BIČIŲ PIENELIO BIOLOGINIO AKTYVUMO TYRIMAS IR LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ GAMYBA

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

KRISTINA PERMINAITĖ

BIČIŲ PIENELIO BIOLOGINIO AKTYVUMO TYRIMAS IR

LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ GAMYBA

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai: Prof. dr. Kristina Ramanauskienė

Prof. dr. Anna Maria Fadda

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data

BIČIŲ PIENELIO BIOLOGINIO AKTYVUMO TYRIMAS IR LIPIDINIŲ

NANONEŠIKLIŲ

GAMYBA

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai: prof.dr. Kristina Ramanauskienė, prof. dr. Anna Maria Fadda

Recenzentas: Darbą atliko:

Magistrantė

Kristina Perminaitė

3

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI...9

ĮVADAS...10

1. LITERATŪROS APŽVALGA...11

1.1.Bičių pienelio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas...12

1.2.Bičių pienelio pritaikymas dermatologinių preparatų gamybai...14

1.3.Ląstelių modeliai, taikomi bičių pienelio biologinio aktyvumo vertinimui...15

1.4.Liposominių nanonešiklių apibūdinimas...15

1.5.Liposomų panaudojimas lokaliam gydymui...17

1.6.Liposomų gamyboje naudojami lipidai...18

1.7.Liposomų kokybės nustatymas in vitro...20

1.8.Naujo tipo lipidiniai nanonešikliai – etosomos ir transfersomos...21

2. TYRIMO METODIKA...23

2.1.Naudotos medžiagos ir aparatūra...23

2.2.Ląstelių sėjimo metodika...24

2.3.Ląstelių tankio nustatymas...24

2.4.Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu...25

2.5.Ląstelių gyvybingumo nustatymas propidžio jodido/Hoechst 33528 metodu...26

2.6.Lipidinių nanonešiklių modeliavimas ir gamyba...26

2.7.Gelio gamyba parenkant gelifikuojančias medžiagas...29

2.8.10-HDA skvarbos į odą tyrimas ex vivo ...31

2.9.Analitiniai metodai...31

2.10. Statistinė analizė...32

3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS...33

3.1.HaCaT ląstelių augimas normaliomis sąlygomis...33

3.2.MTT metodu nustatytas 10-HDA ir bičių pienelio poveikis HaCaT ląstelių gyvybingumui...34

3.3.Propidžio jodido/Hoechst 33528 metodu nustatytas 10-HDA ir bičių pienelio poveikis HaCaT ląstelių gyvybingumui...36

4

3.5.Pagaminto gelio su hidroksietilceliulioze dalelių dydžio ir polidispersijos indekso parametrų

nustatymas...41

3.6.Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai...42

3.7.10-HDA skvarbos į odą iš skirtingų formuluočių tyrimo rezultatai...45

4. IŠVADOS...47

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...48

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS...49

5 7.

SANTRAUKA

K. Perminaitės magistro baigiamasis darbas, moksliniai vadovai prof.dr. Kristina Ramanauskienė ir prof.dr. Anna Maria Fadda;

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra, Kaunas. Universita degli studi di Cagliari, department of enviromental and life science, Cagliari, Italija.

Darbo tikslas – pagaminti liposomas su įterptu bičių pieneliu bei atlikti in vitro tyrimus, atlikti tyrimus su HaCaT ląstelėmis naudojant bičių pienelį bei gryną 10-hidroksi-2-deceno rūgštį.

Uždaviniai. Atlikti tyrimus su HaCaT ląstelėmis ir nustatyti skirtingų koncentracijų bičių pienelio bei 10-HDA mėginių įtaką odos ląstelių gyvybingumui; nustatyti sumodeliuotų lipidinių nanonešiklių fizikochemines savybes – vidutinį dalelių dydį ir polidispersiškumą bei įvertinti jų stabilumą; pagaminti vaisto formą – gelį – su įterptomis liposomomis; įvertinti 10-HDA skvarbą į odą iš skirtingų sumodeliuotų formuluočių.

Tyrimo metodai:

Ląstelių gyvybingumui įvertinti naudotas propidžio jodido/Hoechst 33258 bei MTT metodai. Skirtigų lipidinių nanonešiklių gamybai naudotas plono lipidų sluoksnio hidracijos metodas, homogenizavimui – ultragarsinis metodas. Į visus lipidinius nanonešiklius inkorporuotas bičių pienelis. Visų nanonešiklių vidutinis dalelių dydis ir polidispersiškumas nustatyti naudojnt Zetasizer Nano (Malvern, JK) analizatorių. Dalelių stabilumas vertintas po 1 val, 1 d, 1 sav, 2 sav, 1 mėn. po pagaminimo. Gelis pagamintas naudojant 2,5% hidroksietilceliuliozės. Skvarbos pro odą tyrimas atliktas naudojant Franz tipo celes, tyrimas vykdytas 8 valandas.

Rezultatai ir išvados.

Atlikti MTT bei Propidžio jodido/Hoechst 33528 tyrimai su HaCaT ląstelių linija naudojant skirtingų koncentracijų bičių pienelio ir 10-HDA tirpalų mėginius parodė, jog maži bičių pienelio ir 10-HDA kiekiai neveikia citotoksiškai, todėl juos galima naudoti ant odos norint gauti regeneruojantį ir žaizdų gijimą skatinantį bičių pienelio poveikį.

Nustatyta, kad pasirinktas lipidinių nanonešiklių metodas naudojant plono lipidų sluoksnio hidraciją yra tinkamas lipidinių nanonešiklių gamybai.Patvirtintas ultragarso tinkamumas homogenizuoti lipidines nanodaleles, gautos liposomos buvo 57,83nm dydžio, polidispersiškumas 0,287, tai atitinka taikomus reikalavimus.Atlikus liposomų stabilumo tyrimus liposomos su įterptu bičių pieneliu buvo stabilios, nustatyti pokyčiai buvo statistiškai nereikšmingi (p>0,05) po 30 dienų. Pagaminus vaisto formą – gelį su įterptomis liposomomis naudojant hidroksietilceliuliozę kaip gelifikuojančią medžiagą nustatyta, kad dalelių dydis atitinka reikalavimus. Atlikus skvarbos į odą tyrimą nustatyta, jog geriausiai į odos sluoksnius 10-HDA perneša liposominiai nešikliai, lyginant su kitomis formuluotėmis.

6

SUMMARY

The master thesis „Biologic activity of royal jelly and production of lipid nanoparticles“ written by K.Perminaitė, leading proffessors Kristina Ramanauskienė, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas and Anna Maria Fadda, University of Cagliari, Italy.

The aim of this study was to perform biologic activity experiments with HaCaT cells, which are immortalized human keratinocytes, and produce lipid nanoparticles with royal jelly.

Goals of the study: to perform laboratory experiments with HaCat cell line and sort out the effects of royal jelly and pure 10-HDA, which is the main fatty acid in royal jelly, for the cell line. To create lipid nanoparticles (liposomes, ethosomes and transfersomes) with incorporated royal jelly using thin lipid film hydration method and analyze physicochemical properties – size and polidispersity of nanoparticles, as well as evaluate stability of lipid nanoparticles. To produce semi-solid drug form – gel – production with incorporated liposomes and perfom transdermal experiment to find out how 10-HDA distributes in skin layers.

Methods. Cell viability was assessed by measuring the ability of cells to metabolyze MTT dye, additionally cell viability was evaluated using propidium iodide and Hoechst 33258 assay. All lipid nanoparticles were produced using thin lipid film hydration method and homogenyzed using ultrasonic method. Royal jelly was incorporated in all lipid nanocarriers. The size and dispersity of lipid nanoparticles were evaluated using Zetasizer Nano analyzer. The stability of all nanoparticle suspensions was assessed measuring size and PDI after 1 hour, 1 day, 1 week, 2 weeks, and 1 month after production. Gel was produced using 2,5% hydroxyethylcellulose. Transdermal assay was performed using Franz cells, for 8 hours, taking acceptor samples after 1,2,4,6 and 8 hours.

Results and conclusions. MTT and propidium iodide/Hoechst 33528 assays with HaCaT cell culture line using different concentrations of royal jelly and pure 10-HDA showed that low concentrations do not cause citotoxicity, therefore can be used topically on the skin for its regenerating and wound healing properties. The thin lipid film hydration method wass efficient for production of all lipid nanocarriers, as well as homogenization using ultrasonic method. Liposomes were 57,83nm size, and PDI was 0,287, which is sufficient for use, and after performing stability assays the liposome suspension was stable throughout the timeframe of 30 days. After gelification was assessed that the size slightly increases, and the system becomes less homogenic. Transdermal assay showed that liposomes penetrate better into the skin layers and carry more 10-HDA than royal jelly suspension or gelified liposomes.

7

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju magistro baigiamojo darbo vadovams – prof.dr. Kristinai Ramanauskienei ir prod.dr. Anna Maria Fadda už įvairiapusę pagalbą, patarimus, palaikymą atliekant eksperimentinę dalį ir baigiamojo darbo rašymo metu.

Dėkoju Kaljario universiteto darbuotojams prof.dr. Chiara Sinico, dr. Carla Caddeo, Michele Schlich, už pagalbą atliekant eksperimentinę dalį ir atliekant tyrimus su lipidiniais nanonešikliais.

Dėkoju LSMU FF klinikinės farmacijos katedros doktorantams Vaidai Juškaitei ir Vyčiui Čižinauskui už pagalbą aliekant eksperimentus su HaCaT linijos ląstelėmis ir patarimus dėl magistro baigiamojo darbo rašymo.

Dėkoju LSMU Neuromokslų institutui už sėkmingą bendradarbiavimą atliekant tyrimus su ląstelių kultūromis.

8

SANTRUMPOS

% , proc. – procentai BP – bičių pienelis

FBS – fetalinis veršelio serumas DMSO – dimetilsulfoksidas DNR – deoksiribonukleorūgštis

HaCaT – imortalizuoti žmogaus keratinocitai, ląstelių linija VDD – vidutinis dalelių dydis

PDI – polidispersiškumo indeksas d. – dienos

val. – valandos

P90G – fosfolipoidas 90G UV – ultravioletiniai spinduliai

9

ĮVADAS

Bičių pienelis - klampus, gelsvas gelinio pavidalo bičių produktas, išskiriamas bitės darbininkės galvoje esančių hipofaringinės bei apatinio žandikaulio liaukų. Bičių pienelis pasižymi plačia sudėtimi bei įvairiu biologiniu aktyvumu[8,18,22,25,35].

Bičių pienelis ant odos gali būti pritaikomas kaip odos audinių regeneraciją skatinanti [10] bei žaizdų gijimą greitinanti [25] priemonė. Viena iš problemų yra bičių pienelio stabilumas. Šviežias bičių pienelis yra nestabilus ir turi būti laikomas šaldklyje -18°C temperatūroje. Tai gali būti viena iš priežasčių, apribojančių jo pritaikymą medicinoje. Aktualu ištirti bičių pienelio skvarbą į odą ir parinkti tinkaas formuluotes, kurios užtikrintų vaistinės medžiagos skvarbą bei stabilumą.

Vienas iš dažniausia taikomų bičių pienelio stabilizavimo būdų – liofilizacija. Šiame darbe jo stabilumui padidinti buvo parinktas lipidinių nanonešiklių suformavimas, nes tokiu būdu užtikrinama, jog bičių pienelio sudėtyje esantys vandenyje tirpūs komponentai išsidėstys nanonešiklių viduje, o riebaluose tirpūs komponentai – fosfolipidų dvisluoksnyje. Šis metodas yra tinkamas siekiant padidint bičių pienelio stabilumą ir užtikrinti skvarbą į odą.

10-hidroksi-2-deceno rūgštis yra riebalų rūgštis, natūraliai gamtoje randama tik bičių pienelyje, pasižyminti stipriu antioksidaciniu poveikiu. Dėl savo antioksidacinio, antibakterinio, priešuždegiminio poveikio bičių pienelį galima pritaikyti dermatologinių preparatų gamyboje, naudojant 0,05-1% [25].

Siekiant ištirti bičių pienelio biologinį aktyvumą buvo naudojama HaCaT imortalizuotų žmogaus keratinocitų linija. Siekiant lipidinių nešiklių praktinio pritaikymo pagamintas gelis. Biofarmacinis lipidinių nešiklių ir formuluočių su bičių pieneliu vertinimas atliktas nustatant 10-hidroksi-2-deceno rūgšties skvarbą į odą.

10

Tyrimo problema: bičių pienelio stabilumo problemų sprendimas siekiant praktinio pritaikymo ant odos vartojamų preparatų gamybai.

Tyrimo objektas: bičių pienelis ir lipidiniai nanonešikliai.

DARBO TIKSLAS:

Sumodeliuoti lipidinius nanonešiklius su bičių pieneliu, įvertinti jų kokybę bei atlikti bičių pienelio ir 10-hidroksi-2-deceno rūgšties biologinio aktyvumo tyrimus pritaikius HaCaT ląstelių liniją.

DARBO UŽDAVINIAI:

8. Atlikti tyrimus su HaCaT ląstelėmis ir įvertinti skirtingų koncentracijųbičių pienelio bei 10-HDA įtaką odos ląstelių gyvybingumui.

9. Pagaminti lipidinius nanonešiklius (liposomas, etosomas, transfersomas) su įterptu bičių pieneliu naudojant plono lipidų sluoksnio hidracijos metodą.

10. Nustatyti sumodeliuotų lipidinių nanonešiklių fizikochemines savybes – vidutinį dalelių dydį ir polidispersiškumą bei įvertinti jų stabilumą.

11. Pagaminti vaisto formą – gelį – su įterptomis liposomomis.

12. Įvertinti 10-HDA skvarbą į odą iš skirtingų sumodeliuotų formuluočių: bičių pienelio suspensijos, liposomų ir liposominio gelio.

11

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.

Bičių pienelio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas

Bičių pienelis (BP) (ang. Royal jelly, it. Gelatina reale) - klampus, gelsvas gelinio pavidalo bičių produktas, išskiriamas bitės darbininkės galvoje esančių hipofaringinės bei apatinio žandikaulio liaukų [8,18,25] . Pirmąsias 2-3 dienas BP yra vienintelis maisto produktas, kuriuo maitinasi lervos, vėliau pereinančios prie kitokių maisto šaltinių, o bičių motinėlė juo maitinasi visą savo gyvenimo periodą. Dėl šios priežasties bičių motinėlės gyvena ilgiau nei kitos bitės. BP yra vienas efektyviausių ir naudingiausių vaistų žmonėms, plačiai naudojamas liaudies bei bendroje medicinoje, registruotas kaip maisto papildas. Dėl savo sudėtingos sudėties BP pasižymi plačiu farmakologiniu aktyvumu. BP būdingas rūgščiai aštrus kvapas ir saldžiarūgštis skonis. Išvaizda, skonis bei kvapas yra labai svarbūs kokybės rodikliai. Bėgant laikui BP tamsėja, skonis tampa aitrus, kvapas nemalonus [10]. Šviežias bičių pienelis laikomas šaldiklyje -18°C temperatūroje. Siekiant užtikrinti jo stabilumą gali būti liofilizuojamas [10]. Pagrindiniai bičių pienelį sudarantys komponentai ir jų kiekiai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė.Bičių pienelio sudėtis

Šviežias BP Liofilizuotas BP

Vanduo% 60-70 <5

Lipidai % 3 – 8 8 – 19

10-hidroksi-2-deceno rūgštis% >1,4 >3,5

Baltymai 9 – 18 27 – 41

Fruktozė, gliukozė, sacharozė% 7 – 18

Fruktozė% 3 – 13 Gliukozė % 4 – 8 Sacharozė % 0,5 – 2,0 Pelenai % 0,8 – 3,0 2 – 5 pH 3,4 – 4,5 3,4 – 4,5 Rūgštingumas ml 0,1N NaOH/g 3,0 – 6,0

12

Bičių pienelio biologinis aktyvumas siejamas su baltymais, riebiosiomis rūgštimis bei fenoliniais junginiais, įeinančiais į BP sudėtį. Baltymai sudaro didžiąją BP sausųjų medžiagų masės dalį. Apie 70% aptinkamų baltymų yra tirpūs vandenyje. Laisvos AR sudaro vos 0,6 – 1,5%, daugiausia aptinkama prolino, lizino, glutamo rūgšties, β-alanino, fenilalanino, asparto rūgšties bei serino [36]. Bičių pienelyje randamų laisvų aminorūgščių kiekiai nurodyti 2 lentelėje.

2 lentelė. Laisvų aminorūgščių kiekis bičių pienelyje [36]

Aminorūgštis % Alaninas 1,7 Valinas 1,7 Glicinas 2,1 Izoleucinas 1,3 Leucinas 13,3 Prolinas 139,8 Treoninas 1,0

3 lentelė.Aminorūgščių procentinis kiekis baltymuose, randamuose bičių pienelyje [36]

Aminorūgštis % Serinas 1,6 Metioninas 2,9 Fenilalaninas 3,7 Asparto rūgštis 0,5 Glutamo rūgštis 2,8 Tirozinas 8,3 Lizinas 4,9 Argininas 3,3 Triptofanas 3,4

BP aptinkamas platus vitaminų spektras, daugiausiai B grupės vitaminų (riboflavino, niacino, tiamino, folio rūgšties) [36]. Todėl vartojant bičių pienelį į vidų gaunamas vitamininis poveikis.

13

4 lentelė.Vitaminų kiekis bičių pienelyje [36]

Vitaminai mg/100g Vitaminas A 1,10 Vitaminas D 0,20 Vitaminas E 5,00 Vitaminas B1 2,06 Vitaminas B2 2,77 Vitaminas B6 11,90 Vitaminas B12 0,15

Vitaminas B5 (pantoteno rūgštis) 52,80

Niacinas (vitaminas PP) 42,42

Vitaminas C (askorbo rūgštis) 2,00

Vitaminas B9 (folio rūgštis) 0,40

Lipidai sudaro apie 8 proc. sausos BP masės. Laisvosios riebalų rūgštys sudaro apie 80-90 proc. visų lipidų. Dauguma bičių pienelyje aptinkamų riebalų rūgščių pasižymi gana neįprasta struktūra, tai mono- ir dihidroksi rūgštys bei dikarboksi rūgštys su 8-10 specifiškai išsidėsčiusių anglies atomų [36]. Svarbiausia riebalų rūgštis - 10-hidroksi-2-deceno rūgštis (10-HDA), tai nesočioji riebalų rūgštis, kuri yra atsakinga už BP aktyvumą, pasižymi antibakteriniu veikimu [36,44].

14 Bičių pienelio biologinis aktyvumas

Dėl savo sudėtingos ir plačios cheminės sudėties bičių pienelis pasižymi plačiu biologiniu aktyvumu. Pagal mokslinėje literatūroje skelbiamus duomenis, BP pasižymimi šiomis savybėmis:

 antimikrobinės [8,18,25,41];

 antidiabetinės [56];

 antioksidacinės [20];

 antireumatinės [56]

 imunomoduliacinės [8];

 kolageno atstatyma skatinančiosir odą saugančios [56];

 kraujodarą skatinančios [56];

 priešuždegiminės [17];

 priešvėžinės [38];

odos audinių regeneraciją skatinančios [20,37];

 tonizuojančios [55];

 žaizdų gijimą skatinantis poveikis [26];

atmintį gerinančios [38];

 senėjimo procesus lėtinančios savybės [55];

Apžvelgus literatūrą, galima teigti, jog BP gali būti plačiai taikomas įvairiose medicinos srityse. Viena iš jų – dermatologinės problemos, kurių sprendimui gali būti pritaikomi ant odos vartojami BP preparatai.

1.2.

Bičių pienelio pritaikymas dermatologinių preparatų gamybai

Bičių pienelis pasižymi antioksidacinėmis, antibakterinėmis, priešuždegiminėmis savybėmis, todėl jį galima pritaikyti dermatologinių preparatų gamyboje. Dažniausiai dermatologiniuose preparatuose bičių pienelio koncentracija siekia 0,05 – 1%, tokie preparatai skatina odos regeneraciją [25].

Taip pat dermatologiniai preparatai su bičių pieneliu gali būti naudojami nudegimų, žaizdų bei kitokių odos pažeidimų gydymui. Bičių pienelis taip pat veikia priešuždegimiškai bei mažina tinimą [37]. Atlikti tyrimai su pelėmis rodo, kad kasdien bičių pienelio suspensija veikiamas odos pažeidimas gijo ženkliai greičiau, nei veikiant kontroliniu druskos tirpalu (p<0,05)[47].

15

Taip pat bičių pienelio tepalai (3%, 10% bei 30%) reikšmingai sumažino 5-fluorouracilo sukeltą burnos gleivinės pažaidą žiurkėms (esant didesnei koncentracijai, matomas ryškesnis poveikis burnos gleivinės pažaidų gijimui [50].

1.3.

Ląstelių modeliai, taikomi BP biologinio aktyvumo vertinimui

Norint nustatyti pasirinktų veikliųjų medžiagų biologinį poveikį, cheminių tyrimų neužtenka. Biologiniai modeliai, šiuo atveju tyrimai su imortalizuotomis žmogaus odos ląstelėmis keratinocitais, suteikia patikimesnę informaciją apie tiriamos medžiagos poveikį organizmui. Pasirinktos HaCaT ląstelių linija, imortalizuoti žmogaus keratinocitai, kurie labai plačiai pritaikomi tiriant odos biologiją ir ląstelių diferenciaciją [24]. Ši ląstelių linija naudojama in vitro modeliuose kaip greitai besidauginantis epidermis. HaCaT ląstelės turi bazinio epidermio keratinocitų savybių [29]. HaCaT ląstelių linija gali turėti daugiau nei 140 pasažų, atliekant in vitro tyrimus turi transformuotą fenotipą ir yra nesukelianti navikų augimo [26]. Net ir po daugelio pasažų, HaCaT ląstelės išlaiko normalų dalijimosi greitį ir kiekį, taip pat yra tinkamos keratinizacijos tyrimams, yra stabilios [54]. Galima teigti kad šis biologinio aktyvumo tyrimo metodas leidžia daryti prielaidas apie BP kaip veikliosios medžiagos pritaikymą odos ligų gydymui ir profilaktikai.

1.4.

Liposominių nanonešiklių apibūdinimas

Liposomos pirmą kartą atrastos ir aprašytos 1961 metais Kembridže, Jungtinėje Karalystėje. Hematologas A. D.Bangham atlikdamas bandymus su elektoriniu mikroskopu pastebėjo, kad fosfolipidai vandeniniame tirpale linkę suformuoti uždaras pūsleles – liposomas [31,28]. Liposomų dalelių dydis gali būti nuo 0,02 µm iki 10 µm.

Liposoma – dviejų graikų kalbos žodžių kombinacija, „lipos“ reiškia riebalai, o „soma“ – kūnas. Jos buvo pradėtos gaminti tam, kad būtų pagerintas terapinis vaistų indeksas, veikiant vaistų absorbciją, sumažinant metabolizmą, pailginant pusinės eliminacijos laiką bei sumažinant toksiškumą. Gaminant liposomas, vaisto pasiskirstymas priklauso ne vien nuo pačios vaistinės medžiagos fizikocheminių savybių, tačiau ir nuo vaistinės medžiagos nešiklio. Lipidai, suformuojantys liposomas, gali būti natūralūs arba sintetiniai, o naujos kartos liposomos gali būti suformuojamos iš polimerų.

Liposomų savybės priklauso nuo pasirinktos gamybos technologijos ir naudojamų medžiagų. Liposomų viduje esančioje vandeninėje terpėje pasiskirstohidrofilinės vaistinės medžiagos (hidrofilinės). Lipofilinės ir amfifilinės medžiagos išsidėsto fosfolipidų dvisluoksnyje [29].

16

2 pav. Liposomos sandara [7]

Liposomos skirstomos pagal dydį ir fosfolipidų dvisluoksnių skaičių į 3 pagrindines grupes: 1. Daugialameliarinės (DL) – tai liposominės dalelės, turinčios daugiau nei vieną fosfolipidų dvisluoksnį. Šių pūslelių dydis nuo 100 nm iki keleto mikrometrų, priklausomai nuo jų paruošimo būdo. Dėl didelio fosfolipidų dvisluoksnių skaičiaus jos taikomos pernešant lipofilinius vaistus.

2. Mažos monolameliarinės (MML) – tai liposominės dalelės, turinčios vieną fosfolipidų dvisluoksnį. Dalelių dydis nuo 20 iki 100 nm. Jos tinkamesnės parenteraliniam vartojimui lyginant su DL, nes yra homogeniškos dydžiu. Tačiau dėl mažo dydžio jos pasižymi prastesne inkorporavimo geba.

3. Didelės monolameliarinės (DML) – tai liposominės dalelės, turinčios vieną fosfolipidų dvisluoksnį. Dalelių dydis nuo 100 nm iki keleto mikrometrų. Labiausiai tinkamos inkorporuoti vandenyje tirpias medžiagas, nes turi didesnę hidrofilinę ertmę lyginant su MML [3].

Pašalinimas iš organizmo. Liposomų opsonizaciją ir pašalinimą iš organizmo atlieka retikuloentonelinė sistema (RES). Greitis, per kurį iš sisteminės kraujatokos bus pašalintos liposomos, priklauso nuo liposomų sudėties ir dalelių dydžio. RES – tai dalis žmogaus imuninės sistemos, kurios pagrindinis tikslas pašalinti svetimkūnius iš organizmo. RES susideda iš makrofagų, kurių daugiausiai yra kepenų Kupferio ląstelėse, plaučiuose ir blužnyje. Po injekcijos liposomos padengiamos serumo

Paviršiniai baltymai, naudojami liposomų taikinių nustatymui.

Paviršiniai cukrūs, naudojami apsaugojimui nuo imuninės sistemos

Riebaluose tirpūs vaistai – lipidų dvisluoksnyje Lipidinis

dvisluoksnis

Kietos dalelės bei vandenyje tirpūs vaistai viduje

17

baltymais – opsoninais. Po to jos fagocituojamos RES ląstelių ir didžioji dalis liposomų patenka į kepenis ir blužnį. Didelės liposomos (>200 nm) yra greitai opsonizuojamos ir RES pagalba pašalinamos iš sisteminės kraujotakos, po to akumuliuojasi blužnyje. Opsonizacijos greitis lėtėja mažinant liposomų dydį. Mažos liposomos turi sąlyginai didesnį paviršiaus plotą, todėl prie jų membranos prisijungia mažiau opsoninų ir makrofagai lėčiau jas pašalina. Liposomos, kurių dalelių dydis nuo 70 nm iki 200 nm ilgiau išlieka sisteminėje kraujotakoje ir turi didesnę tikimybę pasiekti taikinį. Lipidų išsidėstymas liposomų membranose turi didelę įtaką fizikinėms membranos savybėms: pralaidumui, elastiškumui ir paviršiaus krūviui. Ši savybė, kaip ir prieš tai minėtas dalelių dydis, svarbi liposomų pašalinimui iš organizmo. Neutralaus krūvio liposomos, dėl tankiai membranoje išsidėsčiusių fosfolipidų, ilgiau išlieka sisteminėje kraujotakoje ir lėčiau atpalaiduojama veiklioji medžiaga, lyginant su krūvį turinčiomis liposomomis. Baltymų opsonizacija prie liposomų paviršiaus sumažėja dėl tankaus lipidų išsidėstymo membranose. Cholesterolis, naudojamas liposomų gamyboje, stabilizuoja membraną ir padeda išvengti vaistinės medžiagos netekimo, be to jis sumažina opsoninų prisijungimą ir prailginą liposomų buvimą in vivo. Tam tikri plazmos baltymai turi afinitetą liposomoms, kuris stiprėja, jei liposomos turi krūvį. Katijoninės dalelės greičiau pašalinamos iš sisteminės kraujotakos, todėl jų gyvavimo pusperiodis in vivo trumpesnis. Anijoninės liposomos, turinčios fosfatidilserino, fosfatidilglicerolio, greitai aptinkamos makrofagų ir pašalinamos iš kraujotakos [33].

Prie liposomų apvalkalo galima prijungti PEG molekules tam, kad būtų pailgintas pusinės eliminacijos laikas.

1.5.

Liposomų panaudojimas lokaliam gydymui

Liposomos vartojamos skystomis (suspensijos), kietomis (sausi liofilizuoti milteliai), arba pusiau kietomis (geliai, kremai) vaistų formomis, dažniausiai vartojamos ant odos bei parenteriniu būdais.

Liposominių preparatų naudojimas per odą pagrįstas tuo, kad lipidų vezikulių dvisluoksnio ir natūralių ląstelių membranos struktūra labai panaši. Tai suteikia liposomoms savybę keisti membranos praeinamumą ir jungtis prie jos. Dermatologijoje liposomos vartojamos dėl drėkinamojo ir atstatančio odą poveikio. Liposomos taip pat gali būti vartojamos skatinant odos regeneraciją. Lipidai yra pakankamai hidratuoti, todėl net ir neturėdami aktyvių medžiagų, drėkiną odą. Dažniausiai to pakanka pagerinti odos elastingumą ir apsauginę funkciją, kurias dažnai sutrikdo įprastas odos senėjimas [9].

Plačiai tyrinėjama liposomų savybė pernešti skirtingas medžiagas į epidermį ar dar gilesnius odos sluoksnius. Tai leidžia pradėti naudoti liposomas įvairiems odos susirgimams gydyti. Įprastos vaistų formos, tokios kaip tirpalai, kremai, tepalai, perneša vaistines medžiagas per stratum corneum,

18

priklausomai nuo koncentracijos. Tačiau daugiasluoksnės liposomos gali pernešti vaistus į stratum

corneum, epidermį ir tikrąją odą per 30 minučių didesnėmis kocentracijomis nei kitos ant odos

vartojamos vaistų formos [28].

Į liposomas galima įterpti įvairias vaistines medžiagas, labiausiai paplitusios yra trys vaistų grupės: kortikoidai, retinoidai ir vietiniai anestetikai [35,53]. Lasch (1989) tyrinėjo liposominio preparato su hidrokortizoliu poveikį žmogaus odai [54]. Jis nustatė, kad toks preparatas perneša didesnį kortizolio kiekį, o tai labai svarbu, nes kortizolis vartojant ilgalaikiam odos gydymui nepasižymi pašaliniu poveikiu, bet dažnai nepasiekiama pakankama jo koncentracija ūmioms dermatozėms gydyti. Dėl šios priežasties didesnė hidrokortizolio kocentracija turės geresnį terapinį 14 efektą. Dvigubai aklame, atsitiktiniame, lyginamajame tyrime betametazono dipropionatas, įterptas į liposomas, buvo lygintas su įprastu betametazono dipropionato preparatu [23]. Pastebėta, kad pacientams, sergantiems atopine egzema ir vartojantiems liposominį betametazono dipropionatą, net ir mažesnėmis koncentracijomis, uždegimo požymiai sumažėjo labiau nei vartojant tradicinį preparatą.

Kita svarbi vaistų grupė – retinoidai. Šios vaistinės medžiagos vartojamos vietiškai, sergant nesudėtinga acne vulgaris forma [37] Tretinoino gelio vartojimas sukelia vietinį perštėjimą ir gydymo pradžioje gali sukelti ligos paūmėjimą. Šių nepageidaujamų reakcijų galima išvengti vartojant liposominį tretinoiną. Schafer-Korting (1994) atliktame dvigubai aklame tyrime buvo bandoma nustatyti liposominio tretinoino efektyvumą ir toleravimą pacientams, sergantiems nekomplikuota acne vulgaris [46]. Rezultatai parodė, kad mažiau koncentruota liposominė tretinoino vaisto forma turėjo vienodą efektyvumą ligos gydyme ir pasižymėjo mažesniu odos dirginimu. Šiuos privalumus lėmė didesnis liposominio tretinoino praeinamumas ir lėtesnis vaisto atpalaidavimas. Norint sukelti ilgalaikę vietinę anesteziją reikalinga didelė anestetiko koncentracija. Gesztes ir kt. (1988) atlikti tyrimai nustatė, kad tetrakainas, įterptas į liposomas, pasižymėjo geresne anestezija (mažesnė vaisto koncentracija, ilgesnis anestezijos laikas) lyginant su įprastiniais nejautrą sukeliančiais kremais [51]. Panašūs rezultatai gauti naudojant kitą vietinį anestetiką lidokainą, kuris yra prekyboje JAV nuo 1998 m. (ELA-Max®).

1.6.

Liposomų gamyboje naudojami lipidai

Liposomų gamyboje naudojami įvairūs fosfolipidai ir jų mišiniai. Tai sudėtiniai lipidai, sudaryti iš glicerolio, fosfato rūgšties liekanos ir riebalų rūgščių. Fosfolipidų molekulės pasižymi amfipatinėmis savybėmis – į hidrofilinę dalį (fosfolipido galvutę) įeina 2-etilamonio fosfato fragmentas, o į hidrofobinę dalį (uodegėlę) – ilgos angliavandenilių grandinės, priklausančios riebalų rūgščių esteriams. Angliavandenilių grandinės, įeinančios į fosfolipidinės plėvelės sudėtį, gali turėti

19

nuo 14 iki 24 anglies atomų. Kiekviena jų turi bent vieną dvigubąjį ryšį (nesotųjį), kuris suteikia molekulei galimybę keisti formą ir mažina standumą. Skirtingi uodegėlių ilgiai ir skirtingas nesočiųjų jungčių skaičius lemia tai, kad fosfolipidų sluoksnis yra takus [23]. Fosfolipidams būdinga tai, kad jų molekulės, patekusios į vandenį, savaime sudaro tam tikras struktūras. Jos būna dviejų tipų: sferinės (viduje paslėptos uodegėlės, o paviršius padengtas polinėmis galvutėmis – micelės) arba plokščios (hidrofobinės uodegėlės išsidėsto tarp dviejų hidrofilinių galvučių sluoksnių – dvisluoksnio). Tokį fosfolipidų išsidėstymą vandeniniame tirpale lemia hidrofobinės reakcijos tarp nepolinių grandinių. [41]. 3 paveiksle nurodyta pagrindinio darbe naudojamo fosfolipido – fosfatidilcholino – cheminė struktūra.

3 pav. Fosfolipidų cheminė sudėtis. Pavyzdyje – fosfatidilcholinas (lecitinas)[42]

Fosfatidiletanolaminai yra etanolamino ir fosfatido rūgšties esteriai. Jie išskiriami iš galvos smegenų audinių. Fosfatidilserinai išskiriami iš širdies raumenų, smegenų ir kepenų. Juose yra aminorūgšties serino. Fosfatidilcholinai yra esteriai, sudaryti iš aminoalkoholio cholino ir fosfatido rūgšties. Jie randami žmogaus nervų sistemoje. Fosfatidilcholinas dar žinomas kaip lecitinas, gaunamas natūraliu bei sintetiniu būdais. Jis lengvai išskiriamas iš kiaušinio trynio ir sojos pupelių. Dar lecitinas naudojamas kaip emulsiklis. Lecitinai, gaunami iš natūralių šaltinių, būna mišiniuose su įvairiais fosfatidilcholinais, kurie turi skirtingo ilgio angliavandenilių grandines. Lecitinas, išskiriamas iš augalinių žaliavų, turi daugiau neprisotintų grandinių. Fosfatidilcholinai – pagrindiniai fosfolipidai, naudojami gaminant liposomas, dėl santykinai mažos gamybos kainos, lyginant su kitais fosfolipidais, neutralaus krūvio ir cheminio inertiškumo [43].

Liposomų išvaizda ir drumstumas.

Liposomų suspensijos išvaizda gali kisti nuo permatomos iki drumstos, priklausomai nuo sudėties ir dalelių dydžio. Jei drumstumas turi melsvą atspalvį, tai reiškia kad mėginyje dalelės yra homogeniškos. Pilkšva arba pilka spalva gali reikšti neliposominę dispersiją arba mikrokristalus. Optinis mikroskopas gali aptikti liposomas ar kitas nereikalingas daleles, jei jų dydis yra >0,3µm.

20

Liposomų suspensijoms būdingos savybės: panaši į vandens tirpalo paviršiaus įtemptis, greitas suputojimas, ir greitai kylantys burbuliukai. Dėl per didelio paviršiaus hidrofobiškumo lėtai kylantys burbuliukai gali būti kaip indikatorius, jog tirpale yra neliposominių lipidų [44].

1.7.

Liposomų kokybės nustatymas in vitro

Lipidinių nanonešiklių kokybė nustatoma stebint keletą parametrų. Dažniausiai charakterizuojamos lipidinių nanonešiklių savybės yra vidutinis dalelių dydis, polidispersiškumo indeksas, zeta potencialas, inkorporavimo efektyvumas, fosfolipidų dvisluoksnio sudėtis ir dalelių sluoksniuotumas.Zeta potencialas – bendras dalelės krūvis, kurį ji įgauna tam tikroje terpėje. Zeta potencialas gali parodyti koloidinės sistemos stabilumą [21]. Inkorporavimo efektyvumas –rodiklis, parodantis, koks veikliosios medžiagos kiekis yra neinkorporuotas liposomų viduje. Tyrimas atliekamas gelinėje kolonėlėje, ultracentrifugavimo metodu arba dializė [44]. Bičių pienelis – kompleksinis junginys, todėl nebuvo įmanoma ištirti zeta potencialo, inkorporavimo efektyvumo, fosfolipidų dvisluoksnio sudėties ir dalelių sluoksniuotumo. Todėl buvo remtasi vidutinio dalelių dydžio bei polidispersijos indekso parodymais.

1.7.1. Liposomų dalelių dydžio nustatymas

Vidutinis lipidinių nanonešiklių dalelių dydis ir dispersiškumas – vieni svarbiausių parametrų. Dalelių dydžiui nustatyti galima naudoti elektroninį mikroskopą, kuriuo galima apžiūrėti atskiras liposomas, tačiau šis būdas reikalauja daug įgūdžių ir laiko, nes reiktų matuoti ne mažiau nei 400 dalelių, norint patikimai įvertinti dalelių dydžio vidurkį bei pasiskirstymą [28].

Kitas dalelių dydžio nustatymo metodas – dinaminės šviesos sklaidos (angl. dynamic light scattering – DLS) metodas, kuris remiasi Brauno dalelių judėjimu (kuo mažesnė dalelė – tuo greičiau ji juda). Atliekant dinaminės šviesos sklaidos matavimus, nustatomas pro liposomų mėginį (20µl liposomų+1ml vandens) praėjusios išsklaidytos šviesos intensyvumas. Gauti signalai apdorojami ir gaunami funkciniai grafikai, nustatomas vidutinis dalelių dydis mėginyje [2].

21

4 pav.Dinaminės sklaidos metodo schema (1 – lazeris, 2 – lęšiai, 3 – kiuvetė su mėginiu, 4 – apertūra, 5 – jutiklis, 6 – kompiuteris)[55]

1.8.

Naujo tipo lipidiniai nanonešikliai – etosomos bei transfersomos

1.8.1. Transfersomos

Transfersomos – naujo tipo lipidiniai nanonešikliai, labiau tinkami vietiniam vartojimui, nei paprastos liposomos. Taip yra todėl, kad transfersomų gamyboje dažniausiai yra naudojami įvairūs surfaktantai (natrio cholatas, natrio deoksocholatas ir įvairūs polisorbatai). Surfaktantai sumažina lipidų dvisluoksnio stabilumą ir suteikia transfersomų nanodalelėms lankstumo [42].

Transfersominių nanonešiklių atsiradimas svarbus faktorius siekiant pagerinti lokaliai vartojamų vaistų efektyvumą. Pagrindinis skirtumas su liposomomis – transfersomos gali deformuotis ir pereiti pro mažas poras. Lyginant su kitomis ant odos vartojamomis vaistų formomis, transfersomos turi šiuos privalumus:

 Pagerina vaistų prasiskverbimą pro pirminius odos sluoksnius dėl savo gebos deformuotis [47]

 Gamyboje naudojamos medžiagos yra saugios, todėl yra tinkamos vaistiniams bei kosmetiniams preparatams kurti [43]

1.8.2. Etosomos

Pirmą kartą pristatytos 1997 metais. Šios pūslelės nuo liposomų skiriasi sudėtimi, struktūra bei veikimo mechanizmu. Etosomos – minkštos lipidinės pūslelės, sudarytos iš fosfolipidų, etanolio bei vandens. Jų pavadinimas pasirinktas dėl santykinai didelės etanolio koncentracijos (20-45%) jų viduje. Etosomos skirtos vartoti ant odos, nes gali pasiekti giliausius odos sluoksnius ir sisteminę kraujotaką.

22

Didžiausias etosomų privalumas, lyginant su liposomomis – jų skvarba, nes taip pat geba deformuotis, kaip ir transfersomos [53].

Etosomų veikimo mechanizmui įtakos turi gamyboje naudojamas etanolis. Vartojant etosomas ant odos, etanolis pirmiausia sąveikauja su intraląstelinių lipidų polinėmis galvutėmis, sumažindamas raginiame sluoksnyje esančių lipidų takumą. Dėl to pasikeičia lipidų tankis odoje ir pagerėja praeinamumas, tai leidžia pernešti didesnius vaisto kiekius į gilesnius odos sluoksnius [40].

Tiriamajame darbe atlikta naujos kartos dalelių – etosomų bei transfersomų gamyba bei palyginimas su transfersomomis.

23

2. METODIKA

2.1.

Naudotos medžiagos ir aparatūra

2.1.1 Naudotos medžiagos

1) Ląstelių auginimo terpė (DMEM+Glutamax) (Sigma-Aldrich) 2) Fetalinis veršelio serumas (FBS) (Sigma-Aldrich)

3) Hank‘s subalansuotas druskos tirpalas (HBSS) (Sigma-Aldrich)

4) Sudėtinis antibiotikų tirpalas (Penicilino-streptomicino tirpalas) (Sigma-Aldrich) 5) Triptano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich)

6) Propidžio jodidas (C27H34I2N4) (Sigma-Aldrich) 7) Bisbenzimido dažai (Hoechst 33342) (Sigma-Aldrich) 8) 10-hidroksi-2-deceno rūgštis (10HDA) (Sigma-Aldrich) 9) Bičių pienelis (UAB „Bičių korys“)

10) Etanolis 96,6 % (v/v) (Sigma-Aldrich) 11) P90G, Lipoidas (GmbH)

2.1.2 Naudota aparatūra

1) Spektrofotometras „Unicom UV/VIS“

2) Laboratorinės analizinės svarstyklės (0,0001 tikslumo) HF-1200 GD, A&D company 3) Fluorescencinis mikroskopas OLYMPUS IX71S1F-3

4) Spektrofotometras Lambda 25, PerkinElmer, JAV

5) Magnetinė maišyklė IKA®C – MAG H57, IKA® - WerkeGmbH&Co. KG, Vokietija 6) Ultragarsinis homogenizatorius su įleidžiamu zondu: Soniprep 150, MSE Crowley, JK 7) Dydžio analizatorius Zetasizernano, MalvernInstuments, JK

8) Vakuuminė pompa: Edwards® 2 Two-StageHighVacuumPump E2M2, JK 9) Ultragarsinė vonelė: Bransonic®, Danbury, JAV

24

2.2.

Ląstelių sėjimo metodika

Tyrimui buvo naudojama HaCaT ląstelių kultūra, imortalizuoti žmogaus keratinocitai. Ląstelių auginimui buvo naudojama auginimo terpė DMEM (Dulbecco‘sModifiedEagle‘smedium; Sigma-Aldrich, D576) su gliutamatu. Į terpę dedame FBS (fetalinio veršelio serumo, Sigma-Aldrich) ir antibiotikų Penicilino-Streptomicino tirpalo (10000IU/ml - 10000μg/ml) (Sigma-Aldrich, P0781) norint išvengti mikrobinio užterštumo. Ląstelės laikomos termostate, 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2atmosferoje. Ląstelių atkėlimui naudojamas Triple E Express tirpalas (Sigma-Aldrich). Tripsinas – tai fermentas, kuris suardo tarpląstelines jungtis, uždėjus ant augimo flakone esančių ląstelių minučių palikus veikti, 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2atmosferos sąlygomis tam tikrą laiko tarpą. Tripsinui suveikus, ant atkibusių ląstelių užpilamas dvigubas kiekis terpės ir centrifuguojama 5 minutes 1000 apsisukimų per minutę greičiu, naudojant Eppendorf (JAV).

2.3.

Ląstelių tankio nustatymas

Ląstelių skaičiavimui naudojamas hemocitometras (Neubauer) ir 0,4% triptano mėlio dažų tirpalas. 20 μltriptano mėlio dažų tirpalo sumaišoma su 20 μl ląstelių suspensijos. 20 µl kiekio įvedama ant hemocitometro kameros po dengiamuoju stikleliu ir stebina pro šviesinį mikroskopą. Skaičiuojamas ląstelių kiekis keturiuose langeliuose. Mėlynai nusidažiusios ląstelės nėra skaičiuojamos, nes dėl ląstelių membranos pažaidos triptano mėlis praeina pro membraną ir jas nudažo, tai reiškia jog šios ląstelės yra negyvos. Skaičiavimui naudojamo hemocitometro schema pateikta 5 paveiksle.

25

Ląstelių skaičius 1 mililitre apskaičiuojamas pagal formulę [59]: n = (a+b+c+d)*4*2*5000,

kur: n – ląstelių skaičius 1 ml;

a, b, c, d – ląstelių skaičius langeliuose; 5000 = c – konstanta;

2 – skiedimų skaičius.

Atliekant tyrimus reikiamas ląstelių kiekis užsėjamas į 96 šulinėlių lėkštelę. Šiuo atveju buvo sėjama po 20,000 ląstelių.

2.4.

Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT testu

3-(4,5 – dimetiltiazol-2-il)-2,5 – difeniltetrazoliobromidas (MTT) yra saugus, plačiai pritaikomas dažas, skirtas tyrimams kolorimetriniu metodu ląstelių gyvybingumui ir tiriamų medžiagų citotoksiškumo nustatymui. Tarp visų fermentų aktyvumu patvirtintų tyrimų MTT yra geriausiai žinomas metodas siekant nustatyti mitochondrijųdehidrogenazėsaktyvumą gyvose ląstelėse. Taikant šį metodą geltonas MTT virsta netirpiais purpuriniais formazano kristalais ((E, Z)-5-(dimetiltiazol-2-il)-1,3-difenilformazanas) veikiant nuo NAD(P)H priklausomomis oksoreduktazėmis.

6 pav. MTT veikiant nuo NAD(P)H priklausomomsoksoreduktazėms, virsta purpuriniu formazanu

Kadangi dažas virsta netirpiais kristalais, prieš matuojant absorbciją reikia naudoti organinį tirpiklį kristalų tirpinimui. Tyrimo metu buvo naudojamas organinis tirpiklis dimetilsulfoksidas

Formazanas MTT

26

(DMSO; Sigma-Aldrich). Geltonos spalvos MTT veikiant mitochondrijose esančiai reduktazai redukuojamas į purpurinės spalvos formazaną.

Nuo ląstelių, kurios buvo auginamos 96 šulinėlių lėkštelėje, nupilama DMEM terpė ir šulinėliai du kartus perplaunami po 100µl HBSS. Nuo ląstelių nupylus HBSS pridedama po 180µl naujo HBSS ir po 20µl 5mg/ml MTT dažo, ištirpinto HBSS. Ląstelės 2 valandas inkubuojamos tamsoje 37°C temperatūroje. Praėjus tam laikui, dažas pašalinamas ir susiformavę formazano kristalai ištirpinami 100µl DMSO tirpalo. 15 minučių lėkštelė laikoma tamsoje. Tuomet atliekami matavimai spektrofotometru Lambda 25,( PerkinElmer, JAV), absorbcija matuojama esant 550 nm bangos ilgiui bei 620 nm standartiniam bangos ilgiui.

2.5.

Ląstelių gyvybingumo nustatymas propidžio jodido/Hoechst 33528

metodu

Ląstelių gyvybingumo papildomam įvertinimui buvo naudojama fluorescencinė mikroskopija. Ląstelės buvo veikiamos propidžio jodido ir Hoechst 33528dažais. Tyrimui buvo pasirinktos atsitiktinės bičių pienelio ir 10-HDA koncentracijos ir gauti duomenys buvo lyginami su kontrole. Užsėjus ląsteles į 96 šulinėlių lėkštelę po 20,000 ląstelių jos buvo stebėtos po 24 valandų. Propidžio jodidas nekrozinius ląstelių branduolius nudažo raudona spalva, o Hoechst 33528 dažas gyvybingų ląstelių branduolius nudažo mėlynai. Fluorescenciniu mikroskopu (OLYMPUS IX71S1F-3) buvo fotografuojami atsitiktina parikti 5 laukeliai kiekviename šulinėlyje. Ląstelės, kurių branduoliai homogeniški, buvo vertinamos kaip sveikos ir gyvybingos ir UV šviesoje jų branduoliai švyti mėlyna spalva. Ląstelių branduoliai, UV šviesoje švytintys raudonai, buvo vertinami kaip nekroziniai, o deformuoti ir UV šviesoje ryškiai švytintys branduoliai buvo vertinami kaip apoptoziniai.

2.6.

Lipidinių nanonešiklių modeliavimas ir gamyba

Šiame tyrime nanonešiklių paruošimui naudotas plono lipidų sluoksnių hidracijos metodas. Fosfolipidųdvisluoksniui sudaryti naudojamas fosfatidilcholinas (P90G). Kiti gamyboje naudojami reagentai pateikti 5 lentelėje.

27

5 lentelė. Skirtingų nanonešiklių gamyboje naudojamos medžiagos

Nanonešiklio tipas Kodas Medžiagos

Drėkiklis P90G Bičių pienelis

Etosomos ET 25% etanolis 500mg 50mg

Transferosomos TF 5% etanolis 500mg 50mg

Liposomos LP Vanduo 500mg 50mg

Liposomas galima paruošti naudojant keletą skirtingų metodų. Šiame tyrime liposomų gamybai buvo naudotas plono lipidų sluoksnio hidracijos metodas, kuris yra dažnai naudojamas ir lengvai taikomas laboratorinėmis sąlygomis, tačiau užimantis pakankamai daug laiko. Be to, gautos dalelės būna daugiasluoksnės, skirtingo dydžio bei formos. 7 paveiksle pateikta lipidinių nanonešiklių gamybos naudojant plono sluoksnio hidracijos metodą, schema [6].

7 pav. Liposomų ruošimo plono sluoksnio lipidų hidracijos metodu, schema: lipido ir organiniuose tirpikliuose tirpių vaistinių medžiagų tirpinimas, tirpiklio išgarinimas – lipidinės plėvelės sluoksnio paruošimas, lipidinio sluoksnio drėkinimas, liposomų homogenizavimas ir susmulkinimas, liposomų išgryninimas

28

Lipidinė plėvelė ruošiama apvaliadugnėje 25ml talpos kolboje. Fosfolipidiniam sluoksniui sudaryti naudojamas fosfatidilcholinas (P90G). Gaminant transferosomas, etosomas bei liposomasfosfatidilcholino tirpinimui naudotas 96% etanolis. Bičių pienelis buvo tirpinamas vandenyje, nes jo sudėtyje daugiau vandenyje tirpių medžiagų. Lipidinio sluoksnio paruošimui kolba prijungiama prie rotacinio garintuvo (BUCHI, Šveicarija) ir įmerkiama į vandens vonią (40°C temperatūra). Mažinant slėgį tirpiklis pamažu išgarinamas iki netakaus lipidų sluoksnio susiformavimo kolbos apačioje. Tuomet kolba atjungiama nuo rotacinio garintuvo. Siekiant pašalinti visus tirpiklio pėdsakus, kolba prijungiama prie vakuuminės pompos ir paliekama 2-4 valandoms. Į kolbas įpilamas atitinkamas tirpalas drėkinimui (6 lentelė), įberiama stiklinių rutuliukų geresnei maišymo kokybei pasiekti, kolba įstatoma į rotacinį garintuvą ir įmerkiama į 50°C temperatūros vandens vonią 30 minučių. Gaunama baltos spalvos neskaidri suspensija, kuri paliekama 1 valandai stabilizuotis.

6 lentelė. Lipidinių nanonešiklių hidracijai naudojami tirpalai

Lipidinis nešiklis Tirpalas

Etosomos 5 ml 25%𝐶₂𝐻₅𝑂𝐻

Transferosomos 5 ml 5% 𝐶₂𝐻₅𝑂𝐻

Liposomos 𝐻₂𝑂

Nanonešiklių dalelių homogenizavimas. Po lipidinio sluoksnio drėkinimo dalelės yra daugiasluoksnės ir didelės (apie 500nm) ir netolygaus dydžio (polidispersiškos), daugiasluoksnės. Dėl šios priežasties taikomas vienas iš liposomų homogenizavimo metodų. Liposomų suspensija po hidracijos homogenizuojama naudojant ultragarsinį homogenizatorių Soniprep su įleidžiamu zondu. Sūkuriniu maišytuvu suplaktos liposominių nanonešiklių suspensijos supilamos į stiklinius buteliukus. Stiklinis buteliukas laikomas ledo vonelėje, nes homogenizatorius stipriai įkaista, ir atvėsinus išvengiama stiklinio buteliuko sudužimo. Į buteliuką įleidžiamas zondas, kuris privalo visiškai nesiliesti su stiklu. Naudojamas ciklinis režimas ultragarsu 5 ciklais 5sekundes įjungiant ir 2 išjungiant. Ciklai kartojami ne mažiau nei 8 kartus, esant poreikiui skaičių padidinant, kol liposomų suspensija tampa skaidri. Jei homogenizavimo metu liposominių nanonešiklių suspensijoje susiformavo putos, palaukiama, kol jos nusistovi, ir homogenizuojama toliau. Bičių pienelio atveju putos susidaro su etanoliniais tirpalais gaminant etosomas bei transferosomas, nes liposomų drėkinimo metu pridedamas etanolis reaguoja su bičių pienelio sudėtyje esančiais baltymais.

29

2.7.

Gelio gamyba parenkant gelifikuojančias medžiagas

2.7.1. Gelifikuojančios medžiagos parinkimas

Norint sukurti pritaikomą vaisto formą su liposomomis, buvo pasirinkta gaminti gelį, nes iš gelių vaistinės medžiagos atsipalaiduoja greičiau nei iš kitų puskiečių vaistų formų.

Gelio formavimui buvo pasirinkta gelifikuojanti medžiaga hidroksietilceliuliozė (HEC).

Hidroksietilceliuliozė – balti, geltonai balti, milteliai arba granulės. Tirpūs karštame bei šaltame vandenyje, sudaro koloidinį tirpalą. Praktiškai netirpsta organiniuose tirpikliuose, tokiuose kaip acetonas, 96% etanolis bei toluenas [14]. Tai nejonogeninis, higroskopiškas, turintis tvirtą grandinę celiuliozės eteris [5,24]. HEC pasižymi didele klampa 2% vandeniniame tirpale 2-20,000 mPa.

Priklausomai nuo molekulinės masės, pramonėja gaunami skirtingos klampos geliai. Jų ruošimo būdai – tirpinant HEC karštame ar šaltame vandenyje. Dispersijos paruošimo pagreitinimui HEC yra kaitinama, maišoma, pakeičiamas pH. Lėtai maišant kambario temperatūroje vyksta polimero drėkinimas. Didinant temperatūrą šios stadijos metu, didėja dispergavimo greitis. Nors HEC dispersijos yra stabilios plačiame pH intervale, išlaikant būdingą (šarminėje aplinkoje) pH reikšmę gerėja dispergavimo efektyvumas. Gelio su HEC klampumas mažėja didinant temperatūrą, tačiau kambario temperatūroje grįžta į pradinę klampą [17].

7 lentelėje pateikti hidroksietilceliuliozės, naudotos tyrime, kaip gelifikuojančios medžiagos privalumai ir trūkumai.

30

7 lentelė. Hidroksietilceliuliozės kaip gelifikanto privalumai ir trūkumai [12]

Privalumai Trūkumai

 Plati panaudojimo sritis (maisto, farmacijos, kosmetikos pramonėje)

 Farmacinių polimerų kaina yra didesnė nei lyginant su nemedicininiais

polimerais

 Netoksiška medžiaga, nepasižymi odą ir akis dirginančiomis

savybėmis

 Gana naujas polimeras, todėl neatlikta daug tyrimų

 Įvairus klampumo laipsnis (mažas, vidutinis ar didelis]

 Neatspari mikrobinei taršai

 Tirpi karštame ir šaltame vandenyje

 Įkvėpus gali suerzinti kvėpavimo takus

 Stabili plačiame pH intervale

 Neturi kvapo ir skonio

2.7.2. Gelio gamyba

Hidroksietilceliuliozės gelis gamintas masės-tūrio metodu. Buvo gaminama 10ml hidroksietilceliuliozės gelio su liposomomis. Kaip tirpiklis naudojamas išgrynintas vanduo. Pagamintas 2,5% galutinės koncentracijos hidroksietilceliuliozės gelis. Automatine pipete pamatuotas reikiamas vandens tūris. Atsvertas reikiamas kiekis hidroksietilceliuliozės miltelių ir suberta į stiklinėlę su tirpikliu. Įpilama 10% glicerolio, atsverto masės metodu. Į stiklinėlę įdedama magnetinė maišyklė ir pastačius ant magnetinės kaitlentės maišoma, kol susiformuoja skaidrus gelis. Proceso metu palaikoma 60°C temperatūra. Maišymo trukmė – 15 minučių. Po maišymo 5% iki kambario temperatūros atvėsintas klampus gelis sumaišomas su tokiu pat kiekiu liposomų suspensijos, nes susiformavusios liposomų suspensijos kaitinti negalima. Sumaišius gaunamas takesnis 2,5% hidroksietilceliuliozės gelis su liposomomis, kuriose įterptas bičių pienelis.

31

2.8.

10-HDA skvarbos į odą tyrimas ex vivo

Skvarbos į odą ex vivo tyrimai atlikti naudojant Franz tipo pratakias difuzines celes. Jos dedamos ant specialaus metalinio bloko, kuriame palaikoma 37°C temperatūra cirkuliuojančio vandens pagalba, naudojant termostatuojama cirkuliacinę vandens vonelę Grant GD120. Akceptorinė terpė pilama į celes (0,9% natrio chloridas). Tyrimams naudota kiaulės oda, kuri laikyta (–20°C). Atšildyta oda paruošiama tyrimams, padalijama į lygias dalis, kurios padengia difuzinę celę. Odos ekvilibracijos procesas vykdytas 24 valandas, kai pro odą cirkuliuoja 0,9% natrio chlorido tirpalas. Po ekvilibracijos and odos celėse užnešamos donorinės fazės, kurių sudėtys pateiktos 9 lentelėje. Kiekvienai formuluotei skiriamos trys celės, uždedama po 100µl tiriamųjų mėginių.

Tyrimai vykdyti 8 valandas. Akceptorinės terpės mėginiai imami po 1, 2, 4, 6 ir 8 valandų, celes pripildant nauja akceptorine terpe. Po 8 valandų donorinė fazė nuimama nuo kiaulės odos, naudotos eksperimentui, ir nuplaunama 0,9% NaCl tirpalu. Odos paviršius nusausinamas, iškerpami plotai, kurie lietėsi su donorine faze. Raginis sluoksnis pašalinamas naudojant tris lipnias juosteles kiekvienam odos gabalėliui. [14,30] Epidermis nuo dermos atskiriamas naudojant skalpelį bei pincetą. Atskirti epidermio bei dermos sluoksniai ekstrahuojami užpylus 1ml metanolio, naudojant ultragarsinį įleidžiamą zondą.Gauti ekstraktai liofilizuojami, tirpinami metanolio-vandens mišinyje ir išmatuojamas 10-HDA kiekis mėginiuose HPLC metodu. Judančioji fazė – metanolio/vandens mišinys (45:55), naudojant atvirkštinių fazių kolonėlę. Nustatytas pH 2,5 buvo pasiektas naudojant fosfato rūgštį, kuri prieš naudojimą buvo perfiltruota pro 0,45 µm membraninį filtrą ir dujos pašalintos veikiant heliu 5 minutes. Kolonėlės tekėjimo greitis – 0,5ml/min. UV detektorius nustatomas ties 225 nm bangos ilgiu, analizei skirtas laikas 30 minučių. Vidinis standartas – α-naftolis.

2.9.

Analitiniai metodai.

Pagamintų nanodalelių dydžio vidurkis ir polidispersiškumas nustatytas dinaminės šviesos sklaidos metodu. Tyrimui naudotas Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments, UK) analizatorius. Praskiestų distiliuotu vandeniu lipidinių nanonešiklių suspensijų VDD ir PDI matuojamas 173° kampu, 25 °C temperatūroje.

32

2.10.

Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) ir ,,SPPS 20.00“ (IBM, JAV) programas. Apskaičiuotas tyrimų duomenų matematinis vidurkis bei statistinis patikimumas ir santykinis standartinis nuokrypis.

33

3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1.

HaCaT ląstelių augimas normaliomis sąlygomis

Tyrimui naudojama sterili 24 šulinėlių plastikinė eksperimentinė lėkštelė, į kiekvieną šulinėlį sėjant po 50 tūkst. ląstelių.

Į kiekvieną šulinėlį pilama po 0,5ml DMEM augimo terpės, ląstelės laikomos 37°C temperatūroje, esant 5% CO2. Išėmus iš inkubatoriaus ląstelės nuplaunamos HBSS tirpalu (Sigma-Aldrich). Kasdien atkeliami trys šulinėliai, užpilant po 0,5ml Triple E express (Sigma-Aldrich), laikoma inkubatoriuje 8 minutes, ląstelėms atkibus nuo šulinėlių dugno užpilama 1 ml terpės, suspensija perkeliama į centrifuginius mėgintuvėlius ir centrifuguojama (Centrifuga Ependorf) 5 minutes, esant 1000rpm. Vėliau ląstelių terpė nupilama, užpilama 1 ml šviežios terpės, suspenduojama ir skaičiuojama. Ląstelių augimo kreivė pateikta 8 paveiksle.

8 paveikslas. HaCaT ląstelių augimas normaliomis sąlygomis

8 paveiksle matoma, jog HaCaT ląstelės dalijasi apytiksliai 1 kartą per 24 valandas, kaip nurodyta ląstelių auginimo protokole [61].

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

1 diena 2 diena 3 diena 4 diena 5 diena

L ąs telių sk aičius š uli nėly je (t ūk st .)

34

3.2.

MTT metodu nustatytas 10-HDA ir Bičių pienelio poveikis HaCaT

ląstelių gyvybingumui

Eksperimentuose buvo siekiama nustatyti, kaip skirtingos koncentracijos 10-HDA gryno tirpalo pavidalu bei ištirpinto bičių pienelio tirpalo pavidalu veikia ląstelių gyvybingumą.

9 pav. 10-HDA poveikis HaCaT ląstelių gyvybingumui, nustatytas MTT metodu

9 paveiksle pateikti 10-HDA tirpalo poveikio gyvybingumui rezultatai buvo lyginami su kontrole. Paveikus ląsteles 6µg grynos 10-HDA, gyvybingų ląstelių skaičius po 24 valandų padidėjo iki 101%. Paveikus ląsteles 80µg 10-HDA, ląstelių kiekis lyginant su kontrole sumažėjo iki 81,04%.. Toliau didinant 10-HDA kiekį iki 300µg ląstelių gyvybingumas lyginant su kontrole sumažėja iki 8%. Nustatyta statistiškai reikšmingas (p < 0,05) ląstelių gyvybingumo sumažėjimas, kai ląstelės buvo veikiamos didesniu nei 80 µg kiekiu 10-HDA. Apskaičiuota 10-HDA IC50 yra 150±5µg.

Bičių pienelio įtaka ląstelių gyvybingumui pateikta 10 paveiksle. 0 20 40 60 80 100 120 L ąs telių gy vy bin gum as ( %) 10 HDA kiekis (µg)

35

10 pav. Bičių pienelio poveikis HaCaT ląstelių gyvybingumui, nustatytas MTT metodu

10 paveiksle pateikti bičių pienelio poveikio gyvybingumui rezultatai buvo lyginami su kontrole. Paveikus ląsteles bičių pienelio kiekiu, kuriame buvo 0,2-1µg 10-HDA, ląstelių kiekis lyginant su kontrole sumažėjo iki 96,45%, todėl bičių pienelis mažomis koncentracijomis yra saugus naudoti liposomų gamybai ir naudoti ant odos. Paveikus ląsteles kiekiu, kuriame 1-5µg 10-HDA, ląstelių kiekis sumažėjo iki 78,82%, šis pokytis buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05). Didinant koncentraciją iki kiekio, kuriame buvo 200µg 10-HDA šulinėlyje, ląstelių gyvybingumas sumažėjo iki 29,34% lyginant su kontrole. Didesnio kiekio uždėti buvo neįmanoma, nes didesnės koncentracijos bičių pienelio suspensija buvo per tiršta, kad būtų galima uždėti ant šulinėlyje esančių ląstelių. Apskaičiuotas bičių pienelyje esančios 10-HDA kiekis, sumažinantis ląstelių gyvybingumą 50% lyginant su kontrole – 30±5µg (t.y. 1,5mg bičių pienelio). Tai yra 5 kartus mažesnis grynos 10-HDA kiekis, nei buvo reikalingas naudojant 10-HDA tirpalą, todėl galima daryti prielaidą, jog bičių pienelio sudėtyje esančios kitos medžiagos taip pat veikia ląstelių gyvybingumą.

0 20 40 60 80 100 120 0,2 0,6 1 2 3 5 7 9 10 13 15 20 25 30 35 40 50 60 70 80 90 100 120 140 160 180 200 L ąs telių gy vy bin gum as ( %)

36

3.3.

Propidžio jodido/Hoechst 33528 metodu nustatytas 10-HDA ir Bičių

pienelio poveikis HaCaT ląstelių gyvybingumui

Antrose eksperimentų serijose buvo vertinamas 10-HDA ir bičių pienelio mėginių poveikis ląstelių gyvybingumui pritaikant fluorescencinę mikroskopiją. Buvo naudojama ląstelių dažymo metodika, kurios metu naudojamas propidžio jodidas, paveikdamas DNR, bet nepereidamas pro ląstelės membraną, nekrozinius HaCaT ląstelių branduolius nudažo raudona spalva. Taip pat buvo naudojamas Hoechst 33258 dažas, kuris pereidamas per membraną ir paveikdamas ląstelės DNR, gyvybingų ląstelių branduolius nudažo mėlyna spalva. 11 paveiksle pateiktas ląstelių kontrolinis vaizdas.

11 pav.. Kontrolė. Kairėje pusėje – fluorescencinė nuotrauka, dešinėje – šviesinio mikroskopo nuotrauka

11 paveiksle matomas vaizdas, kai ant ląstelių nėra uždėti jokie mėginiai. Kairėje pusėje fluorescencinėje nuotraukoje matoma, jog gyvybingų ląstelių, nusidažiusių mėlyna spalva, yra daugiausia. Taip pat matomi pavieniai labai reti nekroziniai raudonos spalvos branduoliai, bei ryškiai švytintys deformuoti apoptotiniai branduoliai.

37

12 paveiksle matyti, kokį poveikį ląstelėms turėjo skirtingos koncentracijos 10-HDA tirpalo mėginiai. Kairėje pusėje – ląstelės, paveiktos 6µg 10-HDA, dešinėje –150 µg 10-HDA. Paveikus ląsteles 6 µg 10-HDA, jos išlieka gyvybingos ir nežymiai skiriasi nuo kontrolės. Paveikus 150 µg gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo iki 84,38%, o paveikus 250 µg – iki 67,52% lyginant su kontrole.

13 pav. 0,2µg 10-HDA kiekis bičių pienelyje

13 paveiksle matomas mažos koncentracijos bičių pienelio mėginių poveikis HaCaT ląstelėms. Mažomis koncentracijomis naudojant ląstelių gyvybingumas nesumažėja lyginant su kontrole.

Tyrimų rezultatai pateikti 14 ir 15 paveiksluose, vertinant gyvybingų ir negyvybingų ląstelių santykį po 24 valandų.

14 pav. 10-HDA poveikis HaCaT ląstelėms po 24 valandų

0,00% 20,00% 40,00% 60,00% 80,00% 100,00% 120,00% L ąst el ių gyvybingum as (% ) 10-HDA kiekis (µg) Negyvybingos (nekrozinės ir apoptotinės) ląstelės Gyvybingos ląstelės

38

14 paveiksle pateikti duomenys buvo gauti skaičiuojant gyvybingų ir negyvybingų ląstelių santykį matomame pro mikroskopą lauke. Daugiausia negyvybingų ląstelių buvo raudonos spalvos nekroziniu keliu žuvusios ląstelės. Paveikus ląsteles 10-HDA kiekiu iki 150µg, ląstelių skaičius sumažėjo iki 84,38%, o paveikus tirpalo kiekiu, kuriame buvo 250µg 10-HDA, ląstelių skaičius sumažėjo iki 67,52%. Iš grafiko ir nuotraukų matome, jog mažos koncentracijos tirpalai HaCaT ląstelių linijos ląstelių neveikia citotoksiškai.

15 paveikslas. Bičių pienelio poveikis HaCaT ląstelėms po 24 valandų

15 paveiksle matyti, kad nedidelės koncentracijos bičių pienelio, kuriame yra iki 20µg 10-HDA, ląstelių citotoksiškai neveikia, o liposomose esanti bičių pienelio koncentracija yra saugi vartoti ant odos. Ant ląstelių užėjus bičių pienelio kiekį, kuriame buvo 50µg 10-HDA, gyvybingų ląstelių kiekis sumažėjo iki 88,06%, šis poveikis nebuvo statistiškai reikšmingas. Didesnės koncentracijos mėginių uždėti nebuvo galimybės, nes dėl bičių pienelio sudėtyje esančių komponentų mikroskopavimo metu buvo sudėtinga atskirti ląsteles dėl pagrindą dengiančio sluoksnio.

0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% L ąst el ių gyvybigum as (% )

10-HDA kiekis bičių pienelyje (µg)

Negyvybingos (nekrozinės ir apoptotinės ) ląstelės

39

3.4.

Lipidinių nanonešiklių formuluotės parinkimas

Nanodalelių homogenizacija taikoma pasiekti mažesnes nei 200nm pūsleles, o PDI būtų mažesnis nei 0,3. Homogenizacijai buvo naudojamas ultragarsinis zondas.

8 lentelė. Pagamintų nanonešiklių formuluočių paaiškinimai

Nanonešiklio tipas Kodas Bičių pienelio

koncentracija

Homogenizavimo režimas

Liposomos L1 20mg/ml Ciklinis 8 kartai

L2 20mg/ml Ciklinis 10 kartų

L3 20mg/ml Ciklinis 15 kartų

L4 20mg/ml +Transcutol P

5mg/ml

Ciklinis 10 kartų

Etosomos E 20 mg/ml Ciklinis 8 kartai

Transfersomos T 20 mg/ml Ciklinis 8 kartai

Pagaminti lipidiniai nanonešikliai buvo tiriami dinaminiu šviesos sklaidos metodu, juo nustatomas lipidinių nanonešiklių dydis (16 pav.) bei polidispersijos indeksas (17 pav.). matavimų rezultatai pateikiami pav. formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 8 lentelėje.

16 paveikslas. Lipidinių nanonešiklių dalelių dydžio nustatymo rezultatai po homogenizacijos 0 20 40 60 80 100 120 L1 L2 L3 L4 E T L ipi din ių neš ik lių dy dis ( nm ) Formuluotės kodas

40

Iš matavimo rezultatų pastebima, kad mažiausias dalelių dydis gautos liposominėse suspensijose, kurios homogenizuotos taikant daugiau ciklų. Mažiausio dydžio dalelės gautos homogenizuojant 15 kartų po 5 ciklus 5 sekundės įjungus ir 2 sekundes išjungus – jų dydis 57,83±6,2 nm. Didžiausio dydžio dalelės gautos gaminant transfersomas, ir taikant 8 kartus po 5 ciklus, kurie taikyti ir liposomų gamybai. Daugiau kartų atlikti homogenizavimą ir pasiekti mažesnių transfersomų nepavyko, nes plėvelės hidracijai naudojamas 5% etanolis, kuris su bičių pienelyje esančiais baltymais suformuoja putas, dėl kurių reikia ilginti laiką tarp homogenizacijos ciklų, arba nutraukti homogenizacijos ultragarsiniu zondu procesą. Transfersomų dalelių dydis – 95,64±8,1 nm. Visos dalelės pagal dydį atitinka reikalavimus, nes tikslas – pagaminti liposomas, kurių dalelių dydis būtų mažesnis nei 200nm. Norint tiksliau įvertinti nanodalelių dydžio matavimo rezultatus, būtina atsižvelgti į jų polidispersiškumą. Polidispersiškumas – tai nevienodų matmenų dalelių buvimas sistemoje. PDI reikšmės gali būti nuo 0 iki 1. Kuo PDI reikšmė mažesnė – tuo sistema homogeniškesnė, todėl idealiu atveju reiktų siekti reikšmės, kuri yra nuo 0,1 iki 0,25, nes remiantis moksline literatūra, tokios sistemos yra vienodžiausios ir pasižymi didžiausiu stabilumu [45]. 17 paveiksle pateikiamos PDI reikšmės, gautos atlikus matavimus dinaminės šviesos sklaidos metodu.

17 pav. Lipidinių nanonešiklių polidispersiškumo nustatymo rezultatai po homogenizavimo 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 L1 L2 L3 L4 E T P DI Formuluotės kodas

41

17 paveiksle matome, kad ne visų lipidinių nanonešiklių reikšmės yra iki 0,3. Pagal dispersiškumą reikalavimus atitinka tik liposominės formuluotės L3 ir L4, kurios atitinkamai buvo paprastos liposomos su įterptu skvarbos skatintoju Transcutol P ir liposomos, į kurių sudėtį papildomų medžiagų įdėta nebuvo, jų polidispersiškumas po homogenizacijos buvo 0,286±0,006 ir 0,297±0,003. Tai rodo, kad šios gautos formuluočių sistemos yra sąlyginai homogeniškos. Didesniu homogeniškumu pasižyminčių lipidinių nanonešiklių pagaminti nepavyko, nes bičių pienelis – sudėtinga daugiakomponentė sistema, didesnis homogeniškumas pasiekiamas gamybai naudojant grynas medžiagas.

3.5.

Pagaminto gelio su hidroksietilceliulioze dalelių dydžio ir PDI

parametrų nustatymas

Pagamintas gelis, naudojant 2,5% hidroksietilceliuliozės, į kurį inkorporuotos liposomos. Liposomose nanodalelių dydis buvo 57,83±6,2nm, gelyje liposominių dalelių dydis buvo 66,19±7,5nm. Galima spręsti, kad gelifikuojanti medžiaga hidroksietilceliuliozė arba glicerolis turi įtakos lipidinių dalelių agregacijai, todėl dalelių dydis buvo didesnis.

18 pav.Liposominių dalelių dydis suspensijoje po homogenizacijos ir gelyje po gelio suformavimo 57,83 66,19 52 54 56 58 60 62 64 66 68

Liposomos Gelis su liposomomis

Da leli ų dy dis ( nm )

42

19 pav. Liposominių dalelių PDI suspensijoje po homogenizacijos ir gelyje po gelio suformavimo

18 ir 19 paveiksluose matome liposominių dalelių dydžio ir polidispersijos indekso matavimo rezultatus prieš gelifikacijos su hidroksietilceliulioze procesą ir po gelio suformavimo. Rezultatai rodo, jog liposomos suspensijoje yra mažesnių matmenų nei gelyje, todėl galima spėti, jog gelį formuojančios medžiagos skatina liposominių dalelių agregaciją, taip pat gelyje liposomos yra mažiau homogeniškos, tačiau dalelių dydis atitinka reikalavimus, o polidispersiškumo indekso padidėjimas po gelifikacijos nėra statistiškai reikšmingas.

0,287 0,383 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45

Liposomos Gelis su liposomomis

P

DI re

ik

šm

43

3.6.

Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai

Visų nanonešiklių formuluočių stabilumas buvo įvertintas laiko atžvilgiu nuo homogenizavimo iki 30 dienų laikotarpio. Stebėtas nanodalelių dydis (sudėtys pateiktos 8 lentelėje) ir polidispersiškumo indeksas (PDI). Visi rezultatai pateikiami 20 ir 21 paveiksluose.

20 pav. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai matuojant dalelių dydį

20 paveiksle matoma, jog matuojant lipidinių nanonešiklių dydį stabiliausios išliko L4 formuluotės liposomos, jų dydis statistiškai reikšmingai nepakito, po 30 dienų dalelių dydis pakito nuo 59,38 iki 68,37 nm. L3 formuluotės liposomos su Transcutol P stabilios išliko 7 dienas, po 14 dienų jų dydis statistiškai reikšmingai pakito, nuo 57,83 iki 68,52nm, o po mėnesio laiko dalelių dydis buvo 73,64nm. Liposomų formuluotės L1, L2, etosomos, transferosomos ir liposomos gelyje išliko buvo nestabilios, jų dalelių dydis pakito statistiškai reikšmingai. Nestabiliausios dalelių dydžio atžvilgiu buvo etosomos, nes jų dalelių dydis per 30 dienų pakito nuo 70,28 nm iki 357,96 nm. Todėl etosominiai nanonešikliai yra visiškai netinkami bičių pienelio inkorporavimui.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 po 1 h po 1d po 7 d po 14 d po 30 d L1 L2 L3 L4 E T Gelis