reakcija ... 23
2.6. Specifinių antikūnų prieš KRKSV nustatymas ... 24
2.7. Statistinė duomenų analizė ... 24
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 25
3.1. Lizdinės AT-PGR rezultatai ... 25
3.2. Realaus laiko TaqMan PGR rezultatai ... 27
3.3. Specifinių antikūnų prieš KRKSV tyrimų rezultatai ... 28
4 4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33 IŠVADOS ... 36 PADĖKA ... 37 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 38 PRIEDAI ... 49
5
SANTRUPOS
AT-PGR – atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
AT-nPGR – lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija bp – bazių poros
kDNR - komplementari DNR grandinė Ct –ciklo slenkstis (angl. cycle threshold) DNR – deoksiribonukleorūgštis
E – KRKSV nukleokapsidės proteinas (membraninis glikoproteinas) GP2a – KRKSV membraninis glikoproteinas
GP2b – KRKSV membraninis proteinas GP3 – KRKSV membraninis glikoproteinas GP4 – KRKSV membraninis glikoproteinas
GP5, GP5a – KRKSV membraninis glikoproteinas IL-2 ir kt. – interleukinai
INF – interferonas kb – kilobazė
KRKS – kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromas
KRKSV – kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo virusas MARK-145 – Afrikos žaliosios beždionės inkstų ląstelių linija N – KRKSV nukleokapsidės proteinas
NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas n – bendras tirtų mėginių skaičius
ORF – atviras nuskaitymo rėmelis (angl. open reading frame) - nukleotidų sekos grandinėje p – patikimumas (statistinis)
PAM – alveoliniai makrofagai (angl. porcine alveolar macrophage) PGR – polimerazės grandininė reakcija
PI – pasikliautinis intervalas proc. – procentai
RNR – ribonukleino rūgštis
6
SANTRAUKA
KRKSV molekulinis charakterizavimas ir paplitimas Lietuvos šernų populiacijoje
Arnoldas Pautienius Magistro baigiamasis darbas
Darbo apimtis: 58 puslapiai, 7 lentelės, 7 paveikslai, 1 schema.
Darbo tikslas: įvertinti KRKSV paplitimą Lietuvoje, taikant skirtingus molekulinius ir serologinius
diagnostikos metodus.
Kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo virusas (KRKSV), šiuo metu aptinkamas beveik visose kiaules auginančiose šalyse ir yra laikomas vienu iš pačių svarbiausių bei ekonomiškai didžiausius nuostolius nešančių virusų kiaulininkystės industrijoje. Nors yra nemažai žinoma apie KRKSV paplitimą įvairių šalių kiaulių populiacijose, informacijos apie viruso paplitimą laukinių šernų (Sus scrofa) tarpe, kurie yra potencialūs viruso gamtiniai reservuarai, yra labai nedaug. Siekiant užpildyti šią spragą, taikant skirtingus molekulinius: AT-nPGR ir TaqMan PGR bei imunofermentinius diagnostikos metodus, buvo ištirta sumedžiotų šernų (n=381) plaučių audinio ir kraujo serumo mėginiai bei įvertintas KRKSV paplitimas Lietuvos teritorijoje.
Mėginių pavyzdžius ištyrus AT-nPGR metodu, buvo gauta 16,58 proc. (95 proc. PI 12,14–22,23) teigiamų mėginių; realaus laiko TaqMan PGR metodu - 18,48 proc. (95 proc. PI 13,80–24,30) teigiamų mėginių. Mėginių pavyzdžius ištyrus ELISA metodu, specifiniai antikūnai buvo nustatyti 4,11 proc. (95 proc. PI 1,30-10,39) tirtųjų mėginių. Daugiausiai teigiamų mėginių 19,10 proc. (95 proc. PI 12,19-28,57) - AT-nPGR metodu ir 21,34 proc. (95 proc. PI 14,04-31,03) - realaus laiko TaqMan PGR metodu buvo randama 12 - 24 mėn. amžiaus šernų mėginiuose (p<0,05). Mažiausiai - 1,61 proc. (95 proc. PI 0,1-7,46) teigiamų mėginių – ELISA tyrimo metodu, < 12 mėn. amžiaus šernų mėginiuose (p<0,05). 3,65 proc. daugiau teigiamų mėginių buvo randama plaučių audinio mėginiuose lyginant su kraujo serumo mėginiais, mėginius tiriant AT-nPGR metodu ir 4,06 proc. - realaus laiko TaqMan PGR (p<0,05). Apskaičiuota, kad nepriklausomai nuo naudoto metodo, teigiamų mėginių pasiskirstymas skirtingose Lietuvos apskrityse yra atsitiktinis ir statistiškai nereikšmingas (p>0,05). Taip pat apskaičiuota, kad metai neturėjo įtakos teigiamų mėginių skaičiui (p>0,05).
7
SUMMARY
Molecular characterization and prevalence of PRRSV in Lithuanian wild boar population
Arnoldas Pautienius Master’s Thesis
Scale and supplementary material: 58 pages, 7 tables, 7 figures and 1 scheme.
Purpose: To assess the prevalence of PRRSV Lithuania, using different molecular and serological
diagnostic methods.
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is currently found in almost all pig producing countries and considered as one of the most important and cost-greatest loss deadly virus in pig industry. While there are a number of publications that confirms PRRSV prevalence across a number of countries in the pig population, there is lack of information about the prevalence of the virus in wild boar (Sus scrofa), which are characterizated as potential natural reservoir of PRRSV. To fill this gap, different molecular (RT-nPCR and TaqMan PCR) and immunoassay diagnostic methods were used to investigate the lung tissue and serum samples of hunted wild boars (n=381) and estimate prevalence of PRRSV in Lithuanian territory.
Positive results were obtained in 16.58 % (95 % CI 12.14 to 22.23) specimen samples by RT-nPCR method and 18.48 % (95 % CI 13.80 to 24.30) by TaqMan real-time PCR. Specific antibodies were detected in 4.11 percent. (95 % CI from 1.30 to 10.39) of investigated samples. The largest proportion of positives results 19.10 % (95 % CI 12.19 to 28.57) and 21.34 % (95 % CI 14.04 to 31.03) were found in 12 - 24 months old boar samples (p <0.05) by RT-nPCR and TaqMan real-time PCR respectively. The lowest proportion of positive results 1.61 % (95 % CI 0.1 to 7.46) was found by ELISA method, in <12 months old boar samples (p <0.05). 3.65 % and 4.06 % more positive samples were obtained in lung tissue samples compared to serum samples by RT-nPCR and Real-time TaqMan PCR respectively (p <0.05). It is estimated that, the positive samples were distributed in different regions of Lithuania randomly (p> 0.05). It is also estimated that the year of survey did not affect the number of positive samples (p> 0.05).
8
ĮVADAS
Kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo virusas (KRKSV), priklausantis Arteriviridae šeimai, ir turintis 15 kb RNR genomą, šiuo metu aptinkamas beveik visose kiaules auginančiose šalyse ir yra laikomas vienu iš pačių svarbiausių bei ekonomiškai didžiausius nuostolius nešančių virusų kiaulininkystės industrijoje (1,2). Yra apskaičiuota, jog KRKS virusas kiekvienais metais padaro nuostolių vertų daugiau nei 0,5 mlrd. eurų - JAV ir apie 1,5 mlrd. eurų – Europoje (3). Virusas charakterizuojamas reprodukciniais sutrikimais paršavedėms, bei kvėpavimo organų ligomis įvairaus amžiaus kiaulėms ir ypač paršeliams (4).
Remiantis genetiniais viruso skirtumais, KRKSV buvo išskirtas į du genotipus: 1 tipo genotipą, daugiausiai aptinkamą Europoje, ir 2 tipo genotipą – daugiausiai aptinkamą Šiaurės Amerikoje ir Azijoje (5). Abu genotipai genetiškai skiriasi apie 40 proc., tačiau kartu skiriasi ir jų virulentiškumas bei kitos savybės. Šiuo metu abu genotipai yra išplitę ir randami visuose žemynuose (6).
Nors yra nemažai žinoma apie KRKSV paplitimą įvairių šalių kiaulių populiacijose, informacijos apie viruso paplitimą laukinių šernų (Sus scrofa) tarpe yra labai nedaug. Dažniausia KRKSV diagnostikos priemonė yra specifinių antikūnų prieš KRKSV nustatymas. Tiriant laukinių šernų mėginius, nustatytas 0,3 – 3,6 proc. serologinis paplitimas kai kuriose Europos šalyse (7-11), tačiau yra šalių, kuriose antikūnai prieš KRKSV nėra aptikti (12-15).
Vis dėlto, šis diagnostikos būdas turi trūkumų, nes negali identifikuoti skirtingų KRKSV genotipų padermių (16). Šiam tikslui naudojamas polimerazinės grandininės reakcijos metodas, tačiau tyrimų atliktų naudojant šį metodą yra dar mažiau – KRKSV buvo aptiktas Italijoje (17), Vokietijoje (18), prieš daugiau nei 5 metus – Lietuvoje (19).
Yra įrodymų, nors ir diskutuotinų, kad šernai yra KRKSV gamtinis rezervuaras (20). Šią hipotezę ypač sustiprina duomenys, rodantys, kad laukiniai šernai yra daugelio kitų virusų, pavojingų žmonėms ir kitiems gyvūnams, gamtinis rezervuaras ir atitinkamomis sąlygomis gali sąlygoti infekcijos perdavimą (20,21).
