LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Simona Sakalauskaitė
Spermos skiediklių ir rentgeno spindulių įtaka šunų
spermos kokybei
Effects of semen extenders and X-irradiation on canine
sperm quality
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovė: prof. dr. Vita Riškevičienė
2 DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Spermos skiediklių ir rentgeno spindulių įtaka šunų spermos kokybei“.
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. Simona Sakalauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Simona Sakalauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3 TURINYS SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SUTRUMPINIMAI ... 7 ĮVADAS... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11 1.1. Spermatogenezė ... 11 1.2. Spermatozoido sandara ... 11
1.3. Spermatozoidų membranos pažeidimą sukeliančios priežastys ... 12
1.4. Spermatozoidų membranos vientisumas bei funkcionalumas ir jų nustatymo būdai ... 14
1.5. Spermatozoidų judrumą įtakojantys veiksniai ... 17
1.6. Spermos skiedikliai ir jų komponentų įtaka spermatozoidų gyvybingumui ... 20
1.7. Rentgeno spindulių įtaka spermos kokybiniams rodikliams ... 24
2. TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI ... 26
2.1. Bandymo atlikimo eiga ... 26
2.2. Subjektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas ... 28
2.3. Objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas ant objektinio stiklelio kompiuterinės spermatozoidų analizės metodu (CASA) ... 28
2.4. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas ... 29
2.5. Spermatozoidų galvučių patologijų įvertinimas ... 29
2.6. Spermatozoidų uodegėlių ir kitų patologijų įvertinimas ... 29
2.7. Spermatozoidų gyvybingumo (funkciškai nepažeistos membranos) nustatymas hipoosmosinio rezistentiškumo metodu (HOT) ... 30
2.8. Spermatozoidų gyvybingumo (struktūriškai nepažeistos membranos) nustatymas naudojant fluorescencinį tyrimą - SYBR-14/PI ... 30
2.9. Statistiniai skaičiavimai ... 31
3. REZULTATAI ... 32
3.1. Šviežios šunų spermos kokybiniai rodikliai ... 32
3.2. Skirtingais skiedikliais skiestos šunų spermos gyvybingumo rodiklių tyrimai ... 33
3.2.1. Skirtingais skiedikliais skiestos šunų spermos spermatozoidų bendro spermatozoidų judrumo pokyčiai ... 33
3.2.2. Skirtingais skiedikliais skiestos šunų spermos spermatozoidų progresyvaus spermatozoidų judrumo pokyčiai ... 34
4 3.2.3. Bendro ir progresyvaus spermatozoidų judrumo priklausomybė nuo patologinių
spermatozoidų kiekio ... 35
3.2.4. Skirtingais skiedikliais skiestos šunų spermos spermatozoidų membranų funkcinis aktyvumas (HOT) saugojimo metu ir jo koreliaciniai ryšiai su spermatozoidų morfologiniais pokyčiais ... 36
3.2.5. Skirtingais skiedikliais skiestos šunų spermos spermatozoidų gyvybingumas (SYBR-14/PI) saugojimo metu ir jo koreliaciniai ryšiai su spermatozoidų morfologiniais pokyčiais ... 37
3.2.6. Skiestos šunų spermos spermatozoidų gyvybingumo ir judrumo koreliaciniai ryšiai saugojimo metu... 39
3.3. Rentgeno spindulių poveikio šunų spermos judrumo ir gyvybingumo rodikliams tyrimai ... 41
3.3.1. Bendro spermatozoidų judrumo pokyčiai rentgeno spinduliais apšvitintoje šunų spermoje... 42
3.3.2. Progresyvaus spermatozoidų judrumo pokyčiai rentgeno spinduliais apšvitintoje šunų spermoje... 43
3.3.3. Apšvitintų ir neapšvitintų rentgeno spinduliais spermatozoidų membranų funkcinio aktyvumo įvertinimas (HOT) ... 44
3.3.4. Apšvitintų ir neapšvitintų rentgeno spinduliais spermatozoidų plazminės membranos vientisumo įvertinimas (SYBR-14/PI) ... 45
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 46
IŠVADOS ... 50
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 52
5 SANTRAUKA
Šio darbo tikslas buvo nustatyti komercinio CaniPlus Chill 5 (Minitüb) (CP) ir laboratorijoje pagaminto (LGS) šunų spermos skiediklių bei rentgeno spindulių įtaką spermatozoidų judrumui ir gyvybingumui saugojimo metu. Taip pat nustatyti koreliaciniai ryšiai tarp šių rodiklių.
Tyrimui naudota 10 skirtingų šunų sperma, kuri buvo padalinta į tris dalis. Viena dalis skiesta LGS skiedikliu. Kitos dvi dalys skiestos CP skiedikliu, iš kurių viena paveikta rentgeno spinduliais 1 kartą peršviečiant introskopu (HI-SCAN 100100 T). Klasikiniais metodais buvo įvertinta šviežios šunų spermos koncentracija, morfologija, subjektyvus judrumas. Atskiestos ir paveiktos rentgeno spinduliais spermos spermatozoidų bendras ir progresyvus judrumas nustatytas naudojant SCA programą (Ispanija, 2011). Spermatozoidų gyvybingumas nustatytas hipoosmosinio rezistentiškumo metodu (HOT) (funkciškai nepažeistos membranos) ir fluorescenciniu tyrimu naudojant SYBR-14/PI (Molecular Probes) (struktūriškai nepažeistos membranos). Judrumas ir gyvybingumas buvo vertinami kas 24 val. 5 dienas iš eilės, spermą laikant 4 oC temperatūroje.
Nustatyta, jog LGS skiestos spermos mėginių spermatozoidų judrumas (p≤0,05) ir spermatozoidų su struktūriškai (p≤0,05) ir funkciškai nepažeistomis membranomis kiekis buvo mažesnis visas 5 tyrimo dienas negu mėginių skiestų CP skiedikliu. Nustatyta, kad spermatozoidų bendras judrumas patikimai (p≤0,05) teigiamai koreliavo su spermatozoidų turinčių funkciškai ir struktūriškai nepažeistas plazmines membranas kiekiu CP skiestuose mėginiuose. Taip pat spermatozoidų bendras judrumas patikimai (p≤0,05) teigiamai koreliavo su spermatozoidų turinčių funkciškai nepažeistas plazmines membranas kiekiu LGS skiestuose mėginiuose.
Įvertinus patologinių spermatozoidų įtaką gyvybingumui LGS skiestuose mėginiuose nustatyta patikima (p≤0,05) neigiama koreliacija tarp galvučių patologijų ir spermatozoidų su funkciškai nepažeistomis plazminėmis membranomis kiekio antrą ir trečią saugojimo dienas, o tarp uodegėlių patologijų ir spermatozoidų su vientisomis plazminėmis membranomis kiekio 2 - 4 saugojimo dienas. CP skiestuose mėginiuose patikima (p≤0,01) neigiama koreliacija tarp spermatozoidų patologijų ir gyvybingumo nustatyta tik pirmą saugojimo dieną.
Rentgeno spinduliais paveiktuose spermos mėginiuose spermatozoidų bendras ir progresyvus judrumas (p>0,05), spermatozoidų su funkciškai (p≤0,05, p≤0,01) ir struktūriškai (p>0,05) nepažeistomis membranomis kiekis buvo mažesnis nei rentgeno spinduliais nepaveiktuose spermos mėginiuose visą saugojimo laiką.
6 SUMMARY
The aim of the present study was to investigate the influence of commercially available extender CaniPlus Chill 5 (Minitüb) (CP) and self-made extender (LGS) and also the effects of exposure to X-rays on motility and viability of canine spermatozoa over the storage period for 5 days. Also we detected correlations among the sperm variables examined.
Semen samples were collected from 10 different dogs. Each ejaculate was divided into three equal aliquots. One aliqout was diluted with LGS extender. Two aliqouts were diluted with CP extender and one of them was transported through airport security X-ray machine (HI-SCAN 100100 T) one time. Concentration, morphology and subjective motility of fresh canine semen were assesed using conventional semen evaluation methods. Progressive and total motility of diluted and exposed to X-rays semen were assesed by SCA (Spain, 2011). Percentage of spermatozoa with intact membrane were assesed using SYBR-14/PI (Molecular Probes) fluorescent staining. Percentage of spermatozoa with functional membrane were assesed using hypoosmotic swelling test (HOT). Extended semen samples were kept at 4 oC and examined every day over the storage period of 5 days.
We asesed that percentage of motile sperm (p≤0,05) and spermatozoa with intact (p≤0,05) and functional membranes were decreasing every day in all samples but were lower in samples extended with LGS than in samples extended with CP. Total motility had a significant (p≤0,05) positive correlation with viable spermatozoa (indicated by both methods - SYBR-14/PI and HOT) in CP samples and with spermatozoa with functional membrane in LGS samples.
Percentage of spermatozoa with head deffects had a significant (p≤0,05) negative correlation with percentage of membrane intact spermatozoa as indicated by HOT on the second and third day. Spermatozoa with tail deviations were inversely correlated (p≤0,05) with membrane intact sperms identified by SYBR-14/PI on 2, 3 and 4 days in LGS extended samples. In CP extended samples abnormal spermatozoa had a significant (p≤0,05) negative correlation with percentage of viable spermatozoa just on first day.
Total and progressive motility (p>0,05), percentage of spermatozoa with functional (p≤0,05, p≤0,01) and inatct (p>0,05) membrane were lower over the storage period for 5 days in semen samples exposed to X-rays compared to control samples.
