LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Aistė Iljenkaitė
Bičių pienelio įtaka kuilių spermatozoidų judrumui,
gyvybingumui ir pH
The Influence of Royal Jelly on Boar Sperm Motility,
Vitality and pH
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: dr. Neringa Sutkevičienė
2 DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Bičių pienelio įtaka kuilių spermatozoidų judrumui, gyvybingumui ir pH“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 81.1Bičių pienelio kilmė, sudėtis ... 8
1.2Bičių pienelio cheminės savybės ... 8
1.3Bičių pienelio biologinės savybės ... 9
1.4Bičių pienelio gavimas ... 10
1.5Bičių pienelio saugojimas ... 10
1.6 Eksperimentiniai tyrimai su bičių pieneliu ... 11
1.7 Kuilių spermos skiedikliai. Sudėtis ... 12
1.8 Kuilių spermatozoidų judrumas ir gyvybingumas, jiems įtaką darantys faktoriai ... 13
1.9 Spermos pH. Jo kitimas. Priežastys ir pasekmės ... 15
2.TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 16
3.TYRIMO REZULTATAI ... 22
3.1 Spermos dozių pradiniai tyrimai ... 22
3.2 Spermatozoidų judrumas ... 26
3.2.1 Subjektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas ... 26
3.2.2 Objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas (SCA) ... 29
3.3 Spermatozoidų gyvybingumas ... 32 3.4 Spermos pH ... 35 4.REZULTATŲ APTARIMAS ... 38 5.IŠVADOS ... 40 6.REKOMENDACIJOS ... 41 7.LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42
4 BIČIŲ PIENELIO ĮTAKA KUILIŲ SPERMATOZOIDŲ JUDRUMUI, GYVYBINGUMUI IR PH
Aistė Iljenkaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Šio darbo tikslas – įvertinti, kokia yra bičių pienelio įtaka kuilių spermatozoidų judrumui, gyvybingumui ir pH. Tyrimas atliktas 2018 metais veislininkystės ir kuilių spermos paruošimo/gamybos įmonėje ,,X“ ir LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Tyrimui panaudota 11 spermos dozių ir iš viso ištirti 396 mėginiai.
Viena spermos dozė iš ejakuliato buvo padalinta į keturis mėgintuvėlius, į kuriuos pridėta skirtingos koncentracijos bičių pienelio: 0, 0,5, 1 ir 2 proc. Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje atlikti pradiniai, spermos pH, judrumo ir gyvybingumo tyrimai, skaičiuojama spermatozoidų koncentracija dozėje bei atlikti morfologiniai spermatozoidų tyrimai. Vėliau mėginiai padalinti į dvi lygias dalis: viena grupė buvo laikoma šaldomajame termostate 16±0,5 oC temperatūroje, o kita – šaldytuve 4±0,5 oC temperatūroje; abu tirti po 24, 48, 72 ir 96 val. Spermatozoidų judrumas tirtas subjektyviai (mikroskopuojant) ir objektyviai (kompiuterine spermos judrumo vertinimo programa SCA), atliktas pH matavimas (elektroniniu pH-matuokliu), gyvybingumo tyrimai (eozino – nigrozino dažai).
Didžiausias spermatozoidų judrumas po 48 val. nustatytas mėginiuose, laikytuose šaldomajame termostate 16±0,5 oC temperatūroje su 0,5 proc. bičių pienelio koncentracija mikroskopuojant, lyginant su kontroline grupe (77,82 ± 7,53 proc.; p ≥ 0,05), o vertinant objektyviai bičių pienelis didelės įtakos neturėjo. Didžiausias spermatozoidų gyvybingumas po 24 val., 48 val., 96 val., nustatytas mėginiuose, laikytuose šaldomajame termostate 16±0,5 oC temperatūroje su 1 proc. bičių pienelio koncentracija, lyginant su kontrolinėmis grupėmis (atitinkamai 92,55 ± 4,41 proc., 92,18 ± 3,03 proc., 87,64 ± 4,61 proc. (p ≥ 0,05)). Spermos pH po 96 val. labiausiai pakito mėginiuose, laikytuose šaldytuve 4±0,5 oC temperatūroje ir aukščiausias pH pasiektas po 96 val. su 0 proc. bičių pieneliu, lyginant grupę su 2 proc. bičių pieneliu (8,12 ± 0,10; p ≤ 0,05). Žemiausias spermos pH buvo po 24 val. mėginius laikant šaldomajame termostate 16±0,5 oC temperatūroje su 2 proc. bičių pienelio koncentracija, lyginant su kontroline grupe (7,16 ± 0,09; p ≤ 0,05).
5 THE INFLUENCE OF ROYAL JELLY ON BOAR SPERM MOTILITY, VITALITY AND PH
Aistė Iljenkaitė
Master‘s Thesis
SUMMARY
The purpose of this master thesis is to evaluate the impact of royal jelly on boar spermatozoa motility, vitality and pH. The tests were concluded in the year 2018 at the breeding on boar sperm prepare facility “X” and “LUHS VA” Animal Reproduction Laboratory. The test was concluded with 11 sperm doses from which a total of 396 samples were tested.
One ejaculated sperm dose was divided into four tubes, which were added with a different concentration of royal jelly: 0, 0.5, 1 and 2 %. Primary testing of sperm pH levels, spermatozoa motility, vitality, spermatozoa dose concentration levels and morphological spermatozoa tests were done in Animal Reproduction Laboratory. Later on, doses were divided into two equal parts from which one group was stored in a cooling thermostat in a 16±0.5 oC temperature. The other group was put in a fridge of 4±0.5 oC temperature. Both of them were tested for 24, 48, 72 and 96 hours. Spermatozoa motility testing was done subjectively (using microscopy) and objectively (using computer sperm motility evaluation program SCA), pH test was made (using electronic pH-meter), the vitality tests were made as well (using eosin-nigrosin dye).
After the 48 hour period compared to the control group, the biggest spermatozoa motility was in samples from the cooling thermostat 16±0.5 oC temperature with 0.5 % of royal jelly concentration by using microscopy (77.82 ± 7.53 %.; p ≥ 0.05). By objective evaluation, royal jelly did not have a significant effect. After the 24, 48, 96 hour period compared to the control groups, the largest spermatozoa vitality was found in samples held in a cooling thermostat at 16±0.5 oC temperature with 1 % royal jelly concentration (92.55 ± 4.41 %, 92.18 ± 3.03 %, 87.64 ± 4.61 %, respectively (p ≥ 0.05)). After the 96 hours compared to the group with 2 % of royal jelly concentration, the most change in sperm pH levels was in samples from the fridge with 4±0.5 oC temperature and the highest pH level after the 96 hour period was with 0 % royal jelly concentration (8.12 ± 0.10; p ≤ 0.05). After the 24 hour period compared to control group, the lowest sperm pH was in samples from the cooling thermostat 16±0.5 oC temperature with 2 % of royal jelly concentration (7.16 ± 0.09; p ≤ 0.05).
6
SANTRUMPOS
BP ̶ bičių pienelis;
pH ̶ vandenilio potencialas; kDa ̶ kilodaltonas;
10-HDA ̶ 10-hidroksi-2-deceno rūgštis; BSA ̶ galvijo serumo albuminas; mOsm ̶ miliosmoliai;
TES ̶ buferinis skiediklis (C6H15NO6S);
HEPES ̶ buferinis skiediklis (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfato rūgštis); MOPS ̶ buferinis skiediklis (C7H15NO4S);
TRIS ̶ buferinis skiediklis ((HOCH2)3CNH2 );
ATP ̶ adenozino trifosfatas; CO2 ̶ anglies dioksidas;
0_BP ̶ kontrolinė grupė, nėra pridėtinio bičių pienelio/mėginiai su 0 proc. bičių pieneliu; 1_BP ̶ mėginiai su 1 proc. bičių pieneliu;
0,5_BP ̶ mėginiai su 0,5 proc. bičių pieneliu; 2_BP ̶ mėginiai su 2 proc. bičių pieneliu;
SCA ̶ judrumo nustatymas kompiuterine programa;
K ̶ spermatozoidų koncentracija, t.y. spermatozoidų skaičius viename spermos dozės mililitre;
SK ̶ spermatozoidų koncentracija spermos dozėje;
S ̶ spermatozoidų skaičius suskaičiuotas 80-tyje mažų kvadratų; Pr ̶ praskiedimo laipsnis.
7
ĮVADAS
Kiaulių dirbtinis apsėklinimas yra labai veiksmingas veisimo metodas įvairių dydžių fermose ir gali būti efektyviai vykdomas visame pasaulyje. Veisiant kiaules dirbtinio sėklinimo būdu yra pagerinamas vaisingumas, genetika, atsivedimas, bandos sveikata ir produkcija. Šiuo metu komercinis produkcijos efektyvumas ir pelnas yra susijęs su dirbtinio sėklinimo taikymu (1). Pagal 2014 metų statistiką iš 1,3 milijono paršavedžių, apsiparšiavimo rodiklis siekė 86 proc., o gimusių paršelių skaičius vadoje buvo 14 (2). Norint išlaikyti geros kokybės kuilių spermatozoidus apvaisinimui keletą ar daugiau dienų bei transportuoti yra svarbu naudoti skiediklį. Pirmieji skiedikliai buvo paprasti ir spermos kokybę išlaikydavo iki 3 dienų in vitro, jie padėjo padidinti tūrį, išlaikyti pH, osmosinį slėgį ir stabilizuoti membraną. Vėliau pridėjus į skiediklius galvijų serumo albumino, spermatozoidų judrumas ir gyvybingumas išsilaikė nuo 4–5 dienų. Skiedikliai pradėti skirstyti į trumpo ir ilgo veikimo. Į ilgo veikimo skiediklius dar pridėta sudėtingesnių buferių, antioksidantų ir antibiotikų (1).