Atsižvelgiant į ligos svarbą, galimas grėsmes ir duomenų apie šio viruso paplitimą stygių, buvo atlikti tyrimai, kurie papildė žinias apie šią infekciją.
Darbo tikslas: įvertinti KRKSV paplitimą Lietuvoje, taikant skirtingus molekulinius ir serologinius
9
Darbo uždaviniai:
1. Tiesiogiai, taikant molekulinius metodus nustatyti KRKSV padermių paplitimą Lietuvos šernų populiacijoje.
2. AT-nPGR metodu panaudojant ORF1 srities oligonukleotidinius pradmenis nustatyti vyraujantį KRKSV padermių genotipą šernų populiacijoje.
3. AT-nPGR ir realaus laiko TaqMan PGR metodais nustatyti KRKSV paplitimą skirtingose šernų amžiaus grupėse.
4. Taikant molekulinius AT-nPGR ir realaus laiko TaqMan PGR metodus įvertinti KRKSV palitimą šernų populiacijoje visose Lietuvos apskrityse.
5. Pagal TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos teigiamų mėginių Ct vertės vidurkį įvertinti
KRKSV tiesioginio tyrimo rezultatutus šernų plaučių mėginiuose.
6. Įvertinti tų pačių sumedžiotų šernų paimtus plaučių ir kraujo serumo mėginius taikant skirtingas PGR modifikacijas - realaus laiko TaqMan PGR ar lizdinę AT-PGR.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Viruso struktūra
Kiaulių reprodukcinio kvėpavimo sindromo virusas (KRKSV) yra viengubos RNR(+) grandinės, 50-60 nm diametro, apvalkalėtasis virusas, priklausantis Nidovirales būriui, Arterividae šeimai, Arterivirus genčiai (23,24).
Viruso branduolį sudaro 20-30 nm nuklepkapsidė ir joje esantis 15,4 kb genomas (25), kuriame yra dešimt, šiuo metu žinomų, skirtingų, atvirų skaitymo rėmelių (ORF): ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5a, ORF5b, ORF6, ORF7 (1 pav.) (26,27). Kiekvienas iš jų yra aktyvus - savo sekose turi atitinkamus genus ir koduoja struktūrinius bei funkcinius viruso komponentus. ORF1a ir ORF1b srityse yra genai koduojantys viruso replikazę (RNR polimerazę) bei helikazę – funkcinius viruso komponentus, būtinus viruso replikacijai ląstelėje. Visų kitų atvirų skaitymo rėmelių srityse yra genai koduojantys struktūrinius viruso komponentus. ORF2a, ORF3, ORF4, ORF5 srityse - membranų glikoproteinus (atitinkamai glikoproteinus GP2a, GP3, GP4, bei GP5a - GP5b kompleksą), ORF2b ir ORF6 - membrarinius proteinus (atitinkamai proteinus E ir M), ORF7 – nukleokapsidės proteiną (nukleokapsidės proteiną N) (1,28,29).
ORF1a sritis yra išsidėsčiusi 5‘ RNR gale ir sudaro didžiausią dalį - apie 80% viso viruso genomo (30,31). Tai pati konservatyviausia viruso genomo dalis. Ši sritis koduoja fermentus reikalingus viruso replikacijai ląstelėje (31). ORF7 sritis išsidėsčiusi priešingame - 3’ gale, yra dar viena sritis išskiriama kaip labai konservatyvi (32). Proteinas N, kurį koduoja minėta sritis, yra tampriai susijęs su viruso genomu. Sąveikaudamas su viruso RNR jis formuoja nukleokapsidę (33,34). Šis proteinas, taip pat, yra pats imunogeniškiausias viruso proteinas bei pasižymi anksčiausiu ir stipriausiu imuniniu atsaku prieš KRRS virusą. Replikacijos metu, proteino N koncentracija daug kartų padidėja, o tai, savo ruožtu, skatina specifinių antikūnų gamybą (35).
Kitos viruso ORF sritys pasižymi daug didesniu genetiniu kintamumu – ypač ORF5 sritis koduojanti glikoproteiną GP5 , kuris kartu su ORF6 srities produktu - baltymu M, sudaro kompleksą (36) atliekantį viruso receptoriaus, prisijungiančio prie ląstelės – taikinio, funkciją (37,38).
Likusios sritys pasižymi vidutiniu genetiniu kintamumu, jų koduojami membranų glikoproteinai yra mažos molekulinės masės, išsidėstę viruso apvalkalo paviršiuje (39-41).
11
1 pav. KRKSV atviri skaitymo rėmeliai (ORF) ir jų koduojami viruso komponentai.
1.2. Viruso genotipai ir subtipai
1.2.1. Genotipai
Liga ir jos klinikiniai simptomai pirmą kartą buvo identifikuoti 1987 metais Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV) (42), 1989 metais tokie pat simptomai buvo užfiksuoti Japonijoje (43). 1990 metais apie ligą paskelbta Vokietijoje (44).
Viruso struktūra pirmą kartą buvo atskleista 1991 metais Olandijoje (45). Praėjus metams, tyrimų rezultatai patvirtinti JAV (46). Vos identifikavus struktūrą, virusas pradėtas nuodugniai tyrinėti molekuliniame lygmenyje, o praėjus metams po viruso atradimo buvo identifikuoti du jo genotipai: 1 ir 2 tipo (1 tipo genotipas dar vadinamas Europos genotipu, 2 – Šiaurės Amerikos genotipu) (47). Yra žinomi abiejų genotipų prototipai: Lelystad padermė (1 genotipo prototipas) ir VR-2332 padermė (2 genotipo prototipas) (48).
Kaip parodė tyrimų rezultatai, abu genotipai yra tik apytikriai 60% genetiškai tapatūs: šiuo metu žinoma, kad abu viruso genotipus sudaro 50 – 70 proc. vienodai išsidėsčiusių nukleotidų ir iki 80 proc. bendrų aminorūgščių (49). Didžiausius skirtumus lemia ORF5 sritis, kurios tapatumas tarp skirtingų genotipų yra ne didesnis nei 55 proc. Be to, būtent šios srities spartus kintamumas virusui padeda išvengti imuninės sistemos poveikio ir yra didelė kliūtis sukurti tinkamai veikiančią vakciną (6,50).
Abu genotipai skiriasi ir savo virulentiškumu (6). Yra žinoma, kad virulentiškumo skirtumus lemia vienos aminorūgšties delecija viruso genomo NSP2 regione (51).
Taip pat yra žinoma, kad genetiniai skirtumai tarp abiejų genotipų, dėl sparčiai besivystančių mutacijų, tendencingai didėja (52).
12
1.2.2. Subtipai
Genotipai nėra genetiškai homogeniški ir pasižymi įvairove. Tyrimais nustatyta, kad 1 genotipo KRRS virusas pasižymi daug didesne genetine įvairove, nei 2 genotipo. Šiuo metu yra išskiriami keturi 1 genomo subtipai: 1 subtipas (Lelystad), 2 subtipas, 3 subtipas (Lena) ir nesenai identifikuotas 4 subtipas (53-55). Nukleotidų sekos tarp skirtingų subtipų skiriasi apie 10 proc., tačiau dėl to skiriasi ir kai kurios virusų ypatybės (56). Pavyzdžiui 2 ir 3 subtipai pasižymi didesniu virulentiškumu nei 1 subtipas (57).
Šiaurės Amerikos genotipas (2 genotipas) nors genetiškai skirtomas į devynias linijas, tačiau nėra tiek heterogeniškas, kad būtų išskirtas į keletą subtipų, todėl iki šiol yra įvardijamas kaip turintis tik vieną subtipą (50).
Visi paminėti genetiniai ir molekuliniai skirtumai paverčia šio viruso diagnostiką dideliu iššūkiu (51).
1.3. KRKSV Paplitimas
Po to kai KRKS pirmą kartą buvo identifikuotas Jungtinėse Amerikos Valstijose (42), sindromo simptomai labai greitai buvo pastebėti ir kitose šalyse: Kanadoje (58) ir Filipinuose (59) 1987 m.; Tailande ir Japonijoje 1989 m. (43), Vokietijoje 1990 m (44). Apie ligą pranešus Vokietijoje, netrukus ligos simptomai buvo pastebėti daugelyje kitų Vakarų Europos šalių: Olandijoje, Danijoje, Belgijoje, Prancūzijoje, Ispanijoje (44). Šiuo metu virusas aptinkamas beveik visoje Europoje (2 pav.).
Per sąlyginai trumpą laiką 2 tipo genotipas išplito ne tik JAV teritorijoje, bet ir beveik visose Azijos ir Pietų Amerikos šalyse, kai tuo tarpu Europoje, buvo fiksuojamas tik 1 genotipas (60). Šiuo metu virusas, su retomis išimtimis, yra aptinkamas daugelyje pasaulio šalių. Be to, Amerikietiškasis genotipas (2 genotipas) yra aptinkamas ir Europoje, o Europietiškasis (1 genotipas) – JAV (6).
