LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
VETERINARINöS MEDICINOS STUDIJOS
UŽKREČIAMŲ LIGŲ KATEDRA
SAULIUS GURBININKAS
Ilgo saugojimo ir kokybinių spermos rodiklių
įtaka kuilių spermatozoidų judrumui, greičiui ir
gyvybingumui
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadov÷:
prof. dr. Vita Riškevičien÷
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Ilgo saugojimo ir kokybinių spermos rodiklių įtaka kuilių spermatozoidų judrumui, greičiui ir gyvybingumui“
yra atliktas mano paties.
1. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
2. Nenaudojau šaltinių, kurių n÷ra nurodytų darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Saulius Gurbininkas
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu atlikto darbo lietuvių kalbos taisyklingumą. Saulius Gurbininkas
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros ved÷jo/jos vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretor÷s (-riaus) parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavard÷)
(parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretor÷s (-riaus) vardas, pavard÷) (parašas)
Santrumpos
CASA – (angl. Computer Assisted Sperm Analyzer) – kompiuterin÷ spermatozoidų analiz÷s sistema
HOT – (angl. “HOST” Hypo-osmotic swelling test) – hipoosmotinio rezistentiškumo testas LIN – spermatozoido jud÷jimo linijiškumas
ROS – (angl. Reactive oxygen species) – reaktyvaus deguonies radikalai
SCA – (angl. Sperm Class Analyzer) – kompiuterin÷ spermatozoidų analiz÷s sistema STR – spermatozoido jud÷jimo tiesumas
VAP – vidutinio spermatozoido įveikto atstumo greitis VCL – netiesinio spermatozoido jud÷jimo greitis VSL – tiesinio spermatozoido jud÷jimo greitis
Turinys
Summary ...6 Santrauka...7 Įvadas ...8 1. Literatūros apžvalga...10 1.1. Kuilio spermatogenez÷...101.2. Spermatozoido sudedamosios dalys ...10
1.3. Spermatozoidų gyvybingumui įtaką darantys veiksniai ...14
1.4. Spermatozoidų morfologija - gyvybingumui įtaką darantis veiksnys ...15
1.5. Spermatozoidų koncentracija ir jos įtaka gyvybingumui...17
1.6. Spermos skiedikliai ir jų įtaka spermatozoidų gyvybingumui...17
2. Spermatozoidų judrumo ir gyvybingumo nustatymo tyrimo metodai ...19
2.1. Spermatozoidų judrumo vertinimas kompiuterine spermatozoidų judrumo vertinimo sistema (CASA) ...19
2.1.1. Spermatozoido jud÷jimo greičio rodikliai ...20
2.1.2. Spermatozoidų jud÷jimo greičio koeficientai ...21
2.2. Hipoosmotinio rezistentiškumo testas ...23
2.3. Subjektyvus spermatozoidų judrumo įvertinimas...24
2.4. Spermatozoidų akrosomų vertinimas...24
3. Tyrimų metodika...25
3.1. Bandymų atlikimo schema...25
3.3. Objektyvus spermatozoidų judrumo vertinimas kompiuterine spermatozoidų judrumo
vertinimo sistema (SCA)...27
3.3.1. Spermatozoido jud÷jimo greičių nustatymas ...27
3.3.2. Spermatozoido jud÷jimo greičio koeficientai ...28
3.4. Spermatozoidų morfologinis tyrimas...28
3.4.1. Spermatozoidų uodeg÷lių morfologijos tyrimas...28
3.4.2. Spermatozoidų galvučių morfologijos tyrimas...29
3.5. Spermatozoidų koncentracijos doz÷je nustatymas...29
3.6. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas hipoosmotinio rezistentiškumo testu (HOT) .29 3.7. Statistiniai skaičiavimai ...30
4. Tyrimų rezultatai...30
5. Tyrimo rezultatų aptarimas ...40
6. Išvados ...44
Literatūros sąrašas...46
Summary
The present study was conducted to determine the influence of long storage and qualitative sperm parameters on motily, velocity and viability of boars spermatozoa and also a correlation of motility, velocity, viability and morphology.
33 ejaculates from a different AI boars extended in Androhep plus were used. Sperm concentration and morphology were registered. Motility, viability, velocity and acrosome integrity were assessed after storage at 17°C for 6, 30, 54, 78, 102 and 150 h. Sperm velocity was assesed by SCA, viability by hypo-osmotic swelling test by using 100 mOsm/L sodium citrate fructose solution. Motility, morphology and acrosome integrity were assesed using conventional semen evaluation methods.
Storage time had a significant influence on motility, viability and velocity while they both declined and had a significant correlation (p≤0.01) with each other. To determine the influence of abnormal sperm morphology on motility, viability and velocity each semen sample was divided into two groups.
First group was with less than 10 percent of abnormal morphology, while the second group was with the greater than 10 percent of abnormal morphology. The mean of the 102 h sperm positive to HOT test on the first group was greater by 8,7 ± 1,2 % than the second group and after a 102 h the second group was below the critical 40 % of sperm positive limit, while the first group had still 45,93 % sperm positive to HOT test.
The motility on the second group reached the critical 60 % motile limit at 78 h, while the first group reached it 24 h later at 102 h. Statistical analysis of the data revealed a significant (p≤0.01) positive correlation between motility and sperm viability determined by percentage of HOT test positive spermatozoa. There was a significant (p≤0.05) negative correlation betwen the abnormal head morphology with HOT test and cytoplasmic droplets with motility. The velocity (VCL, VAP, VSL) declined while LIN and STR inclined and WOB did not showed any significant changes throughout the experiment. There was no significant influence of sperm morphology on velocity. Surprisingly, the influence of spermatozoa concentration was just on the VSL, LIN and STR with a significant (p≤0.05) positive correlations. Means for percentage of spematozoa with normal acrosomes showed a small decline from 99.73 % after 6 h of storage to 98.91 % at 150 h. However, there was a significant (p≤0.05) negative correlation with abnormal head morphology.
Santrauka
Šio darbo tikslas buvo nustatyti spermatozoidų gyvybingumo ir judrumo parametrų pokyčius bei jiems įtakos turinčius veiksnius ilgai 170C temperatūroje saugomoje kuilių spermoje, atskiestoje Androhep plus skiedikliu. Nustatyta ilgo saugojimo ir kokybinių spermos rodiklių įtaka kuilių spermatozoidų judrumui, greičiui ir gyvybingumui bei nustatyti koreliaciniai ryšiai tarp šių rodiklių.
Tyrimui buvo naudojami 33 skirtingų kuilių ejakuliatai. Klasikiniais metodais buvo vertinama pirmin÷ spermos dozių koncentracija, morfologija, judrumas bei akrosomų būkl÷. Spermatozoidų greitis vertintas naudojant SCA programą, gyvybingumas – HOT testą (100 mOsmolių tri-natrio-fruktoz÷s tirpalas). Judrumas, gyvybingumas, jud÷jimo greitis ir akrosomų būkl÷ buvo vertinami po 6, 30, 54, 78, 102 ir 150 valandų, nuo spermos surinkimo, spermos dozes laikant 17°C temperatūroje.
Nustatyta, jog spermatozoidų judrumas bei gyvybingumas patikimai teigiamai koreliavo (p≤0.01) abiem maž÷jant, ilg÷jant spermos saugojimo laikui. Nustatant patologinių spermatozoidų įtaką judrumui, gyvybingumui ir jud÷jimo greičiui spermos doz÷s buvo padalytos į dvi grupes. I grupę sudar÷ doz÷s su mažesniu nei 10 proc., II grupę – su didesniu nei 10 proc. patologinių spermatozoidų kiekiu.
I grup÷s spermatozoidai iki 102 valandų buvo gyvybingesni vidutiniškai 8,7 ± 1,2 proc., lyginant su II grup÷s, o po 102 valandų, kai II grup÷s spermatozoidai jau buvo sumaž÷ję žemiau kritin÷s 40 proc. gyvybingumo ribos, I grup÷s gyvybingumas vis dar buvo 45,93 procento. Spermatozoidų judrumas II grup÷je kontrolinę 60 proc. judrumo ribą kirto po 78 valandų, o I grup÷s judrumas – tik po 102 valandų.
Nustat÷me patikimą (p≤0.01) teigiamą koreliaciją tarp spermatozoidų judrumo ir gyvybingumo, nustatyto HOT testu. Taip pat buvo nustatyta patikima (p≤0.05) neigiama koreliacija tarp HOT testo duomenų su galvučių patologijomis bei judrumo su citoplazminiais lašeliais. Spermatozoidų jud÷jimo greitis (VCL, VAP, VSL) maž÷jo, tuo tarpu LIN ir STR did÷jo, o WOB nerod÷ jokių didesnių pakitimų viso tyrimo metu. Šiems rodikliams spermatozoidų morfologiniai pokyčiai įtakos netur÷jo. Spermatozoidų koncentracija patikimai (p≤0.05) teigiamai koreliavo su VSL, LIN ir STR rodikliais. Spermatozoidų akrosomų pokyčiai saugojimo metu buvo labai nežymūs, bet po 102 ir 150 valandų saugojimo akrosomų pokyčiai prad÷jo patikimai (p≤0.05) neigiamai koreliuoti su spermatozoidų galvučių patologijomis.
Įvadas
Lietuvoje, kaip ir daugelyje pasaulio šalių, kiaulių s÷klinimui naudojama nešaldyta sperma. Tai atliekama tod÷l, kad iki šiol vis dar n÷ra sukurtos pakankamai tobulos kuilių spermos kriokonservavimo technologijos, nors labai daug mokslininkų dirba šia kryptimi.
Kuilių spermos kriokonservavimą riboja specifin÷s kuilio spermatozoidų membranų sudedamųjų dalių savyb÷s, d÷l kurių didelis spermatozoidų kiekis žūsta ją atšildant.
D÷l min÷tų priežasčių skiesta šviežia sperma turi būti pristatoma į kiaulininkyst÷s ūkius visoje šalyje iš Lietuvoje registruotų ir veikiančių veislininkyst÷s įmonių.