Bičių pienelis yra kreminės konsistencijos, gelsvos spalvos medžiaga, kurią gamina bitės darbininkės, jų hipofaringinėje liaukoje gaminasi baltymai, o mandibuliarinėje liaukoje lipidai. Bitės darbininkės bičių pieneliu maitina bičių motinėlę visą gyvenimą (4, 5). Bičių pienelis įgijo didelį mokslinį ir komercinį susidomėjimą dėl jo teikiamų sveikatą gerinančių savybių (5). Bičių pienelis naudojamas kosmetikoje, kaip maisto papildas ar dietinių bei vaistinių preparatų ingredientas. Jis pasižymi antimikrobinėmis, antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis, priešvėžinėmis, imonomoduliacinėmis ir kitomis savybėmis (5).
Šiuo metu skiediklių įvairovė yra labai didelė, bet kaip skiediklis ar skiediklio priedas, kuris pagerintų spermos kokybę gali būti panaudotas ir bičių pienelis, todėl mūsų darbo tikslas yra įvertinti bičių pienelio įtaką kuilių spermatozoidų judrumui, gyvybingumui ir pH.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti kuilių spermatozoidų judrumo kitimą laikant spermą 96 val. skirtingose temperatūrose, spermos mėginį papildžius skirtingos koncentracijos bičių pieneliu.
2. Įvertinti kuilių spermatozoidų gyvybingumo kitimą laikant spermą 96 val. skirtingose temperatūrose, spermos mėginį papildžius skirtingos koncentracijos bičių pieneliu.
3. Įvertinti kuilių spermos pH kitimą laikant spermą 96 val. skirtingose temperatūrose, spermos mėginį papildžius skirtingos koncentracijos bičių pieneliu.
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Bičių pienelio kilmė, sudėtis
Bičių pienelis (BP, angliškai – royal jelly – ,,karališkoji želė“) yra kreminės, klampios konsistencijos išskyros, kurios gaminamos jaunų bičių darbininkių (Apis mellifera) hipofaringininėje ir apatinio žandikaulio liaukose (3, 4).
Bitės darbininkės maitina bičių darbininkių jaunas lervas ir tranų lervas bičių pieneliu pirmas tris paras, o bičių motinėlei tai yra vienintelis maistas visą jos gyvenimą per visas vystymosi stadijas. Po trijų parų darbininkių lervos yra maitinamos bičių pienelio, žiedadulkių ir medaus mišiniu (5, 6).
BP susideda iš vandens, baltymų, angliavandenių, riebalų mineralų ir vitaminų (6). Nustatytos bičių pienelio fizinės savybės yra santykinai rūgšti terpė, pH svyruoja tarp 3,1 ir 3,9, tankis 1,1 g/ml, iš dalies gerai tirpsta vandenyje, nes konsistencija dažniausiai nėra homogeniška dėl esamų neištirpusių įvairaus dydžio granulių (7), spalva svyruoja nuo baltos iki geltonos, o kvapas aštrus, skonis rūgštus ir saldus (8, 9, 10).
1.2 Bičių pienelio cheminės savybės
Bičių pienelio pagrindiniai komponentai yra vanduo (60 – 70 proc.), baltymai (9 – 18 proc.), angliavandeniai (7 – 18 proc.), riebalai (3 – 8 proc.), mineralai (0,8 – 3 proc.), vitaminai, fenoliai ir amino rūgštys (11).
BP esantys pagrindiniai baltymai yra vandenyje tirpūs ir sudaro daugiau negu 80 proc. visų baltymų. Pagrindinė BP proteinų šeima turi 9 narius, kurių molekulinė masė yra tarp 49-87 kDa (8, 12). Taip pat galime rasti laisvųjų amino rūgščių, tarp kurių prolinas, glicinas, lizinas ir glutamino rūgštis yra labiausiai paplitusios (13).
Svarbiausi angliavandeniai, monosacharidai BP yra fruktozė ir gliukozė, kurie sudaro 90 proc. viso cukraus kiekio ir palyginti panašiomis proporcijomis kaip ir medaus, tačiau fruktozė išlieka dominuojantis angliavandenis. Sacharozė visad aptinkama, bet dažnai kinta jos koncentracija. Kiti galimi oligosacharidai tokie kaip maltozė, trehalozė, gentiobiozė, izomaltozė, rafinozė aptinkami žymiai mažesniais kiekais (14, 15).
BP lipidų sudėtis: 80 – 85 proc. sudaro riebalų rūgštys, 4 – 10 proc. fenoliai, 5 – 6 proc. vaškai, 3 – 4 proc. steroidai ir 0,4 – 0,8 proc. fosfolipidai (16). BP riebalų rūgštys yra laisvosios trumpų grandinių riebalų rūgštys, kurios susideda iš 8 – 12 anglies atomų ir dažniausiai tai hidroksilo ar dikarboksilo riebalų rūgštys, kurios skiriasi nuo gyvūnų ar augalų riebalų rūgščių (14). Lercker ir kiti (1981) atrado, jog BP riebalų rūgštys susideda iš hidroksi-2-deceno (HDA) ir 10-hidroksidekano rūgščių (10-HDDA) (17). Unikali BP savybė yra 10-HDA, manoma, kad ji randama
9 tik BP, todėl ši rūgštis naudojma kaip žymeklis BP tikrumui nustatyti arba įvertinti BP kokybę ir turi įvairių farmakologinių ir antibakterinių savybių (18).
Bičių pienelyje gausu mineralinių medžiagų bei vitaminų. Pelenų kiekis reprezentuoja 0,8 – 3 proc. BP šviežios medžiagos (19). Pagrindiniai elementai yra kalis ir jo yra daugiausiai, fosforas, siera, natris, kalcis, aliuminis, magnis, cinkas, geležis, varis, manganas, tačiau yra ir nikelio, chromo, alavo, volframo, stibio, talio pėdsakų (20). Mineralų kiekiai nurodyti 1 lentelėje. BP galime aptikti platų spektrą vitaminų, iš kurių daugiausiai yra B grupės – B1, B2, B6, B5, B8, B9, o vitamino C randame tik pėdsakus (12). Vitaminų kiekiai randami BP nurodyti 2 lentelėje.
1 lentelė. Mineralinių medžiagų kiekis BP (19)
Mineralinės medžiagos mg /100 g Kalis (K) 200 – 1000 Kalcis (Ca) 25 – 85 Magnis (Mg) 20 – 100 Cinkas (Zn) 0,7 – 8 Geležis (Fe) 1 – 11 Varis (Cu) 0,33 – 1,6
2 lentelė. Vitaminų kiekiai BP (12)
Vitaminai mg/100g Vitaminas A 1,10 Vitaminas D 0,2 Vitaminas E 5,00 Vitaminas B1 2,06 Vitaminas B2 2,77 Vitaminas B6 11,90 Vitaminas B12 0,15
Vitaminas B5 (pantoteno rūgštis) 52,80
Niacinas (PP) 42,42
Vitaminas C (askorbo rūgštis) 2,00 Vitaminas B9 (folio rūgštis) 0,40
1.3 Bičių pienelio biologinės savybės
Dėl BP esančių biologinių medžiagų, jis yra plačiai naudojamas medicinos produktuose, kosmetikoje ir maisto papilduose įvairiose šalyse (14). Tyrimais su eksperimentiniais gyvūnais in
10 vivo ir in vitro bei klinikiniais tyrimais buvo pademonstruota, jog BP turi keletą farmakologinių savybių (14) ir dėl didelio kiekio bioaktyviųjų jungininių tokių kaip peptidai, polifenoliai ir lipidai (10-HDA) BP pasižymi sveikatingumą gerinančiomis savybėmis, tokiomis kaip: antimikrobinėmis, antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis, priešvėžinėmis, imonomoduliacinėmis, kraujodarą skatinančiomis, apsauginį poveikį darančiomis širdies ir kraujagyslių sistemai ir kitomis savybėmis (21, 22, 23, 24). Taip pat atlieka svarbų vaidmenį reprodukcinėje sistemoje, apsaugo kepenis ir inkstus bei skatina žaizdų gijimą (25).
1.4 Bičių pienelio gavimas
BP išgavimas yra atliekamas dviem standartiniais būdais. Vienas yra persodinant lervas, o kitas būdas nepersodinant.
Vienas iš metodų išgauti BP yra dirbtiniu būdu persodinti lervas. Šis būdas yra vykdomas, kai lervos yra perkeliamos iš bičių darbininkių korio akelių į didelį kiekį bičių motinėlių dirbtines korio akeles (26). BP produkcijos išgavime yra svarbūs 5 žingsniai. Pirmasis yra išvalyti bičių motinėlių dirbtines akeles, antrasis persodinti lervas. Antrasis žingsnis yra pats svarbiausias ir turi būti atliekamas švelniai ir greitai nepažeidžiant lervos. Tada įdedame BP produkcijos rėmą ir po 3 – 5 valandų patikriname priėmimą. Galutinis žingsnis yra BP išgavimas, kuris atliekamas 68 – 72 valandos po lervos perkėlimo, kiekviena lerva išimama pincetu ir surenkamas BP iškart yra šaldomas (27).
Kitas BP išgavimo metodas yra neperkeliant lervos. Šis naujas metodas yra patogus ir efektyvus, pagrįstas prietaisu, kuris susideda iš bičių darbininkių plastikinio korio pamato su įprastomis skylutėmis, plastikinių akelių apačia sumontuota ant rėmo, kuris gali būti įvestas į korį užpildyti skylutes arba į bičių motinėlių bedugnes plastikines akeles ant BP produkcijos rėmelio (28). Trumpai apibūdinant procesą, norint, jog bitės darbininkės sukurtų korį, pamatas ir rėmai su akelių dugnu turi būti surinkti ir patalpinti į bičių koloniją. Įkaliname bičių motinėlę šiame koryje, kad padėtų kiaušinėlius ir po keturių dienų kiaušinėliai pavirsta į lervas. Šiuo metu rėmai su akelių dugnu ir prilipusiomis lervomis yra ištraukiami ir įdedami į atviras bičių motinėlių akeles su rėmu. Visa įrengta sistema yra gražinama į bičių koloniją ir tada yra gaminamas bičių pienelis. BP surinkimas yra mechanizuotas ir jį apima trys pagrindiniai žingsniai: nupjauti bičių motinėlių išsikišusias akelių dalis, pašalinti lervas ir surinkti BP (27, 28).