Nors yra žinoma, kad KRKSV paplitęs beveik visose kiaulininkyste užsiimančiose šalyse, informacijos apie viruso paplitimą laukinių šernų (Sus scrofa) tarpe yra labai nedaug. Dažniausia KRKSV diagnostikos priemonė yra specifinių antikūnų prieš KRKSV nustatymas. Tiriant laukinių šernų mėginius, serologinis paplitimas nustatytas tik kai kuriose Europos šalyse ar jų dalyse: Turkijoje (7), Prancūzijoje (8), Ispanijoje (Katalonijoje) (9), Vokietijoje (10), Italijoje (61), centrinėje Ispanijoje (11). Visose paminėtose šalyse serologinis paplitimas sąlyginai mažas ir siekia iki 3,6 proc. išskyrus Italiją, kurioje antikūnai prieš KRKS aptikti 37,8 proc. tirtųjų mėginių.
Vis dėlto, esama ir šalių ar jų dalių, kuriose antikūnai prieš KRKSV nebuvo aptikti: Rusijoje (12), Slovėnijoje (13), pietinėje Ispanijos dalyje (14), Kroatijoje (15). Dar kitose šalyse tyrimai niekada nėra vykdyti. Polimerazinės grandininės reakcijos metodas taip puikiai tinka šio viruso diagnostikai,
13 tačiau tyrimų atliktų naudojant šį metodą yra dar mažiau – KRKSV buvo aptiktas Italijoje (17), Vokietijoje (18), prieš daugiau nei 5 metus – Lietuvoje (19).
Subtipų įvairovė šiuo metu pati didžiausia yra Rytų Europoje: Rusijoje, Baltarusijoje, dalyje Lenkijos, Lietuvoje. Remiantis turimais duomenimis Lietuvoje, Baltarusijoje, Rusijoje vyrauja 2 subtipas, Baltarusijoje gausiausiai aptinkamas 3 subtipas. Vis dėlto, šiame regione aptinkami visi keturi Europietiškojo (1-ojo) genotipo subtipai, tuo tarpu Vakarų Europoje visuotinai aptinkamas tik 1 Europiešikojo genotipo subtipas (56).
2 pav. Kiaulių resprodukcinio kvėpavimo sindromo viruso paplitimas Europoje. Parengta pagal OIE
14
1.4. Viruso perdavimas ir užsikrėtimas
Nustatyta, jog inkubacinis kiaulių reprodukcinio kvėpavimo sindromo periodas tęsiasi 4 – 8 dienas, tačiau gali užsitęsti ir iki 37 d. Be to, klinikiniai požymiai pasireiškia ne visada – tai vadinama virusinė tolerancija. Toks reiškinys sudėtingas, valdomas keliolikos genų, bei imuninės sistemos. Be to, tam turi įtakos keliolika kitų veiksnių: amžius, fiziologinė būklė, stresas. Vis dėlto, nors ir nėra pastebimų klinikinių požymių, tokiomis aplinkybėmis virusas replikuojasi, o kiaulė ar šernas tampa jo platintoju (110).
Užsikrėtusios kiaulės bei šernai išskiria virusą 2 – 6 savaites, su įvairiais sekretais ir ekskretais: seilėmis, šlapimu, sperma ir pienu (laktacijos metu) (63,64). Žinomas ir netiesioginis perdavimo kelias – per avalynę ir darbo drabužius (65,66), vabzdžius: uodus ir muses (67), transporto priemones ir aerozolius (68,39). Yra žinoma, kad aplink didelį kiaulių tankį turinčius ūkius, KRKS virusas aptinkamas ore (70). Ne mažiau svarbų vaidmenį, tarp visų KRKSV perdavimo veiksnių vaidina kiaulių ar šernų populiacijos tankis – jam esant dideliam, santykinė rizika perduoti virusą taip pat didėja (71). Virusas tiesioginio kontakto būdu, gali būti perduodamas 14 - 22 savaites po užsikrėtimo (72,73).
Plitimui taip pat nemažą įtaką turi paties viruso savybės. Jis yra sąlyginai atsparus aplinkos poveikiui ir stabilus -70 °C temperatūroje (74). Pavyzdžiui užšaldytoje patologinėje medžiagoje išlieka keletą metų (75), giliai užšaldytoje mėsoje – trejus metus (76). 4 °C laipsnių temperatūroje išlieka gyvybingas apie mėnesį, tačiau sumažėjo jo virulentiškumas. 37 °C temperatūroje virusas degraduoja tik per 48 valandas, aukštesnėje temperatūroje – greičiau. Virulentiškumą praranda mažiausiai 6-20 minučių palaikytas 56 °C temperatūroje (74,77). Virusas sąlyginai neatsparus ph pokyčiams – virulentiškumą praranda esant mažiau 6 ir daugiau kaip 7,5 ph (74).
1.5. Imuninis atsakas ir klinikiniai požymiai
Nustatyta, jog KRKSV infekcijos metu padaugėja uždegiminių citokinų gamyba: interferonų (INF-α, 15 INF-β), TNF-α ir interleukino-1 (78,79). Būtent šie citokinai yra pirmoji nespecifinė gynybinė apsauga prieš KRKS viruso infekciją (80). Taip pat yra žinoma, kad šios infekcijos metu padaugėja kitų citokinų: IL-1β, IL-8 ir INF-g gamyba (81).
Neutralizuojantys antikūnai, KRKSV infekcijos metu, pasirodo vėliau nei įprasta kitoms infekcijoms, nes yra slopinami mechanizmai skatinantys antikūnų susidarymą (82). Slopinama INF-β gamyba (slopinamas jo aktyvatoriaus išskyrimas), TNF-α gamyba (83) bei užkertamas tarpinis TLR-3 signalo perdavimas (82).
15 Citokinų produkcijos slopinimas nespecifinio imuniteto antigenus pristatančiose ląstelėse lemia ne tik uždelstą neutralizuojančių antikūnų susidarymą, tačiau ir silpnesnį ląstelinį imuninį atsaką (84). Vis dėlto, net is silpnesnis ląstelinis atsakas šiuo atveju yra pranašesnis, nes veikia prieš visus struktūrinius viruso komponentus, koduojamus ORF 2 – 7 srityse imtinai, tačiau turi ir trūkumą - pasireiškia tik antrą, o dažnai daug vėlesnę infekcijos savaitę (85,86).
Pagrindinis KRKSV taikinys yra plaučių makrofagai – juose virusas replikuojasi. Susikaupus didelei viruso koncentracijai ląstelėje, ši suardoma. Per pirmą parą nuo užsikrėtimo virusas jau būna randamas ir kraujyje bei limfiniuose mazguose (84).
Kiaulių sergamumas siekia 50 - 100 proc. (87). Patys jautriausi – žindukliai paršeliai, kurių gaištamumas gali siekti 100 proc. Vyresnių kiaulių gaištamumas mažesnis – nujunkintų paršelių apie 70 proc., suaugusių kiaulių – 20 proc. Apie 40 proc. visų paršingų ir KRKSV užsikrėtusių kiaulių įvyksta abortai. Gaištama dėl kvėpavimo organų ligų, kurios ypač tampriai siejamos su antrinėmis infekcijomis (88). Nenugaišę paršeliai auga labai lėtai, ir dėl to taip pat patiriami dideli nuostoliai (87). Be to, klinikiniai požymiai priklauso ir nuo vyraujančio viruso subtipo. Pavyzdžiui Vakarų Europos šalyse KRKSV daugiausiai sukelia reprodukcinius sutrikimus paršavedėms (89), tuo tarpu Rytų Europoje – tiek kvėpavimo tiek reprodukcinius sutrikimus. Ypač pavojingas yra trečias pirmojo genotipo subtipas, aptiktas Baltarusijoje. Jis siejamas su abejais – reprodukciniais ir kvėpavimo sistemos sutrikimais ir pasižymi itin dideliu virulentiškumu (53).
1.6. KRKSV diagnostikos ypatybės
Greita ir savalaikė KRKS viruso diagnostika yra svarbi, nes padeda vykdyti infekcijos kontrolę bei leidžia išvengti viruso plitimo (36). Šiuo metu KRKSV diagnostika paremta keletu skirtingų tyrimų metodų: serologiniais tyrimais (imunoperoksidazės, netiesioginės imunofluorescencijos, imunofermentinės analizės viruso neultralizacijos reakcijos (90) metodais) viruso izoliavimu, įvairių modifikacijų polimerazine grandinine reakcija (91).
Vis dėlto, reiškiamas susirūpinimas dėl serologinių tyrimo metodų jautrumo (92), be to, taikant šį metodą, antikūnai kartais nėra aptinkami praėjus ilgesniam laikui po infekcijos (3 pav.) ir sumažėjus jų titrui (93). Patys svarbiausi diagnostine prasme ORF7 srities koduojami proteinai, nes jie vieninteliai iš visų struktūrinių viruso komponentų naudojami ELISA testuose nustatyti KRKSV. Visi komerciniai ELISA rinkiniai yra paremti ORF7 srities proteinu, priklausančiu pirmo arba antro KRKSV genotipui (94).
16
3 pav. Viruso diagnostikos priklausomybė nuo laiko, taikant skirtingus diagnostikos metodus.
Parengta naudojantis Langenhorst (2012) duomenimis (95).