7 SUTRUMPINIMAI
ATP – adenozintrifosfatas
B16 – 5-(4-dimethilamino-fenil)-2-fenil-penta-2,4-dienoinė rūgštis
CASA – (angl. Computer Assisted Sperm Analyzer) – kompiuterinė spermatozoidų analizės sistema
C-FDA - 6-karboksifloresceino diacetatas CP – CaniPlus Chill 5 spermos skiediklis DNR – deoksiribonukleorūgštis
H2O2 – vandenilio peroksidas
HOT – hipoosmotinio rezistentiškumo testas LGS – laboratorijoje pagamintas spermos skiediklis N-sperma – sperma nepaveikta rentgeno spinduliais PI – propidžio jodidas
R-sperma – sperma paveikta rentgeno spinduliais
ROS – (angl. Reactive oxygen species) - reaktyvaus deguonies radikalai
SCA – (angl. Sperm Class Analyzer) – modulinė automatinė spermos analizės sistema TRIS – tris(hidroksimetil)aminometanas
8 ĮVADAS
Šunys yra vieni populiariausių augintinių daugelyje pasaulio šalių. Archeologiniai radiniai rodo, kad šunys buvo pirmieji prijaukinti gyvūnai ir gyvena kartu su žmogumi bent jau 15 000 metų [1]. Dauguma šunų veislių Europoje atsirado XVII amžiuje [2,3]. Dabar pasaulyje yra priskaičiuojama apie 350 skirtingų šunų veislių [3,4]. Beveik visos veislės atsirado natūralaus kergimo būdu, tačiau dabar vis labiau populiarėja šunų sėklinimas.
Šunų veisime sėklinimo svarbumas ypatingai padidėjo paskutiniais dešimtmečiais [5]. Kartais sėklinimas taikomas kai kalė ar patinas turi lytinių takų anomalijų, libido trūkumų, noro patiną apsaugoti nuo lytiniu keliu plintančių infekcinių ligų ar šunų nepatyrimo kergti natūralus kergimas yra sunkus ar net neįmanomas. Tačiau dažniausiai sėklinimas yra naudojamas kai kalė ir patinas gyvena toli vienas nuo kito, tuo atveju spermos transportavimas yra pigesnis ir greitesnis būdas nei gyvūnų pervežimas, o taip pat ir mažiau streso kalei ir šuniui sukeliantis variantas.
Pastaruoju metu padidėjo susidomėjimas sėklinimu naudojant atvėsintą spermą. Atvėsinta sperma ypatingai tinkama kai sperma saugoma trumpą laiko tarpą, nes ji yra geresnė pirmąsias 118,7±25,9 val. nei šaldyta sperma [5,6]. Didžiausi atvėsintos spermos privalumai, lyginant su šaldyta sperma, yra lengvesnis ir pigesnis jos paruošimas sėklinimui ir transportavimas, nes reikalinga mažiau specializuota įranga [7–10]. Taip pat sėklinimui naudojant atvėsintą spermą kalės geriau apsivaisina, o šuniukų vados būna didesnės lyginant su atvejais kai sėklinimui buvo naudota šaldyta sperma, nors abiem atvejais buvo nustatyta kalių ovuliacija ir pati sėklinimo procedūra atliktos vienodais būdais [10–12].
Sėklinimui ar tyrimo tikslais paimtos šviežos šunų spermos kokybė greitai sumažėja, todėl ji yra skiedžiama ir atvėsinama arba užšaldoma. Atvėsinimas ir užšaldymas sumažina spermatozoidų metabolinį aktyvumą ir dėl to spermos gyvybingumas išsaugomas ilgą laiką [13,14].
Tačiau atvėsinimui ar užšaldymui ruošiama sperma privalo būti praskiedžiama tam tinkamu skiedikliu. Skiedikliai apsaugo spermatozoidus nuo šalčio šoko, palaiko jų metabolinį aktyvumą, tinkamą pH ir osmosinį slėgį, neleidžia daugintis patogeniniams mikroogranizmams spermoje, nes skiedikliuose būna antibiotikų.
Rinkoje yra daug ir įvairių komercinių skiediklių šunų spermai skiesti. Dažniausiai visi skiedikliai turi medžiagas, kurios reikalingos anksčiau minėtoms savybėms palaikyti ar išsaugoti, tai antibiotikai, antioksidantai, amino rūgštys, angliavandeniai, buferinės druskos, krioprotektoriai, tačiau jų kiekiai ir santykis skiediklyje yra neskelbiami nes tai yra laikoma komercine paslaptimi. Dėl to skiediklių, nors ir skirtų tai pačiai procedūrai vykdyti, savybės šiek tiek skiriasi.
9 Yra laboratorijų, kurios spermos skiedikliais neprekiauja, bet gamina skiediklius savo poreikiams pačios. Tai yra ekonomiškai naudingiau, bet reikalauja nuodugnaus pagamintų skiediklių ir jais atskiestos spermos ištyrimo. Priklausomai nuo spermos naudojimo tikslų, specialistai renkasi kiekvienam atvejui skirtingus skiediklius, tačiau norint išsiaiškinti ar naujai pagamintas skiediklis šunų spermai skiesti yra pakankamai geras, galintis užtikrinti spermatozoidų gyvybingumą reikiamą laiką, reikia atlikti nuodugnius tyrimus.
Atvėsintos spermos kokybė ir spermatozoidų vaisingumas taip pat priklauso ir ne tik nuo pačios spermos kokybės ir panaudoto skiediklio, bet ir nuo transportavimo sąlygų, aplinkos temperatūros, trukmės ir kitų veiksnių [15–17]. Vienas iš neigiamai spermatozoidus veikiančių veiksnių gali būti rentgeno spinduliai, kuriais spermos mėginiai dažniausiai yra apšvitinami transportuojant spermą iš vienos šalies į kitą oro transportu praeinant saugumo patikrinimą.
Pastaruoju metu, norint išvengti giminingo veisimo, ar sėklinimui naudoti aukštos genetinės vertės patino spermą ir taip padidinti genetinę įvairovę, šunų sperma gabenama tarptautiniu mastu naudojant oro transportą. Oro uoste sperma, kaip ir kiti kroviniai, peršviečiama introskopu. Tačiau informacijos, kaip tokia patikra gali paveikti spermatozoidų gyvybingumą, nepavyko aptikti, o veterinarijos gydytojams praktikams, tai kelia įtarimų.
Vadovaudamiesi šiomis įžvalgomis mes suformavome ir iškėlėme sau darbo tikslą: įvertinti CaniPlus Chill 5 ir laboratorijoje pagaminto (LGS) šunų spermos skiediklių bei rentgeno spindulių įtaką šunų spermatozoidų judrumui ir gyvybingumui saugojimo metu.
Šiam tikslui įgyvendinti buvo sprendžiami tokie darbo uždaviniai:
1. Nustatyti ir palyginti nepaveiktos rentgeno spinduliais CaniPlus Chill 5 ir LGS skiedikliais atskiestos spermos spermatozoidų judrumo pokyčius saugojimo metu.
2. Nustatyti ir palyginti nepaveiktos rentgeno spinduliais CaniPlus Chill 5 ir LGS skiedikliais atskiestos spermos spermatozoidų gyvybingumo (HOT) pokyčius saugojimo metu.
3. Nustatyti ir palyginti nepaveiktos rentgeno spinduliais CaniPlus Chill 5 ir LGS skiedikliais atskiestos spermos spermatozoidų gyvybingumo (SYBR-14/PI) pokyčius saugojimo metu. 4. Nustatyti šunų spermatozoidų judrumo ir gyvybingumo sąveiką CaniPlus Chill 5 skiedikliu
skiestoje spermoje.
5. Nustatyti šunų spermatozoidų judrumo ir gyvybingumo sąveiką laboratorijoje pagamintu skiedikliu (LGS) skiestoje spermoje.
10 6. Nustatyti patologinių spermatozoidų procento šviežioje spermoje įtaką CaniPlus Chill 5 ir LSG skiestų šunų spermatozoidų funkcinių (HOT) ir struktūrinių (SYBR-14/PI) spermatozoidų plazminės membranos pokyčių pasireiškimui (gyvybingumui).
7. Nustatyti ir palyginti šunų spermatozoidų judrumą tarp rentgeno spinduliais paveiktų ir nepaveiktų CaniPlus Chill 5 skiedikliu skiestų spermos mėginių.
8. Nustatyti ir palyginti šunų spermatozoidų su funkciškai nepažeistomis plazminėmis membranomis kiekį (HOT) tarp rentgeno spinduliais paveiktų ir nepaveiktų CaniPlus Chill 5 skiedikliu skiestų spermos mėginių.
9. Nustatyti ir palyginti šunų spermatozoidų su struktūriškai nepažeistomis plazminėmis membranomis (SYBR-14/PI) tarp rentgeno spinduliais paveiktų ir nepaveiktų CaniPlus Chill 5 skiedikliu skiestų spermos mėginių.
11 1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Spermatogenezė
Spermatogenezė yra unikalus procesas, kurio metu sėklidėse kasdien susidaro milijonai spermatozoidų [18]. Šunų spermatogenezė trunka 49 dienas. Šis procesas yra sudarytas iš trijų funkciškai ir morfologiškai atskirų fazių: spermacitogenezės, mejozės ir spermiogenezės [19].
Spermatogoninėmis kamieninėmis ląstelėmis vadinamos ląstelės esančios vingiuotųjų kanalėlių pagrindo membranoje, šios ląstelės vadinamos A spermatogonijomis, kurios nepertraukiamai dalinasi mitozės būdu iki difenrencijuojasi į B spermatogonijas.
B spermatogonijos taip pat dalinasi mitozės būdu ir tampa pirminiais spermatocitais. Pirminiai spermatocitai jau dalinasi mejozės būdu iki susidaro antriniai spermatocitai. Antriniams spermatocitams antrą kartą mejoziškai pasidalinus susidaro haploidiniai spermatidai, kurie spermiogenezės metu transformuojasi į spermatozoidus.
Spermiogenezė, atsižvelgiant į morfologinius kriterijus, dalinama į 16 stadijų [20]. Spermiogenezės metu besivystančios gametos migruoja iš membranos pagrindo link vingiuotųjų kanalėlių spindžio. Pasibaigus spermiogenezei ląstelės patenka į vingiuotųjų kanalėlių spindį, o šis procesas vadinamas spermacija. Šios ląstelės dabar jau vadinamos spermatozoidais [21].