Spermos, naudojamos kiaulių s÷klinimui, kokyb÷ yra vienas svarbiausių veiksnių, užtikrinančių s÷kmingą apvaisinimą. Tod÷l spermos tyrimai yra atliekami veislininkyst÷s įmonių laboratorijose prieš atskiedžiant spermą. Norint kuo ilgiau išsaugoti spermatozoidų gyvybingumą ir judrumą, spermai skiesti yra naudojami ilgo saugojimo spermos skiedikliai, kurie tur÷tų užtikrinti spermatozoidų kokybinius rodiklius, nepakitusius 3–4 dienas.
Tačiau spermą saugant neužšaldytą, jos vaisingumas vis tiek palaipsniui maž÷ja, kad ir kokį skiediklį benaudotume.
Europoje, kur dažniausiai spermos pa÷mimas ir s÷klinimas vyksta toje pačioje fermoje, naudojami trumpesnio, o pavyzdžiui Amerikoje, kur atstumai tarp veislininkyst÷s įmonių bei fermų yra didesni – ilgesnio veikimo spermos skiedikliai.
K. F. Weitze (1990) sukurtas Androhep skiediklis plačiai naudojamas Europoje ir Lietuvoje. Tai pH reguliatoriaus ir BSA skiediklio mišinys, kuris kompensuoja skiedimo efekto nuostolius spermos plazmoje bei atkuria švelnią, hipertoninę aplinką (309mOsm). Šis skiediklis naudojamas ilgesniam spermos laikymui, tai yra ilgiau nei 4 dienas. Tačiau tiek iki spermos surinkimo, tiek technologinio proceso metu, tiek ir po jo spermą saugant yra daug veiksnių, kurie ilgo saugojimo metu gali būti labai reikšmingi spermatozoidų judrumui ir išgyvenimui. Tai spermatozoidų morfologin÷ kokyb÷, spermatozoidų koncentracija doz÷je, spermatozoido judrumo parametrai, kurie veislininkyst÷s įmon÷se nenustatomi prieš spermos atskiedimą. Faktas, jog egzistuoja žymi įvairov÷ tarp kuilių, ryšiumi su saugojamos spermos apvaisinamaja galia. (Waberski et al. 1994)
D÷l galimyb÷s s÷klinimui naudoti atskiestą spermą 5 dienas ir ilgiau, išlaikant jos kokybinius parametrus, tik nežymiai pakitusius, reikia papildomų mokslinių tyrimų, kurie leistų geriau suprasti spermatozoidų gyvybingumui įtaką darančius veiksnius bei jų
sukeliamus neigiamus pokyčius. Tuomet būtų galima maksimaliai išnaudoti kuilius, turinčius geras genetines savybes, – pagaminti iš jų kuo daugiau ir geresn÷s kokyb÷s spermos dozių. Tai dirbtinio apvaisinimo įmon÷se padidintų produkcijos našumą ir ekonominę naudą (Waterhouse et al., 2004). Tuo vadovaujantis buvo suformuotas ir iškeltas mūsų darbo tikslas.
Darbo tikslas
Nustatyti spermatozoidų gyvybingumo ir judrumo parametrų pokyčius bei jiems įtakos turinčius veiksnius ilgai 170C temperatūroje saugomoje kuilių spermoje, atskiestoje Androhep plus skiedikliu.
Darbo uždaviniai
1. Nustatyti kuilių spermatozoidų judrumo ir gyvybingumo tarpusavio sąveiką bei pokyčius spermos saugojimo metu.
2. Nustatyti kuilių spermatozoidų jud÷jimo greičio rodiklių pokyčius saugojimo metu. 3. Nustatyti kuilių spermatozoidų jud÷jimo greičio koeficientų pokyčius saugojimo
metu.
4. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp spermatozoidų judrumo ir jud÷jimo greičio rodiklių bei koeficientų.
5. Nustatyti doz÷je spermatozoidų koncentracijos įtaką spermatozoidų judrumui ir jud÷jimo greičio rodikliams bei koeficientams.
6. Nustatyti patologinių spermatozoidų kiekio įtaką spermatozoidų judrumui ir gyvybingumui bei jud÷jimo greičiui ir koeficientams.
7. Nustatyti skirtingų spermatozoidų patologijų įtaką spermatozoidų judrumui.
8. Nustatyti akrosomų pažeidimų kitimo dinamiką spermoje saugojimo metu ir įvertinti jų koreliacinius ryšius su spermatozoidų gyvybingumu ir jud÷jimo parametrais.
1. Literatūros apžvalga
1.1. Kuilio spermatogenez÷
L. D. Russel et al. (1990) ir I. Gordon (2004) apibūdino spermatogenezę kaip ciklinį ir labai stipriai koordinuotą procesą, prasidedantį s÷klid÷s spermatogeninio epitelio ląstelių dalijimosi ir diferenciacijos procesu, kurio metu s÷klidžių s÷kliniuose kanal÷liuose gaminamos vyriškosios lytin÷s ląstel÷s – spermatozoidai.
Spermatogenez÷s procesas susideda iš spermatocitogenez÷s, mejoz÷s ir spermiogenez÷s etapų.
Spermatocitogenez÷s metu vyksta mitotinis germinatyvinių ląstelių – spermatogonijų dalijimasis, kurio metu pasigamina pirminiai spermatocitai.
Mejoz÷s metu pirminiai spermatocitai transformuojasi du kartus, kol susidaro haploidinį rinkinį turinčios apvaliosios spermatid÷s. Po to prasideda spermiogenez÷, kurios metu haploidinį chromosomų rinkinį turinčios spermatid÷s turi pereiti visą kompleksą pasikeitimų, iki bus suformuotas spermatozoidas (De Kretser and Kerr, 1988). Pagal De Kretser et al. (1998), spermiogenez÷s metu vyksta spermatidžių struktūrinių ir morfologinių pasikeitimų seka. Formuojasi uodeg÷l÷ ir šerdies mikrovamzdeliai, branduolio chromatinas kondensuojasi ir juda į branduolio periferiją, formuojasi akrosomin÷ kepur÷l÷, formuojanti akrosomą, taip pat formuojasi redukcinis kūnelis, nuimantis didelę dalį citoplazmos, kurią v÷liau pašalina Sertolio ląstel÷s.
Nustatyta, jog ciklas kuilio spermatogeniniame epitelyje trunka 8,3 dienos, tuo tarpu pilnas spermatogenez÷s procesas vidutiniškai tęsiasi 39 dienas (Franca and Russell, 1998).
1.2. Spermatozoido sudedamosios dalys
Spermatozoidas – vyriškoji lytin÷ ląstel÷, kurios funkcija yra apvaisinti kiaušin÷lį – moteriškąją lytinę ląstelę, kad susidarytų zigota, iš kurios vystosi naujas tos pačios rūšies individas. Kadangi kiaušin÷lį apvaisina tik vienas iš kelių milijardų spermatozoidų, tod÷l visa spermatozoido sandara pritaikyta greitai jud÷ti. Spermatozoidas turi tik pusę genetin÷s medžiagos, reikalingos ląstelei, ir nuo spermatozoido priklauso gimsiančio individo lytis.
P. Senger (2003) spermatozoidą įvardijo kaip specializuotą ląstelę su stipriai suspausta genetine medžiaga, specifiškai sukurta spermatogenez÷s metu, kad gal÷tų kuo ilgiau išgyventi nejud÷damas ir kuo greičiau jud÷ti po ejakuliacijos.
R. S. Jeyendran (2003) spermatozoidą apibūdino kaip paprastą, bet labai diferencijuotą ląstelę. Jis išskyr÷, kad funkcionalus spermatozoidas turi tris pagrindinius regionus: galvut÷s, vidurin÷s dalies ir uodeg÷l÷s.
Galvut÷ yra padalyta į du didelius segmentus – priekinį akrosomos segmentą ir užpakalinį poakrosominį segmentą. Galvut÷s citoplazmin÷s organel÷s yra akrosoma, branduolys ir branduolio apvalkalas, prikibęs prie branduolio. Akrosoma apsupta membranos ir savyje turi hidrolizinių fermentų, itin svarbių akrosomin÷je reakcijoje apvaisinimo metu. Akrosoma – tai lyg branduolio kepur÷l÷ priekin÷je galvut÷s dalyje. Ji taip pat apibr÷žia akrosominio segmento ribas. Akrosoma susideda iš trijų morfologiškai skirtingų dalių: priekin÷s, esančios pačioje viršūn÷je, vidurin÷s bei pusiaujo. Akrosomos membrana perskirta į dvi sritis, kurios skiriasi viena nuo kitos savo molekuline sandara (D. W. Fawcett, 1975). Poakrosominiame segmente esantį branduolį supa specializuotas citoskeleto kompleksas – branduolio apvalkalas.
Plazmin÷ membrana apjungia abu – akrosominį ir poakrosominį – segmentus, akrosomą bei sudedamąsias branduolio apvalkalo dalis, kurios struktūriškai reorganizuojasi spermatozoidui iš÷jus iš s÷klid÷s bei pradedant bręsti ants÷klidyje. Išorin÷ akrosomos membrana prisišliejusi prie plazmin÷s membranos, o vidin÷ akrosomos membrana prisiklijavusi prie branduolio paviršiaus. Viršutinis ir vidurinis segmentai susideda iš hidrolizinių fermentų ir akrosomin÷s matricos, tuo tarpu pusiaujo vidinis segmentas – siauras ir apibr÷žtas tilteliais, jungiančiais vidinę ir išorinę akrosomos membranas (L. D. Russell et al., 1998). Tiriant akrosominę reakciją nustatyta, kad išorin÷ viršutinio segmento akrosomin÷ membrana ištirpsta kartu su prie jos esančia plazmine membrana, formuojant akytą mišrų membranų kompleksą, kuris praleidžia akrosominius hidrolizinius fermentus (Barros et al., 1967), o pusiaujo segmentas lieka nepakitęs (H. D. M. Moore and J. M. Bedford, 1978).
Akrosomų segmentai atlieka itin svarbų vaidmenį per apvaisinimą pirminio bei antrinio įsiskverbimo į spindulinį vainiką ir akrosomų hidrolizinio fermento išleidimo metu, taip pat vidin÷ akrosomin÷ membrana sąveikauja su kiaušin÷lio plazma (P. M. Wassarman, 1995).
Spermatozoidų akrosomos dažniausiai yra pažeidžiamos spermatozoidus atšildant (P. Senger et al., 2003).