Dar vienas tradicinis KRKS viruso diagnostikos metodas yra viruso izoliavimas ląstelių kultūrose. Tačiau tai lėtas – iki 14 dienų trunkantis, daug išteklių ir laiko reikalaujantis metodas (96). Be to, susiduriama su metodo jautrumo problemomis (97). Izoliavimui ir gausinimui yra naudojamos pirminės PAM (paršelių plaučių makrofagai) ląstelės (98) gaunamos iš jaunesnių nei 8 savaičių amžiaus kiaulių (99) ir MARC – 145 linijos ląstelių kultūra (beždžionių inkstų navikinės ląstelės) (98). PAM ląstelės yra pagrindinis ir pats jautrausias viruso replikacijos biologinis taikinys, tačiau viruso izoliavimas yra įmanomas ir kitokiose ląstelėse: gimdos gleivinės endotelio (99), kiaulių kraujo monocituose (100), mikroglijos ląstelėse (101).
Įvairių modifikacijų polimerazinės grandininės reakcijos metodas yra pats specifiškiausias, labai jautrus ir sąlyginai greitas diagnostikos metodas (102). Dauguma šio metodo pradmenų yra nutaikyti į pačią imunogeniškiausią KRKS viruso struktūrą - proteiną N (103). Vis dėlto, susiduriama su tam tikrais iššūkiais - taikant atvirkštinės transkriptazės polimerazinės grandininės reakcijos metodą kartais mėginiai kontaminuojami, o tai gali iškreipti tyrimų rezultatus (91).
Realaus laiko TaqMan polimerazinė grandininė reakcija yra dar greitėsnis ir ypač patogus diagnostikos būdas, pirmą kartą pritaikytas aptikti abu KRKSV genotipus 2001 metais (104). Tačiau
17 kaip ir prieš tai minėtu atveju, neapsieinama be metodo trūkumų - yra žinoma, kad kai kurios mutacijos paveikia ORF7 srities pradmenų prisijungimo vietas, todėl gali būti gaunami klaidingai neigiami rezultatai (56).
Apie oligonukleotidinių pradmenų pasirinkimą tiriant iš šernų paimtus mėginius, informacijos beveik nėra, nes absoliuti dauguma pradmenų yra išbandyti tik su kiaulių mėginiais arba ląstelių kultūromis. Naudojamasi Revilla-Fernandez (105), Stadejek (55) ir Reiner (106) išbandytomis ir aprašytomis pradmenų sekomis.
18
2. TYRIMŲ MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1. Tyrimų vieta
Tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Veterinarijos akademijos Anatomijos ir fiziologijos katedros Imunologijos laboratorijoje, LSMU Mikrobiologijos ir virusologijos instituto virusologinių tyrimų laboratorijoje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto (NMVRVI) Serologinių tyrimų skyriuje 2014 – 2016 metais.
19
1 schema. KRKSV tyrimų etapai.
Mėginiai
NMVRVI tirti sumedžiotų šernų (n=170) mėginiai
LSMU VA tirti sumedžiotų šernų (n=211) mėginiai
Kraujo serumo mėginiai (n=170) Plaučių mėginiai (n=211) Kraujo serumo mėginiai (n=201) RNR medžiagos ekstrakcija Atvirkštinė transkripcija - komplementarios DNR sintezė Komerciniai ELISA testai
Realaus laiko TaqMan PGR Lizdinė atvirkštinės transkripcijos PGR PGR vizualizacija elektroforezės gelyje Statistinė analizė
20
2.2. Laukinių šernų mėginiai
Iš viso buvo surinkti ir molekuliniais metodais ištirti 211-kos laukinių sumedžiotų šernų mėginiai. Šernai buvo medžiojami ir mėginiai renkami 2014 – 2016 metais, leidimą medžioti turinčių asmenų, visose Lietuvos apskrityse, medžioklės sezono metu.
Iš kiekvieno šerno, 2-3 valandų bėgyje po sumedžiojimo buvo imami plaučių audinio (n=211) ir kraujo serumo (n=201) mėginiai ir laikantis biologinės saugos reikalavimų, sudėti į sandarią tarą: plastikinius maišelius arba mėgintuvėlius, ir prieš transportavimą laikyti užšaldyti -20 °C temperatūroje.
Sumedžiotiems laukiniams šernams, medžioklės aikštelėse buvo nustatytos amžiaus grupės pagal dantų išaugimo laipsnį bei svorį ir šernai suskirstyti į tris amžiaus grupes: iki 12 mėn. (n=42), 12 – 24 mėn. (n=89) ir daugiau kaip 24 mėn. (n=80). Mėginiai su lydraščio duomenimis buvo pristatyti į LSMU VA Anatomijos ir fiziologijos katedros Imunologijos laboratoriją.
Serologiniai tyrimai buvo atliekami naudojant NMVRVI surinktus mėginius.
2.3. RNR medžiagos ekstrakcija
RNR buvo išskiriama vadovaujantis ,,GeneJET RNA Purification Kit“ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) instrukcijomis.
200 µl kraujo serumo arba 30-50 mg tiriamojo mėginio – plaučių skutenų, prieš tai pocelianiniu grūstuvu homogenizavus iki vienalytės masės ir sudėjus į sterilius 3 ml mėgintuvėlius, veikiami 300 µl lizavimo buferio tirpalu su 6 µl beta-merkaptoetanolio. Kaip reikalaujama instrukcijoje – mėginiai 10 sekundžių purtomi „Vortex“ purtykle, tada užpilama 600 µl reakcijos tirpalo, susidedančio iš 590 µl TE buferio ir 10 µl proteinazės K. Mėginiai pakartotinai purtomi „Vortex“ purtykle 10 sekundžių ir 10 minučių inkubuojami kambario temperatūroje. Praėjus inkubacijos periodui, mėginiai centrifuguojami 12 tūkst. apsisukimų per minutę greičiu, 10 minučių. Centrifugavus, supernatantas (paviršinė frakcija) mikropipete nusiurbiamas, ir perkeliamas į naujus mėgintuvėlius užpildytus 450 µl etanolio (96 proc.) kiekviename, ir pipetuojant išmaišoma. 700 µl mėgintuvėlio turinio perkeliama į specialias rinkinio kolonėles su membrana imobilizuojančia RNR medžiagą. Centrifuguojama 1 minutę, 12 tūkst. apsisukimų per minutę greičiu. Kolonėles dugne likęs skystis nupilamas ir procedūra kartojama. Vadovaujantis instrukcija, į kolonėlę įpilama 700 µl specialaus plovimo buferio Nr.1 ir centrifuguojama anksčiau paminėtu režimu. Procedūra kartojama, tačiau su mažesniu plovimo buferio kiekiu – antrą kartą pilama 600 µl plovimo buferio Nr.1. Plaunama plovimo buferiu Nr.2 – į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama 250 µl buferio ir centrifuguojama 2 minutes, 12 tūkst. apsisukimų per minutę
21 greičiu. Po kiekvieno plovimo, kolonėlės dugne nusėdęs skystis nupilamas. Kolonėlės membrana išdžiovinama papildomai centrifuguojant 1 minutę 12 tūkst. apsisukimų per minutę greičiu. Kolonėlių viršutinė dalis perkeliama į naujus, sterilius mėgintuvėlius. Tiesiogiai į kiekvienos kolonėlės membranos vidurį su pipete įpilama 100 µl vandens be nukleazių ir centrifuguojama 1 minutę, 12 tūkst. apsisukimų per minutę greičiu.
Gauti išgryninti RNR mėginiai laikomi užšaldyti, -20 °C temperatūroje.
2.4 Atvirkštinės transkripcijos lizdinė polimerazinė grandininė reakcija
2.4.1. Atvirkštinė transkripcija
Atvirkštinės transkripcijos reakcijos mišinys buvo gamintas laikantis anksčiau aprašytomis metodikomis, parenkant Reiner‘io pasiūlytus ORF 1-1, ORF 1-2 pradmenis.
Pradžios oligonukleotidinių pradmenų seka: 5’-CAACCTCCTGTATGAACTTGC-3’; Pabaigos oligonukleotidinių pradmenų seka: 5’-AGGTCCTCGAACTTGAGCTG-3’. Gaunamo produkto dydis lygus 258 bp.
5 µl paruoštos, išgrynintos RNR maišoma su 1 µl oligonukleotidinių pradmenų (po 0,5 µl pradžios ir pabaigos pradmenų ) (Thermo Fisher Scientific), 2 µl deoksinukleotidų mišinio (Thermo Fisher Scientific), 4 µl 5x reakcijos buferio (Thermo Fisher Scientific), 6,5 µl išgryninto vandens be nukleazių (Thermo Fisher Scientific), 0,5 µl (20 U) ribonukleazių inhibitoriaus „RiboLock“ (Thermo Fisher Scientific) ir 1 µl (200 U) atvirkštinės transkriptazės „Revert Aid“ (Thermo Fisher Scientific). Mėginiai amplifikuoti „Mastercycler personal“ (Eppendorf, Hamburg) termocikleryje. Amplifikavimo temperatūrinis režimas pateiktas 1 lentelėje.
Gautas produktas - komplementarios viengrandės DNR (kDNR) medžiaga, iki panaudojimo lizdinėje polimerazės grandinės reakcijoje bei realaus laiko TaqMan polimerazinėje grandinėje reakcijoje, laikoma šaldytuve +10°C temperatūroje.
1 lentelė. Atvirkštinės transkripcijos amplifikavimo temperatūrinis režimas.