1.5 Bičių pienelio saugojimas
BP kokybei didelę reikšmę turi šviežumas. Jis gali būti greitai sugadintas, jei nėra tinkamai laikomas, nes yra jautrus karščiui, šviesai ir orui (27, 29). Nustatyta, jog netinkamai laikant BP keičiasi jo fizinės ir cheminės savybės, pavyzdžiui, atsiranda aukštesnis rūgšties titras, tamsėja spalva, didėja klampumas, mažėja laisvųjų amino rūgščių kiekis ir gliukozės oksidazė, todėl būtina imtis
11 priemonių išsaugoti BP biologines savybes laikymo periodu (27). Iškart po BP išgavimo, jis turi būti įdėtas į tamsų, sandarų indą, atvėsintas ir laikomas 0 – 5 ℃ temperatūroje, laikantis šių sąlygų BP kokybė išlieka gera apie 7 savaites 4 ℃ temperatūroje. Kitas saugojimo būdas yra BP užšaldymas -18 ℃ ar žemesnėje temperatūroje ir laikoma ne ilgiau 2 – 3 metus, o po atšildymo laikoma šaldytuve ne ilgiau kaip 12 mėnesių (29). Eksperimentai parodė, kad laikant BP -20 ℃ po 21 mėnesio įvyksta proteolizė (30). Dar vienas patogus saugojimo būdas yra BP užšaldymas ir išdžiovinimas kitaip vadinamas liofilizacija – tai dehidracijos procesas, įprastai naudojamas išsaugoti greitai gendančią medžiagą ir ją padaryti patogią transportuoti. Šio proceso metu užšaldoma medžiaga ir sumažinamas slėgis, leidžiant šaldytam vandeniui medžiagoje tiesiogiai sublimuoti iš kietos fazės į dujų. Liofilizuotas BP yra mažiau jautrus temperatūros skirtumui, todėl gali būti laikomas ilgesnį laiką kambario temperatūroje ir taip pat BP miltelius galime perdirbti į kitus produktus, tokius kaip tabletes ar maišyti su kitais produktais (27). Kayashima su bendraautoriais palygino šviežaus ir liofilizuoto BP fiziologinį aktyvumą ir vystymąsi ant vaisių musyčių (Drosophila melanogaster). Rezultatas parodė, jog liofilizuotas BP išlaikė tam tikras šviežaus BP savybes, darant prielaidą, jog liofilizavimo procesas labai nepakeičia BP kokybės ir funkcijos, o šviežaus ir liofilizuoto BP bioaktyvumas yra beveik identiškas (31).
1.6 Eksperimentiniai tyrimai su bičių pieneliu
BP turi daug biologinių, farmakologinių savybių ir tam tikrą poveikį, tačiau dar nėra pakankamai ištirtas kaip kiti bičių produktai, tokie kaip medus, žiedadulkės ar propolis. Per pastaruosius du dešimtmečius susidomėjimas BP sparčiai padidėjo, todėl iki pat šių dienų intensyviai atliekami tyrimai ir eksperimentai su BP (32). Atlikti tyrimai susiję su reprodukcija, antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis, priešvėžinėmis, imonomoduliacinėmis ir kitomis savybėmis.
BP veterinarinėje medicinoje galima naudoti kaip spermos skiediklį. Shahzad ir kiti (33) įvertinto BP poveikį atšildytai Nili-Ravi buivolų jaučių spermos kokybei. Ejakuliatai buvo praskiesti skiedikliu ir papildyti skirtingų koncentracijų BP (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 proc.), praskiesta sperma buvo atvėsinta 4 ℃, supakuota ir užšaldyta. Atšildyta sperma buvo įvertinta ir rezultatai parodė, jog progresyvus judrumas ženkliai padidėjo (p < 0,05) 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 proc. BP koncentracijos grupėse, negu 0,4 proc. ir kontrolinėje grupėje. Spermos gyvybingumas, plazmos membranos ir akrosomos vientisumas taip pat ženkliai pagerėjo (p < 0,05) 0,1 proc. BP koncentracijos grupėje, negu kitose grupėse. Moradi ir kiti (34) teigia, jog BP pridėjimas žemomis koncentracijomis (0,5 proc. ir 1 proc.) į avinų praskiestą skiedikliu spermą pagerina spermos kinetiką ir plazmos membranos funkcionalumą laikant 4 ℃ temperatūroje. Taip pat apsauginis BP poveikis gali būti susijęs dėl jo antioksidacinių savybių. Amirshahi ir kiti (35) taip pat pritaria, jog BP turi antioksidacinių savybių ir gali padėti
12 išvengti sėklidžių toksiškumo, kurį sukelia chemoterapija bleomicinu (glikopeptidinis antibiotikas). Atliktame tyrime su žiurkių patinėliais, kuriems skyrė 100 mg/kg BP oraliai, nustatė, kad BP pagerino bleomicino sukeltą toksiškumą spermos parametrams, testosteronui ir malondialdehido (tai riebalų rūgščių galutinis peroksidacijos produktas) koncentracijai. Ahmadnia ir kiti (36) atliko tyrimą su žiurkių patinėliais, tiriamajai grupei oraliai skyrė BP 400 mg/kg sumaišytą su medumi, o kontrolinei grupei tik medaus. Ištirta, jog vidutinis spermatozoidų skaičius tiramojoje grupėje buvo penkis kartus didesnis negu kontrolinėje, o spermotozoidų judrumas žymiai efektyvesnis, o Leidigo ląstelių kiekis padidėjęs tiriamojoje grupėje. Straipsnio autoriai mano, kad BP vartojimas būtų naudingas gydymas nevaisingiems vyrams.
Iš aprašytų tyrimų galima teigti, jog bičių pienelis turi teigiamą poveikį tiek tiesiogiai veikiant tiek oraliai ir atlieka apsauginę funkciją bei gerina spermos parametrus. Tačiau tyrimai su BP yra gana nauja sritis ir jis dar nėra visiškai ištirtas.
1.7 Kuilių spermos skiedikliai. Sudėtis
Per pastaruosius metus labai padidėjo spermos produkcija kiaulių dirbtinio apsėklinimo stotelėse, tuo pačiu metu išaugo ir klientų poreikis gauti aukštos kokybės produktą, todėl spermos dozėms turi būti užtikrintas aukštas biologinis saugumas, aukšta genetinė vertė bei išlaikyti aukštą vaisingumą in vitro kelias dienas. Įprastai šviežia sperma po surinkimo yra tinkama apvaisinimui tik kelias valandas (37). Norint išlaikyti kokybišką spermą kelias dienas, reikia atitinkamo skiediklio. Schulze ir kiti (38) įvertino, jog šiuo metu pasaulyje apie 12,8 milijono litrų skiediklio yra išnaudojama per metus. Šiuo metu yra išvystytas platus kuilių spermos komercinių skiediklių pasirinkimas. Kai kurie iš jų užtikrina spermos kokybę tik kelias dienas, tai trumpo veikimo skiedikliai, o kiti tvirtina, jog išlaiko spermos biologinę vertę savaitę ir ilgiau, tai ilgo veikimo skiedikliai. Tačiau daugiausiai apsėklinimų yra atliekama per tris dienas po spermos surinkimo, todėl vis dar populiariausias metodas yra skiestos spermos išsaugojimas 17 ℃ temperatūroje keletą dienų (39).
Svarbiausios skiediklio funkcijos: teikti maistines medžiagas; reguliuoti temperatūrą; reguliuoti pH;
išlaikyti osmosinį slėgį;
stabdyti bakterijų dauginimąsi (40).
Spermos skiedikliai turi teikti maisto medžiagas, kad palaikytų reikiamą spermos metabolizmą, todėl monosacharidai, tokie kaip gliukozė ir fruktozė yra pagrindinis energijos šaltinis ir skiediklio komponentas (40). Kita svarbi skiediklio funkcija yra apsaugoti ląsteles nuo šalčio šoko,
13 nes kuilio spermatozoidai yra ypač jautrūs žemai temperatūrai, dėl plazmos membranos lipidų sudėties: dėl žemo cholesterolio kiekio ir aukšto santykio neriebiųjų ir riebių riebalų rūgščių fosfolipiduose. Kai temperatūra nukrenta iki 5 ℃, sumažėja plazmos membranos fosfolipidų šoniniai judesiai, sukeldami lipidų sluoksnio atsiskyrimą ir negrįžtamus pakitimus membranos baltymams, tokie pokyčiai sukelia spermos gyvybingumo sumažėjimą, todėl skiedikliuose yra naudojamas galvijo serumo albuminas, BSA (41). Zhang su bendraautoriais (42) atrado, jog pridėjus 3 – 5 g/L BSA į spermos skiediklį, padidėjo spermos gyvybingumas, plazmos membranos vientisumas ir sumažėjo malondialdehido kiekis, laikant spermą praskiestą. Padaryti rezultatai, kad šis proteinas BSA yra pagrindinis ilgo veikimo skiediklio komponentas. Dar viena skiediklio savybė yra kontroliuoti pH buferio pagalba, nes šviežiai paimto kuilio ejkuliato pH yra 7,4±0,2 ir kai pH sumažėja, tiek spermos metabolizmas, tiek gyvybingumas sumažėja. Paprasčiausi naudojami buferiai yra bikorbonatas ir natrio citratas, tačiau jie turi ribotą galimybę moderuoti pH, bet yra ir sudėtingesnių buferių, tokių kaip TES, HEPES, MOPS arba Tris. Šie sugeba reguliuoti pH platesniu intervalu, netgi kai keičiasi temperatūra (43). Kita svarbi skiediklių savybė yra osmolingumas. Komercinių skiediklių osmosinis slėgis siekia tarp 240 ir 380 mOsm x kg-1, o kuilių sperma toleruoja nuo 250 – 390 mOsm x kg-1, jei yra žemiau nei 200 mOsm x kg-1, spermatozoidų gyvybingumas sparčiai mažėja. Todėl norint reguliuoti osmosinį slėgį labiausiai tinka natrio chlorido ir kalio chlorido druskos (41). Skiedikliuose taip pat yra naudojami antibiotikai norint išvengti bakterinio užterštumo, kurie daro neigiamą poveikį ne tik patelei, bet ir pačiai spermai. Sukelia spermos gyvybingumo ir judrumo sumažėjimą, agliutinuoja spermatozoidus, pakeičia jos pH. Antibiotikai padeda išvengti bakterinio užterštumo skiediklyje, kurį sukelia gliukozė – viena iš skiediklių svarbių sudedamųjų dalių ir sėklos laikymas 15 – 17 ℃ yra palanki terpė vystytis gramneigiamoms bakterijoms, tokioms kaip Escherichia coli, Salmonella sp. ir Pseudomonas sp. Dažniausiai naudojami antibiotikai yra gentamicinas, kanamicinas, neomicinas (41, 43).