(D. W. Fawcet (1965); M. R. Curry and P. F. Watson (1995). Vidurin÷ spermatozoido dalis tęsiasi nuo distalinio jungiančiosios dalies galo, žiedo – struktūrinio elemento, žyminčio vidurin÷s ir pagrindin÷s dalių susijungimą. Aplink save ji turi spirališkai apsivijusias mitochondrijas, kuriose generuojama energija uodeg÷l÷s jud÷jimui (M. R. Curry and P. F. Watson, 1995). Spermatozoido energijos gaminimo vieta yra vidin÷ mitochondrijų membrana. Toks mitochondrijų išsid÷stymas aplink proksimalinę aksonemos dalį leidžia manyti, kad ji yra būtina kaip ATP energijos uodeg÷l÷s jud÷jimui tiek÷ja.
Uodeg÷l÷ – svarbiausia dalis spermatozoido judrumui. Pagrindin÷ uodeg÷l÷s dalis tęsiasi nuo žiedo (annulus) iki galin÷s dalies kartu su pluoštine makštimi. Struktūriškai uodeg÷l÷ padalyta į tris dideles sritis: kaklelio, vidurin÷s dalies ir galinę dalį. Taip pat joje yra judrumą generuojantis aparatas, mitochondrija, aksonema ir citoskeleto struktūros – išorinis tankusis audinys ir pluoštin÷ makštis (D. W. Fawcett, 1965).
Aksonema tęsiasi beveik per visą uodeg÷l÷s ilgį. Ji susideda iš dviejų centrinių mikrovamzdelių, susijungusių sąsajomis, bei apsuptų devyniomis mikrovamzdelių poromis (9+2 išsid÷stymas) (D. W. Fawcet, 1965; H. Pedersen, 1970). Aksonemos kompleksas yra prijungtas prie plazmin÷s membranos užtrauktuko principu, dviejų eilių, ovalo formos, vidumembraninių dalelių, gretimų išorin÷ms tankiosioms skaiduloms. Toks susijungimas suteikia geresnį judesių veiksmingumą negu jis būtų, jei aksonema būtų neprisitvirtinusi ir jud÷tų plazmin÷s membranos apvalkale (D.S. Friend and D. W. Fawcett, 1974; G. C. Enders et al., 1983).
1959–1961 metais mokslininkai: B. A. Afzelius (1959), I. R. Gibbons ir A. V. Grimstone (1960), R. Gibbons (1961), nustat÷, kad kiekvieno mikrovamzdelio A subvienetas sujungtas dyneino baltymo rankute, kurią R. Gibbons (1965) apibūdino kaip ATP-az÷s kompleksą, keičiantį cheminę energiją (ATP) į kinetinę energiją, leidžiančią gretimai mikrovamzdelių porai slysti greta viena kitos. Taip aksonema susilenkia ir sukelia uodeg÷l÷s jud÷jimą. Tai vyksta prisilietimo-atsiskyrimo cikle tarp dineino rankučių ir gretimos poros (S. P. Marchese-Ragona ir K. A. Johnson, 1990).
H. Pedersen (1970) taip pat nustat÷, kad kiekviena iš devynių periferinių porų turi A subvienetą, esantį O formos ir formuojantį pilną mikrovamzdelį, bei B subvienetą, esantį C formos bei savo laisvais galais prisijungusį prie A subvieneto. Centrin÷ makštis, supanti du centrinius mikrovamzdelius, susideda iš dviejų pluoštų, susisukusių spirališkai. Gretimos mikrovamzdelių poros yra sujungtos neksinų sąsajomis (R. E. Stephens, 1970) tarp A ir B subvienetų (B. Baccetti et al., 1985) (1 paveikslas). Jie laikomi elastiniais elementais,
leidžiančiais reguliuoti lūžimo j÷gas ir taip pat padedančiais išlaikyti aksonemos simetriškumą porų slydimo metu (R. W. Linck, 1979).
Ištirta, kad neksinas gali būti paveiktas elastaz÷s, taip did÷jant uodeg÷l÷s susilenkimo kampui, tuo pačiu maž÷jant uodeg÷l÷s judesių dažniui. Remdamasis šiais tyrimais C. J. Brokaw (1980) nustat÷, kad neksino sąsajos yra elastiniai elementai, prisidedantys prie uodeg÷l÷s judesių amplitud÷s reguliacijos.
Visas spermatozoidas yra padengtas plazmine membrana, tačiau akrosoma, branduolys ir mitochondrija inkapsuliuoti atskiromis membranomis. Plazmin÷ membrana turi aiškius struktūrinius skirtumus, atitinkančius ląstelinius komponentus. Spermatozoido galvut÷s plazmin÷s membranos sud÷tis keičiasi priklausomai nuo spermatozoido veiklos (C.A Wolfe et al., 1998).
W. V. Holt et al. (1984) raš÷, kad visa spermatozoido architektūra atsispindi jo plazmin÷je membranoje, kuri lyg d÷lion÷ funkciškai ir biochemiškai skirtingai atitinka pagrindinius galvos ir uodeg÷l÷s segmentus.
1.3. Spermatozoidų gyvybingumui įtaką darantys veiksniai
Susidom÷jimas veiksniais, darančiais įtaką spermatozoidų gyvybingumui, prasid÷jo nuo 1677 metų, kada Antonijus Leeuwenhoek`as atrado judrų spermatozoidą žmogaus ejakuliate. R. Knox et al. (2008) teig÷, kad atsisžvelgiant į tai, jog kiaul÷s dažniausiai apvaisinamos jas s÷klinant surinkta ir atitinkamai apdorota kuilio sperma, labai svarbu nustatyti veiksnius, kurie veikia spermatozoidų gyvybingumą. Taip pat labai svarbu suprasti, kurie veiksniai veikia spermatozoidų gyvybingumą nuo pat spermos pa÷mimo, laikant ją atskiestą skiedikliu, iki panaudojimo s÷klinimui.
Reaktyvių deguonies radikalų (ROS) vaidmuo yra svarbus lipidų peroksidacijoje, kuri žaloja plazminę spermatozoidų membraną. 1970 metais mokslininkai J. I. Jones ir D. R. Mann atliko eksperimentą, kurio metu į avinų spermą buvo prid÷ta Fe2+. Tai parod÷, jog lipidų peroksidaciją gal÷jo sukelti mirštančių spermatozoidų kv÷pavimo dažnio sumaž÷jimas. Taip pat J. I. Jones ir D. R. Mann (1973) nustat÷, kad mirusio spermatozoido komponentai patenka į ejakuliato bendrą suspensiją, bei teig÷, kad šis atradimas gali paaiškinti ne tik kaip atsiranda lipidų peroksidacija, bet dar svarbiau – kaip lipidų peroksidacija, kaip žalojantis faktorius, veikia plazminę spermatozoidų membraną.
Šių tyr÷jų teigimu, yra kelios pagrindin÷s priežastys, d÷l kurių ROS sukelta lipidų peroksidacija padaro spermatozoidą tokiu pažeidžiamu.
Spermatozoidas yra unikaliai sukurta ląstel÷, nuo spermatogenez÷s iki kiaušin÷lio apvaisinimo pereinanti eilę pasikeitimų. Savo tikslui pasiekti spermatozoido struktūra pasikeičia – DNR stipriai suspaudžiama galvut÷s branduolyje bei prarandamas didelis citoplazmos kiekis, tačiau kartu prarandama savyb÷ pačiam apsiginti nuo oksiduojančių veiksnių.
Antra priežastis, d÷l kurios spermatozoidas yra jautrus ROS ir lipidų peroksidacijai, yra tai, kad plazmin÷ membrana susideda iš daug nesočiųjų riebalų rūgščių, kurios labai tinkamas substratas ROS bei puiki terp÷ lipidų peroksidacijai vykti.
E. Kommisrud et al. (2002) nustat÷ kuilio spermatozoidų judrumo bei akrosomų skirtumus, atsirandančius spermą saugant ilgiau nei 78–102 valandas. Tyrimo metu buvo vertinamas judrumas bei akrosomų vientisumas. Judrumui (p<0.01) ir akrosomų vientisumui (p<0.001) buvo nustatyta dienų skaičiaus įtaka. Judrumas sumaž÷jo nuo 79,8 proc. po 6 valandų laikymo iki 78,4 proc. po 102 valandų laikymo. Spermatozoidų su normaliomis akrosomomis procentinis kiekis nuolat maž÷jo viso tyrimo metu. Po 6, 30, 54, 78 ir 102 valandų spermatozoidų su normaliomis akrosomomis atitinkamai buvo 93,9 proc., 90,6 proc.,
88,0 proc., 84,8 proc. ir 78,2 procento. Judrumui didžiausią įtaką tur÷jo kuilys (p<0.001) bei spermos koncentracija doz÷je (p<0.01), tuo tarpu akrosomų pakitimams įtaką dar÷ tik kuilys (p<0.001). Veisl÷ bei ejakuliato kiekis šiems rodikliams įtakos nedar÷. L. A. Johnson et al. (2000) savo tyrimais padar÷ prielaidą, kad spermatozoidų judrumas yra aktyvaus metabolizmo ir membranų vientisumo indikatorius. Jie pasteb÷jo ryškų spermatozoidų judrumo sumaž÷jimą po 72 valandų laikymo visų rūšių skiedikliuose. M. Ambrogi et al. (2006) tyrimo metu taip pat gavo panašius rezultatus. Mokslininkas nustat÷, kad ryškiai sumaž÷jęs spermatozoidų judrumas po 72 valandų tur÷jo didelę įtaką jų apvaisinimo galiai.
1.4. Spermatozoidų morfologija - gyvybingumui įtaką darantis
veiksnys
Mokslininkai savo atliktuose darbuose pažym÷jo, kad spermatozoidų morfologijos nustatymas yra reikšmingas diagnostinis spermos kokyb÷s rodiklis, turintis reikšmingą įtaką spermatozoidų judrumui ir gyvybingumui (D. Waberski et al., 1990, 1994; Y. Itoh ir Y. Toyama, 1995; Y. Itoh et al., 1996; B. Corcuera et al., 2002; J. Gadea, 2002
E. Blom (1973). Spermatozoidų patologijas suskirst÷ į:
Svarbias – neišsivystę, dvigubi, akrosomų defektai, kriauš÷s formos, siauro pagrindo, nenormalių kontūrų, mažos nenormalios galvut÷s, laisvos (be uodeg÷lių) nenormalios galvut÷s, vidurin÷s dalies defektai, proksimaliniai lašeliai, stipriai susisukusios ir susilanksčiusios uodeg÷l÷s.