Etapai Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
Atvirkštinė transkripcija 42 °C 30 min 1
Pradinė denatūracija 95 °C 5 min 1
Denatūracija 94 °C 1 min 40
Hibridinimas 55 °C 1 min 40
DNR sintezė 72 °C 1 min 30 s 40
22
2.4.2. Lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazinė grandininė reakcija
Lizdinės atvirkštinės transkripcijos polimerazinės grandininės reakcijos mišinys buvo ruošiamas naudojant 2,5 µl prieš tai aprašytos, atvirkštinės transkripcijos reakcijos metu gautos komplementarios DNR (kDNR) medžiagos, bei: 1 µl deoksinukleotidų mišinio (Thermo Fisher Scientific), 13,8 µl išgryninto vandens be nukleazių (Thermo Fisher Scientific), 0,5 µl Taq DNR polimerazės (Thermo Fisher Scientific), 2,2 µl 4x Dream Taq polimerazės reakcijos buferio (Thermo Fisher Scientific), 4 µl MgCl2 2,5 nM (Thermo Fisher Scientific) ir 1 µl oligonukleotidinių pradmenų (po 0,5 µl pradžios ir
pabaigos pradmenų, 20 pmol/ µl koncentracijos) (Thermo Fisher Scientific). Naudoti pradmenys 1 KRKSV genotipui aptikti:
Pradžios - 5’-CTGTATGAACTTGCAGCAGGA-3’ Pabaigos - 5’-CGACAATACCATGTGCTG-3’. Gaunamo produkto dydis – 186 bp.
Naudoti pradmenys 2 KRKSV genotipui aptikti: Pradžios - 5’-GGCGCAGTGACTAAGAGA-3’ Pabaigos - 5’-GTAACTGAACACCATATGCTG-3’ Gaunamo produkto dydis – 108 bp.
Mėginiai amplifikuoti „Mastercycler personal“ (Eppendorf, Hamburg) termocikleryje. Amplifikavimo temperatūrinis režimas pateiktas 2 lentelėje.
2 lentelė. Lizdinės atvirkštinės transkripcijos polimerazinės grandininės reakcijos amplifikavimo
temperatūrinis režimas.
Etapai Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 95 °C 3 min 1
Denatūracija 95 °C 30 s 40
Hibridinimas 55 °C 30 s 40
DNR sintezė 72 °C 1 min 40
Galutinis išlaikymas 72 °C 10 min 1
2.4.3. Lizdinės AT-PGR rezultatų vizualizacija
Siekiant nustatyti lizdinės atvirkštinės transkripcijos polimerazinės grandininės reakcijos produktų dydį, buvo atliekama elektroforezė.
23 Buvo ruošiamas 1,8 proc. agarozės gelis, kurį sudaro: agarozė (Top vision Agarose, Thermo Fisher Scientific), 1xTBE buferis (Thermo Fisher Scientific), 1 µl/ml etidžio bromidas (Life Technologies).
Prieš paleidžiant elektroforezę, į agarozės gelį, šalia patalpintų tiriamųjų mėginių, įdededamas molekulinės masės žymeklis „GeneRuler Range DNA Ladder“, bei teigiama ir neigiama kontrolė. Teigiama kontrolė – Lelystad viruso padermė gauta iš referentinės laboratorijos. Neigiama kontrolė – reakcijos mišinys be tiriamųjų nukleorūgščių.
Elektroforezė atliekama aparate „Consort EV243“ (Sigma) 1x TBE buferyje, esant 120 V įtampos elektros srovei, 67 minutes.
Rezultatai buvo vertinami, gelį po elektroforezės apšvietus UV lempa „UV T-20M“ (Herolab), pagal susidariusio produkto molekulinės masės dydį ir fluorescencijos signalo intensyvumą į: silpnai teigiamą (+), teigiamą (++), stipriai teigiamą (+++) bei neigiamą (-).
2.5. Realaus laiko TaqMan polimerazinė grandininė reakcija
Relaus laiko TaqMan reakcijos mišinys buvo ruošiamas vadovaujantis gamintojo nurodymais: 2,5 µl turimos kDNR įdedama į reakcijos mišinį susidedantį iš: 8 µl išgryninto vandens be nukleazių (Thermo Fisher Scientific), 12,5 µl reakcijos mišinio „TaqMan Universal Master Mix II UNG“ (Applied Biosystems, Foster), 1 µl zondo (10 µM) ir 1 µl x 2 pradžios ir pabaigos ORF srities pradmenų.
Pradmenų sekos:
Pradžios - 5’-GTAGAAAGTGCTGCAGGTCTCCA-3’ Pabaigos - 5’-CACGAGGCTCCGAAGTCCT-3’ Zondo seka:
5’-6FAM-CTGTGAGAAAGCCCGGAC-NFQ-MGB-3’.
Mėginiai aplifikuoti „Mastercycler Realplex S“ termocikleryje. Amplifikavimo temperatūrinis režimas pateiktas 3 lentelėje.
Reakcijos rezultatai vertinami pagal Ct reikšmę – slenkstinį ciklą, pasireiškiantį suintensyvėjusiu
24
3 lentelė. Realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos amplifikacijos temperatūrinis
režimas.
Etapai Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 95 °C 10 min 1
Denatūracija 95 °C 30 s 40
Hibridinimas 60 °C 30 s 40
Išlaikymas 72 °C 30 s 40
2.6. Specifinių antikūnų prieš KRKSV nustatymas
Specifiniai KRRSV antikūnai buvo nustatinėjami netiesioginės imunofermentinės analizės metodais. Tyrimams buvo naudojami komerciniai rinkiniai: IDEXX PRRS HerdChek, IDEXX PRRS X3 ir INGEZIM PRRS Europa. Rinkiniai validuojami atrinktais kontroliniais arba iš referentinių laboratorijų gautais serumų mėginiais su specifiniais antikūnais.
Tyrimai buvo atliekami vadovaujantis detaliomis gamintojų metodikomis: tiriamieji kraujo serumo mėginiai, pagal rinkinio gamintojo nurodymus, atitinkamu laipsniu skiedžiami mėginių skiedimo tirpalu, išpilstomi į plokštelės duobutes po 100 µl, priklausomai nuo rinkinio inkstrukcijos, inkubuojami 30 - 60 min 37 °C temperatūroje. Po inkubacijos plokštelės plaunamos 3-5 kartus specialiu plovimo buferiu, po to, veikiamos konjugatu ir pakartotinai inkubuojamos. Praėjus inkubacijos laikui, vėl plaunamos plovimo buferiniu tirpalu bei veikiamos 100 µl substrato tirpalu. Inkubuojama 15 min. Reakcija sustabdoma, specialiu reakcijos stabdymo tirpalu. Rezultatas vertinamas spektrofotometru – pagal tiriamojo kraujo serumo ir žinomo teigiamo kontrolinio mėginio optinio tankio santykį. Mėginiai laikomi teigiamais, jei teigiamo serumo optinio tankio ir teigiamo kontrolinio mėginio optinio tankio santykis >0,4 ir neigiamais, jei ≤0,4.
2.7. Statistinė duomenų analizė
Atlikta aprašomoji statistinė duomenų analizė ir duomenys grafiškai pateikti naudojant Microsoft Office Excel (2013) programą. Buvo įvertintos duomenų sklaidos charakteristikos: minimali ir maksimali reikšmė; duomenų padėties charakteritikos: aritmetinis vidurkis. Duomenų skirtumams tarp nepriklausomų imčių įvertinti naudotas t-testas, tarp kokybinių kintamųjų veiksnių – chi-kvadrato testas. Apskaičiuoti pasikliautiniai intervalai. Duomenys laikyti patikimais, kai p<0,05.
25
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. Lizdinės AT-PGR rezultatai
Sumedžiotų šernų plaučių mėginius (n=211) ištyrus lizdinės atvirkštinės transkriptazės polimerazinės grandininės reakcijos metodu, pasirinkus ORF1 srities oligonukleotidinius pradmenis PRRSV1 – PRRSV2, buvo gauta 16,58 proc. teigiamų mėginių.
Ištyrus iš tų pačių sumedžiotų šernų paimtus plaučių ir kraujo serumo mėginius (4 lentelė), 3,65 proc. daugiau teigiamų mėginių buvo randama plaučių mėginiuose (p<0,05).
4 lentelė. Teigiamų plaučių ir kraujo serumo tiriamųjų mėginių dalis taikant AT-nPGR ir realaus laiko
TaqMan PGR tyrimo metodus.
Šernų mėginiai
Tirtų mėginių
sk.
AT-nPGR Realaus laiko TaqMan PGR Teigiamų mėg. sk. (proc.) 95 proc. PI Teigiamų mėg. sk. (proc.) 95 proc. PI Plaučių aud. mėg. 211 35 (16,58 proc.) 11,56 – 21,60 39 (18,48 proc.) 13,24 – 23,72 Serumo mėg. 201 26 (12,93 proc.) 8,29 – 17,57 29 (14,42 proc.) 9,56 – 19,28 Viso 412 61 (14,80 proc.) 11,37 – 18,23 68 (16,50 proc.) 12,92 – 20,08
Teigiami mėginiai buvo randami visose sumedžiotų šernų amžiaus grupėse, tačiau didžiausia teigiamų mėginių procentinė dalis nustatyta 12 – 24 mėn. amžiaus šernų mėginiuose (5 lentelė) – tai 0,15 karto daugiau nei >24 mėn. šernų mėginiuose ir 0,38 karto daugiau nei <12 mėn. šernų mėginiuose.
Tarp <12 mėn. šernų mėginių, teigiamų mėginių buvo randama 0,3 karto mažiau, lyginant su 12 – 24 mėn. ir >24 mėn. amžiaus šernų mėginiais (p<0,05).