Skirtumas tarp trumpo veikimo skiediklio ir ilgo yra tas, jog ilgo veikimo skiedikliai yra daug kompleksiškesnės struktūros ir į juos įeina sudėtingesni buferiai tokie kaip: HEPES, Tris, TES ir kiti, taip pat antioksidacinės medžiagos tokios kaip: BSA, beta karotenas, cisteinas, taurinas, askorbo rūgštis, vitaminas E, glutationas (43, 44). Ilgo veikimo skiedikliai išsaugo geresnę spermos kokybę ir apvaisinimo galimybę negu trumpo veikimo (41).
1.8 Kuilių spermatozoidų judrumas ir gyvybingumas, jiems įtaką darantys
faktoriai
Norint gauti geros kokybės spermatozoidus apvaisinimui, ypač, jei spermos dozės bus laikomos keletą dienų prieš apsėklinimą, reikia tinkamai paimti spermą. Sėklos surinkimo, skiedimo, pripildymo į plastmasinius indelius ir transportavimo į fermą metu, higiena ir temperatūra yra
14 pagrindiniai veiksniai, kurie daro įtaką spermos kokybei: judrumui bei gyvybingumui ir kitiems parametrams (37).
Spermatozoidų judrumas yra laikomas vienas iš svarbiausių savybių įvertinti ejakuliuotų spermatozoidų vaisingumo potencialą (45). Pagal LST 1574:2003 šviežios spermos kuilių spermatozoidų judrumas balais arba proc. turi siekti ne mažiau kaip 7 arba 70 proc., o praskiestos kuilių spermos spermatozoidų judrumas balais arba proc. turi siekti ne mažiau kaip 6 arba 60 proc. (46).
Spermatozoidų judrumas yra ypač jautrus aplinkos veiksniams, karščiui ar šalčiui (47). Atliktame tyrime buvo nustatyta, jog spermos laikymo temperatūra ir laikymo trukmė turi įtakos judrumui. Spermatozoidų judrumas sumažėjo juos laikant 25 ℃, 16 ℃, bet labiausiai 5 ℃ temperatūroje laikant 10 dienų. Po 6 dienų 16 ℃ spermatozoidų judrumas nebesiekė 60 proc., o 25 ℃ ir 5 ℃ jau antrą dieną (48). Tačiau skiediklis gali pakeisti judrumą, dažniausiai padidindamas spermatozoidų greičio parametrus (47). Spermatozoidų judrumui daro įtaką daug veiksnių. Jie yra išskirstyti į 2 pagrindines grupes:
1. Endogeniniai:
Amžius (donoro, laiko tarpas tarp ejakuliacijų);
Spermos subrendimas (morfologinis, fiziologinis, biocheminis); Energijos atsargos, ATP (membraninis transportas, jonų transportas);
Paviršius ir aktyvūs agentai (agliutinuojantys faktoriai, antikūnai, dezinfekcinės priemonės, receptoriai, membranos vientisumas).
2. Egzogeniniai:
Biofiziniai ir fiziologiniai faktoriai (hidrodinamika, osmosinis slėgis, pH, temperatūra, jonų sudėtis);
Skysčiai (antsėklidžio skysčiai, sėklinė plazma, gimdos kaklelio gleivės, gimdos skysčiai); Stimuliuojantys ir inhibuojantys faktoriai (neorganiniai jonai – Cu, Zn, Cd, Mn, Hg,
hormonai, cikliniai nukleotidai, prostaglandinai, aplinkos tarša, imuno-cheminiai faktoriai) (47).
Spermos gyvybingumo rodiklis yra spermatozoidų membranos vientisumas ir šis yra svarbus, kad išlaikytų spermos funkciją, bet spermos judrumas irgi yra vienas iš pagrindinių parametrų, kuris rodo spermos gyvybingumą. Daugelis spermos procedūrų, tokių kaip skiedimas ar jos laikymas žemoje temperatūroje, gali pažeisti spermatozoidų membraną susilpninant apvaisinimą, tačiau pats skiediklis išlaiko spermatozoidų gyvybingumą, nes įprastai be skiediklio išgyvena tik keletą valandų (49). Pagal LST 1574:2003 praskiestos kuilių spermos gyvybingumas 16 ℃ temperatūroje turi išlikti ne mažiau kaip 72 val. (46).
15
1.9 Spermos pH. Jo kitimas. Priežastys ir pasekmės
Iškart po ejakuliacijos sėklos pH yra maždaug 7,4±0,2. Kai pH mažėja, kartu mažėja ir aktyvus metabolizmas bei spermos judrumas. Spermos glikolitinis metabolizmas (gliukozė yra pagrindinis angliavandenis) sumažina intraląstelinį pH ir tai galiausiai pablogina ląstelių metabolizmą. Pagrindinis metabolitas yra pieno rūgštis, kuris ir yra kaip indikatorius nustatyti spermos kokybę (41, 43). Tačiau spermos pH taip pat gali ir didėti, Vyt ir kiti įrodė, jog didelis kiekis oro yra susijęs su pH padidėjimu ir sumažėjusiu judrių spermatozoidų kiekiu (50). Kitame tyrime irgi buvo atliktas eksperimentas, kuriame buvo nustatyta, jog kuo daugiau oro praskiestuose spermos dozėse, tuo pH didėja (51). Vandenilio potencialas galėjo padidėti dėl skiediklyje esančios bikarbonato buferinės sistemos, dėl kurio yra prarandamas CO2 iš praskiestos spermos į oro kamerą spermos dozėje, todėl nuolat yra prarandami protonai skiediklyje. Pridedant CO2 į oro tarpą spermos dozėje, truputėlį sumažėja pH (50). Schulze ir kiti atliko pirmą eksperimentą, praskiedus BTS (Beltsville Thawing Solution) skiedikliu spermą ir suskirstęs jas į tris grupes: A – mėginiai nevartomi, B – vartomi manualiai 180⁰ kas 12 val., C – 360⁰ automatiniai vartymai 5 kartus per valandą. Mėginiai laikomi tamsoje 17 ℃ temperatūroje įvertinant 1, 3 ir 5 laikymo dieną. Jis nustatė, kad B ir C grupėse labai pakilo pH nuo 7,3 iki 7,5 (p < 0,05), negu lyginant su A grupe. Antrame eksperimente stebėjo pH A ir C grupėse, bet su pH stabilizatoriumi, abiejuose grupėse pH nepasikeitė ir liko 7,1. Jis nustatė, kad spermos dozių vartymas sukelia jų didėjančią alkalinizaciją, dėl CO2 praradimo praskiestoje spermoje (52).
16
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tyrimo eiga. Tyrimas atliktas 2018 metais, nuo gegužės 7 dienos iki birželio 1 dienos, veislininkystės ir kuilių spermos paruošimo/gamybos įmonėje ,,X“ ir LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje.
Veislininkystės įmonėje tyrimo laikotarpiu buvo laikoma vidutiniškai 60 veislinių kuilių reproduktorių. Pagal spermos gamybos technologiją, iš kuilių sperma buvo imta pagal nustatytą spermos ėmimo rėžimą ir mažiausiai kartą per savaitę. Sperma imama manualiniu būdu. Pirmiausia po ejakuliato paėmimo įmonės laboratorijoje vizualiai vertinama ejakuliato spalva ir konsistencija. Po to ejakuliatas perkošiamas per 3 – 4 sterilios marlės sluoksnius į sterilų, šiltą (30 – 32oC) graduotą matavimo cilindrą ir nustatomas jo tūris mililitrais ir fotometru apskaičiuojama spermatozoidų koncentracija. Ejakuliatas skiedžiamas ilgo laikymo skiedikliu Vitasem ir išfasuojama į dozes (paruoštas paršavedžių sėklinimui), kurioje spermatozoidų koncentracija ne mažesnė kaip 3 mlrd. Taip išfasuotos spermos dozės atvėsinamos iki 16 – 20 oC temperatūros ir specialiose termo dėžėse transportuojamos į veislinius kiaulininkystės ūkius, kur panaudojamos paršavedžių sėklinimui.
Tyrime naudotas natūralus bičių pienelis (BP) įsigytas iš bitininko ,,Y“ bityno. Nuo pat bičių pienelio gavimo jis buvo laikomas šaldiklyje, t.y. -20 ± 0,5 oC temperatūroje. Prieš naudojimą bičių pienelis buvo išimtas iš šaldymo kameros ir laikytas kambario temperatūroje apie 1 val. Kambario temperatūroje bičių pienelis suminkštėja, tampa klampios konsistencijos.