Mažiau svarbias – siauros galvut÷s, mažos ar didel÷s normalios galvut÷s, laisvos (be uodeg÷lių) normalios galvut÷s, nesimetrinis uodeg÷l÷s prisitvirtinimas, distaliniai lašeliai, paprastai užlinkusi uodeg÷l÷.
Pašalines ląsteles spermoje – epitelin÷s ląstel÷s, medūzos formos ląstel÷s, verpst÷s formos ląstel÷s, spermatogeninio epitelio ląstel÷s, leukocitai, eritrocitai.
Uodeg÷lių patologijos apima paprastai susisukusias uodeg÷les, susisukusias po galva arba aplink galvą, taip pat dvigubai susisukusias uodeg÷les (Donald G. Levis, 2002). Uodeg÷lių patologijos atsiranda spermatozoidų brendimo stadijoje arba jiems keliaujant ants÷klidžiu. Paprastai susisukusios uodeg÷l÷s yra dažniausiai pasitaikanti patologija, atsirandanti netinkamai apdorojant ar laikant spermą (E. Blom., A. A. Birch, 1975). Atliekant bandymus su žinduolių sperma pasteb÷ta, kad greitas spermos atv÷sinimas ir atskiedimas fosfato buferiniu tirpalu ar fiziologiniu tirpalu sukelia uodeg÷lių susisukimą.
Susisukusios uodeg÷l÷s pakeičia spermatozoidų jud÷jimą ir jie negali prasiskverbti pro kiaušin÷lio skaidriąją zoną ir negali apvaisinti kiaušin÷lio (E. Blom, 1977).
Labai svarbus pažeidimas – akrosomų defektai. Jie vystosi spermatogenez÷s metu, Goldžio stadijoje. Pažeidimas labai svarbus apvaisinimui, tod÷l gyvuliai, kurių spermoje daug spermatozoidų su specifiniais akrosomų defektais, praktiškai yra nevaisingi. Specifiniai akrosomų defektai atsiranda, kai įtaką daro genetiniai ir aplinkos faktoriai, o nespecifiniai – saugant spermatozoidus ilgesnį laiką ( V. Riškevičien÷ ir H Žilinskas, 1999).
Citoplazminiai lašeliai – labai dažnai sutinkamas morfologinis pakitimas. Citoplazminis lašelis yra apie 2 mikrometrų diametro (M. Kaplan et al., 1984). Citoplazminis lašelis susideda iš citoplazmos ir ląstel÷s organelių kilm÷s membranų, kurios galimai yra kitų spermatidžių organelių liekanos, atsiradusios joms sunykstant paskutin÷s spermiogenez÷s stadijos metu (R. Oko et al, 1993).
Tačiau D. Waberski et al. (1994) savo tyrimuose teig÷, kad distaliniai lašeliai apsivaisinimui yra mažiau reikšmingi nei proksimaliniai lašeliai. Šie mokslininkai padar÷ išvadą, kad citoplazminiai lašeliai yra rimtas morfologinis defektas, turintis didelę reikšmę spermai, laikomai in vitro bei naudojamai dirbtiniam s÷klinimui. Skiesta kuilių sperma, turinti didelį kiekį proksimalinių ir distalinių citoplazminių lašelių, tur÷jo neigiamą koreliaciją vados dydžiui ir n÷štumo dažnumui.
Proksimaliniai ir distaliniai citoplazmos lašeliai ilgą laiką nebuvo laikomi rimta patologija, kol biocheminiais tyrimais nustatyta, kad citplazmos lašeliuose yra fermento lipoksigenaz÷s, atsakingo už lipidų peroksidaciją, taip pat dalyvaujančio ir akrosomin÷je spermatozoido reakcijoje (V. Riškevičien÷, 2008).
Taip pat nustatyta, kad citoplazminiame lašelyje yra baltymas šaperonas ubikvitinas, dalyvaujantis baltymų proteoliz÷je formuojantis pailgajai spermatidei. Šių abiejų baltymų – lipoksigenaz÷s ir ubikvitino – sinergistinis veikimas, nepažeisdamas spermatidžių membranos, s÷kmingai reguliuoja spermatidžių diferenciaciją s÷klid÷je ir subrendimą ants÷klidyje. Jei citoplazmos lašeliai spermatozoido vystymosi ants÷klidyje metu nuo spermatozoido nepasišalina, spermoje atsiranda spermatozoidų su proksimaliniais ar distaliniais lašeliais, o juose esanti lipoksigenaz÷ ar ubikvitinas sukelia membranų lipidų peroksidaciją; susidarę laisvieji radikalai pažeidžia spermatozoido membranas ar jų funkcijas ir taip sumažina spermatozoidų judrumą ir apvaisinamąją galią (V. Riškevičien÷, 2008). Lipidų peroksidacija – žalojantis procesas, vedantis prie spermatozoido judrumo sumaž÷jimo bei apvaisinimo geb÷jimo mažinimo (A. Lenzi et al., 1996). Susidarę ROS veikia spermatozoido funkcijas peroksiduojant nesočiąsias riebalų rūgštis plazmin÷je membranoje
bei pakeičia citoskeletą ir aksonemos vystymąsi (E. De Lamirande ir C. Gagnon, 1992). Tuo vadovaudamiesi šie mokslininkai rekomendavo, kad bendras citoplazminių lašelių procentas ejakuliate neturi viršyti 10 proc., ypač kai naudojama sperma laikoma in vitro.
Spermatozoidų morfologijos įvertinimas yra indikatorius, rodantis, kad spermatogenez÷s, spermatozoidų brendimo ar ejakuliacijos procesuose yra sutrikimų. S÷klinimui kuiliai parenkami remiantis jų spermos mažu spermatozoidų patologijų kiekiu, bet d÷l apsiparšiavimo remtis statistiniais skaičiavimais ir koreliacija n÷ra labai informatyvu. Tačiau yra tyrimų, parodžiusių žymią neigiamą koreliaciją tarp spermatozoidų su citoplazminiais lašeliais ir apsiparšiavimo bei gyvų gimusių paršelių (A. Zeuner, 1992).
1.5. Spermatozoidų koncentracija ir jos įtaka gyvybingumui
Spermos koncentracija daro įtaką s÷klin÷s plazmos kiekiui, supančiam kiekvieną spermatozoidą skiestoje bei šviežioje spermoje. Did÷jant spermos koncentracijai, s÷klin÷s plazmos kiekvienam spermatozoidui maž÷ja (Kommisrud et al., 2002).
E. Kommisrud et al. (2002) atliktame tyrime pasteb÷jo, kad ejakuliatą laikant ilgesnį laiką, judrumas išliko geresnis, kai spermos koncentracija neskiestoje spermoje buvo mažesn÷, lyginant su didesn÷s koncentracijos sperma. Tai parodo, kad didesnis spermos plazmos kiekis daro teigiamą įtaką spermatozoidų judrumui; be to galima manyti, kad joje yra komponentų, naudingų geresniam judrumo išlaikymui, ir šių komponentų koncentracija po praskiedimo gali būti labai svarbi.
D. L. Garner et al. (2001) tyrimais įrod÷ teigiamą prid÷tos spermos plazmos įtaką bulių spermatozoidų gyvybingumui.
Nustatyta, kad spermatozoidų koncentracija ir skiestos spermos saugojimo laikas yra veiksniai, stipriai veikiantys spermatozoidų judrumą spermos doz÷se (Stančić et al., 2002; Kommisrud et al., 2002; Stančić et al., 2003ab; Grafenau et al., 2003ab; Katanić, 2004; Boe-Hansen et al., 2005; Stančić et al., 2009).
1.6. Spermos skiedikliai ir jų įtaka spermatozoidų gyvybingumui
Spermos skiedikliai yra sukurti, kad prailgintų spermatozoidų gyvenimo trukmę po spermos surinkimo. Spermos laikymo sąlygos ir skiediklio sud÷tis yra labai svarbūs išoriniai
faktoriai, po spermos skiedimo darantys įtaką spermatozoidų gyvybingumui ir išgyvenimo trukmei.
Be skiediklio spermatozoidas negali išgyventi ilgiau nei kelias valandas. Spermos skiedimo tikslas yra stabilizuoti spermatozoidą prailgintam laiko periodui, neprarandant apvaisinimo galios. Spermatozoido medžiagų apykaita turi būti sumažinta arba sustabdyta, kad jis gal÷tų išsaugoti apvaisinimo geb÷jimus. Be to, geras spermos skiediklis turi apsaugoti spermatozoidą nuo aplinkos poveikio, išsaugant nepažeistą membraną, bei apsaugoti nuo žalojančių likutinių produktų (P. Senger et al., 2003).
Skiedikliai turi atlikti penkias pagrindines funkcijas: 1. suteikti maisto medžiagas spermatozoidų medžiagų apykaitai vykti; 2. neutralizuoti metabolitus; 3. stabilizuoti spermatozoidų membranas; 4. išlaikyti osmotinę pusiausvyrą; 5. pristabdyti bakterijų dauginimąsi.
Skiedikliai bendrai skirstomi į trumpo (3 dienų) arba ilgo (5–7 dienų) laikymo, atsižvelgiant į jų galimybę išlaikyti spermatozoidų gyvybingumą (Flowers, 2004). Kuilio spermatozoido osmosinis sl÷gis yra 290–300 mOsm ir jis gali toleruoti sl÷gio svyravimus (240–380 mOsm).
Šviežiai paimtos kuilių spermos pH yra apie 7,4, tai yra panaši į kitų organizmo skysčių. Maž÷jant pH – maž÷ja metabolizmas bei judrumas. Gliukoz÷ yra pagrindinis spermatozoido angliavandenis, tad vykstant jos metaboliniams procesams, maž÷ja intraląstelinis pH. Pieno rūgštis yra pagrindinis šio proceso metabolitas ir naudojamas kaip spermos kokyb÷s indikatorius. Taigi buferinių medžiagų (hidrokarbonato, natrio citrato) įd÷jimas į spermos skiediklį kontroliuoja plazmos pH.
Europoje, kur spermos pa÷mimas ir s÷klinimas dažniausiai vyksta toje pačioje fermoje, naudojami trumpesnio, o Amerikoje, kur atstumai tarp veislininkyst÷s įmonių bei fermų didesni – ilgesnio veikimo spermos laikymo skiedikliai. Kai norima laikymą prailginti, skiedžiant būtina sumažinti temperatūrą bei spermatozoidų metabolinį aktyvumą iki pakankamo apvaisinimui laipsnio.