Teigiamų mėginių skaičius, lyginant 2015 m. ir 2016 m. tirtus mėginius statistiškai nereikšmingas (p>0,05).
Pasirinkus ORF1 srities PRRSV NA1 - PRRSV NA2 oligonukleotidinius pradmenis, skirtus aptikti 2 tipo KRKSV genotipą, neaptiktas nė vienas teigiamas mėginys.
26
5 lentelė. Teigiamų mėginių pasiskirstymas taikant AT-nPGR ir realaus laiko TaqMan PGR tyrimo
metodus, priklausomai nuo sumedžiotų šernų amžiaus.
Šernų amžius
Tirtų mėginių
sk.
AT-nPGR Realaus laiko TaqMan PGR Teigiamų mėg. sk. (proc.) 95 proc. PI Teigiamų mėg. sk. (proc.) 95 proc. PI < 12 mėn. 42 5 (11,90 proc.) 4,73 - 25,46 5 (11,90 proc.) 4,73 - 25,46 12 - 24 mėn. 89 17 (19,10 proc.) 12,19 - 28,57 19 (21,34 proc.) 14,04 - 31,03 > 24 mėn. 80 13 (16,25 proc.) 9,61 - 25,98 15 (18,75 proc.) 11,59 - 28,77 Viso 211 35 (16,58 proc.) 12,14 - 22,23 39 (18,48 proc.) 13,80 - 24,30
Daugiausiai teigiamų mėginių – 21,7%, buvo aptikta Klaipėdos apskrityje (5 pav.). Apskaičiuota, kad teigiamų mėginių pasiskirstymas skirtingose Lietuvos apskrityse yra atsitiktinis ir statistiškai nereikšmingas (p>0,05).
6 lentelė. Teigiamų mėginių skaičius, priklausomai nuo tyrimo metų, taikant AT-nPGR ir realaus laiko
TaqMan PGR tyrimo metodus.
Metai
Tirtų mėginių
sk.
AT-nPGR Realaus laiko TaqMan PGR Teigiamų mėg. sk. (proc.) 95 proc. PI Teigiamų mėg. sk. (proc.) 95 proc. PI 2015 118 20 (16,94 proc.) 11,17 - 24,81 23 (19,49 proc.) 13,29 - 27,62 2016 93 15 (16,12 proc.) 9,91 - 25,04 16 (17,20 proc.) 10,77 - 26,24 Viso 211 35 (16,58 proc.) 12,14 - 22,23 39 (18,48 proc.) 13,80 - 24,30
27
3.2. Realaus laiko TaqMan PGR rezultatai
Plaučių mėginių pavyzdžius (n=211) ištyrus realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos metodu, buvo gauta 18,48 proc. teigiamų mėginių. Teigiamų mėginių (4 pav.) Ct vertės
vidurkis buvo lygus 32,73 ciklui. Labai stiprus signalas (Ct = < 28) buvo nustatytas 19,8 proc.,
vidutinis (Ct = 28 – 32) – 34,3 proc., silpnas (Ct = 32 – 36) – 46,9 proc. tirtųjų mėginių.
Ištyrus iš tų pačių sumedžiotų šernų paimtus plaučių ir kraujo serumo mėginius, 4,06 proc. daugiau teigiamų mėginių buvo randama plaučių mėginiuose (p<0,05). Teigiamų mėginių skaičiaus skirtumai tarp tos pačios rūšies mėginių (plaučių, arba kraujo serumo mėginių), taikant skirtingas PGR modifikacijas - realaus laiko TaqMan PGR ar lizdinę AT-PGR, yra statistiškai nereikšmingi (p>0,05).
Analogiškai, kaip ir pritaikius prieš tai aptartą tyrimų metodą, tiriant realaus laiko TaqMan PGR, teigiami mėginiai buvo randami visose sumedžiotų šernų amžiaus grupėse, tačiau 0,4 karto daugiau teigiamų mėginių buvo randama 12 – 24 mėn. ir >24 mėn. šernų mėginiuose, lyginant su <12 mėn. šernais (p<0,05).
Teigiamų mėginių skaičiaus skirtumai, taikant realaus laiko TaqMan PGR, priklausomai nuo tyrimo metų, yra statistiškai nereikšmingi (p>0,05).
28
5 pav. AT-nPGR ir realaus laiko TaqMan PGR tyrimo metodais gautų teigiamų mėginių
pasiskirstymas po Lietuvos apskritis.
3.3. Specifinių antikūnų prieš KRKSV tyrimų rezultatai
Sumedžiotų šernų kraujo serumo mėginius ištyrus komerciniais netiesioginės imunofermentinės analizės rinkiniais, pagrįstais ELISA metodu, specifiniai antikūnai buvo nustatyti 4,11 proc. tirtųjų mėginių.
Nors teigiami mėginiai buvo randami visose tirtųjų sumedžiotų šernų amžiaus grupėse (7 lentelė), skirtingai nei tiriant polimerazės grandininės reakcijos metodais, tiriant ELISA tyrimų metodu, daugiausiai teigiamų mėginių buvo aptikta > 24 mėn. amžiaus šernų mėginiuose – 3,1 karto daugiau nei 12 - 24 mėn. amžiaus ir 4,6 karto daugiau nei < 12 mėn. šernų mėginiuose (p>0,05).
29
7 lentelė. Teigiamų mėginių pasiskirstymas taikant ELISA tyrimo metodą, priklausomai nuo
sumedžiotų šernų amžiaus.
KRKSV antikūnai kraujo serume
Šernų amžius Tirtų mėginių sk. Teigiamų mėg. sk. (proc.) 95 proc. PI
< 12 mėn. 62 1 (1,61 proc.) 0,1 - 7,46
12 - 24 mėn. 42 1 (2,38 proc.) 0,1 - 13,44
> 24 mėn. 67 5 (7,46 proc.) 2,86 - 16,68
Viso 170 7 (4,11 proc.) 1,30 - 10,39
2015 metais buvo tirti 98 mėginiai iš kurių nustatyti 4 teigiami (4,08 proc.) (95 proc. PI 1,27 - 10,36). 2016 metais iš 72 tirtųjų mėginių nustatyti 3 teigiami (4,16 proc.) (95 proc. PI 0,94 - 12,03). Apskaičiuota, jog tyrimo metai neturėjo įtakos teigiamų mėginių skaičiui (p>0,05).
30
3.4. Taikytų KRKS diagnostikos metodų palyginimas
Taikant realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodą, tarp visų 2015 metais tirtų mėginių buvo nustatyta 2,55 proc. daugiau teigiamų mėginių, lyginant su atvirkštinės transkriptazės lizdinės polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodu gautų teigiamų mėginių skaičiumi. Analogiškai, realaus laiko TaqMan PGR metodu, buvo nustatyta 1,08 proc. daugiau teigiamų mėginių 2016 metais tirtuose mėginiuose.
Nors statistiškai didžiausias teigiamų mėginių procentas (6 pav.) buvo gautas taikant realaus laiko TaqMan PGR tyrimo metodą, palyginus šiuo metodu gautų teigiamų mėginių skaičių su AT-nPGR tyrimo metodu gautų teigiamų mėginių skaičiumi, statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas (p>0,05).
Taikant ELISA tyrimų metodą 2015 metais nustatyta 4,16 karto, o 2016 metais – 3,87 karto mažiau teigiamų mėginių lyginant su su atvirkštinės transkriptazės lizdinės polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodu gautų teigiamų mėginių skaičiumi (p<0,05). Lyginant ELISA metodu gautų teigiamų mėginių skaičių su realaus laiko TaqMan PGR metodu gautų teigiamų mėginių skaičiumi, 2015 metais buvo gauta 4,77 karto, 2016 metais – 4,13 karto mažiau teigiamų mėginių (p<0,05).
6 pav. AT-nPGR, realaus laiko TaqMan PGR ir ELISA tyrimo metodais gautų KRKS teigiamų
mėginių procentinės dalies palyginimas priklausomai nuo tyrimo metų.
16.94 19.49 4.08 16.12 17.2 4.16 0 5 10 15 20 25
AT-nPGR Realaus laiko TaqMan PGR ELISA
Tei gi am ų m ė gi n ių p ro ce n tas Metodas 2015 2016
31 Nors visose sumedžiotų šernų amžiaus grupėse statistiškai didžiausi teigiamų mėginių procentai buvo gauti mėginius ištyrus realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodu (7 pav.) , tačiau palyginus šiuo metodu gautų teigiamų mėginių skaičių su atvirkštinės transkriptazės lizdinės polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodu gautų teigiamų mėginių skaičiumi, statistiškai reikšmingi skirtumai taikant šiuos metodus, nenustatyti nė vienoje amžiaus grupėje (p>0,05), o < 12 mėn. šernų mėginiuose taikant minėtus tyrimo metodus, gautas vienodas teigiamų mėginių procentas.