Sėklidėse susidarę spermatozoidai yra nejudrūs ir transportuojami į anstėklidį dėka vingiuotųjų kanalėlių spindyje esančio skysčio spaudimo ir ištekamųjų kanalėlių virpamųjų ląstelių judesių.
Spermatozoidų subrendimas vyksta antsėklidžio galvutėje. Antsėklidyje spermatozoidai tampa judrūs ir įgyja sugebėjimą apvaisinti. Šiuos procesus užtikrina antsėklidyje esantys dekapacitacijos faktoriai (proteinai, glikolipidai ir/ar lipidai), kurie stabilizuoja spermatozoido membraną. Subrendę spermatozoidai transportuojami į antsėklidžio kūną ir uodegėlę ir iki ejakuliacijos saugomi antsėklidžio uodegėlėje [22].
1.1. Spermatozoido sandara
Spermatozoidas yra pailgėjusi judri ląstelė, kurios funkcija perduoti haploidinį patino genomą į oocitą [22]. Struktūriškai spermatozoidas yra sudarytas iš galvutės, jungiančiosios dalies ir uodegėlės. Šunų spermatozoidai turi apvalią plokščią galvutę. Šuns spermatozoido ilgis yra apie 70 µm. Šio viso ilgio 10 proc. sudaro galvutė, 20 proc. – jungiančioji dalis, o likusius 70 proc. – uodegėlė [21].
12 Spermatozoido galvutė sudaryta iš branduolio ir akrosomos. Branduolyje yra kompaktiškai kondensuoto chromatino, kuris yra sudarytas iš DNR, kurią sudaro protaminai. Branduolys sudarytas iš haploidinio chromosomų skaičius, kuris susidaro dėl mejozinio ląstelės dalijimosi spermatogenezės metu.
Priekinę spermatozoido branduolio dalį dengia akrosoma – plonas, dvigubas, membraninis maišelis. Joje yra akrozino, hialuronidazės ir kitų hidrolitinių fermentų, kurie dalyvauja apvaisinimo procese. Vidurinė akrosomos dalis yra svarbi, nes ji kartu su poakrosominio regiono priekine dalimi susilieja su oocito membrana apvaisinimo metu.
Jungiančioji dalis arba kaklelis jungia uodegėlę su galvute. Joje yra pamatinis kūnelis, kuris duoda pradžią toliau einančiai aksonemai.
Uodegėlė sudaryta iš trijų dalių: vidurinės, pagrindinės ir galinės. Vidurinėje dalyje, kaip ir visoje uodegėlėje, yra aksonema sudaryta iš dviejų centrinių mikrovamzdelių, kurie apsupti devynių dvigubų mikrovamzdelių. Visus mikrovamzdelius gauba devynios išilginio pluošto skaidulos vadinamos išorinėmis tankiosiomis skaidulomis. Periferiškai aplink aksonemą ir tankiąsias skaidulas yra išsidėsčiusios mitochondrijos, kurios yra energijos šaltinis, užtikrinantis spermatozoido judėjimą. Vidurinė dalis taip pat sudaryta iš aksonemos ir tankiųjų skaidulių pluošto. Šis pluoštas suteikia stabilumo kontraktilinėms uodegėlės sudedamosioms dalims. Galinė dalis sudaryta tik iš aksonemos, padengtos plazmine membrana [23].
Visą gyvą spermatozoidą dengia vientisa plazminė membrana. Vientisa spermatozoido plazminė membrana yra vienas svarbiausių spermatozoido struktūrinių komponentų, užtikrinančių spermatozoido gyvybingumą ir funkcijas, tokias kaip kapacitacija, akrosominė reakcija ir susiliejimas su kiaušinėlio plazmine membrana [22].
1.2. Spermatozoidų membranos pažeidimą sukeliančios priežastys
Plazminė spermatozoido membrana supa visą spermatozoido ląstelę laikydama kartu jos organeles ir intraląstelinius komponentus ir, dėl savo pusiau pralaidžių savybių, palaiko cheminį jonų ir kitų tirpių komponentų gradientą. Specifiniai plazminės membranos baltymai palengvina gliukozės ir fruktozės transportą iš ekstraląstelinės aplinkos į spermatozoidą [24–27]. Šios medžiagos yra nepakeičiamas energijos šaltinis: subrendusiame spermatozoide apie 90 proc. ATP yra pagaminama anaerobinės glikolizės būdu, kas parodo monosacharidų, kaip substratų, svarbą ATP gamyboje [27–29]. Plazminė membrana dalyvauja svarbiuose procesuose, tokiuose kaip spermatozoidų išgyvenamumas patelės lytiniuose takuose, spermatozoidų kapacitacija ir apvaisinimas [30,31].
13 Spermatozoidų membrana gali būti pažeidžiama spermos ruošimo in vitro metu, kai sperma yra skiedžiama, atvėsinama ar saugojama ilgesnį laiko tarpą, nes laikant atvėsintą spermą didelę įtaką spermatozoidų kokybei turi oksidacinis stresas [32,33].
Tosic and Walton [34] nustatė, kad bulių spermatozoidai generuoja reaktyviuosius deguonies junginius (ROS), vėliau [35] jie įrodė, kad H2O2 gamyba padidėja naudojant spermos skiediklius su
kiaušinio tryniu. Buvo nustatyta, kad aktyvusis kiaušinio trynio komponentas yra aromatinė amino rūgštis fenilalaninas. Mokslininkai įrodė, kad bulių spermatozoidai turi L-amino rūgščių oksidazės
sistemą, kuri, esant deguonies, gali katalizuoti aromatinių amino rūgščių deaminizaciją ir dehidrogenizaciją susidarant H2O2 ir amoniakui. Nors susidarę H2O2 kiekiai būna maži, bet jie yra
pakankami, kad slopintų spermatozoidų kvėpavimą ir sumažintų judrumą. Taip pat įrodyta, kad už šiuos padarinius buvo atsakingi ROS, o ne amoniakas, nes toksiškas fenilalanino poveikis galėjo būti visiškai atstatomas pridėjus katalazės. Taigi jau šie, seniai atlikti, tyrimai parodė, kad žinduolių spermatozoidai yra jautrūs oksidaciniam stresui, o oksidacinio streso ir su tuo susijusių padarinių pagrindinė priežastis yra H2O2 [36].
Laisvieji radikalai ir ROS, kurie yra generuojami spermatozoidų atvėsintos spermos saugojimo metu, sukelia neigiamus pokyčius spermatozoidų hiperaktyvacijoje, kapacitacijoje ir akrosominėje reakcijose. ROS kiekis intraląstelinių antioksidantų pagalba yra palaikomas reikiamame lygyje, tačiau kai ROS-inaktyvacijos mechanizmai sutrinka, įvyksta oksidacinis stresas ir spermatozoidai yra pažeidžiami [37,38].
Spermatozoidai yra labai jautrūs oksidaciniam stresui, ypač lipidų peroksidacijai, dėl to, kad jų didelę plazminės membranos dalį sudaro polinesočiosios riebalų rūgštys. Riebalų rūgštys yra būtinos patinų germinatyvinėms ląstelėms, kad palaikytų spermatozoidų funkcijas, tačiau spermatozoidai negali resintezuoti plazminės membranos komponentų [39,40]. Todėl spermos skiediklius papildžius antioksidantais galima sumažinti ROS sukelto oksidacinio streso poveikį [40].
Tirdami atvėsintą šunų spermą ir įvairius antioksidantus Michael et al. [40] nustatė, kad vitaminas E pasižymėjo ryškiausiu teigiamu poveikiu išlaikant spermos kokybinius rodiklius. Ypač reikšmingai spermos kokybinius parametrus (judrumas, membranos vientisumas), lyginant su kontrole, pagerino 0,1 mM koncentracijos α-tokoferolio pridėjimas į skiediklį. Taip pat vitaminas E pasižymėjo patenkinamu bendru ROS slopinamuoju poveikiu, nes visada spermoje, skiestoje skiedikliu su šiuo antioksidantu, buvo nustatomi mažesni ROS kiekiai, lyginant su kontroline grupe, bet reikšmingas skirtumas buvo nustatytas tik po 72 val. spermos laikymo.
Tame pačiame tyrime kitas, kaip geriausias, antioksidantas atvėsintai šunų spermai rekomenduojamas 5-(4-dimethilamino-fenil)-2-fenil-penta-2,4-dienoinė rūgštis (B16). Šis
14 antioksidantas reikšmingai sumažino ROS kiekį (po 24 ir 72 val.), kas parodė, kad B16 galima naudoti kaip antioksidantą norint spermą laikyti šiek tiek ilgiau. Pridėjimas 0,1 mM B16 teigiamai koreliavo su tirtais spermos parametrais, o teigiamas efektas buvo šiek tiek geresnis nei vitamino E. Geriausi rezultatai buvo nustatyti hipoosmotinio testo būdu (HOT), kas parodė, kad B16 apsaugo ląstelių membranų funkcinį vientisumą.
Spermatozoidų plazminę membraną gali pažeisti spermos užteršimas bakterijomis, nes tai skatina makrofagų ir polimorfonuklearinių granuliocitų produkciją, ko pasėkoje taip pat susidaro ROS. Nustatyta, kad Escherichia coli ir Pseudomonas aeruginosa gali sukelti spermatozoidų membranos, akrosomos ar vidurinės dalies struktūrinius pokyčius [41,42].
Spermos užšaldymas ir atšildymas taip pat sukelia pokyčius spermatozoidų plazminėje membranoje dėl susidariusių ledo kristalų, dėl toksinio ar osmosinio streso sukeliamo į spermos skiediklius dedamų krioprotektorių [43].
Dažnai kaip krioprotektorius skiedikliuose naudojamas glicerolis. Manoma, kad glicerolio: fosfolipidų santykis yra pagrindinis faktorius įtakojantis spermatozoidų plazminės membranos pralaidumą ir stabilumą. Spermos užšaldymas sukelia cholesterolio kiekio sumažėjimą plazminėje membranoje, dėl ko įvyksta ankstyva akrosominė reakcija [44].