J. Gadea (2003) apraš÷ spermos skiediklius bei suskirst÷ juos pagal naudojimą į periodus po atskiedimo: trumpo laikymo (Beltsville Liquid (BL-1), Beltsville Thawing Solution (BTS), Illinois Variable Temperature (IVT), Merck-III, Kiev ir Vital) bei ilgo laikymo (Acromax, Androhep, Androstar Plus, Duragen, Dofu gold, Modena, MR-A, MULBERRY-III, Reading, NUTRIXcell, VITASEM LD, Zorlesco ir ZORPVA), taip pat antioksidantus (BSA, beta-karotinas, cisteinas, hipotaurinas, taurinas, vitaminas E, askorbo rūgštis ir kiti).
H. Funashasi ir T. Sano (2005) antioksidantus išskyr÷ kaip teigiamą faktorių d÷l geb÷jimo išlaikyti spermos kokybę saugojimo metu, mažinant žalingą reaktyvių deguonies atmainų poveikį ir lipidų peroksidaciją spermatozoido plazmin÷je membranoje.
1983 metais J. Alvarez ir B. Storey atliktu tyrimu, kuriame BSA buvo įd÷tas į triušių spermą, padar÷ išvadą, kad BSA geba išlaikyti judrumą ir slopinti lipidų peroksidaciją. Kokiu būdu BSA tai atlieka, pilnai neišaiškinta, tačiau autoriai sp÷ja: kadangi BSA yra per didelis praeiti pro plazminę membraną, jis gali apsaugoti nuo lipidų peroksidacijos, prisitvirtindamas prie išorin÷s membranos pus÷s. Ši hipotez÷ grindžiama tuo, kad BSA geba formuoti viduląstelinius ryšius su spermatozoido plazmine membrana. Tai nustat÷ M. L. Blank et al. (1976).
BSA dedamas į ilgo laikymo skiediklius, pavyzdžiui, Androhep (W. L. Flowers, 2004). R. O. Davis et al. (1981) nustat÷, kad cholesterolis yra labiausiai paplitęs lipidas žinduolių spermoje. Membranos cholesterolis yra neigiamai veikiamas ir oksiduojasi spermatozoidui senstant, taip pat neigiamos įtakos jam turi ir kitos aplinkos sąlygos.
R. Vishwanath ir P. Shannon, 2000 metais atlikdami tyrimus, nustat÷, kad aukšta temperatūra, deguonies kiekis, pH svyravimas ir osmotiškumas yra pagrindiniai išoriniai faktoriai, darantys įtaką cholesterolio ištek÷jimui iš spermatozoido.
T. Katila (1997) apraš÷, kad tinkamas spermos surinkimas ir apdorojimas padidina gero spermos išsaugojimo galimybę. Šviesa, šaltis ar karštis stipriai neigiamai veikia spermą.
K. F. Weitze (1990) sukūr÷ Androhep skiediklį. Tai pH reguliatoriaus ir BSA skiediklio mišinys, kompensuojantis skiedimo efekto nuostolius spermos plazmoje bei atkuriantis švelnią, hipertoninę aplinką (309mOsm). Šis skiediklis naudojamas ilgesniam spermos laikymui (ilgiau nei 4 dienas).
2. Spermatozoidų judrumo ir gyvybingumo nustatymo
tyrimo metodai
2.1. Spermatozoidų judrumo vertinimas kompiuterine
spermatozoidų judrumo vertinimo sistema (CASA)
M. J. Zinaman et al. (1996) CASA apibūdino kaip labai gerą priemonę spermos analiz÷s priemonę. Šia kompiuterine analiz÷s sistema galima per kelias minutes išanalizuoti
jud÷jimo greitį: intensyviai, vidutiniškai, l÷tai judančius bei nejudrius. Taip pat CASA geba nustatyti laiką, per kurį spermatozoidas įveik÷ nustatytą atstumą ir kitus konkretaus spermatozoido jud÷jimo parametrus (2 paveikslas).
2 pav. Spermatozoidų judrumo vertinimas kompiuterine spermatozoidų judrumo vertinimo sistema (CASA)
2.1.1. Spermatozoido jud÷jimo greičio rodikliai
Spermatozoido jud÷jimo greičiui įvertinti naudojami trijų rūšių greičio rodikliai, nurodantys centroido judesių greitį, tai: VCL, VSL ir VAP.
Netiesinio jud÷jimo greitis (VCL) – jud÷jimas, kurio metu spermatozoido jud÷jimo kryptis yra kintanti ir spermatozoido jud÷jimo kelias – netiesi (lenkta) linija. Tai dvimatis trimačio netiesiaeigio jud÷jimo takelio atvaizdavimas. Šis rodiklis parodo, kokiu greičiu spermatozoidas, jud÷damas savo trajektorija, įveik÷ užfiksuotą atstumą.
Vidutinis įveikto atstumo greitis (VAP) – vidutinis įveikto atstumo greitis, trumpesnis atstumas negu skaičiuojant VCL. Jis parodo bendros spermatozoido jud÷jimo trajektorijos ilgį. Pagal D. Mortimer (1990), tai – “auksinis standartas” nustatant spermatozoido įveikto atstumo vidurkį.
Tiesinio jud÷jimo greitis (VSL) – spermatozoido galvut÷s jud÷jimo vidutinis greitis, suskaičiuotas išvedant tiesią liniją tarp dviejų spermatozoido taškų, fiksuotų pradžioje ir pabaigoje. C. Holt et al. (1997) tyrimais nustat÷, kad sperma su padid÷jusiu spermatozoidų VSL ir trajektorijos tiesiškumu (STR) tur÷jo ryšį su vados kiekiu po dirbtinio apvaisinimo, tai yra, did÷jant šiem rodikliams, did÷jo gimusių paršiukų skaičius.
DJ. McLean et al. (1997) atlikęs tyrimą nerado jokio VSL rodiklio skirtumo tarp vaisingų ir nevaisingų gaidžių, bet tai tikriausiai buvo d÷l tarp atskirų grupių 30 proc. judrumo vidurkio skirtumo.
2.1.2. Spermatozoidų jud÷jimo greičio koeficientai
S. P. Boyers et al. (1989) apraš÷ trajektorijas, giliau apibūdinančias spermatozoidų jud÷jimo greičio koeficientų vertes.
LIN – (linijiškumas) nurodo tiesin÷s ir netiesin÷s spermatozoido jud÷jimo linijų palyginimą (pavyzdžiui, jei abi linijos sutampa – spermatozoidas 100 proc. juda tiesiai).
Ratu judantys spermatozoidai tur÷s šį rodiklį (LIN) mažą, nes jų netiesinio jud÷jimo kelias bus daug ilgesnis negu VSL.
LIN rodiklis būna didelis tada, kai netiesinis jud÷jimas turi sąlyginai mažą lateralinių galvut÷s poslinkių amplitudę ir bendrai jud÷jimas būna tiesus.
STR – (tiesumas) parodo ryšį tarp VSL ir VAP. (VSL/VAP) x 100. Trajektorija, turinti vienodai nutolusius kelio taškus ir mažą amplitudę, tur÷s aukštą tiesumo rodiklį, tada vidutinis kelias (VAP) bus gana tiesus. Besisukantys spermatozoidai tur÷tų tur÷ti mažą tiesumo rodiklį, nes vidutinio kelio įveikto atstumo greitis (VAP) bus netiesinio kelio vidurkis, ir tada jud÷jimas bus tiesus. (STR) bus didesnis nei linijiškumas (LIN), bet vis tiek nedidelis.
WOB – (virp÷jimas) – tai ryšio tarp vidutinio ir netiesinio takų išraiška. (VAP/VCL) x 100. WOB spermatozoido bus mažas, jei jis tur÷s plačią jud÷jimo trajektoriją.
Įvairių gyvūnų spermos tyrimuose šie judrumo rodikliai koreliavo su spermos apvaisinimo paj÷gumu ir n÷štumu (P. B. Farrel et. al., 1998). Mokslininkas, ištyręs spermą
(+0,98) su karvių vaisingumu. P. Kathiravan et al. (2011) nustat÷ rodiklių VAP, VSL ir VCL aukštą koreliacinį ryšį su apsivaisinimu in vitro.
R. Kasimanickam et al. (2007) tirdamas avinų spermą nustat÷, kad koncentracija ir dienų skaičius stipriai neigiamai koreliavo su spermatozoidų stuktūriniais, funkciniais ir judrumo parametrų kitimais (P < 0.0001).
S. Shafer-Somi ir C. Aurich (2007) pasteb÷jo, kad spermos doz÷se kartais būna pašalinių dalelių, kurias aparatas gali užfiksuoti kaip negyvus spermatozoidus. Kad spermatozoidas būtų atpažintas kaip spermatozoidas, videokadre turi būti nustatyti jo galvut÷s ilgis ir plotis bei turi tur÷ti atitinkamą ryškumą (D. Mortimer, 1994). Buvo nustatyta, kad geriausią nuotrauką spermatozoido analizei galima išgauti naudojant fazių kontrastinį mikroskopą. Spermos galvut÷ fiksuojama kaip ryškus objektas tamsiame fone (C. H. Yeung and E. Nieschlag, 1993).
Metodų, pagal kuriuos identifikuojamas ir fiksuojamas spermatozoido jud÷jimas tarp kompiuterinių analizatorių, esti įvairių, pavyzdžiui, sistema “CellSoft” identifikuoja spermatozoido galvutę kaip taškų seką bei nustato visų taškų centrą – centroidą (G. S. Berns and M. W. Berns, 1982).
Celltrack sistema naudoja kraštinių linijų aptikimo metodą, pagal kurį skaičiuojami tik taškai, apribojantys spermatozoido ribas, ir pagal jų koordinates nustatomas centroidas (S. P. Boyers et al., 1989). Hamilton Thorne CASA sistema identifikuoja spermatozoidą, nustatydama ir fiksuodama kiekvienos nuotraukos ryškiausią vietą. Nor÷damas pabr÷žti šio metodo pritaikymo galimybes, C. H. Yeung et al. (1992) palygino metodų taikymą skirtingoms gyvūnų rūšims ir nustat÷, kad, pavyzdžiui, žmonių spermatozoido toks taškas yra apytiksliai galvut÷s centre, o žiurkių spermatozoido – vidurin÷je dalyje.
Tik viena CASA komercin÷ sistema (Strömberg-Mika Cell Motility Analyser(CMA)) kiekvienoje nuotraukoje identifikuoja visą spermatozoidą – nuo galvut÷s iki uodeg÷l÷s (Neuwinger et al., 1990).
CASA turi ir savų minusų, kurie dažni visuose prietaisuose. Vienas iš jų – spermatozoido neatskyrimas nuo nuos÷dų, susigrūdusių į grupeles, arba agliutinuotų spermatozoidų. Tai gali būti nepakankamai geri trajektorijos atkūrimo aspektai.
Atskirti nuos÷das ir spermatozoidus yra svarbu tuomet, kai CASA sistema naudojama nustatyti spermos koncetracijai arba judrumui. Sistema, nuos÷das ir kitas pašalines daleles priskirdama spermatozoidams, nustato klaidingai aukštą spermatozoidų koncentraciją ar netikslius judrumo rezultatus (D. Vantman et al., 1988).
Per 10 metų laikotarpį SCA® kūr÷jams dirbant su pačiais įžymiausiais apvaisinimo centrais ir keletu tarptautinių universitetų, padaryta išvada, kad dabartin÷je rinkoje SCA® yra viena iš geriausių CASA sistemų.
SCA® turi daug privalumų, tarp jų – didelis tikslumas ir pasikartojamumas, kuris neįmanomas dirbant remiantis įprastais metodais. Windows platformoje veikianti sistema greitai išmokstama per trumpą laiką. SCA® yra būtina programa moksliniams tyrimams ir įrodymams, be to – aukštos kokyb÷s įrankis rezultatams nustatyti.
2.2. Hipoosmotinio rezistentiškumo testas
R. S. Jeyendran et al. (1984) šį testą apibūdino kaip paprastą testą, pagrįstą nepažeistos ląstel÷s pusiau laidžios membranos pralaidumu, leidžiančiu spermatozoidui išbrinkti atsidūrus hipoosmotin÷se sąlygose. Vanduo tuomet patenka į sveiko spermatozoido vidų, o miręs spermatozoidas lieka su nesusisukusia uodeg÷le, nes į osmoso pokyčius jis nereaguoja.
Pristatytas kaip klinikinis, hipoosmotinis testas gali būti naudojamas ir kaip papildomas spermatozoidų gyvybingumo nustatymo testas. Jo metu lengva vertinti rezultatus, gaunama papildoma informacija apie spermatozoidų membranos vientisumą.
Funkcinis bei struktūrinis spermatozoido membranos vientisumas jo gyvybingumui yra esminis. Dažnai naudojamas dažymo eozino-nigrozino dažais testas rodo tiktai struktūrinius membranos pakitimus. Hipoosmotinis testas naudojamas įvertininti membranos funkcinę būklę. Testo principas pagrįstas funkciuonuojančių spermatozoidų geb÷jimu išsipūsti hipoosmotiniame tirpale. Skystis tokiame tirpale per ląstel÷s plazminę membraną juda į ląstelę. M÷gindami atkurti pusiausvyrą tarp ląstel÷s vidaus ir išor÷s, spermatozoidai su funkciškai sveika membrana pradeda brinkti uodeg÷lių srityje (Cabrita et al., 1999). Toks spermatozoidas priskiriamas prie spermatozoidų su susisukusia uodeg÷le arba vadinamas hipoosmozei atspariu (HOS+), tuo tarpu spermatozoidų uodeg÷l÷s su funkciškai pažeista membrana neišbrinksta. Tirpalo ir spermatozoido osmotiškumas turi būti pakankamai skirtingas, kad sukeltų geriausią efektą nesukeldamas membranos liz÷s. Spermatozoidai laikomi gyvybingi, jei iš 200 spermatozoidų suskaičiuojama daugiau nei 40 proc. su susisukusiomis uodeg÷l÷mis. R. S. Jeyendran et al. (1984) teig÷, kad osmotiškumas turi būti toks, kad spermatozoidai gal÷tų pakankamai išbrinkti, tačiau ne per daug, kad neįvyktų membranos liz÷. J. M. Vasquez et al. (1997) nustat÷, kad kuiliams HOT tirpalo osmotiškumas turi būti 50–150 mOsm/l.
2.3. Subjektyvus spermatozoidų judrumo įvertinimas
Virtualus spermatozoidų judrumo tiesia eiga judrių spermatozoidų įvertinimas procentine išraiška yra vienas labiausiai paplitusių spermos gyvybingumo vertinimo metodų. Tai subjektyvus vertinimo metodas, nes galutiniam rezultatui daro įtaką steb÷tojo įgūdžiai ir patirtis. S÷kmingam apvaisinimui reikia tam tikro kiekio judrių ir morfologiškai nepakitusių spermatozoidų skaičiaus. Tyrimais nustatyta, kad kuilių ejakuliatai, kuriuose yra mažiau nei 60 proc. judrių spermatozoidų, ir mažiau nei 70 proc. morfologiškai nepakitusių spermatozoidų, yra blogos kokyb÷s ir netur÷tų būti naudojami s÷klinimui. Judrumo ir morfologijos rodikliai tiesiogiai neatspindi apvaisinimo kokyb÷s, tačiau parodo tam tikrą spermatozoidų gyvybingumo vertę. Spermatozoidų gyvybingumo ir morfologijos vertinimas gali netiesiogiai daryti įtaką apvaisinimo rezultatams, jeigu blogos kokyb÷s ejakuliatai bus eliminuojami, o s÷klinimui naudojama tik geros kokyb÷s sperma. D÷l to bus apvaisinama daugiau patelių ir gaunama daugiau palikuonių (Januškauskas, 2010).
2.4. Spermatozoidų akrosomų vertinimas
Keletas atliktų tyrimų leidžia daryti prielaidą, kad akrosomų vientisumas gali būti geresnis spermos kokyb÷s indikatorius nei judrumas. E. Kommisrud et al. (2002) atliko tyrimą, kuriame vertino spermatozoidų kitimą, laikant ejakuliatą penkias dienas. Jis pasteb÷jo, jog laikant spermą ilgesnį laiką, akrosomos yra labiau jautrios, negu kitos spermatozoido organel÷s, svarbios judrumui.
Buvo nustatyta, kad tiek judrumo lygį, tiek patologinių akrosomų skaičių bei jų kitimą lemia individualios kuilio savyb÷s. Įdomus faktas, kad E. Kommisrud et al. (2002) nepasteb÷jo jokios kuilio veisl÷s įtakos šiems rodikliams. Įtakos taip pat nedar÷ ejakuliato tūris.
Spermatozoidų koncentracija daugiau įtakos dar÷ spermatozoidų judrumui, tačiau ne akrosomų kitimui. Spermos plazmos prid÷jimas į ejakuliatą akrosomoms apsaugin÷s funkcijos netur÷jo.
N. L. Cross (1996) pasteb÷jo, kad žmonių spermos plazmoje esantis cholesterolis, manoma, pristabdo akrosomų reakcijas, vykstančias spermatozoide, taip gerindamas jų išlikimą. Pagal P. F. Watson ir J. M. Plummer (1985), kuilių, lyginant su žmonių, spermatozoidų membranos susideda iš mažo kiekio cholestorolio. Taigi galimas mažas
cholesterolio kiekis spermos plazmoje, dar labiau sumaž÷jantis ją atskiedus, gali paaiškinti, kod÷l spermatozoidų koncentracija doz÷je netur÷jo įtakos akrosomų vientisumo pokyčiams.
3. Tyrimų metodika
3.1. Bandymų atlikimo schema
Spermos tyrimai buvo atliekami 2012 metų birželio– liepos m÷nesiais. Buvo tiriama kuilių reproduktorių, laikomų Lietuvos veislininkyst÷s įmon÷se, sperma. Ji buvo imama iš sveikų kuilių manualiniu būdu ir skiedžiama ilgalaikiu spermos skiedikliu Androhep Plus ir išpilstoma po 150 ml į spermos dozei laikyti pritaikytus plastikinius konteinerius.
Spermos doz÷s buvo pristatomos į LSMU VA Gyvulių reprodukcijos laboratoriją. Sperma buvo saugoma 150 valandas 17°C temperatūroje termospintoje FRIOCELL (Vokietija) ir tiriama pra÷jus 6, 30, 54, 78, 102, 150 valandų po spermos pa÷mimo. Buvo atliekamas jos gyvybingumo ir judrumo parametrų tyrimas, naudojant HOT gyvybingumui nustatyti bei judrumui įvertinti – SCA® (sperm class analyzer) (CASA sistema) programą ir šviesinį OLYMPUS BH-2 (Japonija) bei fazių – kontrastinį NIKON (Japonija) mikroskopus.
Kadangi skysta sperma laikoma iki 72 valandų, šiuo tyrimu buvo norima įvertinti spermos kokybę ir po 78, 102, 150 valandų. Kiekvieną dieną iš bendros doz÷s buvo paimama po 5 ml spermos, skirtos tos dienos tyrimams, o pats konteineris 2 kartus per dieną apverčiamas, kad susimaišytų konteinerio apačioje nus÷dę spermatozoidai. Taip pat saugojimo metu iš konteinerių buvo išspaudžiamas oras.
Tyrimui buvo panaudota 33 kuilių sperma. Spermos tyrimai atlikti šia tvarka: Pirmąją dieną, pra÷jus 6 valandoms po spermos pa÷mimo:
a. Nustatoma spermatozoidų koncentracija doz÷je (Januškauskas, 2010); b. Nustatomas spermatozoidų judrumas (subjektyvus) (Januškauskas, 2010);
c. Kompiuterine spermatozoidų judrumo vertinimo programa SCA (Ispanija, 2011) įvertinamas objektyvus spermatozoidų judrumas bei spermatozoidų jud÷jimo greičio rodikliai ir koeficientai;
e. Įvertinama spermatozoidų morfologija (galvučių ir uodeg÷lių) (Riškevičien÷ ir Žilinskas, 1999);
g. Įvertinama spermatozoidų akrosomų būkl÷ (Riškevičien÷ ir Žilinskas, 1999).
Likusias dienas – po 30, 54, 78, 102 ir 150 valandų: a. Nustatomas spermatozoidų judrumas (subjektyvus);
b. Kompiuterine spermatozoidų judrumo vertinimo programa SCA įvertinamas objektyvus spermatozoidų judrumas bei spermatozoidų jud÷jimo greičio rodikliai ir koeficientai;
c. Atliekamas spermatozoidų gyvybingumo įvertinimas, naudojant atsparumo hipoosmotiniam tirpalui testą (HOT);
d. Įvertinama spermatozoidų akrosomų būkl÷.
Ištirti 33 kuilių spermos m÷giniai buvo analizuojami kartu; taip pat pagal nustatytų patologinių spermatozoidų procentą jie buvo suskirstyti į dvi grupes.
I grupę sudar÷ 13 m÷ginių, kuriuose bendras patologinių spermatozoidų procentas buvo ne didesnis nei 10 proc. (vidutiniškai 9 ±1,5 proc.), o II grupę sudar÷ 20 m÷ginių, kuriuose bendras patologinių spermatozoidų procentas buvo daugiau nei 10 proc. (vidutiniškai 18,4 ±7,6 proc.).
3.2. Subjektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas
Kuilio spermatozoidų judrumas buvo vertinamas 37°C laipsnių temperatūroje fazių kontrastiniu mikroskopu ant pašildomo stiklinio stalelio, nustatant judrių spermatozoidų kiekį procentais. Ant objektyvinio stiklelio užlašinama 10 µL spermos ir, padidinus 20 kartų, įvertinamas judrumas. Vertinama pagal 100 proc. skalę vidutiniškai dešimtyje matymo laukų. Išvedamas spermatozoidų judrumo m÷ginyje aritmetnis vidurkis (A. Januškauskas, 2010).
3.3. Objektyvus spermatozoidų judrumo vertinimas kompiuterine
spermatozoidų judrumo vertinimo sistema (SCA)
Spermatozoidų judrumo tyrimas buvo atliktas naudojantis SCA v.5.1 Microptic S.L. CASA sistema (Ispanija, 2011), veikiant 25 videokadrų per sekundę fiksavimu per IBM suderintą asmeninį kompiuterį, veikiantį 33 mhz. Kontrastas ir filtrai buvo parinti subjektyviai, tačiau minimalus (MTP 24) (minimum trackpoints) ir (search radius) paieškos spindulys (SR) 13 mikrometrų. Šių nustatymų patvirtinimas buvo aprašytas mokslo straipsniuose (Holt et al, 1996). Nustatant MTP prie 24 reiškia, kad kiekvienas spermatozoidas sekamas tik tada, jai jis nepertraukiamai užfiksuojamas mažiausiai 24 videokadruose.
SR (paieškos spindulys) nustato paieškos zoną iki arčiausio judančio spermatozoido. Pernelyg mažas SR laipsnis neleidžia paieškos zonoje aptikti greitai judančių ląstelių, tuo tarpu per didelis SR laipsnis lemia klaidingus rezultatus susiejant tarpusavyje nesusijusius objektus.
3.3.1. Spermatozoido jud÷jimo greičių nustatymas
Spermatozoido jud÷jimo greičiui įvertinti naudojami trijų rūšių greičio rodikliai, nurodantys centroido judesių greitį, tai: VCL, VSL ir VAP.
Netiesinio jud÷jimo greitis (VCL) – jud÷jimas, kurio metu spermatozoido greičio kryptis yra kintanti ir spermatozoido jud÷jimo kelias – netiesi (lenkta) linija. Tai dvimatis trimačio netiesiaeigio jud÷jimo takelio atvaizdavimas.
Vidutinis įveikto atstumo greitis (VAP) – vidutinis įveikto atstumo greitis, trumpesnis atstumas negu skaičiuojant VCL. Jis parodo bendros spermatozoido jud÷jimo trajektorijos ilgį (spermatozoido įveikto atstumo vidurkį).
Tiesinio jud÷jimo greitis (VSL) – spermatozoido galvut÷s jud÷jimo vidutinis greitis, suskaičiuotas išvedant tiesią liniją tarp dviejų spermatozoido taškų, fiksuotų pradžioje ir pabaigoje.
3.3.2. Spermatozoido jud÷jimo greičio koeficientai
LIN (linijiškumas) – parodo tiesin÷s ir kreivin÷s spermatozoido jud÷jimo linijų palyginimą (pavyzdžiui: jei abi linijos sutampa – spermatozoidas 100 proc. juda tiesiai).
Ratu judantys spermatozoidai tur÷s šį rodiklį (LIN) mažą, nes jų netiesinio jud÷jimo kelias bus daug ilgesnis negu VSL.
LIN rodiklis būna didelis, kai netiesinis jud÷jimas turi sąlyginai mažą lateralinių galvut÷s poslinkių amplitudę ir bendrai jud÷jimas būna tiesus.
STR (tiesumas) – parodo ryšį tarp VSL ir VAP. (VSL/VAP) x 100. Trajektorija, turinti vienodai nutolusius kelio taškus ir mažą amplitudę, tur÷s aukštą tiesumo rodiklį, tada vidutinis kelias (VAP) bus gana tiesus. Besisukantys spermatozoidai tur÷tų tur÷ti mažą tiesumo rodiklį, nes vidutinis kelias (VAP) bus netiesinio kelio vidurkis ir tada jud÷jimas bus tiesus, (STR) bus didesnis nei linijinis (LIN), bet vis tiek nedidelis.
WOB (virp÷jimas) – tai ryšio tarp vidutinio ir netiesinio takų išraiška. (VAP/VCL) x 100. Spermatozoido WOB bus mažas, jei jis tur÷s plačią jud÷jimo trajektoriją.
3.4. Spermatozoidų morfologinis tyrimas
3.4.1. Spermatozoidų uodeg÷lių morfologijos tyrimas
Sperma skiedžiama buferinio formalino tirpalu Eppendorf (Vokietija) m÷gintuv÷liuose, į kuriuos mikropipete įpilama po 190 µL buferinio formalino tirpalo ir po 50 µL spermos. Ant objektyvinio stiklelio uždedamas atskiestos spermos lašas, uždengiamas dengiamuoju stikleliu ir fazių kontrastiniu mikroskopu, padidinus 400 kartų, suskaičiuojama 200 spermatozoidų. Skaičiuojami ir vertinami visi matymo lauke esantys spermatozoidai. Norint išvengti tų pačių spermatozoidų suskaičiavimo, stiklelis slenkamas laužtine kreive.
Tyrimo metu registruojami spermatozoidų pažeidimai: proksimalinis lašelis, distalinis lašelis, laisvos galvut÷s, nenormali vidurin÷ dalis, paprastai susisukusi uodeg÷l÷, uodeg÷l÷s, susisukusios po galvute arba aplink ją, dvigubai susilanksčiusios uodeg÷l÷s. Taip pat nustatomi specifiniai ir nespecifiniai akrosomų defektai.
3.4.2. Spermatozoidų galvučių morfologijos tyrimas
Ant objektyvinio stiklelio uždedama (10 µL) anilino m÷lynojo dažų, juose išmaišomas spermos lašas (∼5 µL), stikleliu su nugludinta briauna paruošiamas tepin÷lis. Tepin÷lis išdžiovinamas ir šviesiniu mikroskopu, padidinus 1000 kartų, suskaičiuojama 100 spermatozoidų.
Tyrimo metu registruojamos spermatozoidų galvučių patologijos: kriauš÷s formos, siauro pagrindo, siauros, nenormalios ir be uodeg÷lių galvut÷s, nenormalių kontūrų bei neišsivystę spermatozoidai. Registruojami spermatozoidai, turintys dydžio pakitimus (Riškevičien÷ V., Žilinskas H., 1999).
3.5. Spermatozoidų koncentracijos doz÷je nustatymas
Kuilio sperma buvo skiedžiama destiliuotu vandeniu santykiu 1:50, tai yra į stiklinę įpilama 9,8 ml vandens ir 0,2 ml spermos. Po dengiamuoju stikleliu, pritvirtintu prie skaičiavimo kameros, įlašinama kruopščiai išmaišytos praskiestos spermos. Naudojant Biurkerio kamerą, spermatozoidai skaičiuojami įstrižai 5 dideliuose kvadratuose (80 mažų kvadrat÷lių).
Skačiuojami spermatozoidai, esantys kvadrato viduje bei ant kairiosios ir viršutin÷s kvadrato linijų.
Spermatozoidų koncentracija nustatoma pagal forumlę:
Koncentracija mlrd/ml = Spermatozoidų skaičius 80 mažų kvadrat÷lių x Praskiedimo laipsnis x 5 x 10000.
M÷ginio koncentracija skaičiuojama du kartus. Atlikus pakartotinį praskiedimą išvedamas dviejų skaičiavimų vidurkis (Januškauskas, 2010).
3.6. Spermatozoidų gyvybingumo nustatymas hipoosmotinio
rezistentiškumo testu (HOT)
Tyrimo eiga: 50 µL spermos m÷ginys sumaišomas su 0,5 ml 100 mOsmolių tri-natrio citrato fruktoz÷s (HOS) tirpalo, pašildyto iki 37–380C laipsnių temperatūros. Gauta spermatozoidų suspensija 1 valandą inkubuojama 37–380C laipsnių temperatūroje ir po to paruošus tepin÷lį m÷ginyje nustatomas spermatozoidų su susikusiomis uodeg÷l÷mis procentas.
Spermatozoidai išskiriami į tris kategorijas pagal uodeg÷lių susisukimo laipsnį: 1. Nesusikusios; 2. Susisukusios, nejudrios; 3. Susisukusios, judrios (A. Januškauskas 2010).
Tyrimo pabaigoje apskaičiuojamas bendras sureagavusių spermatozoidų procentas. Pagal Jeyendran (2003), ejakuliatas laikomas nenormaliu, jeigu mažiau nei 40 proc. spermatozoidų reguoja į HOT.
3.7. Statistiniai skaičiavimai
Statistin÷ duomenų analiz÷ buvo atlikta SPSS statistinio paketo Nr. 9 versija (SPSS for Windows 9.0, SPSS Inc., Chicago, IL, JAV, 1989–1999). Surinkti duomenys buvo apdoroti „Microsoft Excel“ (Microsoft Office Excell, 2003) programa. Analizuojant duomenis, pirmiausia buvo atliekamas jų aprašymas, naudojantis aprašomąja statistika (aritmetinis vidurkis). Koreliaciniai ryšiai tarp priklausomų kintamųjų įvertinti Pearsono koreliacine matrica. Duomenys buvo laikomi statistiškai patikimi, kai * p≤0,05; ** p≤0,01.
4. Tyrimų rezultatai
Mažesnis nei 60 proc. judrumas spermos doz÷je yra kritin÷ kuilių spermatozoidų judrumo riba. Spermatozoidų judrumas pra÷jus 78 valandoms nuo spermos saugojimo pradžios sumaž÷jo iki 57,88 proc. ir maž÷jo toliau. Bandymo pabaigoje po 150 valandų judrių spermatozoidų kiekis doz÷je vidutiniškai buvo 33,03 procento.
Tiriamų spermatozoidų atsparumo rodiklis hipoosmotiniam tirpalui pra÷jus 54 valandoms vidutiniškai buvo 41,78 ± 13,07 proc.; pra÷jus 78 valandoms nuo tyrimų pradžios šis rodiklis ÷m÷ maž÷ti, o pra÷jus 150 valandoms siek÷ vos 19,52 proc. (1 paveikslas).
1 pav. Spermatozoidų judrumo ir atsparumo HOT pokyčiai, saugant spermą 150 valandas, proc.
Įvertinus spermatozoidų judrumo parametrų kitimo tarpusavio santykį su HOT (1 paveikslas), parodantį spermatozoidų membranų funkcinius pokyčius, nustatyta, kad iki 78 saugojimo valandų ryškios ir patikimos koreliacijos tarp šių rodiklių n÷ra. Pra÷jus 102 valandoms, duomenys pradeda teigiamai koreliuoti tarpusavyje (r = 0,40, p≤0.05), o po 150 valandų koreliacija dar sustipr÷ja (r = 0,59, p≤0.01).
Analizuojant atskirų spermatozoidų patologijų, tai yra citoplazminių ląšelių, uodeg÷lių defektų bei galvučių defektų įtaką spermatozoidų judrumo ir rezistentiškumo HOT pokyčiams, neigiamas patikimas koreliacinis ryšys nustatytas pra÷jus 30 valandų tarp spermatozoidų galvučių patologijų ir HOT testo duomenų (r = - 0,375, p ≤ 0,05). Po 30, 78 ir 102 valandų patikima neigiama koreliacija (r = - 0,348, p ≤ 0,05, r = - 0,435, p ≤ 0,05) bei (r = - 0,374, p ≤ 0,05) atitinkamai nustatyta tarp spermatozoidų, turinčių proksimalinius ir/ar distalinius citoplazminius lašelius, kiekio ir spermatozoidų judrumo.
2 pav. Spermatozoidų judrumo greičio VCL, VSL, VAP parametrų kitimo dinamika Androhep plus skiedikliu skiestoje kuilių spermoje, µm/s
Antrame paveiksle pavaizduotas kompiuterine spermatozoidų judrumo parametrų analizavimo sistema (CASA) gautų spermatozoidų jud÷jimo greičio parametrų – VCL, VSL, VAP – kitimas per 150 valandų saugojimo laikotarpį spermoje, atskiestoje Androhep plus skiedikliu ir saugojamoje 170 C temperatūroje.
Netiesinis spermatozoidų judrumo greičio (VCL) rodiklio vidurkis iki 78 valandų buvo 77,82 ± 0,49 µm/s; tyrimo pabaigoje, pra÷jus 150 valandų nuo saugojimo pradžios, sumaž÷jo iki 63,5 µm/s.
Tiesinis spermatozoidų judrumo greitis (VSL) su nedideliais svyravimais, lyginant tarp jud÷jimo greičio po 6 ir 150 valandų, sumaž÷jo nuo 31,13 µm/s iki 28,82 µm/s. Vidutinio kelio greitis (VAP) tyrimo pradžioje po 6 valandų saugojimo buvęs 57,98 µm/s, vertinant po 150 valandų, buvo sumaž÷jęs iki 46,32 µm/s.
3 pav. Spermatozoidų judrumo greičio koeficientų LIN, STR, WOB kitimo dinamika Androhep plus skiedikliu skiestoje kuilių spermoje, µm/s
Trečiame paveiksle grafiškai pavaizduoti spermatozoidų jud÷jimo greičio koeficientų – LIN ir STR bei WOB – rodiklių kitimai per visą tyrimų laikotarpį (6–150 valandų).
LIN, nurodantis tiesin÷s (VSL) ir kreivin÷s (VCL) spermatozoidų jud÷jimo linijų palyginimą, bei sutapimą procentais (VSL/VCL.x100) did÷jo, did÷jant spermos saugojimo valandų skaičiui. Tyrimo pradžioje, po 6 valandų, VSL ir VSL linijų sutapimas, buvęs 39,98 proc., pra÷jus 150 valandų po spermos pa÷mimo, išaugo iki 47,12 procento.
STR, parodantis ryšį tarp VSL ir VAP rodiklių (VSL/VAP) x 100), tyrimo pradžioje buvo 53,68 proc. ir ilg÷jant spermos saugojimo laikui palaipsniui kilo, kol po 150 valandų pasiek÷ 64,10 procento. WOB, nusakantis ryšio išraišką tarp vidutinio (VAP) ir kreivinio (VCL) jud÷jimo linijų (VAP/VCL) x 100), nuo po 6 valandų užfiksuotų 74,25 proc. iki pat 150 valandų praktiškai laik÷si vienodas ir sumaž÷jo iki 72,78 procento.
4 pav. Judrumo ir judrumo geičių rodiklių ir koeficientų kitimas tyrimo laikotarpiu, pavaizduotas šimtaine trupmena
Ketvirtame paveiksle pateikiami judrumo bei CASA tyrimo būdu gauti spermatozoidų judrumo greičių parametrai ir koeficientai bei jų kitimas viso tyrimo metu.
Norint pavaizduoti ir įvertinti visus rodiklius vienoje diagramoje, šie rodikliai (µm/s ir proc.) buvo paversti šimtaine trupmena.
Diagramoje matyti, kaip maž÷jant spermatozoidų judrumui kartu maž÷ja ir spermatozoidų greičio rodikliai VCL, VSL, VAP, bet greičio judrumo koeficientai STR, LIN did÷ja, tik WOB lieka nepakitęs.
Judrumo tarpusavio ryšio su spermatozoidų judrumo greičių parametrais patikslinimui buvo nustatyti koreliaciniai ryšiai tarp šių parametrų. Nustatyta, kad spermatozoidų judrumas, vertinant subjektyviai, po 6 valandų teigiamai patikimai koreliavo su VCL (r = 0,485, p≤0.01), VSL (r = 0,390, p≤0.05) ir VAP (r = 0, 518, p≤0.01).
Po 30 valandų nustatyta patikima teigiama koreliacija su VAP rodikliu (r = 0, 376, p≤0.05), po 54 valandų – su VCL rodikliu (r = 0,494, p≤0.01), o su tiesinio jud÷jimo greičio koeficientu LIN patikima, bet neigiama koreliacija ( - 0,446, p≤0.05).
Nuo tyrimų pradžios pra÷jus 78 valandoms, patikimi teigiami judrumo koreliaciniai ryšiai nustatyti su VCL (r = 0,433, p≤0.05), VSL (r = 0,427, p≤0.05) ir VAP (r = 0, 572, p≤0.01).
Po 102 valandų teigiami koreliaciniai ryšiai tarp judrumo ir judrumo greičio paramertų sustipr÷jo ir buvo VCL (r = 0,644, p≤0.01), VSL (r = 0,558, p≤0.01), VAP (r = 0, 695, p≤0.01). Tie patys, tik silpnesni, koreliaciniai ryšiai išliko ir paskutinę tyrimų dieną (po 150 valandų) – v÷l buvo nustatyta patikima neigiama koreliacija su tiesinio ir netiesinio greičio koeficientais LIN (r = -0,546, p≤0.01) bei STR (r = -0, 651, p≤0.01).
1 lentel÷. Koreliaciniai ryšiai tarp spermatozoidų koncentracijos doz÷je (mljrd/ml) ir spermatozoidų judrumo bei spermatozoidų judrumo greičio parametrų ir koeficientų
Spermatozoidų jud÷jimo greičio rodikliai Spermatozoidų jud÷jimo greičio koeficientai Tyrimų dienos Spermatozoidų judrumas
VCL VSL VAP LIN STR WOB 6 val. -0,144 -0,2 0,164 -0,73 0,256* 0,38* -0,199 30 val. 0,157 0,156 0,178 0,171 0,07 0,07 0,024 54 val. -0,194 0,182 0,414* 0,267 0,379* 0,378* 0,248 78 val. -0,77 0,11 0,156 0,113 0,091 0,142 -0,05 102 val. -0,38 -0,021 0,114 -0,05 0,178 0,268 -0,86 150 val. 0,157 0,389* 0,225 0,333 -0,244 -0,259 -0,101
Pajuodintai ir žvaigždut÷mis pažym÷ti patikimi koreliaciniai ryšiai -*P≤0.05; ** P≤0.01
Nustačius spermatozoidų koncentraciją milijardais tyrimo doz÷s mililitre, buvo nustatytas bendras visų dozių koncentracijos vidurkis 0,038 ± 0,008 mljrd/ml.
Įvertinus spermatozoidų koncentracijos įtaką spermatozoidų judrumui ir spermatozoidų jud÷jimo greičio rodikliams, spermą saugant 150 valandų 17o C temperatūroje, atskiedus ją ilgalaikiu skiedikliu Androhep plus, nustatyti koreliaciniai ryšiai tarp spermatozoidų koncentracijos spermos doz÷je ir kiekvieną dieną kintančių judrumo bei judrumo greičio ir greičio koeficientų rodiklių (1 lentel÷).
Pra÷jus 6 valandoms nuo spermos pa÷mimo, STR rodiklis keit÷si – kuo spermatozoidų koncentracija doz÷je buvo didesn÷, tuo STR taip pat buvo didesnis. Tarp šio spermatozoidų greičio koeficiento rodiklio (STR) ir koncentracijos doz÷je nustatytas teigiamas patikimas koreliacinis ryšys r = 0,380, (p≤0,05) po 6 valandų ir po 54 valandų – (r = 0,378, p≤0,05). Po