Taikant ELISA tyrimų metodą visose amžiaus grupėse buvo gauta mažiau teigiamų mėginių lyginant su molekuliniais tyrimo metodais. Atvirkštinės transkriptazės lizdinės polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodu, > 24 mėn. amžiaus sumedžiotų šernų mėginiuose buvo nustatyta 2,1 karto, 12 - 24 mėn. šernų mėginiuose – 8 kartus, < 12 mėn. šernų mėginiuose – 7,4 karto daugiau teigiamų mėginių (p<0,05). Taikant realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodą, > 24 mėn. amžiaus sumedžiotų šernų mėginiuose buvo nustatyta 2,5 karto, 12 - 24 mėn. šernų mėginiuose – 8,9 karto, < 12 mėn. šernų mėginiuose – 7,4 karto daugiau teigiamų mėginių (p<0,05)
7 pav. AT-nPGR, realaus laiko TaqMan PGR ir ELISA tyrimo metodais gautų KRKS teigiamų
mėginių procentinės dalies palyginimas priklausomai nuo sumedžiotų šernų amžiaus.
11.9 11.9 1.61 19.1 21.34 2.38 16.25 18.75 7.46 0 10 20 30 40 50 60
AT-nPGR Realaus laiko TaqMan PGR ELISA Tei gi am ų m ė gi n ių p ro ce n tas Metodas > 24 mėn. 12 - 24 mėn. < 12 mėn.
32 Lyginant realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodu ir atvirkštinės transkriptazės lizdinės polimerazinės grandininės reakcijos tyrimo metodu gautų teigiamų mėginių skaičių skirtingose Lietuvos apskrityse, statistiškai reikšmingi skirtumai tarp šių metodų nenustatyti nė vienoje apskrityje (p>0,05).
33
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šio tyrimo metu nustatytas vidutinis KRKSV paplitimas: 16,58 proc. teigiamų mėginių nustatytų AT-nPGR metodu tiriant plaučių audinio pavyzdžius ir 18,48 proc. teigiamų mėginių - TaqMan PGR metodu, yra pastebimai aukštesnis lyginant su panašiais užsienio šalių tyrimais. Vokietijoje atliktame tyrime, taikant AT-nPGR metodą su ORF1 srities pradmenimis, buvo gauta 15,9 proc. teigiamų mėginių (18), pietinėje Slovakijos dalyje – tik 1,6 proc. (107). Įdomu tai, kad kaimynių šalių: Rusijos (12) ir Lenkijos (108) atliktuose tyrimuose, KRKS virusas, taikant tokius pačius metodus, sumedžiotų laukinių šernų mėginiuose aptiktas nebuvo. Taip pat neigiami rezultatai buvo gauti Ispanijoje atliktame tyrime, kuriame buvo tiriami ir kraujo serumo ir plaučių audinių mėginiai (14). Be to, Vokietijoje atliktame tyrime taip pat buvo aptiktas 2 genotipo (Amerikietiškojo genotipo) KRKS virusas, tuo tarpu šiuo tyrimu buvo įrodyta, kad 2 genotipo padermės Lietuvos šernų populiacijoje nėra paplitusios.
Nepaisant to, kad šiame tyrime buvo gauta sąlyginai daug teigiamų rezultatų, egzistuoja tikimybė, kad kai kuriuose tirtuose mėginiuose viruso koncentracija buvo per maža ir pasirinktais skirtingais polimerazinės grandininės reakcijos metodais neaptinkama. Idealiomis sąlygomis, virusą būtų galima izoliuoti ir padauginti ląstelių kultūrose, tačiau tai retai taikoma procedūra. Ypač dėl to, kad 1 tipo genotipas ir jo subtipai, kurie ir yra labiausiai paplitę Europoje, sunkiai adaptuojasi MARC-145 ląstelių linijoje, kuri gerai tinka tik 2 genotipo KRKS viruso izoliavimui. Įprastai 1 genotipo virusas izoliuojamas pirminėse ląstelėse - paršelių plaučių makrofaguose (PAM), tačiau šias ląsteles sąlyginai brangu išgauti, jos yra sunkiai prieinamos, todėl retai naudojamos. Vis dėlto, yra duomenų apie sėkmingą 1 genotipo KRKS viruso 3 ir 4 subtipo izoliavimą MARC-145 ląstelėse (2 priedas), tad atlikus papildomų tyrimų ir patvirtinus gautus rezultatus, viruso izoliavimas ir padauginimas prieš atliekant polimerazinės grandininės reakcijos tyrimus, galėtų tapti rutininės diagnostikos dalimi bei sąlygotų dar tikslesnius rezultatus.
Daugiau teigiamų mėginių buvo randama plaučių audinio mėginiuose lyginant su kraujo serumo mėginiais (p<0,05). Tai galima paaiškinti viruso replikacijos mechanizmais – viruso taikinys yra plaučių makrofagai, būtent dėl šios priežasties juose ir randama didžiausia viruso koncentracija (84). Be to, yra duomenų, įrodančių, kad virusą iš plaučių audinio, taikant molekulinius metodus, galima aptikti daug ilgesnį laiko tarpą po infekcijos, lyginant su kraujo serumo mėginiais (95).
Daugiausiai teigiamų mėginių taikant molekulinius tyrimo metodus buvo nustatyta 12 - 24 mėn. amžiaus šernų mėginiuose (p<0,05), o specifinių antikūnų daugiausiai buvo aptikta > 24 mėn. amžiaus šernų mėginiuose. Šiuos skirtumus iš dalies galima paaiškinti tuo, kad antikūnai, esant KRKSV infekcijos metu susiformuoja vėliau (uždelstas antikūnų susidarymas) (84). Tai kartu galėtų paaiškinti
34 ir kodėl jaunesnių šernų mėginiuose antikūnų buvo aptikta mažiau. Be to, rezultatams įtakos galėjo turėti ir tai, kad molekuliniais ir imunofermentiniais tyrimo metodais buvo tiriami ne tie patys sumedžiotų šernų mėginiai.
Visose Lietuvos apskrityse sumedžiotuose laukiniuose šernuose randamas KRKS virusas gali būti paaiškinamas tuo, jog Lietuvos aplinka, laukiniams šernams, yra labai palanki. Šį teiginį patvirtina 2015 m. t.y. šio tyrimo pradžios metais, Lietuvos teritorijoje ypač pagausėjusi šernų populiacija. Remiantis Lietuvos Respublikos aplinkos ministerijos duomenimis, 2011 metais vienam kvadratiniam kilometrui miško teko 1,84 šerno, 2015 metais – šernų pagausėjo iki 2,66 šerno vienam kvadratiniam kilometrui. Išaugęs šernų skaičius, potencialiai galėjo būti migracijos iš kaimyninių šalių pasekmė, bet ne mažiau svarbu ir tai, jog Lietuvoje yra praktikuojamas šernų šėrimas. Tokiu būdu siekiama sumažinti šernų sukeliamus derliaus nuostolius. Taip pat netoli medžioklės aikštelių yra įrenginėjamos šėryklos ir šernai, ypač žiemos periodu, yra papildomai šeriami, siekiant į konkrečią teritoriją pritraukti didesnę jų populiacijos dalį.
Papildomas šėrimas ne tik lemia šernų populiacijos gausėjimą, bet ir sutraukia didelę šernų populiacijos dalį į sąlyginai mažą teritoriją, dėl šios priežasties didėja kontaktų tarp šių gyvūnų skaičius, o kartu ir viruso perdavimo galimybė.
Atlikus tirtųjų mėginių filogenetinę analizę (1 priedas) buvo nustatyta, jog tarp Lietuvos šernų labiausiai paplitęs yra trečias ir ketvirtas pirmojo genotipo subtipai. Tai susirūpinimą keliantis atradimas, nes Lietuvos kiaulių populiacijoje aptinkamas daugiausiai antras pirmojo genotipo subtipas. Tai reiškia, kad kiaulės neturėjusios kontakto su minėtais subtipais yra mažiau atsparios ir turės sąlyginai didesnę tikimybę užsikrėsti. Be to, trečias subtipas, pasižymi didesniu, lyginant su kitais subtipais, virulentiškumu (57).
Atliekant šį tyrimą, ELISA metodu, lyginant su skirtingais PGR tyrimo metodais, buvo nustatyta sąlyginai mažai teigiamų mėginių (4,11 proc. tirtųjų mėginių) tačiau panašūs, tik šiek tiek mažesni, rezultatai buvo gauti ir užsienio šalyse: Vokietijoje 3,82 proc. (10), Ispanijoje 3 proc. (11). Gautų teigiamų mėginių procentas panašus į ankstesniame tyrime įvertintą KRKSV paplitimą Lietuvos kiaulių populiacijose (4,32 proc.) ir yra kiek mažesnis nei ankstesniais metais tirtuose šernų mėginiuose: 2011 metais buvo nustatyta 6,06 proc., 2012 metais – 9,1 proc. (109)
Faktą, kad imunofermentiniais tyrimo metodais buvo gauta mažiau teigiamų rezultatų, nors šernai buvo tiriami tuo pačiu metu labai panašiomis sąlygomis, galima paaiškinti tuo, jog po infekcijos laikui bėgant sumažėja cirkuliuojančių antikūnų skaičius (93) bei anksčiau paminėtu teiginiu, nurodančiu, jog
35 KRKS infekcijai būdingas uždelstas antikūnų susidarymas. Dėl šių priežasčių dalies antikūnų imunofermentiniais tyrimais nepavyksta užfiksuoti.
Nepaisant to, kad šio tyrimo rezultatai parodė sąlyginai didelį KRKS viruso paplitimą tarp laukinių šernų, Lietuvos teritorijoje, tačiau norint detaliau įvertinti viruso paplitimą ir iš to išplaukiančias grėsmes, reikėtų naujesnių tyrimų aplinkinėse šalyse: Latvijoje, Baltarusijoje, Rusijoje (Kaliningrado srityje) bei Lenkijoje.