Nustatyta, kad šunų spermatozoidų plazminės membranos vientisumui įtakos turi spermatozoidų koncentracija spermoje ir patologinių spermatozoidų kiekis. Kuo spermoje buvo daugiau patologinių spermatozoidų tuo mažiau buvo spermatozoidų su nepažeista plazmine membrana. Tačiau kuo spermos koncentracija buvo didesnė tuo daugiau buvo spermatozoidų su nepažeista plazmine membrana [45].
Taip pat plazminės membranos vientisumui įtakos turi ir tokie veiksniai kaip šuns amžius ir veislė. Vakarų Škotijos baltųjų terjerų spermos mėginiuose lyginant su kitomis šunų veislėmis nustatyta mažesnis spermatozoidų su vientisa plazmine membrana kiekis. Amžius taip pat turėjo neigiamos įtakos membranų vientisumui [45].
1.3. Spermatozoidų membranos vientisumas bei funkcionalumas ir jų nustatymo būdai
Spermatozoidų gyvybingumas gali būti įvertinamas apskaičiuojant spermatozoidų su nepažeista membrana kiekį [30,46]. Spermos gyvybingumas ir akrosomos vientisumas yra pagrindiniai faktoriai vertinant spermos kokybę, norint nustatyti spermatozoidų apvaisinimo galimybes [42,47,48]. Spermos gyvybingumas gali būti nustatomas vertinant spermatozoidų plazminių membranų vientisumą, kuris yra būtinas normaliam spermatozoidų metabolizmui ir
15 kitoms funkcijoms [42,49]. Jeigu nustatoma, kad spermatozoido plazminė membrana yra pažeista spermatozoidas yra vadinamas negyvu ir nesugebančiu apvaisinti kiaušialąstės [27].
Dauguma būdų naudojamų įvertinti plazminės membranos būseną yra pagrįsti pažeistos spermatozoido plazminės membranos pralaidumu įvarioms medžiagoms. Šie plačiai naudojami metodai įvertina membranos pralaidumą vandeniui osmotinio rezistentiškumo metodu (HOT), vitaliniams dažams (eozino – nigrozino metodas) ar fluorescenciniams dažams [50].
Fluorescenciniai dažai naudojami dažyti įvairių gyvūnų rūšių spermatozoidams ir įvertinti plazminių membranų vientisumą. Kadangi yra trys skirtingos spermatozoido membranos dalys (dengianti išorinę akrosomos membraną, poakrosominę spermatozoido galvutės dalį bei kaklelį ir uodegėlę), tai skirtingos plazminės membranos dalys tiriamos skirtingais dažais [30,46].
Plazminės membranos vientisumas dažniausiai įvertinamas nudažius ląsteles membranai nepralaidžiais dažais. Ląstelės kurios nenusidažo vadinamos gyvomis.
Alternatyvus būdas membranos vientisumui tirti yra acilintų membranų dažų naudojimas. Šie membranų dažai dėka savo sudėtyje turimos acetilo grupės yra amfipatiniai, galintys praeiti per sveiką membraną ir patekti į sveiką (su nepažeista membrana) spermatozoidą. Tuomet, kai ląstelėje intraląstelinių esterazių dėka dažų acetilo grupė pašalinama šie dažai jau negali per membraną grįžti atgal ir todėl lieka ląstelėje, o spermatozoidai su sveikomis membranomis nusidažo. Jei ląstelės membrana yra pažeista, tuomet dažai ląstelėje nelieka.
Šios rūšies dažai naudojami spermatozoidų gyvybingumui nustatyti buvo floresceino diacetatas ir karboksi(metil) derivatai [27,51,52] Pastaruoju metu spermatologijoje naudojamas dažas - SYBR-14, kuris patekęs į gyvą ląstelę yra deacilinamas ir prisijungia prie DNR bei įgyja fluorescencinių savybių. Todėl kartu naudojant šiuos dažus su etidžio homodimeru ar propidžio jodidu (PI) galima tuo pačiu metu nudažyti gyvas ląsteles (su SYBR-14 (fluorescuojančiai žaliai)), o pažeistas ląsteles su etidžio homodimeru ar propidžio jodidu (fluorescuojančiai raudonai) [27,53,54].
Garner and Johnson [54] teigė, kad dviejų dažų, kurie reaguoja su gyvais ir negyvais spermatozodais, naudojimas gali būti pranašesnis būdas nustatant spermatozoidų gyvybingumą negu naudojant vieną fluorescencinį dažą. Manoma, kad būdas, kai plazminės membranos vientisumui įvertinti naudojami dažai besijungiantys su nukleino rūgštimis, yra mažiau nepastovesnis nei enzimais pagrįstas dažymas. Spermatozoido DNR yra geresnis taikinys ląstelėje dėl savo savybių nusidažyti ir nusidažyti tolygiai [47].
Viename tyrime atvėsinta skirtingais skiedikliais atskiesta šunų sperma buvo saugota ir tirta 23 dienas. Spermatozoidų membranų vientisumas nustatytas dažant 6-karboksifloresceino diacetatu (C-FDA) ir PI. Pirmasias 14 dienų spermatozoidų membranos vientisumo mažėjimas pastebėti su
16 visais skiedikliais, bet nenustatytas joks reikšmingas skirtumas tarp skiediklių. Bet vėliau spermos mėginiuose skiestuose tris-kiaušinio trynio-gliukozės skiedikliu su aktyvatoriumi ar be nustatytas patikimai didesnis procentas spermatozoidų su nepažeista membrana, nei mėginiuose skiestuose su CLONE+ACL skiedikliu [8].
Du Bois et al. [55] naudodami SYBR-14 ir PI dažus ir tirdami užšaldytos šunų spermatozoidų membranų vientisumą nustatė, kad trumpesnis užšaldymo laikas - 30 min., lyginant su 60 min. bei naudojant užšaldytai vyrų spermai skirtą skiediklį turi neigiamą įtaką membranų vientisumui (p=0,02). Spermą užšaldžius per 60 min. nustatytas ir didesnis judrumas lyginant su 30 min. šaldymo laiku, tai galėjo būti dėl to, kad pirmuoju atveju nustatyta didesnis procentas spermatozoidų su nepažeista membrana.
Dažant SYBR-14/PI dažais, kai kurie spermatozoidai, stiprėjant jų membranos pažeidimo laipsniui, nusidažo dviem spalvomis (pereinamieji spermatozoidai) jų membranoms palaipsniui tampant vis labiau pažeistoms ir pralaidžioms PI dažams [46,56]. Garner and Johnson [54] pastebėjo, kad dviem spalvomis nusidažę (pereinamieji) spermatozoidai būdingi visoms jų tirtoms gyvūnų rūšims ir apibūdino šiuos spermatozoidus kaip mirštančius, kurie prarado sugebėjimą pašalinti propidžio jodidą.
Brito et al. [57] pastebėjo, kad dažant su SYBR/PI spermatozoidai su pažeista membrana kartais nusidažo neryškiai dvigubomis spalvomis dėl laipsniško SYBR-14 dažų pakeitimo PI. Taip pat dviem spalvomis nusidažiusiems spermatozoidams būdinga, kad PI nusidažo spermatozoido dalis nuo kaklelio link uodegėlės. Tai gali reikšti, kad kaklelio plazminė membrana yra pažeidžiamaa lengviau nei kitos membranos dalys, nors tai gali būti ir dėl mažesnio kaklelyje esančios DNR kondensacijos laipsnio už esančios branduolyje. Dėl ko palengvėja SYBR dažų pakeitimas PI dažais. Retais atvejais esant dvigubam spermatozoido nusidažymui matoma homologinė fluorescuojanti oranžinė spalva [57].
Spermatozoido plazminė membrana gali būti pažeidžiama hipoosmotinio streso ar lipidų peroksidacijos. Plazminę membraną gali pažeisti osmotinio streso sukeltas fizinis spaudimas, bet jeigu osmoso pokyčių laipsnis neviršijamas, plazminė membrana išlieka funkciškai aktyvi ir tiriant duoda matomą morfologinį atsaką [58].
Jeyendran et al. [59] norėdami įvertinti vyrų spermatozoidų plazminės membranos funkcinį aktyvumą pasiūlė naudoti metodą, kurio metu spermatozoidai buvo tirti nepalankiomis osmotinėmis sąlygomis - tai yra juos patalpinant į mažo osmosinio slėgio tirpalą. Spermatozoidai buvo vertinti pagal jų atsaką (spermatozoido uodegėlės susisukimą ar susiraitymą) į hipoosmosinį tirpalą. Mokslininkai nustatė keletą skirtingų spermatozoidų uodegėlių pokyčių po 30 min. inkubavimo hipoosmosiniame tirpale: uodegėlės galo išsiplėtimas, uodegėlės susisukimas, sutrumpėjusi ir
17 sustorėjusi uodegėlė arba išbrinkusi zona, kuri dalinai arba visiškai aptraukia spermatozoido uodegėlę. Ryškiausi spermatozoidų uodegėlės pokyčiai nustatyti, kai hipoosmotinis tirpalas buvo sudarytas iš natrio citrato ir fruktozės, o jo osmoliališkumas buvo 150 mOsm/L.
Šis metodas buvo pavadintas osmotinio rezistentiškumo metodu, o spermatozoidai su susisukusiomis uodegėlėmis – gyvais spermatozoidais, turinčiais funkcionuojančias plazmines membranas [60].
Metodas pagrįstas principu, kad hipoosmotinėmis sąlygomis biochemiškai aktyvūs spermatozoidai su nepažeista membrana absorbuoja vandenį ir išsipučia, padidėdami tūriu kol pasiekiama pusiausvyra tarp skysčių spermatozoide ir ekstraląstelinėje terpėje. To pasėkoje uodegėlę dengianti membrana išsiplečia sferiškai, todėl uodegėlė yra priversta susisukti membranos viduje. Mažėjant osmosiniam slėgiui supančioje terpėje, uodegėlės susisukimas prasideda jos distalinėje dalyje ir tęsiasi link vidurinės dalies ir galvutės. Spermatozoidai gali turėti skirtingą uodegėlių susisukimo laipsnį priklausomai nuo hioosmosinio tirpalo slėgio (kiekvienai gyvūno rūšiai skirtingas slėgis). Kaip teigė Jeyendran et al. [59] optimalus hipoosmotinis tirpalas turėtų sukelti pakankamai didelį osmosinį stresą, kad sukeltų matomą spermatozoido tūrio padidėjimą, bet pakankamai mažas, kad išvengti spermatozoido membranos lizės [61]. Osmosinio rezistentiškumo metodas atliktas su įvairių žinduolių sperma, naudojant skirtingus tirpalus su angliavandeniais, kurių osmotiškumas buvo nuo 0 iki 150 mOsm/L [31,62,63]. Šunų spermai tirti naudoti 60 – 150 mOsm/l hipoosmotiniai tirpalai [40,64].
Viename tyrime lyginti dviem būdais atlikti osmosinio rezistentiškumo testai: naudojant 60 mOsm/L hipoosmotinį tirpalą ir 0 mOms/L distiliuotą vandenį. Tirta šviežia, atvėsinta ir atšaldyta-atšildyta šunų sperma. Patikimas skirtumas tarp tyrimo būdų nustatytas tik tiriant šviežią spermą. Taip pat nustatytas spermatozoidų membranos vientisumo sumažėjimas po spermos atšildymo [60]. Goericke-Pesch and Failing [45] tyrė šunų spermą naudodami 150 mOms/L hipoosmotinį tirpalą ir osmosinio rezistentiškumo metodu nustatė, kad spermatozoidai su susisukusiomis uodegėlėmis teigiamiai koreliuoja su progresyviai judančiais spermatozoidais, spermatozoidais su vientisomis membranomis (dažyta eozinu) (p<0,0001). Taip pat nustatė, kad spermatozoidai su susisukusiomis uodegėlėmis neigiamai koreliuoja su spermatozoidais turinčiais akrosomų pokyčių (dažyta – Spermac®).
1.4. Spermatozoidų judrumą įtakojantys veiksniai
Spermatozoidų gyvybingumo nustatymo būdų yra daug ir įvairaus sudėtingumo, brangumo bei atlikimo greičio. Vienas paprasčiausių ir greičiausiai atliekamų gyvybingumo nustatymo būdų
18 yra spermatozoidų judrumo įvertinimas. Tradiciškai spermatozoidų judrumas nustatomas naudojant fazių kontrastinį mikroskopą ir laborantui akimi įvertinant judančių spermatozoidų kiekį. Tačiau šis būdas yra subjektyvus ir nestandartizuotas, nes priklauso nuo stebėtojo įgūdžių ir patirties [65]. Nėra galimybės įrašyti mėginių vizualaus įvertinimo rezultatų ir vėliau iš naujo juos peržvelgti [66]. Taip pat šis būdas užima daug laiko ir juo įvertinamas mažas spermatozoidų kiekis. Dėl šių trūkumų sukurta keletas kompiuterizuotų spermos įvertinimo būdų [67]. Kompiuterinę spermatozoidų analizės sistemą (CASA) pirmieji aprašė Dott and Foster [68] pritaikydami ją įvairioms gyvūnų rūšims: galvijams, arkliams, kiaulėms, triušiams, žiurkėms ir avims. Paskutiniais dešimtmečiais vis dažniau šis būdas naudojamas veterinarinėje medicinoje [67].
Daugelyje tyrimų CASA buvo naudinga norint objektyviai palyginti skirtingus skiediklius ar kitus veiksnius darančius įtaką spermatozoidų judrumui. Spermatozoidų judrumą gali paveikti daugelis aplinkos veiksnių: šuns amžius, veislė, naudojamas spermos skiediklis, spermos atvėsinimas ir užšaldymas bei kt. Normalus šuns spermatozoidų progresyvus judrumas turėtų būti ≥ 70 proc. [69].
Goericke-Pesch and Failing [45] ištyrę 256 sveikų šunų spermą nustatė, kad šunų amžius neigiamiai koreliuoja su bendru ir progresyviu judrumu (p<0,001, r= –0,16). Taip pat šie mokslininkai nustatė, kad Vakarų Škotijos baltųjų terjerų spermos mėginiuose buvo mažesnis progresyviai judančių spermatozoidų procentas lyginant su kitomis veislėmis.
Nustatyta, kad atvėsintos šunų spermos progresyviam judrumui įtakos turi ir transportavimo talpykla. Atvėsinta šunų sperma buvo laikoma 72 val. skirtingose talpyklose: poliesterio putų dėžėje su ledo paketais, termose su grūstu ledu ir specialiai arklių spermai pritaikytoje transportavimo talpykloje Equitainer®. Po 24 val. nebuvo jokio progresyvaus judrumo skirtumo tarp skirtingose talpyklose laikytų mėginių, bet po 48 val. mėginiai laikyti termose pasižymėjo mažesniu progresyviu judrumu (p<0,001) negu laikyti Equitainer® talpykloje. Po 72 val. mėginiai laikyti Equitainer® talpykloje pasižymėjo didesniu progresyviu judrumu (p<0,001) negu kitose dviejuose talpyklose [70].
Spermatozoidų judrumą mažina ir spermos atšaldymas, nes susidaro reaktyvieji deguonies radikalai, todėl į skiediklį pridėjus katalazės progresyvus šunų spermatozoidų judrumas buvo didesnis (p<0,001) lyginant su kontroline grupe [71].
Taip pat judrumui turi įtakos spermos ėmimo būdas. Viename tyrime palygintas šunų spermatozoidų judrumas po spermos ėmimo elektroejekuliacijos ir manualiniu būdais. Nepastebėti jokie neatskiestos bendro judrumo skirtumai nuo 0 iki 2 val. po ėmimo, o atskiestos nuo 0 iki 8 val. po ėmimo, bet vėliau abiem atvejais nustatytas patikimai mažesnis bendras judrumas elektroejekuliacijos būdu paimtų spermos mėginių [72].
19 Judrumui įtakos turi ir spermos saugojimo laikas bei naudotas skiediklis. Skirtingais skiedikliais atskiesta ir atvėsinta šunų sperma buvo saugota ir tirta 10 dienų. Po 24 val. CaniPro Chill 10, tris-kiaušinio trynio ir Upssalos A, į kurio sudėtį įeina kiaušinio trynys ir 3 proc. glicerolio, skiedikliais atskiestuose mėginiuose nustatytas didesnis judrių spermatozoidų procentas. Šis pokytis galimas dėl sudedamųjų medžiagų esančių skiediklyje, kurios sukelia spermatozoidų aktyvumo padidėjimą [5,7,73,74].
Judrumo pagerėjimo nebuvo nustatyta mėginiuose skiestuose Upssala A+B skiedikliu, į kurio sudėtį įeina 7 proc. glicerolio ir Equex-STM pasta. Tai galėjo būti dėl didesnio glicerolio kieko ir Equex-STM pastos, nes šios medžiagos sumažina spermatozoidų judrumą [5,75,76]. Visą spermos saugojimo laiką judrumas mažėjo (p<0,0001). Mokslinikai mano, kad šis judrumo sumažėjimas galimas dėl suaktyvėjusio spermatozoidų metabolizmo, padidėjusio deguonies, skiediklio substratų ir energijos sunaudojimo, ko pasėkoje padidėja laktato koncentracija ir sumažėja pH [5,74].
CaniPro Chill 10 skiedikliu skiestų mėginių spermatozoidų bendras judrumas 10 tyrimo dieną buvo 59,1±21,7, o tris-gliukozės-kiaušinio trynio skiestu skiedikliu – 54,5±22,1 (p<0,05). Šis skirtumas, manoma, pasireiškė dėl dviejų priežasčių. Pirmoji priežastis – CaniPro Chill 10 skiediklyje kaip energijos substratai yra pridėta gliukozės ir fruktozės, o tris-kiaušinio trynio skiediklyje yra tik fruktozės. Iguer-Ouada and Verstegen [77] nustatė, kad šunų sperma atskiesta tris-kiaušinio trynio skiedikliu su gliukoze, o ne fruktoze pasižymėjo reikšmingai didesniu judrių spermatozoidų procentu. Priešingai kitame tyrime nustatytas geresnis šunų spermatozoidų bendras judrumas naudojant tris-kiaušinio skiediklį su fruktoze negu su gliukoze ar fruktozės ir gliukozės mišiniu [7]. Antroji priežastis – CaniPro Chill 10 skiediklyje yra nežinomas antibiotiko gentamicino kiekis. Antibiotikų pridėjimas gali paveikti spermatozoidų gyvybingumą ir judrumą, nes yra žinoma, kad kai kurios bakterijos reikšmingai paveikia spermatozoidų judrumą, greitį ir membranų vientisumą [5,78].
Kitame tyrime atvėsinta šunų sperma taip pat buvo saugota 10 dienų ir atskiesta skirtingais skiedikliais. Nuo 2 dienos progresyvus spermatozoidų judrumas buvo prastesnis mėginiuose skiestuose skiedikliu su kiaušinio tryniu nei su 0,4 proc. sojos lecitinu, o nuo 4 dienos prastesnis ir už mėginius skiestus su skiedikliu, kurio sudėtyje yra 0,04 proc. sojos lecitino [79].
Viename tyrime atvėsinta ir tris-gliukozės-kiaušinio trynio skiedikliu atskiesta šunų sperma saugota 27 dienas. Pirmas 10 dienų judrumas reikšmingai nesiskyrė lyginant su 0 diena, o nuo 11 dienos judrumas pradėjo reikšmingai mažėti (p=0,002) ir sumažėjo iki nulio 16–17 dieną. Kai kurie mėginiai 11 dieną buvo paruošti iš naujo ir vėl atskiesti tuo pačiu skiedikliu ir judrių spermatozoidų procentas pakilo iki beveik 0 dienos ribų ir buvo statisiškai patikimai didesnis nei prieš papildomą atskiedimą. Po to vėl buvo stebimas progresyvus judrumo mažėjimas, kuris nuo 13 dienos tapo
20 reikšmingas. 21 dieną pridėjus skiediklio judrumas vėl reikšmingai padidėjo lyginant su 20 dieną, bet 27 dieną vėl spermą atskiedus nebebuvo pastebimas joks judrumo pasikeitimas. Tai parodo, kad papildomai atskiedus spermą galima prailginti jos saugojimo laiką ir reaktyvuojant nebejudrius spermatozoidus padidinti judrumą [74].
1.5. Spermos skiedikliai ir jų komponentų įtaka spermatozoidų gyvybingumui
Kalių sėklinimas atvėsinta sperma dažnai naudojamas veisiant šunis. Tai ypač reikšminga žvelgiant iš genetinės pusės, nes padeda išvengti inbrydingo, kai nėra pakankamo kiekio kergimui tinkamų patinų [80]. Tuo tikslu sperma gali būti skiedžiama ir užšaldoma arba skiedžiama ir atvėsinama iki 4–5 o C temperatūros.
Atvėsintos spermos paruošimas, persiuntimas į reikiamą vietą yra paprastesnis ir pigesnis negu užšaldytos [8]. Taip pat nustatyta jog po 1 ar 2 dienų atvėsintos šunų spermos laikymo, ją dar galima užšaldyti jei ji nebuvo panaudota sėklinimui. Tokios spermos judrumas, akrosomų ir spermatozoidų plazminių membranų vientisumo pokyčiai po atšildymo būna nereikšmingi [81]. Tad atvėsinimas tinka naudoti kai atvėsinta sperma siunčiama į spermos banką šaldymui [8].
Atvėsintos šunų spermos vaisingumas gali būti išlaikytas bent jau 4 dienas, o judrumas netgi ilgiau, bet logistinės problemos dažnai paailgina spermos transportavimo laiką dėl ko spermos kokybė pablogėja [74,77,80,82]. Todėl norint kales sėklinti atvėsinta sperma turi būti ieškoma priemonių paailginti spermos išgyvenamumą [80].
Užtikrinti ir paailginti spermatozoidų išgyvenamumo laiką gali tinkamai paruošti ir panaudoti šunų spermos skiedikliai. Skiediklis tai toks tirpalas, kuris užtikrinta reikiamą energijos kiekį spermatozoidams, palaiko pH ir osmolingumą ir apsaugo spermatozoidų membranas nuo pažeidimų susijusių su spermos atvėsinimu ir laikymu [8,80].
Prekyboje yra daug šunų spermai skiesti skirtų skiediklių: CaniPlus Chill, CaniPlus Freeze, CaniPlus Enchance (Minitüb, Vokietija), Fresh Express® Extender (Synbiotics Corporation, JAV), Kenney Extender for Canine Semen (Hamilton Research, JAV) ir kt.
Naudojant komercinius skiediklius, kurių sudėtis yra patentuota, ištirtus spermos kokybinius rodiklius galima efektyviau palyginti tarpusavyje. Sėklinant kales su komerciniu skiedikliu skiesta sperma lengviau įvertinti ir interpretuoti sėklinimų efektyvumo rezultatus gautus skirtingose laboratorijose. Daugelio komercinių skiediklių, norint išlaikyti komercinę paslaptį, sudėtis nėra skelbiama [5,83].
21 Literatūroje yra aprašyta ir laboratorijose sukurtų bei spermos skiedimui naudojamų skiediklių, kurie nėra platinami. Todėl jų protokolai, priešingai nei komercinių skiediklių, yra aprašyti moksliniuose straipsniuose [5].
Tokie skiedikliai pasižymi keletu privalumų - žinomi visi skiediklio komponentai bei jų kiekiai, bet turi ir trūkumų: skiediklio gamyba užima nemažai laiko, o gamybos procese galimos klaidos. Prieš pradedant juos naudoti spermai skiesti reikia atlikti brangiai kainuojančius tyrimus, kad įvertinti skiediklio įtaką spermatozoidų kokybiniams rodikliams ir išgyvenimui [5,11,84,85].
Žinoma, kad į šunų spermos skiediklių (tiek komercinių, tiek laboratorijose pagamintų) sudėtį įeina keletas komponentų, iš kurių pagrindiniai yra: buferinės druskos, angliavandeniai, aminorūgštys, antibiotikai, krioprotektoriai, antioksidantai, distiliuotas vanduo [86].
Antibiotikai į skiediklius pridedami norint išvengti patogeninių bakterijų perdavimo ir sumažinti nepatogeninių bakterijų kiekį spermoje [86]. Bakterinis užterštumas gali paveikti spermos kokybę ir spermatozoidų išgyvenamumą bei gali sukelti tokia sperma apsėklintų patelių lytinių takų infekcines ligas [42].
Į spermos skiediklius dedami įvairūs antibiotikai, bet dažniausiai streptomicinas ir penicilinas [42,87]. Į spermos skiediklius pridėjus įvairių antibiotikų nustatyta statistiškai patikimai didesnis spermatozoidų su nepažeista plazmine membrana kiekis nei spermos mėginiuose atskiestuose skiedikliu be antibiotikų [41].
Angliavandeniai ir aminorūgštys yra pridedami kaip maitinamoji terpė spermatozoidams, bei norint palaikyti osmosinį slėgį. Paprastieji cukrūs (gliukozė, fruktozė, manozė ir arabinozė) naudojami kaip energijos spermatozoidams suteikiantys komponentai.
Buferinės druskos naudojamos norint apsaugoti spermatozoidus nuo terpės rūgštingumo padidėjimo, nes spermatozoidai toleruoja tik mažus pH pokyčius. Dažniausiai yra naudojami organiniai buferiai. Vienas seniausiai ir dažniausiai spermos skiedikliuose naudojamų organinių buferių yra tris(hidroksimetil)aminometanas (TRIS) [86].
Mokslininkai geriausius rezultatus, palaikant atvėsintos spermos kokybę, gavo spermą skiesdami su citrato - ar tris-kiaušinio trynio skiedikliais su gliukoze [5].
Kiaušinio trynys jau 60 metų yra įprastinis atvėsintos ir užšaldytos skirtingų gyvūnų rūšių spermos skiediklių komponentas. Kiaušinio trynys apsaugo spermatozoidą nuo pažeidimų atvėsinimo ir užšaldymo metu, taip pat apsaugo nuo tokių žalojančių aplinkos veiksnių kaip pH ir osmosinio slėgio pokyčiai ar pavojingų medžiagių, kaip reaktyvųjų deguonies radikalų, susikaupimo. Tačiau iki šiol dar nėra žinoma kokiu būdu kiaušinio trynio komponentai apsaugo spermatozoido membraną. Gali būti, kad šios apsauginės savybės atsiranda dėl specifinės mažo tankio lipoproteinių frakcijos ir kai kurių spermos plazmos baltymų sąveikos. Ši sąveika sumažina
22 cholesterolio ir fosfolipidų kiekio sumažėjimą spermatozoido membranoje [88]. Palaikydamas koloidinį slėgį, trynys apsaugo spermatozoidą nuo perteklinio katijonų praradimo, reguliuoja transmembraninį Ca2+
judėjimą ir ROS susikaupimą. Kiaušinio trynys apsaugo nuo šalčio šoko sukeltos išankstinės kapacitacijos [80]. Kiaušinio trynyje yra šiek tiek gliukozės, o 20 proc. kiaušinio trynio tirpale distiliuotame vandenyje nustatyta 3 – 4 mM gliukozės koncentracija [7].
Ponglowhapan et al. [7] nustatė, kad skiedikliu, kuriame yra kiaušinio trynio, atskiesta ir atvėsinta šunų sperma pirmas 4 dienas pasižymėjo didesniu nei 70 proc. judrumu ir išgyveno ilgiau nei 21 d., kas parodė, jog kiaušinio trynyje esantis mažas gliukozės kiekis yra pakankamas atvėsintos šunų spermos saugojimui. Tačiau gliukozės ar fruktozės pridėjimas į skiediklius padeda palaikyti geresnį judrumą ilgesnį laiko tarpą.
Nustatyta, kad į komercinius skiediklius papildomai įdėjus 20 proc. kiaušinio trynio pagerėjo visi šunų spermatozoidų judrumo parametrai, nors reikšmingas judrumo parametrų pasikeitimas buvo pastebėtas tik su Biladyl skiedikliu [77].
Dorado et al. [89] tirdami Andalūzijos asilų spermą ir lygindami skiediklį, kurio pagrindinė sudedamoji dalis buvo kiaušinio trynys (Gent® A) su pieno proteino pagrindo skiedikliu (INRA 96®) nustatė, kad spermatozoidų judrumo parametrai po 72 val. saugojimo 5 oC temperatūroje buvo geresni su Gent® A skiedikliu. Panašūs rezultatai gauti ir tiriant arklių spermą. Tačiau tiriant avinų spermą nepastebėta skirtumų tarp judrumo parametrų lyginant panašios sudėties skiediklius [90].
Šunų spermos skiestos su tris-kiaušinio trynio skiedikliu 5-tą tyrimų dieną bendras spermatozoidų judrumas buvo 67,6±17,6 proc. ir mažai skyrėsi nuo komerciniu CaniPro Chill 10 skiestos spermos bendro judrumo - 68,9±16,0 proc. Lyginant šiuos skiediklius tarpusavyje taip pat nebuvo nustatyta jokio skirtumo tarp spermatozoidų gyvybingumo, tačiau mėginiuose skiestuose skiedikliu, turinčiu kiaušinio trynio ir glicerolio buvo nustatytas daug didesnis sveikų, su nepažeista membrana, spermatozoidų procentas [5].
Nepaisant visų teigiamų kiaušinio trynio savybių, jį naudojant spermos skiediklių gamybai, reikia atsižvelgti į tai, kad kiaušinio trynio sudėtis nėra pastovi. Taip pat platinant skiestą spermą ir pervežant spermą tarptautiniu mastu, susiduriama su sanitarinių normų neatitikimu [80,91]. Norint išvengti daug biologinių skirtumų turinčio ir infekcijos išplatinimo atžvilgiu pavojingo (pvz.: bakterinė kontaminacija, Salmonella spp.) produkto - kiaušinio trynio naudojimo, rekomenduojama jį pakeisti lecitinu [5].
Sojų pupelių lecitinas buvo naudojamas skiedikliuose, kuriais skiesta atvėsinta arklių sperma ir buvo sėkmingai panaudotas bulių, avinų ir šunų spermos šaldymui [80].
Beccaglia et al. [92] pagamino TRIS-pagrindo skiediklį turintį 0,04 proc. lecitino ir antioksidantą katalazę skirtą atvėsintai šunų spermai. Su šiuo, lecitino turinčiu, skiedikliu skiestoje
23 spermoje atšildytos šunų spermos spermatozoidų judrumas buvo geresnis lyginant su sperma, atskiesta skiedikliu, kurio sudėtyje yra kiaušinio trynys. Kitame tyrime naudotas skiediklis turintis 0,8 proc. lecitino ir tirta atvėsinta šunų sperma, kuri buvo saugoma aštuonas dienas. Spermatozoidų judrumas buvo geresnis visomis dienomis, kai buvo tiriamas judrumas (pirmą, antrą, trečią ir aštuntą dienas) lyginant su sperma atskiesta skiedikliu, turinčiu kiaušinio trynio [80].
Kasimanickam et al. [79] nustatė, kad, naudojant skiediklį turintį 0,4 proc. lecitino, po 3 dienų saugojimo išlieka didesnis procentas spermatozoidų su nepažeista membrana, negu naudojant skiediklius su kiaušinio tryniu ar skiedikliu, turinčiu 0,04 proc. lecitino.
Yra nustatyta, kad galima naudoti skiediklį, kurio pagrindą sudaro kokoso pieno miltelių vandeninis tirpalas (ACP-106c). Šiuo skiedikliu skiesta sperma ir su Tris-kiaušinio trynio skiedikliu skiesta sperma pasižymėjo panašiais judrumo ir membranų funkcionalumo parametrais. Šis ACP-106c skiediklis pasižymėjo tuo, jog po sėklinimo šunų sperma skiesta šiuo skiedikliu, kalės atsivedė proporciškai daugiau patelių (65,7 proc.) nei patinėlių (34,3 proc.) [93]. Tai yra aktualu šunų veisėjams, nes kalytės yra labiau pageidaujamos nei patinėliai.
Kaip jau buvo minėta, vienas pagrindinių veiksnių sukeliantis atvėsintos spermos spermatozoidų judrumo ir vaisingumo sumažėjimą yra reaktyviųjų deguonies radikalų (ROS) susidarymas, kurie atsiranda kaip normalaus spermatozoidų metabolizmo rezultatas. Kadangi patys spermatozoidai yra mažai pajėgūs apsisaugoti nuo oksidacinio streso, todėl svarbu, kad žalingą ROS poveikį spermatozoidams sumažintų skiedikliai [94–96]. Šiuo tikslu į skiediklius dedama antioksidantų, tokių kaip: cisteinas vitaminas C, vitaminas E, katalazė, glutationo peroksidazė, superoksido dismutazė [97].
Pridėjimas nefermentinių (cisteinas, vitaminas C, vitaminas E) ir fermentinių antioksidantų (katalazė, glutationo peroksidazė, superoksido dismutazė) į spermos skiediklius turi teigiamą poveikį kai kuriems kačių ir šunų kokybiniams spermos rodikliams: spermatozoidų judrumui, jų plazminės membranos ir DNR membranos vientisumui [71,98]. Vitaminas E (α-tokoferolis) gali apsaugoti nuo lipidų peroksidacijos įsiterpdamas į lastelės membraną [99,100]. Yousefian et al. [100] nustatė, kad eržilų sperma skiesta skiedikliu, kuriame yra 1 µM kofermento Q10 ir 5 mM
α-tokoferolio, laikant ją 48 val. 5 oC temperatūroje, pasižymėjo geresniais kokybiniais rodikliais
(bendras ir progresyvus judrumas, plazminės membranos vientisumas ir funkcionalumas), lyginant su sperma skiesta skiedikliu, kurioje nėra antioksidantų.
Kitas antioksidantas - vitaminas C (askorbo rūgštis) vienas negali panaikinti lipofilinių radikalų spermatozoidų lipidinėje dalyje, bet jis gali veikti sinergistiškai su α-tokoferoliu, kad sumažinti lipidų peroksidacijos radikalus reaguojant su tokoferoksilo radikalais ir regeneruojant aktyvų α-tokoferolį [101,102]. Michael et al. [102] atliko tyrimą su atvėsinta šunų sperma ir nustatė,
24 kad skiediklis su vitaminu C sumažino superoksido ir hidroksilo radikalų kiekius lyginant su kontroline grupe, bet tam, kad reikšmingai sumažėtų šių ekstraląstelinių radikalų, buvo reikalinga didesnė nei 1 mM askorbo rūgšties koncentracija skiediklyje. Tačiau šiame tyrime taip pat nustatyta, kad vitaminas C neturi jokio teigiamo efekto kitiems įvairiems spermos rodikliams, o net atvirkščiai. Didesnės nei 1 mM askorbo rūgšties koncentracijos panaudojimas skiediklyje pablogino kai kuriuos spermatozoidų kokybinius rodiklius. Pavyzdžiui į spermos skiediklį pridėjus 2,5 mM vitamino C, jis turėjo neigiamą poveikį spermatozoidų judrumui ir progresyviniam judrumui.
Wyttayarat et al. [38] kaip antioksidantą atvėsintai šunų spermai naudojo žaliosios arbatos polifenolį ir nustatė, kad po keturių savaičių laikymo spermatozoidų judrumas, nepaisant polifenolio koncentracijos, visada buvo geresnis nei kontrolinėje grupėje. Priešingai polifenolis nedavė teigiamo efekto tiriant spermatozoidų membranų vientisumą.
Sariozkan et al. [103] tyrė fermentinio antioksidanto L-karnitino poveikį triušių
spermatozoidams ir nustatė, kad net tokios mažos dozės kaip 0,5 mM turėjo reikšmingos teigiamos įtakos spermatozoidų judrumui, akrosominės ir plazminės membranų vientisumui spermą laikant 5
oC temperatūroje 12 ir 24 val.
Camara et al. [104] tirdami atvėsintą ir laikomą 24 val. avinų spermą į spermos skiediklį pridėjo kito fermentinio antioksidanto katalazės ir nustatė, kad sperma skiesta šiuo antioksidantu (100 ir 200 U/ml) pasižymėjo geresniu bendru spermatozoidų judrumu lyginant su kontroline grupe, tačiau nenustatė jokio teigiamo poveikio spermatozoidų membranų vientisumui. Michael et al. [102] nustatė, kad katalazė turėjo tik vidutiniškai teigiamą poveikį atvėsintos šunų spermos rodikliams. Tačiau po 72 val. katalazė turėjo gana didelį teigiamą efektą daugumai rodiklių, tad šį antioksidantą galima naudoti kai sperma laikoma ilgesnį laiką.
1.6. Rentgeno spindulių įtaka spermos kokybiniams rodikliams
Eksperimentai norint nustatyti rentgeno spindulių poveikį spermatozoidams pradėti atlikti XX amžiaus viduryje. Pirmieji tyrimai atlikti norint nustatyti neigiamą rentgeninės spinduliuotės poveikį spermatozoidų apvaisinimo galimybėms [105].
Žinoma, kad rentgeninė spinduliuotė sukelia somatinių ir germinatyvinių ląstelių, ejakuliuotų spermatozoidų DNR grandinių trūkimus ir chromosomų aberacijas [106]. Radiacija gali pakenkti spermatozoidų judėjimo ypatumams dėl DNR vientisumo praradimo. Radiacija taip pat gali turėti netiesioginį neigiamą efektą spermatozoidų DNR dėl padidinto ROS susidarymo po apšvitinimo [107].
25 Pastaruoju metu tokių biologinių medžiagų, kaip sperma, kiaušinėliai ir embrionai, gabenimui tapo įprasta naudoti oro transportą. Šios biologinės medžiagos yra apšvitinamos rentgeno spinduliais patekimo į oro uostą ir išvežimo iš jo metu [106].
Atliktas tyrimas, kurio metu atšaldyta bulių sperma buvo peršviečiama 1, 2 ar 3 kartus registruotam arba rankiniam bagažui skirtais introskopais. Tačiau net ir tris kartus apšvitintų mėginių spermatozoidų chromatino vientisumas buvo beveik toks pats kaip ir kontrolinės grupės. Tris kartus registruotam bagažui skirtu introskopu apšvitinus bulių spermą nustatytas neigiamas poveikis oocitų dalijimosi greičiui (p=0,07) ir blastocistų vystymusi (p=0,06). Rankiniam bagažui skirtu introskopu apšvitinus spermos mėginius nenustatytas reiškimingas neigiamas poveikis oocitų dalijimosi greičiui ir blastocistų vystymuisi lyginant su kontroline grupe [106].
Tyrime su atšaldyta naminių katinų sperma, kuri vieną arba tris kartus apšviesta registruotam bagažui tikrinti skirtu introskopu, po atšildymo nustatyta, kad nepaisant gautos dozės sumažėjo spermatozoidų judrumas (p<0,05) lyginant su kontroline grupe. Tačiau apšvita neturėjo įtakos akrosomų vientisumui. Taip pat spermos mėginiuose apšvitintuose tris kartus padaugėjo DNR pažeidimų (p<0,05), lyginant su kontroliniais ar apšvitintais vieną kartą mėginiais. Šie tyrimų rezultatai rodo, kad krovinių patikros oro uostuose metu sukelta radiacija gali turėti negiamą įtaką užšaldytos spermos ir kitų biologiškai svarbių medžiagų kokybiniems rodikliams [108].
Nepavyko rasti mokslinės informacijos apie rentgeno spindulių poveikį atvėsintos šunų spermos kokybiniams rodikliams.
26 2. TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1. Bandymo atlikimo eiga
1 pav. Bandymo schema Šviežia sperma:
1. Subjektyvus spermatozoidų judrumas; 2. Spermatozoidų koncentracija;
3. Spermatozoidų morfologija
Atskiesta laboratorijoje pagamintu skiedikliu (LGS)
Atskiesta CaniPlus Chill 5 (CP) Neapšvitinta rentgeno spinduliais Apšvitinta rentgeno spinduliais 1 tyrimo diena: 1. Spermatozoidų judrumas; 2. Spermatozoidų koncentracija;
3. Spermatozoidų gyvybingumas hipoosmosinio rezistentiškumo metodu (HOT) - (funkciškai nepažeistos membranos)
4. Spermatozoidų gyvybingumas fluorescenciniu metodu (SYBR14/PI) - (struktūriškai nepažeistos membranos)
Likusios 4 tyrimo dienos: 1. Spermatozoidų judrumas;
2. Spermatozoidų gyvybingumas hipoosmosinio rezistentiškumo metodu (HOT) - (funkciškai nepažeistos membranos)
3. Spermatozoidų gyvybingumas fluorescenciniu metodu (SYBR14/PI) - (struktūriškai nepažeistos membranos)
27 Tyrimas atliktas 2013 metais. Tyrimo atlikimo eiga pateikiama bandymo atlikimo schemoje (1 pav.).
Šunų sperma surinkta ir atskiesta klinikos laboratorijoje pagamintu spermos skiedikliu (LGS), kurio sudėties skelbti neleista, X smulkiųjų gyvūnų klinikoje.
Spermos kokybės tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Gyvulių reprodukcijos laboratorijoje.
Spermos mėginių donorais buvo 10 veislinių šunų, kurių sperma yra imama esant poreikiui. Šunų sperma buvo imama manualiniu būdu į plastikinį mėgintuvėlį [109]. Iš karto po paėmimo buvo išmatuojamas spermos tūris ir nustatyta koncentracija. Taip pat, subjektyviu būdu, naudojant šviesinį mikroskopą Olympus BH2 (Olympus Optical Co., Japonija) įvertintas spermatozoidų bendras judrumas.
Mėginiai prieš atskiedimą skiedikliu ir atvėsinimą buvo padalinami į tris lygias dalis ir skiedžiami:
Dvi spermos mėginio dalys buvo atskiestos CaniPlus Chill 5 (Minitüb, Vokietija) skiedikliu (CP).
o Viena šių mėginių dalių neveikta jokių papildomų veiksnių.
o Antra šių mėginių dalių buvo apšvitinama rentgeno spinduliais. Spermos mėginys buvo peršviestas HI-SCAN 100100 T (Heimann Systems GmbH, Vokietija) introskopu. Vieno apšvitinimo metu sukaupiama spinduliuotės dozė mėginiui judant be sustojimo per introskopą buvo 1,4 µSV.
Trečia dalis skiedžiama klinikos užsakymu veislininkystės įmonės laboratorijoje pagamintu šunų spermai skiesti pritaikytu skiedikliu (LGS) (sudėtis ir tiksli gaminimo vieta ir sąlygos neskelbiami dėl komercinių sumetimų).
Sperma abiem skiedikliais buvo skiedžiama taip, kad spermos dozės mililitre vidutiniškai būtų 200 - 400 × 106
spermatozoidų.
Visi - neapšvitinti (N-sperma) ir apšvitinti (R-sperma) spermos mėginiai buvo saugojami 4
0C temperatūroje termospintoje Friocell (Vokietija, 2011) 5 paras ir kas 24 val. atliekami šie
tyrimai:
Pirmają dieną nustatyta:
1. Subjektyvus ir objektyvus spermatozoidų judrumas; 2. Spermatozoidų koncentracija;
3. Spermatozoidų uodegėlių morfologija; 4. Spermatozoidų galvučių morfologija;
28 6. Spermatozoidų gyvybingumas fluorescenciniu metodu (SYBR14/PI).
Likusias 4 dienas nustatyta: 1. Spermatozoidų judrumas;
2. Spermatozoidų gyvybingumas hipoosmosinio rezistentiškumo metodu (HOT); 3. Spermatozoidų gyvybingumas fluorescenciniu metodu (SYBR14/PI).
2.2. Subjektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas
Šunų spermatozoidų judrumas buvo vertinimas 37oC temperatūroje. Esant labai koncentruotai
spermai ją galima praskiesti 37o
C 2.9% natrio citrato tirpalu Eppendorf (Vokietija) tipo mėgintuvėlyje. 5 µl 37 oC spermos užlašinama ant tokios pačios temperatūros objektinio stiklelio ir
uždengus šiltu dengiamuoju stikleliu analizuojami 3 matymo laukai fazių kontrastiniu mikroskopu Nikon (Japonija) 100 kartų padidinimu. Kiekviename matymo lauke nustatomas tiesiai judančių spermatozoidų procentas ir išvedamas vidurkis [110].
2.3. Objektyvus spermatozoidų judrumo nustatymas ant objektinio stiklelio kompiuterinės spermatozoidų analizės metodu (CASA)
Objektyvus spermatozoidų judrumo vertinimas atliekamas naudojant kompiuterinės spermatozoidų analizės metodus (CASA). CASA sistema yra automatiška, objektyvi ir standartizuota įranga, kuri leidžia tirti spermos koncentraciją, judrumą ir morfologiją.
Ši analizė buvo atliekama įranga, kurią sudaro šviesinis mikroskopas, vaizdo kamera ir kompiuteris su Sperm Class Analyzer® (SCA)® programa (Ispanija, 2011). Naudojantis SCA® programa buvo gauti objektyvūs kiekybiniai spermos kokybės rodikliai: bendras ir progresyvus judrumas. Ši programa automatiškai identifikuoja ir pamatuoja spermatozoidų judėjimo parametrus mikroskopo regėjimo lauke naudojant 10x padidinimo objektyvą, ir pateikia spermos judrumo rezultatus procentais, suskirstydama spermatozoidus į progresyviai judančius, neprogresyviai judančius ir nejudrius.
Kaip ir subjektyvaus spermatozoidų judrumo vertinimo metu tyrimas buvo atliekamas 37o
C temperatūroje. Spermos lašas buvo dedamas ant šilto objektinio stiklelio ir uždengiamas šiltu dengiamuoju stikleliu. Mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu 100 kartų padidinimu ir naudojant žalią filtrą. Analizavome apie 500 spermatozoidų, tam reikėjo užfiksuoti 2 – 3 regėjimo laukus.
29 2.4. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas
Spermatozoidų koncentracija buvo apskaičiuota Biurker kamera. Prie skaičiavimo kameros buvo pritvirtinamas dengiamasis stiklelis, po kuriuo tiksliai įlašinama kruopščiai išmaišytos praskiestos su distiliuotu vandeniu spermos. Mikroskopavome padidinę 200 kartų. Naudojant Biurker skaičiavimo kamerą, spermatozoidai buvo skaičiuojami 5 dideliuose laukuose (80 mažų kvadratėlių) įstrižai. Iš viso spermatozoidai skaičiuojami 15 dideliuose laukuose ir išvedamas vidurkis. Skaičiuojamos visos spermatozoidų galvutės esančios kvadrato viduje ir ant kairės bei viršutinės didelio kvadrato linijų. Tada koncentraciją nustatėme pagal formulę:
K = S × P × 5 × 10
K – koncentracija; S – spermatozoidų skaičius 80 mažų kvadratėlių; P – praskiedimo laipsnis; 5 – koeficientas, kadangi spermatozoidai skaičiuoti 0.2 mm2 kameros ploto; 10 – daugiklis, nes kameros gylis 0.1 mm. Norint apskaičiuoti spermatozoidus 1 ml tūrio naudojamas daugiklis 1000 [110].
Mėginio koncentracija buvo skaičiuojama du kartus ir išvedamas dviejų skaičiavimų vidurkis.
2.5. Spermatozoidų galvučių patologijų įvertinimas
Ant objektinio stiklelio buvo uždedamas spermos lašas ir anilino mėlynojo dažų lašas bei sumaišoma. Tepinėlis ruošiamas stikleliu su nugludinta briauna. Paruoštas tepinėlis išdžiovinamas ir tiriamas šviesiniu mikroskopu Olympus BH2 (Olympus Optical Co., Japonija) su aliejine imersija 1000 kartų padidinimu. Skaičiuojami 200 spermatozoidų ir užpildoma spermiograma. Šiems spermatozoidų morfologiniams pažeidimams priskiriamos: kriaušinės formos, siauru pagrindu, pakitusios formos, neišsivysčiusios, siauros, didelės, mažos normalios, trumpos plačios, laisvos patologinės galvutės ir spermatozoidų uodegėlių paracentrinė implantacija [111].
2.6. Spermatozoidų uodegėlių ir kitų patologijų įvertinimas
Šiam tyrimui šunų sperma buvo skiedžiama buferiniu formalino tirpalu santykiu 1:1 – 1:2. Jeigu tyrimas neatliekamas iškart buferiniu formalinu atskiestą spermą galima laikyti šaldytuve be morfologinių pakitimų [111].
Spermos atskiestos buferiniu formalino tirpalu lašas buvo uždedamas ant objektinio stiklelio ir uždengiamas dengiamuoju stikleliu, paliekamas kelioms minutėms, kad spermatozoidai nusėstų ant dugno. Mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu 400 kartų padidinumu ir