Mūsų tyrimo metu, vienas kuilio ejakuliatas buvo skiedžiamas ilgo laikymo skiedikliu Vitasem ir fasuojamas į spermos dozes skirtas kiaulių sėklinimui. Viena spermos dozė iš ejakuliato iš karto buvo padalinama į keturis mėgintuvėlius, kuriuose prieš tai buvo įdedama natūralaus bičių pienelio, kurio koncentracija galutiniame mėginyje buvo: 0, 0,5, 1 ir 2 proc. (0_BP, 1_BP, 0,5_BP, 2_BP) Mėginiai specialioje termodėžėje per 1 val. nuo spermos praskiedimo buvo pristatomi į LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratoriją tyrimams. Tik gavus mėginius laboratorijoje buvo atlikti pradiniai spermos pH, judrumo ir gyvybingumo tyrimai, skaičiuojama spermatozoidų koncentracija dozėje bei atlikti morfologiniai spermatozoidų tyrimai. Atlikus pradinius tyrimus, kiekvienas mėginys buvo padalinamas į dvi lygias dalis. Viena dalis mėginių buvo laikomi šaldomajame termostate (Friocell 111, Vokietija) 16±0,5 oC temperatūroje. Kita dalis mėginių buvo laikoma šaldytuve (Eiron EI 220, Italija) 4±0,5 oC temperatūroje. Spermatozoidų judrumo, pH ir gyvybingumo tyrimai visuose mėginiuose buvo atliekami po 24, 48, 72 ir 96 val. (žiūrėti į 1 pav.)
Tyrimui panaudota 11 spermos dozių gautų iš 11 skirtingų kuilių ejakuliatų. Iš vienos dozės buvo gauti 8 mėginiai ir atlikta 36 tyrimai. Iš viso ištirta 396 mėginiai.
17 Spermatozoidų judrumo nustatymas. Spermatozoidų judrumo nustatymas buvo atliekamas dviem būdais: subjektyviai (mikroskopuojant) ir objektyviai (kompiuterine spermos judrumo vertinimo programa Sperm Class Analyzer (SCA, Microptic, Ispanija)). Kuilių spermatozoidų judrumas buvo nustatomas 37±0,5 oC temperatūroje, kai spermatozoidai yra maksimaliai aktyvūs.
Prieš kiekvieną judrumo tyrimą mėgintuvėliai su kuilių sperma buvo įstatomi į vandens vonią (Memmert, Vokietija) palaikančią pastovią 37±0,5 oC temperatūrą, 5 minutėms.
Subjektyviam spermatozoidų judrumo vertinimui buvo naudojamas fazių kontrastinis mikroskopas (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija) su integruotu šildomuoju staleliu, kuris palaiko nekintančią 37 оC temperatūrą bei naudojami pašildyti objektiniai ir dengiamieji stikleliai, pipečių antgaliai. Ant šilto 37 oC temperatūros objektinio stiklelio užlašinamas šiltos spermos lašas ir uždengiamas šiltu dengiamuoju stikleliu. Subjektyviai, akimi įvertinamas spermatozoidų judrumas, nustatant judančių spermatozoidų kiekį procentais, trijuose – penkiuose mikroskopo matymo laukuose. Galutiniam rezultatui gauti apskaičiuojamas visų matavimų aritmetinis vidurkis (53).
Objektyvus spermatozoidų judrumas buvo nustatomas prie mikroskopo, kuriuo vertinome subjektyvų spermatozoidų judrumą, įrengtos kameros pagalba. Ja mikroskopo vaizdas perduodamas į kompiuterį, kuriame instaliuota kompiuterinė spermos judrumo vertinimo sistema SCA (MICROPTIC S.L., Ispanija). Kompiuteriu, kiekviename mėginyje buvo išanalizuota ne mažiau kaip
Atlikti pradiniai, kontroliniai spermos tyrimai Laikoma šaldomajame termostate 16±0,5 oC Laikoma šaldytuve 4±0,5 oC Ištirta 11 spermos
dozių 1 spermos dozė
0BP_T 0BP_Š 0,5BP_T 0,5BP_Š 1BP_T 1BP_Š 2BP_T 2BP_Š
1 pav. Vieno kuilio spermos dozės tyrimo schema
Veislininkystės ir kuilių spermos paruošimo/gamybos įmonė ,,X“ LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje Tirta po 24, 48, 72 ir 96 val.
18 1500 spermatozoidų (ne mažiau kaip 3 matymo laukuose). Kompiuteriu buvo fiksuojamas bendras spermatozoidų judrumas procentais (Judrumas SCA).
Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas dažant eozino – nigrozino dažais. Spermatozoidų gyvybingumui įvertinti naudojome eozino – nigrozino dažus.
Pagrindinis dažų tirpalas: 5 proc. eozino (bluish) tirpalas distiliuotame vandenyje ir 10 proc. nigrozino tirpalas distiliuotame vandenyje.
Dažymui buvo naudojamas darbinis tirpalas: 1 dalis 5proc. eozino tirpalo ir 4 dalys 10proc. nigrozino tirpalo. Pagaminto darbinio tirpalo galiojimo laikas 2 – 3 metai kambario temperatūroje ir naudojamas rutininiams spermatozoidų morfologijos ir gyvybingumo tyrimams. Dažas eozinas prasiskverbia pro pažeistas (sutrūkusias ar plyšusias) spermatozoidų membranas ir ląstelė nusidažo rausvai. Spermatozoidai su sveikomis (nepralaidžiomis, nepažeistomis) membranomis išlieka nenusidažę, balti tamsiame nigrozino dažų fone.
Prieš dažymą tirpalas pašildomas iki 37 – 38 oC. Ant pašildyto objektinio stiklelio (37 oC) dedame mikropipete pamatuotą 10 µl kiekį eozino nigrozino dažų ir 10 µl skiestos spermos. Dažus ir spermą atsargiai išmaišome, padarome tepinėlį ir išdžioviname ore. Mikroskopuojame fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija), naudojant 1000 kartų padidinimą su imersiniu aliejumi. Stebint mikroskopu matomi baltos (gyvi) ir rausvos ar raudonos spalvos (negyvi) spermatozoidai tamsiame nigrozino dažų fone (žiūrėti į 2 pav.). Buvo skaičiuojama 200 spermatozoidų, skirstant į gyvus ir negyvus. Apskaičiuojamas gyvų spermatozoidų procentas mėginyje – spermatozoidų gyvybingumas (53).
19 Spermos pH tyrimai. Elektroniniu pH-matuokliu (AB150, Fisher Scientific Accumet®, JAV) su skaitmenine prietaiso indikacija, naudojant standartinį H jonų elektrodą buvo nustatyta H jonų koncentracija skiestoje kuilių spermos dozėje. Prieš tyrimą mėgintuvėliai su kuilių spermos mėginiais 5 minutėms buvo įstatomi į vandens vonią (Memmert, Vokietija) palaikančią pastovią 37±0,5 oC temperatūrą. Vėliau, į mėgintuvėlį buvo įmerkiamas elektrodas ir fiksuojama pH reikšmė, kuri buvo nurodyta ekrane.
Spermatozoidų koncentracijos tyrimai. Nustatant spermatozoidų koncentraciją fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojamas 100 kartų padidinantis objektyvas ir hematocitometrinė (NewBauer) kamera (53). Sperma buvo praskiedžiama distiliuotu vandeniu santykiu 1:20 ir kruopščiai išmaišoma. Tada užpildoma hematocitometrinė kamera, o spermatozoidai skaičiuojami 5 dideliuose kvadratuose (80 mažų kvadratėlių) arba 0,2 mm2 plote. Spermatozoidai skaičiuojami tris kartus skirtinguose kvadratuose ir suskaičiuojamas trijų skaičiavimų vidurkis. Spermatozoidų koncentracija nustatoma pagal šią formulę:
K = S × Pr × 5 ×10 × 1000, kur:
K – spermatozoidų skaičius viename spermos mililitre (koncentracija), S – spermatozoidų skaičius 80-tyje mažų kvadratų,
Pr – praskiedimo laipsnis,
5 – koeficientas, nes spermatozoidai buvo skaičiuoti 0,2 mm2 kameros plote, 10 – daugiklis, nes kameros gylis yra 0,1 mm.,
1000 – daugiklis, spermatozoidus perskaičiuojant į 1 ml.
2 pav. Gyvybingi spermatozoidai balti (A), o negyvybingas
rožinis (B)
A
B
20 Norint spermos dozėje nustatyti spermatozoidų koncentraciją, buvo apskaičiuotas spermatozoidų kiekis mililitre daugintas iš spermos dozės tūrio (mililitrais).
Spermatozoidų koncentracija kuilių spermos dozėje apskaičiuojama pagal formulę: SK = K × 100, kur:
K – spermatozoidų skaičius viename spermos mililitre, 100 – daugiklis, nes spermos dozės tūris yra 100 ml.
Patologinių spermatozoidų kiekio nustatymas – morfologiniai tyrimai. Jie buvo atliekami pagal A. Januškausko aprašytas ir kiek modifikuotas metodikas (53). Spermatozoidų galvučių patologijos ir spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis kiekis vertinamas atskirai. Norint įvertinti spermatozoidų galvučių patologijas spermatozoidai buvo dažomi metileno mėlynaisiais dažais pagal gamintojo instrukcijas (Sperm Blue, MICROPTIC S.L., Ispanija).
Spermatozoidų dažymas Sperm Blue dažais:
1. Ant objektinio stiklelio padaromas tepinėlis ir išdžiovinamas ore. 2. Stiklelis merkiamas į fiksavimo tirpalą 10 min.
3. Stiklelis merkiamas į dažus 20 – 30 min.
4. Nudažytas stiklelis trims sekundėms įmerkiamas į destiliuotą vandenį ir išdžiovinamas ore.
Mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojant 1000 kartų padidinimą su imersija. Spermatozoidų morfologinių pažeidimų nustatymui vertinama 500 spermatozoidų iš įvairių tepinėlio vietų. Registruojamos tokios spermatozoidų galvučių patologijos: kriaušės formos, siauru pagrindu, nenormaliais kontūrais, neišsivysčiusios, nenormalios galvutės be uodegėlių, siauros, didelės, mažos normalios, trumpos plačios galvutės ir spermatozoidai su paracentriniu viduriniosios dalies prisitvirtinimu. Įvertinus 500 spermatozoidų būklę, apskaičiuojamas bendras patologinių galvučių procentas.
Spermatozoidų uodegėlių įvertinimui buvo naudojamas Hancock’o (šlapio preparato) metodas. Sperma skiedžiama buferinio formalino tirpalu santykiu 1 : 10. Lašas atskiestos spermos (5 – 10 μl) dedamas ant objektinio stiklelio, uždengiamas dengiamuoju stikleliu. Iš viršaus lengvai nusausinamas filtriniu popieriumi. Keletą minučių leidžiama nusėsti spermatozoidams ant stiklelio dugno, tada mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija), naudojant 400 kartų padidinimą. Įvertiname 200 spermatozoidų. Registruojami tokie spermatozoidų uodegėlių pažeidimai: vidurinės dalies pakitimai, paprastai ir po galva susisukusios
21 bei dvigubai sulinkusios uodegėlės, bei kitos patologijos: proksimaliniai ir distaliniai lašeliai, spermatozoidų galvutės be uodegėlių, akrosomų defektai ir pakitimai, vakuolės. Apskaičiuojamas bendras uodegėlių patologijų ir bendras kitų patologijų procentas, bei bendras visų patologijų (galvučių, uodegėlių ir kitų) kiekis procentais.
Statistinė duomenų analizė. Gauti duomenys buvo apdoroti „Microsoft Excel“ (Microsoft Office Excell, 2003) programa. Analizuojant duomenis „Microsoft Excel“ programa buvo apskaičiuotas vidurkių skirtumo patikimumas naudojant statistinę TTEST funkciją. Taip pat statistinė duomenų analizė buvo atlikta SPSS statistinio paketo Nr. 13 versija (SPSS for Windows 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, JAV, 1989–1999). Analizuojant duomenis buvo atliekamas jų aprašymas naudojantis aprašomąja statistika (aritmetinis vidurkis, standartinis nuokrypis, minimalios ir maksimalios reikšmės). Duomenys buvo laikomi statistiškai patikimi, kai * p ≤ 0,05.
22
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Spermos dozių pradiniai tyrimai
Gavus mėginius, LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje buvo iškart atlikti pradiniai tyrimai (t.y. mėginys ištirtas iki jo padalijimo ir inkubavimo skirtingose temperatūrose). Skaičiuojama spermatozoidų koncentracija dozėje, atlikti morfologiniai spermatozoidų tyrimai bei spermos judrumo ir gyvybingumo, pH tyrimai. Iš viso ištirti 44 pradiniai mėginiai.
Spermatozoidų koncentracijos vidurkis skiestoje vienoje kuilio dozėje siekė (nuo 3,7 iki 6,5 mlrd.) 4,85 ± 0,83 mlrd., o viename mililitre (nuo 37 iki 65 mlrd.) 48,55 ± 8,29 mln. (3 pav.).
Apskaičiavus spermatozoidų morfologinius pokyčius, nustatėme, jog bendras patologinių spermatozoidų kiekis dozėje vidutiniškai buvo 22,18 ± 13,02 proc., tai yra neviršijo 25 proc. Bendras patologinių galvučių kiekis sudarė 3,18 ± 1,72 proc., o uodegėlių 7,91 ± 5,32 proc. (4 pav.).
3 pav. Spermatozoidų koncentracijų vidurkis spermos dozėje
0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 S pe rma toz oidų konc entra cij os vidurkis, ml n. S pe rma toz oi dų konc entra cij os vidurkis, ml rd. 0 5 10 15 20 25 30 35 Bendras patologinių galvučių skaičius Bendras patologinių uodegėlių skaičius
Kitos patologijos Bendras patologinių spermatozoidų skaičius P atol og ini ų spe rma toz oidų kiekis, proc .
Spermatozoidų patologijos spermos dozėje
23 60 70 80 90 100 0 0.5 1 2 S pe rma toz oidų judrumo vi durkis, pr oc .
Bičių pienelio koncentracija, proc. Judrumas Judrumas SCA
Objektyviai vertinant pradinį spermatozoidų judrumą šviežioje atskiestoje kuilių spermoje kontroliniame mėginyje, kur 0 proc. BP, jis siekė vidutiniškai 94,29 ± 5,11 proc., didžiausią vidutinį judrumą pasiekė su 0,5 proc. BP koncentracija 95,06 ± 3,61 proc., spermatozoidų judrumo skirtumo vidurkis tarp grupių buvo 0,77 proc., p ≥ 0,05, rodiklis statistiškai nepatikimas. Mažiausias judrumo vidurkis buvo su 1 proc. BP koncentracija 89,93 ± 6,34 proc. Spermos dozės papildytos su 2 proc. BP, vidutinis judrumas buvo 92,29 ± 5,65 proc.
Subjektyviai vertinant pradinį spermatozoidų vidutinį judrumą, didžiausias judrumas buvo su 0 proc. BP koncentracija 84,09 ± 7,00 proc., o mažiausias 80,45 ± 5,70 proc. su 1 proc. BP koncentracija. Mėginiai papildyti su 0,5 proc. BP koncentracija, judrumas sudarė 83,27 ± 4,67 proc., o didžiausioje BP koncentracijoje su 2 proc. siekė 81,27 ± 7,40 proc. Judrumo skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. ir 1 proc. BP koncentracijų grupių buvo 2,82 proc., rodiklis statistiškai patikimas, p ≤ 0,05.
Lyginant judrumo vertinimo metodą, objektyviai vertinamas šviežios skiestos kuilių spermatozoidų vidutinis judrumas buvo didesnis negu tiriant subjektyviai. Su didesne BP koncentracija, 1 proc., 2 proc., tiriant tiek objektyviai tiek subjektyviai, spermatozoidų judrumas mažėjo, lyginant su 0 proc. ir 0,5 proc. BP koncentracijomis (5 pav.).
24 Įvertinus pradinį vidutinį spermatozoidų gyvybingumą, didžiausias buvo nustatytas iškart gavus spermos dozes mėginuose su 0 proc. BP koncentracija – 93,73 ± 3,04 proc., o mažiausiai gyvybingi su 2 proc. BP – 90,91 ± 5,67 proc. Spermos dozės papildytos su 0,5 proc. BP koncentracija sudarė 92,82 ± 3,31 proc., o su 1 proc. BP koncentracija gyvybingumo vidurkis nežymiai padidėjo 0,18 proc. ir buvo 93,00 ± 4,84 proc. Skirtumas tarp 0,5 proc. ir 1 proc. BP koncentracijos grupių buvo 0,18 proc., p ≥ 0,05. Kuo didesnė BP koncentracija, tuo spermatozoidų gyvybingumas nežymiai mažėjo (6 pav.). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0.5 1 2 S pe rma toz oidų gy vy bin gumo vidurkia i, proc .
Bičių pienelio koncentracija, proc.
6 pav. Skirtingos koncentracijos BP įtaka pradiniam
25 Įvertinus pradinius skiestos kuilių spermos pH rodiklius, aukščiausias vidurkis buvo spermos dozėse su 0 proc. BP koncentracija, kai pH siekė 7,43 ± 0,09, o žemiausias su 2 proc. BP koncentracija 6,89 ± 0,13. Skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių buvo 0,54, rodiklis statistiškai patikimas, p ≤ 0,05. Mėginiuose su 0,5 proc. BP koncentracija pH vidurkis buvo 7,22 ± 0,15, o su 1 proc. BP koncentracijoje 7,16 ± 0,10. Vandenilio potencialo skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. ir 1 proc. BP koncentracijos grupių buvo 0,06, p ≥ 0,05. Skirtumo vidurkis tarp 1 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių buvo 0,27, p ≤ 0,05, o skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių buvo 0,33, p ≤ 0,05 (7 pav.).
6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 0 0.5 1 2 S pe rmos pH
Bičių pienelio koncentracija, proc.
7 pav. Pradinis spermos pH kitimas, spermos dozes papildžius su
26
3.2 Spermatozoidų
judrumas
3.2.1 Subjektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas
Iš viso subjektyvaus spermatozoidų judrumo tyrimo metodu buvo ištirti 352 mėginiai, iš kurių pusė – 176 buvo laikomi šaldomajame termostate 16±0,5 oC, o kita 176 mėginių grupė buvo laikoma šaldytuve 4±0,5 oC, abi grupės buvo papildytos su skirtinga BP koncentracija.
Didžiausias spermatozoidų judrumo vidurkis abiejuose grupėse buvo kontrolinėje grupėje, nepridėjus BP. Spermos mėginius laikant šaldomajame termostate, vidurkis sudarė 75,52 ± 13,61 proc., o laikant šaldytuve – 51, 95 ± 25,67 proc. (p ≤ 0,05). Žemiausias spermatozoidų judrumo vidurkis abiejuose grupėse buvo pridėjus į spermos dozes po 2 proc. BP koncentracijos. Spermos mėginius laikant šaldomajame termostate, kuriuose buvo 2 proc. BP koncentracijos, spermatozoidų judrumo vidurkis siekė 68,91 ± 13,83 proc., o su tokia pat BP koncentracija grupėje mėginių laikytų šaldytuve vidurkis sudarė 39,55 ± 27,78 proc. Spermatozoidų mėginius laikant šaldomajame termostate skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių sudarė 6,61 proc., p ≤ 0,05. Spermatozoidų mėginius laikant šaldytuve skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių buvo 12,4 proc., p ≤ 0,05. Abiejuose grupėse matomas spermatozoidų judrumo vidurkio mažėjimas, kuo didesnė BP koncentracija tuo mažesnis ir judrumo vidurkis, tačiau mėginių laikytų šaldytuve spermatozoidų judrumo vidurkis yra žymiai mažesnis, lyginant su laikytais šaldomajame termostate (8 pav.).
0 20 40 60 80 100 0 0.5 1 2 Sper ma toz oidų judr umo vidurkis, proc .
Bičių pienelio koncentracija, proc. Šaldomajame termostate Šaldytuve
8 pav. Skirtingos koncentracijos BP įtaka spermatozoidų judrumui (subjektyvus
nustatymas), laikant spermos dozes skirtingomis sąlygomis,paveiksle parodytas spermatozoidų judrumo kitimas
27 Apskaičiuotas spermatozoidų judrumo vidurkis, kai spermos dozės buvo laikytos šaldomajame termostate 16±0,5 oC ir papildytos su skirtinga BP koncentracija bei vertintos po 24 val., 48 val., 72 val. ir 96 val. Nustatytas didžiausias judrumo vidurkis buvo po 24 val. kontrolinėje grupėje, nepridėjus BP, 83,27 ± 6,07 proc. Po 48 val. spermos dozė be pridėtinio BP, judrumo vidurkis siekė 77,00 ± 8,19 proc., o su 0,5 proc. BP koncentracija judrumo vidurkis buvo nežymiai padidėjęs 77,82 ± 7,53 proc., skirtumo vidurkis tarp šių grupių buvo 0,82 proc., rodiklis statistiškai nepatikimas, p ≥ 0,05. Po 48 val. mėginių su 1 proc. BP koncentracija judrumo vidurkis buvo 74,82 ± 5,76 proc., o su 2 proc. BP koncentracija buvo truputį padidėjęs 75,64 ± 8,10 proc., skirtumo vidurkis tarp grupių – 0,82 proc., p ≥ 0,05. Po 96 val. judrumo skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijų grupių buvo 12,73 proc., p ≥ 0,05. Po 24 val., 72 val., 96 val. spermatozoidų dozės su skirtingomis BP koncentracijomis judrumo vidurkis palaipsniui mažėjo taip pat mažėjo judrumo vidurkis didėjant BP koncentracijai.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
24 val. 48 val. 72 val. 96 val.
S pe rma toz oidų judrumo vi durkis, pr oc .
Spermos laikymo trukmė, valandomis
0_BP 0,5_BP 1_BP 2_BP
9 pav. Skirtingos laikymo trukmės įtaka spermatozoidų judrumui, laikant spermos
dozes šaldomajame termostate 16±0,5 oC ir su skirtinga BP koncentracija,
28 Įvertintas spermatozoidų judrumo vidurkis, kai spermos dozės buvo laikytos šaldytuve 4±0,5 o
C ir papildytos su skirtinga BP koncentracija bei vertintos po 24 val., 48 val., 72 val. ir 96 val. Didžiausias judrumo vidurkis buvo nustatytas po 24 val. skirtingose BP papildytose grupėse, bet aukščiausias buvo mėginiuose su 0 proc. BP koncentracija 81,36 ± 8,59 proc., o žemiausias judrumo vidurkis buvo po 96 val. skirtingose BP koncentracijose, bet pats žemiausias judrumo vidurkis pasiektas mėginiuose su 2 proc. BP 15,36 ± 10,03 proc., skirtumo vidurkis 66,00 proc. (p ≤ 0,05). Po 24 val. judrumo skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių buvo 8,72 proc. mažesnis (p ≤ 0,05). Po 96 val. judrumo skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių buvo 16 proc. mažesnis (p ≤ 0,05). Kuo ilgesnė spermatozoidų dozių laikymo trukmė ir didesnė BP koncentracija, tuo judrumo vidurkis mažėja. (10 pav.).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
24 val. 48 val. 72 val. 96 val.
S pe rma toz oidų judrumo vi durkis, pr oc .
Spermos laikymo trukmė, valandomis
0_BP 0,5_BP 1_BP 2_BP
10 pav. Skirtingos laikymo trukmės įtaka spermatozoidų judrumui, laikant spermos
dozes šaldytuve 4±0,5 oC ir su skirtinga BP koncentracija, paveiksle parodytas
29 3.2.2 Objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas (SCA)
Iš viso objektyvaus spermatozoidų judrumo tyrimo metodu buvo ištirti 352 mėginiai, iš kurių pusė – 176 buvo laikomi šaldomajame termostate 16±0,5 oC, o kita 176 mėginių grupė buvo
laikoma šaldytuve 4±0,5 oC, abi grupės buvo papildytos su skirtinga BP koncentracija.
Didžiausias judrumo vidurkis šaldomajame termostate pasiektas kontrolinėje grupėje su 0 proc. BP koncentracija 87,78 ± 9,24 proc., o mažiausias 2 proc. BP koncentracijoje – 77,82 ± 14,23 proc. Judrumo vidurkio skirtumas tarp grupių buvo 9,96 proc. (p ≤ 0,05).
Šaldytuve laikomoms spermos dozėms didžiausias judrumo vidurkis buvo su 0 proc. BP 64,22 ± 24,15 proc., o mažiausias su 2 proc. BP koncentracija 46,94 ± 27,68 proc. Judrumo vidurkio skirtumas tarp grupių buvo 17,28 proc. (p ≤ 0,05).
Abiejuose grupėse didėjant BP koncentracijai mažėja judrumo vidurkis, proc., bet judrumo vidurkis mažesnis mėginių grupėms laikomoms šaldytuve (11 pav.).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0,5 1 2 S pe rma toz oid ų judrumo vi durkis, pr oc .
Bičių pienelio koncentracija, proc.
Šaldomajame termostate Šaldytuve
11 pav. Skirtingos koncentracijos BP įtaka spermatozoidų judrumui (objektyvus
nustaymas, SCA), laikant spermos dozes skirtingomis sąlygomis, paveiksle parodytas spermatozoidų judrumo kitimas
30 Apskaičiuotas spermatozoidų judrumo (SCA) vidurkis, kai spermos dozės buvo laikytos šaldomajame termostate 16±0,5 oC ir papildytos su skirtinga BP koncentracija bei vertintos po 24 val., 48 val., 72 val. ir 96 val.
Didžiausias nustatytas judrumo vidurkis buvo grupėje po 24 val., kurioje nebuvo pridėta BP – 92,91 ± 6,58 proc., o pats mažiausias po 96 val. su 2 proc. BP koncentracija – 63,73 ± 15,89 proc. (p ≤ 0,05). Po 24 val. visų mėginių papildytų skirtingomis BP koncentracijomis judrumo vidurkis išliko aukštesnis, lyginant su grupėmis po 48 val., 72 val., 96 val., kurių judrumo vidurkis palaipsniui mažėjo. Judrumo skirtumo vidurkis grupėje po 96 val. su 0 proc. BP koncentracija ir 2 proc. koncentracija buvo 19,55 proc. (p ≤ 0,05). 12 paveikslėlyje matome, jog kuo ilgesnė spermos mėginių laikymo trukmė ir kuo didesnė BP koncentracija, tuo spermatozoidų judrumo vidurkis proc. mažėja (12 pav.).
12 pav. Skirtingos laikymo trukmės įtaka spermatozoidų judrumui, laikant spermos dozes
šaldomajame termostate 16±0,5 oC ir su skirtinga BP koncentracija, paveiksle parodytas
spermatozoidų judrumo kitimas 0 20 40 60 80 100 120
24 val. 48 val. 72 val. 96 val.
S pe rma toz oidų judrumo (SC A) vidurkis, proc entais
Spermos laikymo trukmė, valandomis 0_BP 0,5_BP 1_BP 2_BP
31 Įvertintas spermatozoidų judrumo (SCA) vidurkis, kai spermos dozės buvo laikytos šaldytuve
4±0,5 oC ir papildytos su skirtinga BP koncentracija bei vertintos po 24 val., 48 val., 72 val. ir 96 val. Didžiausias spermatozoidų judrumo vidurkis yra po 24 val., lyginant su grupėmis po 48 val., 72 val., 96 val. Po 24 val. labiausiai judrūs spermatozoidai yra kontroliniuose mėginiuose su 0 proc. BP 91,19 ± 6,53 proc. negu kitose BP koncentracijose. Tarp grupių su 0 proc. BP ir 2 proc. BP skirtumo vidurkis – 11,69 proc. (p ≤ 0,05). Po 48 val. mėginiuose tarp 0 proc. BP koncentracijos ir 2 proc. koncentracijos grupių skirtumo vidurkis – 16,55 proc., šis skirtumas yra statistiškai patikimas, nes p ≤ 0,05. Po 72 val. mėginiuose su 2 proc. BP koncentracija spermatozoidų judrumas padidėjo - 39,03 ± 22,95 proc. ir yra didesnis negu su 1 proc. BP, kur spermatozoidų judrumo vidurkis siekia 34,52 ± 22,50 proc. Skirtumo vidurkis tarp grupių – 4,51 proc., tačiau statistiškai nepatikimas, nes p ≥ 0,05. Mažiausias spermatozoidų judrumo vidurkis buvo po 96 val. ir mažiausiai judrūs buvo su 2 proc. BP koncentracija – 22,47 ± 12,57 proc. Po 96 val. tarp 0 proc. BP koncentracijos ir 2 proc. BP koncentracijos grupių judrumo skirtumo vidurkis siekė 23,12 proc., p ≤ 0,05 (13 pav.).
13 pav. Skirtingos laikymo trukmės įtaka spermatozoidų judrumui, laikant spermos dozes
šaldytuve 4±0,5 oC ir su skirtinga BP koncentracija, paveiksle parodytas spermatozoidų
judrumo kitimas 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
24 val. 48 val. 72 val. 96 val.
S pe rma toz oidų judrumo (SC A) vidurkis, proc entais
Spermos laikymo trukmė, valandomis
32
3.3 Spermatozoidų gyvybingumas
Tyrimo metu iš viso ištirti 352 spermatozoidų gyvybingumo mėginiai, iš kurių pusė – 176 buvo laikomi šaldomajame termostate 16±0,5 oC, o kita 176 mėginių grupė buvo laikoma šaldytuve 4±0,5 oC, abi grupės buvo papildytos su skirtinga BP koncentracija.
Šaldomajame termostate laikomų spermatozoidų mėginių didžiausias gyvybingumo vidurkis buvo spermos dozėse su 1 proc. BP koncentracija 90,45 ± 4,53 proc., o žemiausias su 2 proc. BP koncentracija 85,66 ± 7,42 proc. (p ≤ 0,05). Gyvybingumo skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. ir 1 proc. BP koncentracijos grupių sudarė 0,47 proc., p ≥ 0,05. Skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių buvo 4,5 proc., p ≤ 0,05.
Šaldytuve laikomų spermatozoidų mėginių didžiausias gyvybingumo vidurkis pasiektas kontrolinėje grupėje, be pridėtinio BP – 79,73 ± 11,30 proc., o mažiausias gyvybingų spermatozoidų vidurkis buvo su 2 proc. BP – 67,30 ± 11,78 proc. Skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių sudarė 12,43 proc., p ≤ 0,05 (14 pav.).
50 60 70 80 90 100 0 0.5 1 2 S pe rma toz oidų gy vy bin gumo vidurkis, proc .
Bičių pienelio koncentracija, proc.
Šaldomajame termostate Šaldytuve
14 pav. Skirtingos koncentracijos BP įtaka spermatozoidų gyvybingumui, laikant
33 15 paveikslėlyje spermos dozės buvo laikytos šaldomajame termostate 16±0,5 oC ir papildytos su skirtinga BP koncentracija bei vertintos po 24 val., 48 val., 72 val. ir 96 val. Po 24 val. kontrolinėje grupėje su 0 proc. BP spermatozoidų gyvybingumo vidurkis sudarė 91,18 ± 5,67 proc., o su 0,5 proc. BP koncentracija gyvybingumo vidurkis nežymiai padidėjo ir buvo 91,73 ± 5,59 proc. Skirtumo vidurkis tarp grupių – 0,55 proc., šis rodiklis statistiškai nepatikimas, p ≥ 0,05. Mėginiuose su 1 proc. BP koncentracija gyvybingumo vidurkis taip pat padidėjo, bet nežymiai ir sudarė 92,55 ± 4,41 proc. Skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. BP ir 1 proc. BP koncentracijos grupių – 0,82 proc. (p ≥ 0,05). Po 48 val. spermatozoidų gyvybingumo vidurkis nežymiai pakilo su 0,5 proc. BP ir 1 proc. BP koncentracija, lyginant su 0 proc. BP koncentracija. Gyvybingumo skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. BP ir 1 proc. BP koncentracijos grupių – 0,18 proc. (p ≥ 0,05). Po 72 val. gyvybingumo vidurkis nuosekliai mažėjo, didėjant BP koncentracijai. Skirtumo vidurkis tarp 0 proc. BP ir 2 proc. BP koncentracijos grupių – 6,55 proc., rodiklis statistiškai patikimas (p ≤ 0,05). Po 96 val. mėginiuose su 0,5 proc. BP koncentracija gyvybingumo vidurkis truputėlį pamažėjo – 86,36 ± 6,28 proc., lyginant su kontrolinės grupės gyvybingumu – 87,00 ± 5,60 proc., bet su 1 proc. BP gyvybingumo vidurkis siekė 87,64 ± 4,61 proc. Skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. BP ir 1 proc. BP koncentracijos grupių – 1,28 proc. (p ≥ 0,05). Skirtumo vidurkis tarp 1 proc. BP ir 2 proc. BP koncentracijos grupių – 7,91 proc., rodiklis statistiškai patikimas, p ≤ 0,05. Tiek po 24 val., 48 val., 72 val., 96 val. 2 proc. BP koncentracijoje spermatozoidų gyvybingumo vidurkis labiausiai sumažėjo, lyginant su kitomis BP koncentracijomis (15 pav.).
15 pav. Spermatozoidų gyvybingumo vidurkio kitimas laiko atžvilgiu, spermos dozes
laikant šaldomajame termostate 16±0,5 oC ir su skirtinga BP koncentracija
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
24 val. 48 val. 72 val. 96 val.
S pe rma toz oidų gy vy bin gumo vidurkis, proc .
Spermos laikymo trukmė, val.
34 16 pav. pavaizduotas įvertintas spermatozoidų gyvybingumo vidurkis, kai spermos dozės buvo laikytos šaldytuve 4±0,5 oC ir papildytos su skirtinga BP koncentracija bei vertintos po 24 val., 48 val., 72 val. ir 96 val. Didžiausias gyvybingumo vidurkis buvo po 24 val. kontrolinėje grupėje su 0 proc. BP 88,64 ± 7,55 proc., o mažiausias po 24 val. su 2 proc. BP koncentracija 70,36 ± 11,98 proc., skirtumo vidurkis tarp šių grupių buvo 18,28 proc., rodiklis statisitškai patikimas, p ≤ 0,05. Po 48 val. ir 72 val. gyvybingumo vidurkis nuosekliai mažėjo, didėjant BP koncentracijoms. Po 48 val. skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių gyvybingumo vidurkis sudarė 14,36 proc. (p ≤ 0,05). Po 72 val. gyvybingumo skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių sudarė 9,55 proc. (p ≤ 0,05). Po 96 val. mėginiuose be pridėtinio BP, 0 proc. BP koncentracija, gyvybingumo vidurkis buvo 68,64 ± 9,68 proc., o su 0,5 proc. BP truputį padidėjo – 71,00 ± 8,41 proc. Gvybingumo skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 0,5 proc. BP koncentracijos grupių sudarė 2,36 proc., rodiklis statistiškai nepatikimas p ≥ 0,05 (16 pav.).
16 pav. Spermatozoidų gyvybingumo vidurkio kitimas laiko atžvilgiu, spermos
dozes laikant šaldytuve 4±0,5 oC ir su skirtinga BP koncentracija
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
24 val. 48 val. 72 val. 96 val.
S pe rma toz oidų gy vy bin gumo vidurkis, proc .
Spermos laikymo trukmė, val.
35
3.4 Spermos pH
Tyrimo metu iš viso ištirti 352 spermos pH mėginiai, iš kurių pusė – 176 buvo laikomi šaldomajame termostate 16±0,5 oC, o kita 176 mėginių grupė buvo laikoma šaldytuve 4±0,5 oC, abi grupės buvo papildytos su skirtinga BP koncentracija.
Spermos laikomos šaldytuve pH buvo aukštesnis negu laikant šaldomajame termostate. Kuo didesnė BP koncentracija, tuo pH palaipsniui mažėjo abiejuose grupėse. Didžiausias vidutinis pH buvo kontrolinėje grupėje su 0 proc. BP koncentracija, laikant šaldytuve 7,89 ± 0,23, o laikant šaldomajame termostate didžiausias spermos pH vidurkis buvo su 0 proc. BP koncentracija – 7,76 ± 0,13 (p ≤ 0,05). Mažiausias pH vidurkis buvo laikant spermos dozes šaldomajame termostate mėginiuose su 2 proc. BP – 7,37 ± 0,16, o laikant šaldytuve taip pat su 2 proc. BP – 7,54 ± 0,26 (p ≤ 0,05). Vandenilio potencialo skirtumo vidurkis laikant spermos dozes šaldytuve tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijų grupių buvo 0,35, rodiklis statistiškai patikimas, p ≤ 0,05, o laikant šaldomajame termostate tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijų grupių buvo 0,39, p ≤ 0,05 (17 pav.).
6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 0 0,5 1 2 S pe rmos pH
Bičių pienelio koncentracija, proc.
Laikoma šaldytuve Laikoma šaldomajame termostate
36
Spermos dozės buvo laikytos šaldomajame termostate 16±0,5
oC ir papildytos su skirtinga BP koncentracija bei vertintos po 24 val., 48 val., 72 val. ir 96 val. Kuo ilgesnė spermos dozių laikymo trukmė, tuo pH vidurkis didėja, po 24 val. spermos pH vidurkis yra žemiausias lyginat po 48 val., 72 val., 96 val. BP koncentracijai didėjant, spermos vidurkio pH mažėja. Didžiausias pH vidurkis buvo po 96 val. be pridėtinio. BP 7,85 ± 0,10, o mažiausias po 24 val. su 2 proc. BP 7,16 ± 0,09. Po 24 val. pH skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių yra 0,47, rodiklis statistiškai patikimas, p ≤ 0,05. Po 48 val. pH skirtumo vidurkis tarp 1 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių yra 0,26 (p ≤ 0,05). Po 72 val. pH skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 0,5 proc. BP koncentracijos grupių yra 0,11 (p ≤ 0,05). Po 96 val. pH skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių yra 0,19, p ≤ 0,05 (18 pav.). 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.224 val. 48 val. 72 val. 96 val.
S
pe
rmos pH
Spermos laikymo trukmė, valandomis
0_BP 0,5_BP 1_BP 2_BP
18 pav. Spermos pH kitimas laiko atžvilgiu spermos dozėse su skirtinga BP
37 Apskaičiuotas spermos pH vidurkis, kai spermos dozės buvo laikytos šaldytuve 4±0,5 oC ir papildytos su skirtinga BP koncentracija bei vertintos po 24 val., 48 val., 72 val. ir 96 val. Kuo ilgesnė spermos dozių laikymo trukmė, tuo pH vidurkis didėja, po 24 val. spermos pH vidurkis yra žemiausias, lyginant po 48 val., 72 val., 96 val. BP koncentracijai didėjant, spermos vidurkio pH mažėja. Aukščiausias spermos pH vidurkis buvo po 96 val. kontrolinėje grupėje su 0 proc. BP – 8,12 ± 0,10, o žemiausias pH vidurkis po 24 val. laikymo su 2 proc. BP koncentracija – 7,21 ± 0,14. Po 24 val. pH skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių yra 0,4, rodiklis statistiškai patikimas, p ≤ 0,05. Po 48 val. pH skirtumo vidurkis tarp 0 proc. ir 1 proc. BP koncentracijos grupių yra 0,17 (p ≤ 0,05). Po 72 val. pH skirtumo vidurkis tarp 1 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių yra 0,19 (p ≤ 0,05). Po 96 val. pH skirtumo vidurkis tarp 0,5 proc. ir 2 proc. BP koncentracijos grupių yra 0,23, p ≤ 0,05 (19 pav.).
19 pav. Spermos pH kitimas laiko atžvilgiu spermos dozėse su skirtinga BP
koncentracija ir spermos dozes laikant šaldytuve 4±0,5 oC
6.60 6.80 7.00 7.20 7.40 7.60 7.80 8.00 8.20 8.40
24 val. 48 val. 72 val. 96 val.
Sper
m
os
pH
Spermos laikymo trukmė, valandomis