36
IŠVADOS
1. Plaučių audinių AT-nPGR ir realaus laiko TaqMan PGR rezultatai leido tiesiogiai europietiškojo genotipo KRKSV nustatyti atitinkamai 16,58 proc. (95 proc. PI 11,56-21,60) ir 18,48 proc. (95 proc. PI 13,24-23,72) tirtų mėginių, kurie įrodo šio genotipo viruso paplitimą Lietuvos šernų populiacijoje.
2. AT-nPGR rezultatai su amerikietiškojo genotipo ORF1 srities pradmenimis ištyrus tuos pačius plaučių ir kraujo serumo mėginius (n=412) įrodė, kad šio genotipo KRKSV padermės Lietuvos šernų popliacijoje nėra paplitusios.
3. AT-nPGR ir realaus laiko TaqMan PGR tyrimo metodais daugiausiai teigiamų mėginių, atitinkamai 19,10 proc. (95 proc. PI 12,19-28,50) ir 21,34 proc. (95 proc. PI 14,04-31,03), buvo nustatyta 12 - 24 mėn. amžiaus šernų mėginiuose (p<0,05), mažiausiai (iki 11,90 proc.) teigiamų mėginių < 12 mėn. amžiaus šernų mėginiuose (p<0,05).
4. KRKSV tyrimo rezultatai Lietuvos apskrityse įrodė, kad teigiamų mėginių yra randama visoje Lietuvos teritorijoje, tačiau, nepriklausomai nuo naudoto AT-nPGR ir realaus laiko TaqMan PGR metodo, teigiamų mėginių pasiskirstymas skirtingose Lietuvos apskrityse yra atsitiktinis ir statistiškai nereikšmingas (p>0,05), kaip ir 2015 - 2016 metais surinktų KRKSV atžvilgiu teigiamų mėginių tyrimų rezultatai.
5. Plaučių mėginių pavyzdžius (n=211) ištyrus realaus laiko TaqMan polimerazinės grandininės reakcijos metodu teigiamų mėginių Ct vertės vidurkis buvo lygus 32,73 ciklui, labai stiprus
signalas (Ct = < 28) buvo nustatytas 19,8 proc., vidutinis (Ct = 28 – 32) – 34,3 proc., silpnas (Ct
= 32 – 36) – 46,9 proc. tirtųjų mėginių.
6. Ištyrus iš tų pačių sumedžiotų šernų paimtus plaučių ir kraujo serumo mėginius, 4,06 proc. daugiau teigiamų mėginių buvo randama plaučių audinio mėginiuose (p<0,05), tačiau teigiamų mėginių skaičiaus skirtumai tarp tos pačios rūšies mėginių (plaučių, arba kraujo serumo mėginių), taikant skirtingas PGR modifikacijas - realaus laiko TaqMan PGR ar lizdinę AT-PGR, buvo nustatyti statistiškai nereikšmingi (p>0,05).
7. Specifinių antikūnų tyrimų rezultatai ELISA metodu patvirtino molekulinių tyrimų rezultatus, tačiau daugiausiai serologiškai teigiamų šernų buvo aptikta > 24 mėn. amžiaus grupėje – 3,1 karto daugiau nei 12 - 24 mėn. amžiaus ir 4,6 karto daugiau nei < 12 mėn amžiaus grupėje (p>0,05).
37
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovui prof. dr. Arūnui Stankevičiui už suteiktas plačias galimybes savarankiškai atlikti tiriamąjį darbą, už pasitikėjimą, supratingumą, patarimus, pasiūlymus, betarpišką bendravimą, nepaprastą humoro jausmą ir visą man skirtą laiką, energiją bei kantrybę.
Dėkoju NMVRVI Serologinių tyrimų skyriaus vedėjai dr. Jūratei Buitkuvienei už šiltą priėmimą, darbingą atmosferą bei nepaprastai vertingas pastabas.
Dėkoju UAB „Magnum Veterinarija“ už man skirtą vardinę stipendiją bei LSMU Studentų mokslinei draugijai už finansinį indėlį, kurie leido dalį mano tyrimų rezultatų pristatyti tarptautinėje konferencijoje.
Atskirai, už išreikštą santūrumą, dėkoju visiems, sąmoningai netrikdžusiems ir dirbtinai neapsunkinusiems darbo proceso.
38
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Wu WH, Fang Y, Farwell R, Steffen-Bien M, Rowland RRR. A 10-kDa structural protein of porcine reproductive and repiratory sindrome virus encoded by ORF2b. Virology. 2001;287:183– 191.
2. Meulenberg JJ, Hulst MM, Demeijer EJ, Moonen PL, Denbesten A, Dekluyver EP, Wensvoort G, Moormann RJ. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic and respiratory syndrome (pears), is related to. Ldv and Eav. Virol. 1993;192:62–72.
3. Velasova M., Alarcon P., Williamson S., Wieland B.. Risk factors for porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection and resulting challenges for effective disease surveillance.. BMC Veterinary Research. 2012;8:184.
4. Neumann E.J., Kliebenstein J.B., Johnson C.D., Mabry J.W., Bush E.J., Seitzinger A.H.,Green A.L., Zimmerman J.J. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States. Journal of American Veterinary Medicine Association. 2005;22:385–392.
5. Drigo M., Franzo G., Belfanti I., Martini M., Mondin A., Ceglie L. Validation and comparison of different end point and real time RT-PCR assays for detection and genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of Virological Methods. 2014;201:79–85. 6. Shi M., Tsan-Yuk Lam T., Hon C.C., Hui R.K.H., Faaberg K.S., Wennblom T.,Murtaugh M.P.,
Stadejek T., Leung F.C.C. Molecular epidemiology of PRRSV: a phylogenetic perspective.. Veterinary Research. 2010;154:7–17.
7. Albayrak H, Ozan E, Cavunt A. A serological survey of selected pathogens in wild boar (Sus scrofa) in northern Turkey. Eur J Wildl Res. 2013;59:893–7.
8. Albina E, Mesplede A, Chenut G, Le Potier MF, Bourbao G, Le Gal S,Leforban Y.. A serological survey on classical swine fever (CSF), Aujeszky’s disease (AD) and porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infections in French wild boars from 1991 to 1998. Vet Microbiol. 2000;77:43–57.
9. Closa-Sebastia F, Casas-Diaz E, Cuenca R, Lavin S, Mentaberre G, Marco I.. Antibodies to selected pathogens in wild boar (Sus scrofa) from Catalonia. Eur J Wildl Res. 2011;57:977–81. 10. Kaden V, Lagen E, Hanel A, Hlinak A, Mewes L, Hergarten G, Irsch B, Deken J, Bruer W.
Retrospective serological survey on selected viral pathogens in wild boar populations in Germany. Eur J Wildl Res. 2009;55:153–9.
39 11. Rodriguez-Prieto V, Kukielka D, Martinez-Lopez B, DelasHeras AI, Barasona JA, Gortazar CH, Sanchez-Vizcaino JM, Vincente J. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in wild boar and Iberian pigs in south-central Spain. Eur J Wildl Res. 2013;59:859–67.
12. Kukushkin S, Kanshina A, Timina A, Baybikov T, Mikhalishin V.. Investigation of wild boar (Sus scrofa) for porcine reproductive and respiratory syndrome in some territories of Russia. Eur J Wildl Res. 2008;54:515–8.
13. Vengust G, Valencak Z, Bidovec A. Serological survey of selected pathogens in wild boar in Slovenia. J Vet Med B. 2006;53:24–7.
14. Vincente J, Leon-Vizcaino L, Gortazar C, Jose Cubero M, Gonzalez M Martin-Atance P. Antibodies to selected viral and bacterial pathogens in European wild boars from southcentral Spain. J Wildl Dis. 2002;38:649–52.
15. Zupacic Z, Jukic B, Lojki M, Cac Z, Jemersic L, Staresina V. Prevalence of antibodies to classical swine fever, Aujieszky‘s disease, porcine reproductive and respiratory syndrome, bovine viral diarrhoea viruses in wild boars in Croatia. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 2002;49:253–6.
16. Yang K., Li Y., Duan Z., Guo R., Liu Z., Zhou D., Yuan F., Tian Y. A one-step RT-PCR assay to detect and discriminate porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in clinical specimens. Gene. 2013;531:199–204.
17. Bonilauri P, Merialdi G, Dottori M, Barbieri I. Presence of PRRSV in wild boar in Italy.Vet Rec. 2006;158:395–404.
18. Reiner G, Fresen C, Bronnert S, Willems H. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in wild boars. Vet Microbiol. 2009;136:250–8.
19. Stankevicius A, Buitkuviene J, Valanciute J, Cepulis R, Stadejek T. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in Lithuanian wild boar (Sus scrofa) population. Proceedings of the EuroPRRS2011Novi Sad, Serbia. 2011;54–9.
20. Ruiz-Fons F, Segales J, Gortazar C. A review of viral diseases of the European wild boar: effects of population dynamics and reservoir role. Vet J. 2008;176:158–69.
21. Meng X.J., Lindsay D.S., Sriranganathan N. Wild boars as sources for infectious diseases in livestock and humans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 2009; 364:2697–2707. 22. Ruiz-Fons F., Segales J., Gortazar C.. A review of viral diseases of the European wild boar:
