FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
MATAS VITKAUSKAS
LIETUVIŠKO BIČIŲ PIENELIO KOKYBĖS IR BIOLOGINIO
AKTYVUMO VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Prof. Dr. Kristina Ramanauskienė
Konsultantas Prof. Daiva Majienė
FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
LIETUVIŠKO BIČIŲ PIENELIO KOKYBĖS IR BIOLOGINIO
AKTYVUMO VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas Darbo vadovas
Prof. Daiva Majienė Prof. Dr. Kristina Ramanauskienė
Recenzentas Darbą atliko
Matas Vitkauskas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Bičių pienelio apibūdinimas ... 10
1.2. Bičių pienelio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas ... 10
1.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos apibūdinimas ... 13
1.4. Antioksidacinis aktyvumas ... 14
1.5. Antimikrobinis aktyvumas ... 16
1.6. Glioblastoma ... 18
2. METODIKA ... 20
2.1. Naudotos medžiagos ir aparatūra ... 20
2.1.1. Naudotos medžiagos ... 20
2.1.2. Naudota aparatūra ... 20
2.2. Bičių pienelio kokybės nustatymo metodai ... 21
2.2.1. Bičių pienelio pH reikšmės nustatymas ... 21
2.2.2. Bičių pienelio reologinių savybių tyrimas ... 21
2.2.3. Bičių pienelio drėgmės kiekio nustatymas ... 21
2.2.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos pritaikymas ir validacija 10-HDA juginio analizei ... 21
2.3. Bičių pienelio biologinio aktyvumo nustatymo metodai ... 22
2.3.1. Bičių pienelio antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 22
2.3.2. Bičių pienelio antimikrobinis tyrimas ... 23
2.3.3. Ląstelių sėjimo metodika ... 23
2.3.4. Ląstelių tankio nustatymas ... 24
2.3.5. Ląstelių gyvybingumo nustatytas MTT testu ... 25
2.4. Statistinė analizė ... 26
3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. Bičių pienelio kokybės vertinimas ... 27
3.2. 10-HDA nustatymas taikant efektyviąja skysčių chromatografija ... 29
3.4. Bičių pienelio antimikrobinio tyrimo rezultatai ... 33
3.5. 10-HDA ir bičių pienelio poveikis ląstelių gyvybingumui nustatant MTT metodu ... 36
4. IŠVADOS ... 39
5. REKOMENDACIJOS ... 40
6. PUBLIKACIJOS DARBO TEMA ... 41
SANTRAUKA
Mato Vitkausko magistro baigiamasis darbas „Lietuviško bičių pienelio kokybės ir biologinio aktyvumo vertinimas“ mokslinė vadovė Prof. Dr. Kristina Ramanauskienė, konsultantė Prof. Daiva Majienė.
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra, Kaunas. Darbo tikslas: įštirti lietuviško bičių pienelio kokybę ir biologinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti skirtingais metais gauto lietuviško bičių pienelio fizikines savybes (išvaizdą, drėgmę, pH reikšmę, klampą).
2. Parinkti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką veikliosios lietuviško bičių pienelio medžiagos 10-HDA (10-hidroksi-2-deceno rūgštis) nustatymui.
3. Ištirti lietuviško bičių pienelio antimikrobinį aktyvumą in vitro.
4. Ištirti antioksidacinį skirtingais metais gauto lietuviško bičių pienelio aktyvumą.
5. Ištirti C6 ląstelių kultūros gyvybingumą išgautą iš žiurkės smegenų auglio paveikiant jas skirtingomis 10-HDA bei lietuviško bičių pienelio koncentracijomis.
Tyrimo metodai:
Naudojant atitinkamą įrangą buvo tiriama lietuviško bičių pienelio drėgmė, ph, klampa bei spalva. 10-HDA nustatyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika. Bičių pienelio antibakterinės savybės vertintos in vitro, taikant difuzijos į agarą metodą. Naudotas Miulerio–Hintono agaras. Tyrimai in vitro vykdyti su gram teigiamomis ir gram neigiamomis referentinėmis bei klinikinėmis bakterijų padermėmis. Naudotos bakterijos: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Antioksidacinis nustatymas bičių pieneliui buvo atliekamas panaudojant laisvojo radiklo surišimo metodą su DPPH tirpalu. Ląstelių gyvybingumui įvertinti naudotas MTT metodas t. y. geba metabolizuoti MTT dažą.
Rezultatai ir išvados:
Lietuviškam bičių pieneliui (BP) yra būdinga gelsva spalva, klampi konsistencija, pasižymi rūgštinėmis savybėmis. Didinant temperatūrą BP struktūra silpnėja, nes mažėja klampa. ESC (efektyvioji skysčių chromatografija) nustatyta, kad 1-ame mg bičių pienelio yra ~22 µg 10-HDA. BP yra efektyvus prieš gram neigiamas Eschericia coli, Pseudomona aeruginosa ir gram teigiamas Staphylococcus aureus, Enterococcucs faecalis bakterijas. Šviežesnis, gautas 2017 metais, lietuviškas bičių pienelis pasižymi didesniu antioksidaciniu poveikiu. Bičių pienelis ir 10-HDA turi įtakos vėžinių ląstelių gyvybingumo sumažėjimui.
SUMMARY
The master thesis „Quality and biological activity evaluation of lithuanian Royal jelly” written by Matas Vitkauskas, leading proffessor Kristina Ramanauskienė, consultant proffessor Daiva Majienė.
Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy Kaunas.
The aim: to evaluate biological activity and quality of lithuanian Royal jelly. Objectives:
1. To investigate physical properties of lithuanian Royal jelly (appearance, moisture, pH, viscosity) which was received in different years.
2. To select High-performance liquid chromatography method for determining 10-HDA levels in lithuanian Royal jelly.
3. To evaluate antimicrobial activity of lithuanian Royal jelly in vitro.
4. To investigate antioxidity of lithuanian Royal jelly which was received in different years.
5. To evaluate the vitality of C6 rat brain cancer cells by exposing them to different concentrations of 10-HDA and lithuanian Royal jelly.
Methods:
Using the appropriate equipment lithuanian Royal jelly moisture, pH, viscosity and appearance were investigated. 10-HDA was determined by High-performance liquid chromatography (HPLC).
Antibacterial properties of lithuanian Royal jelly were evaluated in vitro using an agar diffusion method. Used Muller-Hinton Agar. In vitro studies was performed with gram-positive and gram-negative reference and clinical bacterial strains of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa. Antioxidant activity of lithuanian RJ was performed using free radical scavenging method with DPPH solution. MTT method was used to evaluate cell viability - ability to metabolise MTT paints.
Results and conclusions.
Lithuanian Royal jelly (RJ) is characterized by a yellowish-white color, viscous consistency and acidic properties. As the temperature rises, lithuanian RJ viscosity decreases. HPLC estimates that in 1 mg of lithuanian Royal jelly is about 22 µg 10-HDA. Lithuanian RJ is effective against gram-negative Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa and gram-positive bacteria of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis. Fresher lithuanian Royal jelly which was got in 2017 has a higher antioxidant effect. Royal jelly and 10-HDA have effect on the viability of cancer cells.
SANTRUMPOS
BP – bičių pienelis10-HDA - 10-hidroksi-2-deceno rūgštis ESC – efektyvioji skysčių chromatografija 1% CHX – 1 proc. chlorheksidino gelis FBS – fetalinis veršelio serumas
DMSO – dimetilsulfoksidas
C6 – ląstelių kultūra išgauta iš žiurkės smegenų auglio DPPH - 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas
LOD - aptikimo riba
LOQ - kiekybinio nustatymo riba
MTT - 3-(4,5- dimetiltiazol-2- il)-2,5- difeniltetrazolio bromidas Kl. - klinikinė padermė
Ref. - referentinė padermė UV - ultravioletiniai spinduliai GMB - glioblastoma
ĮVADAS
Bičių pienelis (angl. Royal Jelly) – klampi, gelsvai baltos spalvos, šiek tiek aštraus kvapo bei skonio medžiaga, kurią išskiria bitės darbininkės galvoje esanti hipofaringinė bei apatinio žandikaulio liauka [5]. BP spalva, kvapas, skonis, drėgmė, klampa ir pH yra labai svarbūs kokybės rodikliai. Šviežias bičių pienelis turi būti laikomas -18 °C laipsnių temperatūroje, nes laikant kambario temperatūroje pradeda keisti savo spalvą bei skonį, pradeda rudėti, o skonis tampa aitresnis [6]. Norint pagerinti bičių pienelio kokybę, galima jį liofilizuoti [2, 6].
Bičių pienelis turi sudėtingą baltymų, amino rūgščių, organinių rūgščių, angliavandenių, vitaminų, mineralų ir kitų komponentų sudėtį [3]. Svarbiausia riebalų rūgštis bičių pienelyje ya 10-HDA, kuri manoma, kad yra randama tik bičių pienelyje ir kuri pasižymi įvairiu biologiniu aktyvumu [4]. Bičių pienelis dėl turimų biologinių savybių galėtų būti taikomas kaip profilaktinė priemonė vėžiu, hipertenzija, cukriniu diabetu sergantiems žmonėms [38].
Aktualu ištirti plačiau lietuvško BP kokybę kadangi šis produktas nėra taip plačiai tyrinėjimas kaip kiti bičių produktai (medus, propolis). Apžvelgus mokslinę literatūra galima teigti, kad BP plačiau tyrinėjamas, Japonijos, Kinijos mokslininkų. Dėl esamo tyrimo trūkumo su lietuvišku bičių pieneliu yra aktualu įvertinti lietuviško bičių pienelio kokybę, antimikrobinį, antioksidacinį aktyvumą bei poveikį vėžinėms ląstelėms.
Kadangi viena iš pagrindinių riebalų rūgščių yra 10-HDA ir ji randama tik bičių pienelyje, aktualu identifikuoti ir nustatyti jos kiekį lietuviškame bičių pienelyje vertinant jo kokybę. Siekiant ištirti lietuviško BP esančio 10-HDA kiekį buvo pasirinkta ESC metodika, o vertinant biologinį aktyvumą buvo naudojama C6 žiurkių smegenų auglio ląstelių kultūra. Taip pat atlikti antioksidaciniai bei antimikrobiniai tyrimai, kurie padėjo įvertinti bičių pienelio aktyvumą.
Atlikti tyrimai reikšmingi siekiant bičių pienelio kokybės parametrų standartizavimui. Tai yra svarbu, nes tik kokybišką bičių pienelį galima pritaikyti kaip veikliają medžiagą farmaciniuose preparatuose pasižyminčiuose antioksidaciniu, antimkrobiniu bei priešvėžiniu poveikiu.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įštirti lietuviško bičių pienelio kokybę ir biologinį aktyvumą. Darbo uždaviniai:1. Ištirti skirtingais metais gauto lietuviško bičių pienelio fizikines savybes (išvaizdą, drėgmę, pH reikšmę, klampą).
2. Parinkti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką veikliosios lietuviško bičių pienelio medžiagos 10-HDA nustatymui.
3. Ištirti lietuviško bičių pienelio antimikrobinį aktyvumą in vitro.
4. Ištirti antioksidacinį, skirtingais metais gauto lietuviško bičių pienelio, aktyvumą.
5. Ištirti C6 ląstelių kultūros gyvybingumą išgautą iš žiurkės smegenų auglio paveikiant jas skirtingomis 10-HDA bei lietuviško bičių pienelio koncentracijomis.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bičių pienelio apibūdinimas
Bičių pienelis (angl. Royal Jelly) – klampi, gelsvai baltos spalvos, šiek tiek aštraus kvapo bei skonio medžiaga, kurią išskiria bitės darbininkės galvoje esanti hipofaringinė bei apatinio žandikaulio liauka [5]. Bičių pienelis lervoms yra maitinamas tris gyvenimo dienas, o bičių motinėlėms jis duodamas visą gyvenimo laikotarpį, taip pat bičių pienelis gali būti maitinamas iki lervos periodo pabaigos, jeigu ji atrinkta vystytis į bičių motinėlę [1]. Motinėlės minta tik bičių pieneliu, be šio maisto jos negalėtų pilnai išsivystyti, o tai lemia jų neįtikėtiną dydį bei ilgaamžiškumą [2]. Jos net 42 procentus didesnės ir sveria 62-ejais procentais daugiau negu bitės darbininkės ir gyvena 40 kartų ilgiau, septyni metai lyginant su septyniomis savaitėmis [2].
BP spalva, kvapas, skonis, pH, drėgmė ir klampa yra labai svarbūs kokybės rodikliai. Šviežias bičių pienelis turi būti laikomas -18 °C temperatūroje, nes laikant kambario temperatūroje pradeda keisti savo spalvą bei skonį, pradeda rudėti, o skonis tampa aitresnis [6]. Norint pagerinti bičių pienelio kokybę, galima jį liofilizuoti [2, 6].
1.2. Bičių pienelio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas
Žinios apie bičių pienelio sudėtį yra labai reikšmingos, nes tai mums leidžia įvertinti jo kokybę bei pritaikymą farmaciniuose produktuose. Šviežio bei liofilizuoto bičių pienelio sudėtis skiriasi. Pagrindinės medžiagos sudarančios bičių pienelį nurodytos 1-oje lentelėje.
1 lentelė. Bičių pienelio sudėtis [2, 6, 7]
Šviežias Liofilizuotas
Vanduo % 60-70 <5
Lipidai % 3-8 8-19
10-hidroksi-2-deceno rūgštis % >1,4 >3,5
Baltymai % 9-18 27-41
Fruktozė, gliukozė, sacharozė % 7-18 -
Fruktozė % 3-13 -
Gliukozė % 4-8 -
Pelenai % 0,8-3,0 2-5
pH 3,4-4,5 3,4-4,5
Rūgštingumas (ml 0,1N NaOH/g) 3,0-6,0 -
Bičių pienelis turi sudėtingą baltymų, amino rūgščių, organinių rūgščių, angliavandenių, vitaminų, mineralų ir kitų komponentų sudėtį [3]. Taip pat bičių pienelio sudėtis gali skirtis prikausomai nuo sezono ar regioninės padėties kur ši žaliava buvo gauta [4]. Liofilizuotame bičių pienelyje veikliųjų medžiagų yra iki 3-jų kartų daugiau negu šviežiame.
Tiek baltymai, lipidai, angliavandeniai, amino rūgštys, vitaminai ir mineralai turi svarbią reikšmę farmakologiniam veikimui bei biologiniam aktyvumui. Baltymai sudaro didžiausią sausąją bičių pienelio dalį, t. y. apie 27-41 procentą ir daugiau negu 80 procentų baltymų yra tirpūs vandenyje [4]. Lipidų yra tik 3-8 procentai, tačiau jie yra svarbūs biologiniam aktyvumui [5]. Angliavandeniai sudaro 30 procentų sausosios bičių pienelio masės, pagrindiniai jų yra fruktozė, gliukozė bei sacharozė taip pat galime rasti oligosacharidų tokių kaip rafinozė, maltozė ir kt., tačiau labai mažais kiekiais [5]. Laisvųjų aminio rūgščių yra tik 0,6-1,5 procento, didžioji dalis priklauso L tipo, pagrindinės randamos amino rūgštys yra prolinas, lizinas, glutamo rūgštis, b-alaninas, fenilalaninas, aspartatas ir serinas [4, 6]. Pagrindinės laisvosios amino rūgštys pateiktos 1 pav.
1 pav. Laisvosios amino rūgštys [5]
1.7 2.1 1.7 139.8 1 1.3 13.3 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Alaninas Glicinas Valinas Prolinas Treoninas Izoleucinas Leucinas
L as iv ųj ų a m ino r ūg šč ių ki eki s proc .
Pagrindiniai mineralai randami bičių pienelyje yra K, P, S, Na, Ca, Al, Mg, Zn, Fe, Cu ir Mn, bet jų kiekiai yra labai menki tik 0,01-1mg/100g. Natrio kiekis bičių pienelyje varijuoja nuo 11-14mg/100g [6]. Pagrindinių mineralų kiekis nurodytas 2 lentelėje.
2 lentelė. Mineralų kiekis bičių pienelyje [6]
Mineralai Mg/100g K 200-1000 Ca 25-85 Mg 20-100 Zn 0,7-8 Fe 1-11 Cu 0,33-1,6
Vitaminai bičių pienelyje, kurie turi reikšmės yra riboflavinas, tiaminas, niacinas ir folio rūgštis. Taip pat galime aptikti piridoksino, biotino, pantetoninės rūgšties ir inozitolio. Vitaminų A, D, E ir K nėra. Kaip matome bičių pienelyje vyrauja B grupės vitaminai [6]. Pagrindiniai vitaminų kiekiai nurodyti 3 lentelėje.
3 lentelė. Vitaminų kiekis bičių pienelyje [6]
Vitaminai Mg/100g Niacinas (B3) 4,5-19 Piridoksinas (B6) 0,2-55 Pantetoninė rūgštis 3,6-23 Riboflavinas ( B2) 0,5-2,5 Tiaminas (B1) 0,1-1,73 Biotinas (H) 0,15-0,55 Folio rūgštis 0,01-0,06
Kaip buvo rašyta anksčiau, lipidų kiekis yra ganėtinai mažas, bet jis yra labai svarbus biologiniam aktyvumui. Ne taip kaip organinės rūgštys, riebalų rūgštys bičių pienelyje yra sudarytos iš 8-10 anglies atomų grandinės ir jos dažniausiai būna hidroksi arba dikarboksilinės rūgštys [4]. Svarbiausia
riebalų rūgštis bičių pienelyje yra 10-HDA (2 pav.), kuri manoma, kad yra randama tik bičių pienelyje ir kuri pasižymi įvairiu biologiniu aktyvumu [4].
2 pav. 10-hidroksi-2-deceno rūgštis
Bičių pienelio biologinis aktyvumas buvo tiriamas in vitro taip pat ant laboratorinių gyvūnų (pelių, žiurkių, triušių, žiurkėnų, fermos gyvūnų (avelių, vištų) bei buvo atliekami klinikiniai tyrimai [8]. Moksliškai įrodytas bičių pienelio biologinis aktyvumas yra:
• Antioksidacinis [1,8]; • Priešvėžinis [4,8]; • Priešuždegiminis [6]; • Antimikrobinis [4, 5, 9];
• Žaizdų gyjimą skatinantis poveikis [6]; • Imunomoduliacinis [2, 6];
• Tonizuojantis poveikis [2]
• Senėjimą lėtinantis poveikis [1,8]; • Antireumatinės [6];
• Antidiabetinės [10].
Galima teigti, kad bičių pienelis pasižymi labai dideliu biologiniu aktyvumu ir gali būti taikomas farmacinių produktų gamyboje kaip veiklioji medžiaga.
1.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos apibūdinimas
Bičių pienelis turi labai didelį komercinį susidomėjimą dėl išskirtinių biologinių savybių ir šiomis dienomis yra pritaikomas įvairiose srityse pradedant nuo vaistų, maisto ir baigiant kosmetika [7].
Unikali ir chemiškai įdomi bičių pienelio sudėtis, kuri yra sudaryta iš lipidų, peptidų, riebalų rūgščių bei daugybe kitų medžiagų, skatina bičių pienelio tyrinėjimą [26]. Riebalų rūgštys yra atsakingos
už didžiausią biologinį bičių pienelio aktyvumą, o pagrindinė riebalų rūgštis, kuri pasižymi įvairiu biologiniu akyvumu yra 10-HDA [26].
10-HDA kiekis gryname bičių pienelyje gali kisti priklausomai nuo BP kilmės [27]. Kadangi kiti bičių produktai tokie kaip medus ir propolis neturi šios riebalų rūgšties savo sudėtyje, šią medžiagą galima panaudoti kaip žymeklį įvertinti BP kokybę lyginant su kitais bičių produktais [27].
Žinant faktą, kad 10-HDA yra svarbi sudėtinė BP dalis ir kad pagal ją galima nustatyti BP kokybę, buvo ieškomas metodas, kuris leistų tinkamai šią riebalų rūgštį įvertinti [13]. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas buvo įvertintas kaip tinkamas 10-HDA nustatymui bičių pienelyje [13]. Taip pat svarbu žinoti, kad 10-HDA gali būti nustatinėjamas ir kitais metodais, vienas iš jų kapiliarinė elektroforezę [27]. Šis kapiliarinės elektroforezės metodas sukurtas Bolonijoje, Italijoje [27].
Efektyvioji skysčių chromatografija yra populiarus analitinis metodas medžiagų atskyrimui, identifikavimui ir kiekio nustatymui tam tikrame mėginyje [48]. Todėl lietuviškame bičių pienelyje 10-HDA kiekis buvo nustatinėjamas šio metodo pagalba. Efektyviosios skysčių chromatografijos metu tirpiklis teka per kolonėlę gravitacijos jėga arba tirpiklis gali tekėti aukšto spaudimo pagalba, kad mėginys galėtų būti atskirtas į skirtingas sudedamasias dalis [11]. Iš gautų chromatogramų matoma, kokios medžiagos buvo mėginio sudėtyje, nes didžioji dalis medžiagų jau turi moksliškai pagrįstą sulaikymo laiką.
Kadangi šis analitinis metodas yra labai plačiai pritaikomas nustatinėti įvairias analites jis buvo panaudota nustatyti 10-HDA kiekį lietuviškame bičių pienelyje pagal Sao paulo valstijoje, Brazilijoje atliktą tyrimą [13].
1.4. Antioksidacinis aktyvumas
Antioksidantai yra molekulės, kurios slopina laisvųjų radikalų reakcijas vysktančias organizme ir padeda slopinti ląstelių pažeidimą [36]. Nors antioksidacinis poveikis gali skirtis priklausomai nuo organizmo atsako į šias reakcijas, antioksidacijos reakcijos yra tokios pat visuose organizmuose [37]. Laisvieji radikalai gali būti įvardijami kaip toksiški arba naudingi junginiai, nes jie yra tiek naudingi, tiek kenksmingi mūsų organizmui [16].
Įprastos biocheminės reakcijos, padidėjęs sąlytis su aplinka, didesnis ksenobiotikų suvartojimo kiekis skatina reaktyviųjų deguonies formų susidarymą [37]. Reaktyviosios deguonies formos susidaro normalaus ląstelių metabolizmo metu [16]. Kuomet jų koncentracija yra atitinkamose ribose šios reaktyviosios deguonies formos veikia teigiamai bei yra sunaudojamos fiziologinių ląstelių procesų metu,
bet jų koncentracijai padidėjus gali atsirasti neigiamas povekis ląstelių sudedamosioms dalims tokioms kaip lipidai, proteinai ir DNR [38].
Kuomet susidaro reaktyviųjų deguonies formų perteklius ir jos organizme palaipsniui nėra sunaikinamos jos pradeda kauptis organizme ir gali sukelti oksidacinį stresą [16]. Oksidacinis stresas sukelia daug patologinių procesų mūsų organizme įskaitant vėžį, neurologinius sturikimus, aterosklerozę, hipertenziją, diabetą, LOPL ir astmą [38]. Skiriamos dvi pagrindinės reaktyviosios deguonies formos:
• Endogeninės [38]; • Egzogeninės [38].
Pagrindinės endogeninės molekulės, kurios gali sukelti antioksidacinį stresą ir pažeisti organizmo ląsteles yra superoksiko anijonas (O2−.), hidroksilo radikalas (•OH), ir peroksidas (H2O2) [38].
Egzogeninių oksidantų šaltiniai yra rūkymas, oro tarša, jonizuojanti ir nejonizuojanti radiacija, maistas, vaistai bei įvairūs ksenobiotikai [39].
Žmogaus organizmas turi daugybe antioksidantų, kurie padeda kovoti su oksidaciniu stresu ir šios antioksidantų grupės gali būti suskirstomos į fermentinius antioksidantus ir mažos molekulinės masės gaudykles. Fermentai saugantys ląstelę nuo oksidantų yra:
1. Superoksido dismutazė (SOD), kuri O2−. dismutuoja į H2O2: 2O2 •- + 2H+ → H2O2 + 3 O2 [39];
2. Katalazės, esančios peroksisomose, verčia H2O2 į H2O ir O2: 2H2O2 → 2 H2O + O2 [39];
3. Glutationo peroksidazė (GSHPX) yra svarbiausias H2O2 šalinantis fermentas žmogaus ir kitų
žinduolių ląstelėse: 2GSH + H2O2 → G-S-S-G + 2 H2O [39].
Mažos molekulinės masės gaudykles yra tokios kaip vitaminas C ir E, beta karotenas, šlapimo rūgštis ir glutationas [38].
Pastartuoju metu natūralūs antioksidantai sulaukė labai daug dėmesio iš mokslininkų ir tyrėjų dėl jų teigiamo poveikio mūsų sveikatai [14].
Bičių pienelis yra natūralus dažnai naudojamas produktas apsisaugoti nuo oksidacinio streso [15]. Yra atlikta tyrimų su bičių pieneliu įrodančių, kad šis natūralus antioksidantas pasižymio šiomis savybėmis [14, 15, 16]. Visi tyrimai, įrodantys šį poveikį buvo atliekami naudojant laisvojo radikalo surišimo metodą su DPPH tirpalu. Laisvolo radikalo surišimo metodas yra vienas paprasčiausių metodų nustatyti tyrinėjamos medžiagos antioksidacines savybes [17]. Šio metodo metu DPPH tirpalas sumaišomas su tiriamosios medžiagos tirpalu ir yra matuojama UV spinduliais [17]. Norint įsitikinti ir įvertintų lietuviško bičių pienelio gauto 2016 metais vasario mėnesį bei 2017 metais lapkričio mėnesį buvo atliktas tyrimas pritaikant šį laisvojo radikalo surišimo metodą.
1.5. Antimikrobinis aktyvumas
Antibiotikai yra pagrindiniai vaistai skirti kovoti su bakterijomis [41]. Tačiau dešimtmečiais daugybę įvairių antibiotikų buvo naudojami ne tik terapiniais tikslais, jie buvo pritaikyti kaip profilaktika kitose pramonės šakose, kaip žemės ūkis bei gyvulininkystė [40]. Šis piktnaudžiavimas ir netikslingas antibiotikų vartojimas sukėlė bakterijų rezistentiškumą jiems [40].
Norint išvengti bakterijų atsparumo ir parinkti tinkamą antimikrobinį preparatą yra svarbu žinoti bakterijų anatomiją [41]. Bakterijų apvalkalai skirstomi į dvi pagrindines grupes t.y. gram neigiamas ir gram teigiamas [20]. Gram neigiamos bakterijos yra apsuptos plona peptidoglikano sienele, kuri yra apsupta išorine membrana sudaryta iš lipopolisacharidų ir baltymų [20]. Gram neigiamos bakterijos apvalkalą galite matyte paveikslėlyje apačioja (3 pav.).
3 pav. Gram neigiamos bakterijos apvalkalas
Gram teigiama bakterija neturi išorinės membranos sudarytos iš lipopolisacharidų ir baltymų, bet yra apsupta daugeliu sluoksnių iš peptidoglikano, kuris yra storesnis nei randamas gram neigiamose bakterijose [20]. Gram teigiamos bakterijos apvalkalą galite matyti apačioje (4 pav.).
Visos bakterijos gali būti paveiktos skirtingai, priklausomai nuo antibiotikų poveikio [41]. Antibiotikai gali veikti ląstelės sienelę ir sukelti bakterijos lizę (beta laktaminiai, glikopeptidiniais antibiotikai), taip pat slopinti baltymų sintezę (tetraciklinai, makrolidai, oksazolidinonai) bei DNR replikaciją (chinolonai) [41].
Bakterijų rezistentiškumas antibiotikams modernioje medicinoje šiuo metu yra didelė problema pasauliniame lygmenyje todėl yra mėginama rasti alternatyviąją mediciną atsisakant antibiotikų [18]. Medus, propolis ir bičių pienelis yra alternatyvių terapinių produktų tarpe [18]. Nuo neatmenamų laikų bičių pienelis buvo laikomas kaip maistas ir medicina. [18]. Neseniai buvo pastebėta, kad šis bičių produktas gali būti potenciali medicina prieš bakterines infekcijas, ypač odos ir minkštųjų audinių [18].
Bičių pienelio sudėtyje yra proteino, angliavandenių, lipidų ir kitų vandenyje tirpių junginių [3]. Baltymai sudaro 9-18 procentų bičių pienelio [6]. Manoma, kad BP sudėtyje esantys baltymai „royalisin”, pasižymi antibakterinėmis savybėmis prieš gram teigiamas bakterijas, tačiau šis baltymas yra neaktyvus prieš gram neigiamas [19]. Taip pat antibakterinės BP savybės gali būti siejamos su riebalų rūgštimi vadinama 10-hidroksi-2-deceno rūgštis (10-HDA) [46].
Pagal naujesnę informaciją izoliuoti BP antibakteriniai peptidai, „jelleines“ yra trumpi peptidai, kurie pasižymi antibakteirniu aktyvumu prieš gram teigiamas ir gram neigiamas bakterijas bei prieš grybelį [19]. Bičių pienelio sudėtyje esančios medžiagos tiek peptidai, tiek lipidai, tiek riebalų rūgštis, pasižymi antibakterinėmis savybėmis [49,50]. Tačiau veikimo mechanizmas prieš gram teigiamas ir gram neigiamas bakterijas nėra aiškus ir tikslus.
Įvairus spektras skirtingų bakterijų yra atsakingi už žaizdų užteršimą, žaizdų kolonizavimą ir klinikinę infekciją. Mikroorganizmai, tokie kaip Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Streptococcus uberis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli ir Klebsiella pneumonia yra dažnai randami ant odos žaizdų [25].
Yra atliktų tyrimų, įrodančių, kad bičių pienelis yra efektyvus prieš gram teigiamas ir gram neigiamas bakterijos tiek bakteriocidiškai, tiek bakteriostatiškai [25]. Norint išsiaiškinti ar bičių pienelis iš tiesų pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas buvo atlikas tyrimas su šiomis gram teigiamomis bakterijomis:
• Staphylococcus aureus [23] • Enteroccucs faecalis [24]
Bei gram neigiamomis bakterijomis: • Eschericia coli [21]
1.6. Glioblastoma
Vėžys yra pagrindinė mirties priežastis pasaulyje po širdies ir kraujagyslių ligų [27]. Su šia liga susiduria daugelis žmonių pasaulyje [27]. Žodis „vėžys” kilo nuo Graikiško “karkinos”, kuomet gydytojas Hipokratas apibūdino karcinomos navikus, tačiau jis nebuvo pirmasis gydytojas, kuris atrado šią ligą [27]. Piktybinės gliomas yra dažniausias tipas pirminio smegenų auglio [43]. Glioma yra bendrinis terminas naudojamans pirminių smegenų auglių apibūdinimui ir yra klasifikuojamas priklausomai nuo ląstelės kilmės [47]. Gali būti astrocitiniai navikai (astrocitomos, anaplastinės astrocitomos ir glioblastoma), oligodendrogliomos, ependimomos ir mišrios gliomos [44]. Gliomos yra dažniausiai pasitaikantys navikai centrinėje nervų sistemoje, kurie sudaro beveik 80 procentų piktybinių pirminių smegenų auglių [44]. Glioblastoma yra piktybinis ir dažnai pasitaikantinis pirminių astrocitomų tipas, kuris sudaro daugiau kaip 60 procentų visų suaugusių smegenų auglių [44].
Glioblastoma (GBM) – piktybinis navikas, kuris yra viena iš greičiausiai besidauginančių navikų rūšių [30]. Šis navikas yra labiausiai paplitęs smegenų auglys suaugusiųjų amžiaus tarpe 45-70 metų [28]. Sudaro maždaug 15% visų diagnozuotų smegenų navikų, ir beveik 50% visų pirminių smegenų navikų [30]. Glioblastomos naviko augimą mėnesio eigoje galite matyte paveikslėlyje apačioje (5 pav.)
GBM galime suskirstyti į pirminę ir antrinę, o šios rūšys vystosi iš žemesniojo laipsnio navikų [31]. Didesnis sergamumas pasireiškia vyrams lyginant su moterimis ir sergamumas nėra siejamas nei su maistu, mobiliaisiais telefonais ar su rūkymų [32]. Literatūroje yra aprašyta, kad GBM atsiradimas gali priklausyti nuo sąlyčio su plastiku PVC bei jonizuojančiosios spinduliuotės [33]. Auglys suaugusiems dažniausiai pasireiškia priekinėje arba šoninėje smegenų dalyje [31].
Dabartinis gydymas įtraukia chirurginę rezekciją, radiacinį spinduliavimą bei chemoterapiją [28]. Žmonės, kurie turi šį auglį išgyvena neilgiau nei pusantrų metų po aptikimo, vidutiniškai, žmogus, turintis glioblastomą išgyvena apie tris mėnesius atliekant procedūras išvardintas aukščiau [32]. Tačiau šiam augliui įprastinio chemoterapinio gydymo ir radiacinio spinduliavimo neužtenka, GBM turi atsparumą prieš šiuos gydymo metodus [34]. Naujai diagnozuotam GBM reikia kelių gydymo būdų, norint gauti efektyvumą [35]. Nors taikant gydymą ligą galima kontroliuoti, bet galutinis rezultatas vis tiek išlieka prastas [34]. Šią ligą sunku gydyti todėl, kad ji plinta labai greitai ir patenka į smegenų dalis, kurios atsakingos už kalbą, motoriką bei pojūčius. Dėl šios priežasties chirurginė rezekcija yra sudėtinga [35]. Taip pat gydymo sunkumą sukelia kraujo ir smegenų barjeras, o naviko ląstelės, esančios hipoksijos srityje yra atsparesnės radiacijai [34].
Glioblastoma yra labai agresyvus bei vienas iš labiausiai paplitusių smegenų auglių ir žmonių su šiuo naviku išgyvenamumas yra mažas. Labai svarbu rasti papildomų gydymo, profilaktinių ir prevencinių priemonių padedančių slopinti šios ligos progresavimą. Natūralūs produktai gauti iš bičių, manoma, kad pasižymi savybėmis padedančiomis kovoti prieš prostatos bei krūties vėžį [45]. Tačiau nėra atlikta tyrimų su glioblastomos augliu, todėl yra moksliškai svarbu ir naudinga ištirti lietuviško bičių pienelio bei jo pagrindinės sudedamosios dalies, riebalų rūgšties, 10-HDA poveikį prieš šio auglio vėžinių ląstelių kultūra išgauta iš žiurkių smegenų (C6).
2. METODIKA
2.1. Naudotos medžiagos ir aparatūra
2.1.1. Naudotos medžiagos
1) Ląstelių augimo terpė (DMEM, Sigma Aldrich, D5796) 2) Fetalinio veršelio serumas (FBS, Sigma Aldrich)
3) Penicilino/Streptomicino sudėtinis antibiotikų tirpalas (Sigma, P0781) 4) Triptano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich)
5) Bičių pienelis (UAB „Bičių korys“; Andriaus Bučiaus „Bitynas“, Kaunas) 6) Etanolis 96,6 % (v/v) (Sigma-Aldrich)
7) 10-hidroksi-2-deceno rūgštis (10HDA) (Sigma-Aldrich) 8) Fosfatinis druskos buferis (PBS) (Sigma-Aldrich)
9) HBSS (Hanks’ balanced salt solution; Sigma Aldrich, H8264) 10) 0,5 proc. acto rūgštis (Sigma-Aldrich)
11) Metanolis (Sigma-Aldrich)
12) 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas (Sigma-Aldrich)
13) Miulerio-Hintono agaras (Oxoid LTD, Bsingstoke, Hampshire, Anglija).
14) Bakterijų kultūros: referentinės Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) ir klinikinės Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli ir Pseudomonas aeruginosa
2.1.2. Naudota aparatūra
1) Spektrofotometras „UNICOM UV/VIS“ 2) Spektrofotometras „Agilent 8453“ 3) pH-metras „pH-Meter 766 Calimatic“
4) Reometras „Modular Compact Rheometer MCR 102“ 5) ESC chromatografas „Agilent 1260 Infinity“
6) Centrifūga „Eppendorf” 7) Hemocitometras „Neubauer”
2.2. Bičių pienelio kokybės nustatymo metodai
2.2.1. Bičių pienelio pH reikšmės nustatymas
pH nustatymas buvo atliekamas potenciometriškai. Atliktas dviejų skirtingais metais gautų (2016, 2017) lietuviškų BP pH nustatymas. Nustatymas atliktas atšildžius bičių pienelį iki skystos konsistencijos ir tiesiogiai pH-metrą įkišus į jį. Kiekvienam bičių pieneliui atliki trys nustatymai su temperatūros rodmenimis ir įvertinti pH skirtumai tarp 2016 ir 2017 metais gauto lietuviško bičių pienelio. Gauti rezultatai suvesti į 4 lentelę.
2.2.2. Bičių pienelio reologinių savybių tyrimas
2016 ir 2017 metais gauto lietuviško bičių pienelio reologinės savybės nustatinėjamos su reometru. Naudojant reometrą buvo įvertinta bičių pienelio klampa prie skirtingų temperatūrų t.y. +4 °C, +20 °C ir +32 °C. Gauti rezultatai buvo lyginimi 8 pav.
2.2.3. Bičių pienelio drėgmės kiekio nustatymas
Lietuviško bičių pienelio gauto 2016 ir 2017 metais drėgmės nustatymas atliktas gravimetriškai. Buvo pasveriama 0,50 g BP ir džiovinama 100-105 °C temperatūroje 3h. Atvėsinama eksikatoriuje virš fosforo pentoksido R ir pasveriama. Rezultatas apskaičiuojamas procentais. Gauti rezultatai suvesti į 4 lentelę ir buvo stebimas drėgmės skirtumas tarp bičių pienelių.
2.2.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos pritaikymas ir validacija 10-HDA
juginio analizei
ESC tyrimas atliktas Brazilijoje buvo pritaikytas nustatinėti 10-HDA lietuviškame BP. Bičių pienelio junginio (10-HDA) kokybinės ir kiekybinės sudėties analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografu „Agilent 1260 Infinity‘‘, taikant laboratorijoje įdiegtą ir validuotą metodiką. Chromatografinei analizei taikytos sąlygos:
• Kolonėlė – C18 kolonėlė;
• Izokratas – 50% 0,5 proc. acto rūgšties ir 50% metanolio; • Injekcijos tūris – 0,2 µl;
• Tėkmės greitis – 10 µl/min; • Kolonėlės temperatūra – 25 °C; • Fenolinių junginių detekcija – 225 nm. • Metodikos trukmė – 15min.
Chromatografinės metodikas validacija. Aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos nustatytos, analizuojant tris tirpalus, kuriuose standartų koncentracija buvo 2,5, 5 ir 10 µg/ml. Pagal kiekybinio nustatymo ribos reikšmes paruošti 6 skirtingų koncentracijų standartų tirpalai kalibracinės kreivės sudarymui. Kalibracinių kreivių linijiškumas vertintas pagal determinacijos koeficientą (R2). Metodikos tikslumas ir glaudumas vertintas ruošiant 3 skirtingų koncentracijų bandinių 3 serijas tą pačią dieną (pakartojamumo validacija) ir skirtingomis dienomis (atkuriamumo validaciją). Metodikos tikslumas išreišktas rastos analitės procentiniu kiekiu, o glaudumas vertintas pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN, proc.).
2.3. Bičių pienelio biologinio aktyvumo nustatymo metodai
2.3.1. Bičių pienelio antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Antioksidacinis nustatymas bičių pieneliui buvo atliekamas laisvojo radikalo surišimo metodu su DPPH tirpalu. Buvo pagamintas 0,1 mmol/l DPPH tirpalas 96 procentų etanolyje. Jis buvo laikomas 24 valandas tamsioje, vėsioje vietoje. Prieš analizę lietuviški BP buvo laikomi šaldytuve -18 °C laipsnių temperatūroje. Nustatymas atliktas su skirtingu metu gautais bičių pieneliais (2016 metais vasario mėnesį bei 2017 metais lapkričio mėnesį). Buvo atliekami 3 tyrimai su 2016 metais gautu lietuvišku BP bei 3 tyrimai su 2017 metais gautu lietuvišku BP. BP tirpalas paruoštas paimant 1g bičių pienelio ir jį tirpinant 10 ml distiliuoto vandens, kuris vėliau buvo filtruojamas per filtrą. Šių tirpalų reakcijos atliktos kiuvetėse. Į kiuvetę pilta 2,9 ml DPPH tirpalo ir 0,1 ml tiriamojo tirpalo. Viską supylus į kiuvetė buvo paliekama stovėti 15 min tamsoje, po to supurtyta ir laikoma dar 15 min. Lyginimasis tirpala - 96 procentų etanolis. Viskas buvo matuojama spektrofotometru esant 518 nm bangos ilgiui. Rezultatai išreiškiami procentais. Apskaičiavimas:
Ao – bandinio be tiriamojo tirpalo absorbcija, gryno DPPH optinis tankis; At – bandinio su tiriamuoju turpalu absorbcija pusiausvyroje.
2.3.2. Bičių pienelio antimikrobinis tyrimas
Tyrimas atliktas LSMU VA Dr. Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikoje bendradarbiaujant su A. Grigonio mokslininkų grupe. Bičių pienelio antibakterinės savybės vertintos in vitro, taikant difuzijos į agarą metodą. Naudotas Miulerio–Hintono agaras (Mueller–Hinton agar (CM 0337) Oxoid LTD, Bsingstoke, Hampshire, Anglija).
Tyrimai in vitro vykdyti su gram teigiamomis ir gram neigiamomis referentinėmis bakterijų padermėmis Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) bei klinikinėmis Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli ir Pseudomonas aeruginosa bakterijų padermėmis.
Naudotas neskiestas bičių pienelis. Kaip kontrolė imta 1 proc. CHX gelis.
Pagal „Clinical and Laboratory Standarts Institute“ (CLSI) patvirtintą standartą paruoštas skystas Miulerio-Hintono agaras buvo išpilstytas į 10 cm skersmens Petri lėkšteles po 35 ml į kiekvieną ir paliktas horizontalioje padėtyje, kad sutirštėtų. Ant sustingusios terpės paviršiaus paskleidus bakterijų padermę, kiekvienoje Petri lėkštelėje buvo padaryta 6 šulinėliai (7 mm skersmens), į kuriuos buvo pilama po 0,1 ml neskiesto bičių pienelio ir 1 proc. chlorheksidino gelio. Kiekvienai bakterijų padermei buvo skirtos 8 Petri lėkštelės. Lėkštelės buvo inkubuojamos 24 val. 36 °C laipsnių temperatūroje.
Antibakterinis BP aktyvumas in vitro vertintas po 24 val. kultivavimo, apskaičiuojant skaidrių zonų, susidariusių aplink šulinėlius, skersmenį milimetrais. Jei aplink šulinėlį skaidri zona nesusidarė, daryta išvada, kad tirta medžiaga neturi baktericidinio poveikio tiriamai bakterijų padermei.
2.3.3. Ląstelių sėjimo metodika
Šiam tyrimui atlikti buvo naudojama C6 ląstelių kultūra išgauta iš žiurkės smegenų auglio. Ląstelių augimui buvo naudojama auginimo terpė DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Sigma Aldrich, D5796) su gliutamatu. Į terpę dėtas FBS (fetalinio veršelio serumas, Sigma Aldrich) ir antibiotiko Penicilino/Streptomicino tirpalas (10000 IU/ml – 10000 µg/ml) norint išvengti mikroorganizmų augimo. Ląstelės buvo laikomos termostate, kurio temperatūra visuomet 37°C, 5 proc. CO2. Ląstelių atlipinimui
jungtis, uždėjus ir palikus jį veikti keletą minučių augimo flakone, ląsteles galime tuomet atlipinti nuo mėgintuvėlio dugno. Po kelių minučių patikrinta per mikroskopą ar ląstelės yra atlipusios. Atšokusios ląstelės buvo centrifuguojamos 5 minutes 1000 apsisukimų per minute greičiu, 25°C temperatūroje (centrifuga Eppendorf)
2.3.4. Ląstelių tankio nustatymas
Ląstelėms suskaičiuoti buvo naudojamas 0,4 procento triptano mėlio dažų tirpalas ir hemocitometras (Neubauer) (6 pav.). 20 µl ląstelių suspensijos sumaišoma su 20 µl 0,4 procento triptano mėlio dažų tirpalo. Ant hemocitometro kameros po dengiamuoju stikleliu įvedama 20 µl mišinio ir stebima pro šviesinį mikroskopą bei skaičiuojamas ląstelių skaičius. Skaičiavimas yra atliekamas keturiuose langeliuose. Ląstelės, kurio nusidažusios mėlyna spalva yra neskaičiuojamos, nes dėl ląstelių membranos pažaidos triptano mėlis praeina pro membraną ir jas nudažo mėlynai, visos mėlynai nusidažiusio ląstelės yra laikomos negyvomis. Naudojamas hemocitometras skaičiavimui pateiktas 6 paveikslėlyje apačioje.
6 pav. Hemocitometro kamera
Ląstelių skaičius 1 mililitre apskaičiuojamas pagal formulę: n = (a+b+c+d)*4*2*5000,
kur: n – ląstelių skaičius 1 ml;
a, b, c, d – ląstelių skaičius langeliuose; 5000 = c – konstanta;
2.3.5. Ląstelių gyvybingumo nustatytas MTT testu
MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2- il)-2,5- difeniltetrazolio bromidas) dažas yra dažnai bei plačiai naudojamas saugus ląstelių gyvybingumui ir citotoksiškumui nustatyti kolorimetriniu metodu. Tarp visų fermentų aktyvumu patvirtintų tyrimų MTT yra geriausiai žinomas metodas siekant nustatyti mitochondrijų dehidrogenazės aktyvumą gyvose ląstelėse. Taikant šį metodą geltonas MTT virsta netirpiais purpuriniais formazano kristalais ((E, Z)-5-(dimetiltiazol-2-il)-1,3-difenilformazanas) veikiant nuo NAD(P)H priklausomomis oksoreduktazėmis (7 pav.)
7 pav. Geltonos spalvos MTT veikiant mitochondronei reduktazei redukuojasi į violetinės spalvos formazaną
Prieš matuojant absorbciją, reikalingas organinis tirpiklis, kad ištirpintų susidariusius kristalus. Tyrimo metu kaip organinis tirpiklis buvo naudojamas dimetilsulfoksidas (DMSO; Sigma Aldrich, 34943).
Nuo ląstelių, kurios augo šulinėliuose nupilta DMEM terpė ir šulinėliai 2 kartus praplauti su PBS po 100 µl. Pašalinus buferį į šulinėlius buvo pridedama po 180 µl naujo HBSS ir 20 µl 5 mg/ml MTT dažo ištirpinto PBS. Ląstelės 2 valandas inkubuojamos tamsoje 37 °C temperatūroje. Tuomet pašalinamas dažas, o susiformavę kristalai ištirpinti 100 µl DMSO tirpale. 15 minučių lėkštelė buvo laikoma tamsoje. Alikti matavimai spektrofotometru, absorbcija buvo matuojama prie 550 nm bangos ilgio ir 620 standartinio bangos ilgio.
2.4.
Statistinė analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) ir ,,SPPS 25.00“ (IBM, JAV) programas. Apskaičiuotas tyrimų duomenų matematinis vidurkis ir santykinis standartinis nuokrypis.
3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Bičių pienelio kokybės vertinimas
Kokybinis lietuviško bičių pienelio įvertinimas turi labai daug įtakos bičių pienelio parinkimui farmaciniams preparatams bei jo pačio efektyvumui. Įvertinti lietuviško bičių pienelio, kuris buvo gautas skirtingais metais kokybiškumui buvo nustatyta pH reikšmė, drėgmė, išvaizda, klampa bei 10-HDA kiekis. Efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai bus aptarti tolimesniame skyrelyje. Pirminius duomenis galite matyti 4 lentelėje.
4 lentelė. Lietuviškų bičių pienelių kokybiniai rodikliai
Bičių pienelis Išvaizda pH Drėgmė
2016 Gelsvai baltas 4,22 ± 0,01 (21,1 °C) 64%
2017 Gelsvai baltas 4,30 ± 0,02 (21,1 °C) 61%
Lietuviško bičių pienelio išvaizda, pH, drėgmė buvo panašūs su kitose šalyse surinkto bičių pienelio skelbiamais tyrimų duomenimis [4]. Bičių pienelio išvaizda, kitose šalyse buvo taip pat gelsvai balta arba gelsva, lietuviško bičių pienelio yra gelsvai balta. Drėgmė lietuviško bičių pienelio nustatyta 61 bei 64 procentai. Atsižvelgiant į kitų mokslininkų straipsnius, drėgmė bičių pienelio gali svyrtuoti nuo 60% ± 10% [5]. pH reikšmė gali kisti nuo 3,4-4,5 [5], mūsų pH rezultatai gauti tokie: 2016 metais gauto lietuviško bičių pienelio pH kito nuo 4,2 iki 4,25 esant temperatūrai 21.1 °C, o 2017 – pH kito nuo 4,25 iki 4,34 esant temperatūrai 21.1 °C.
Sulyginus duomenis su kitų mokslininkų gautais rezultatais, galime teigti, kad lietuviškas bičių pienelis gautas 2016 metais ir 2017 metais yra kokybiškas remiantis išvaizda, pH bei drėgme ir nesiskiria nuo kitų šalyse surinktų bičių pienelių.
Taip pat atlikti reologiniai tyrimai lietuviško bičių pienelio gauto 2016 ir 2017 metais. Mėginiai tirti prie +4 °C, +20 °C bei +32 °C laispnių temperatūros norint pažiūrėti kaip kinta šios medžiagos struktūra. Gautus rezultatus galite matyti 8 pav.
8 pav. Lietuviškų bičių pienelių klampos priklausomybė nuo temperatūros
Remiantis 8 pav., galime matyti, kad klampa mažėja didėjant temperatūrai, taip yra todėl, kad lietuviško bičių pienelio struktūrinės savybės silpnėja didėjant temperatūrai. Patikrinus korialiaciją (Spirmeno koreliacijos koeficientas) gauta statistiškai reikšminga neigiama atvirkštinė priklausomybė (9, 10 pav.). 0 5 10 15 20 25 30 4 20 32 K la m pa , P a*s Temperatūra °C BP 2016 BP 2017 +4 +20 +32 +4 +20 +32 +4 +20 +32 Temperatūra °C Temperatūra °C Kla m pa , P a* s Kla m pa , P a* s
9 pav. 2016 metų lietuviško bičių pienelio klampos priklausomybė nuo temperatūros. r=-0,949, p<0,05
10 pav. 2017 metų lietuviško bičių pienelio klampos priklausomybė nuo temperatūros. r=-0,896, p<0,05
3.2. 10-HDA nustatymas taikant efektyviąja skysčių chromatografija
Efektyviosios skysčių chromatografijos pagalba lietuviško bičių pienelio kokybiškumo įvertinimas atliktas pagal 10-HDA nustatymą. Atlikti tyrimai su 2016 metais gautu bičių pieneliu. Efektyvioji skysčių chromatografija nustatant 10-HDA lietuviškame bičių pienelyje buvo atlikta remiantis Brazilijoje patvirtinta metodika [13]. Ši metodika buvo šiek tiek pakeista: lietuviško bičių pienelio judri faze – 0,5 proc. acto rūgšties ir metanolis, izokratas 50 proc./ 50proc., metodo trukmė – 15 min. Brazilijoje atliktame tyrime judri fazė buvo sudarya iš vandens ir metanolio, izokratas 45 proc./ 55 proc. Metodo trukmė – 30 min.
Tiriant 10-HDA, standartinį tirpalą bei bičių pienelį, būtina įrodyti pasirinkto analizės metodo tinkamumą, todėl yra atliekama ESC validacija. Efektyvosios skysčių chromatografijos validacija atlikta su standartiniu 10-HDA tirpalu pagal šiuos pasirinktus validacijos parametrus: specifiškumas, pakartojamumas ir atkartojamumas.
Metodikos specifiškumas yra gebėjimas įvertinti analitės buvimą. Kiekviena chromatografinė smailė parodo atskirą junginį. Specifiškumas pagrindžiamas lyginant analičių ir standartinių tirpalų chromatogramas, t.y. smailių sulaikymo laikus.
12 pav. Lietuviško bičių pienelio charakteringoji chromatograma. tR=9.30 min
Lyginant lituviško bičių pienelio ir standartinio 10-HDA tirpalo sulaikymo laikus, aiškiai matyti, jog sulaikymo laikai yra labai panašūs, skirtumas yra tik 5 sekundės (11, 12 pav.)
Metodo tikslumui ir glaudumui įvertinti apskaičiuotas rezultatų, gautų analizės metu, pakartojamumas bei atkuriamumas. Pakartojamumas (angl. Repeatability) parodė rezultatų tikslumą vertinant tą pačią dieną, tokiomis pačiomis sąlygomis, ruošiant 3 skirtingų koncentracijų bandinių 3 serijas, o atkuriamumas (angl. Reproducibility) išreiškia tikslumą skirtingomis dienomis esant tomis pačioms sąlygomis, pavyzdžiui, per tris skirtingas dienas. Atkuriamumas taip pat atliktas ruošiant 3 skirtingų koncentracijų bandinių 3 serijas. Metodikos tikslumas išreikštas rastos analitės (10-HDA) procentiniu kiekiu, o glaudumas vertintas pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN, proc.).
10-HDA aptikimo apatinė riba (LOD), kiekybinio nustatymo apatinė riba (LOQ) ir sudarytos kalibracinės kreivės koncentracijų ribos pateiktos 5 lentelėje. Determinacijos koeficientas R2 = 0,99917
5 lentelė. 10-HDA kalibracinės kreivės parametai Analitė Koncentracijos Regresijos
lygtis R
2 LOD LOQ
10-HDA 28,59-182,59 µg/ml
X=21,64X-38,7 0,99917 2,7 8,9
Glaudumas ir tikslumas ESC metodikos metu vertintas naudojant trijų skirtingų koncentracijų (kalibracinės kreivės apatinį, vidurinį ir viršutinį tašką) tirpalus. Pakartojamumo rezultatai pateikti 6 lentelėje.
6 lentelė. 10-HDA pakartojamumo reikšmės
Analitė Tikslumas (proc.) Glaudumas (SSN, proc.)
10-HDA 97,8-98,9 0,46-7,12
Atkuriamumo rezultatai pateikti lentėleje apačioje (7 lentelė).
7 lentelė. 10-HDA atkuriamumo reikšmės
Analitė Tikslumas (proc.) Glaudumas (SSN, proc.)
10-HDA 98,86-107,1 0,65-3,17
Pakartojamumo sąlygomis tikslumo reiškmės buvo nuo 97,8 iki 103,3 procentų ribose, o atkuriamumo sąlygomis tikslumo reikšmės 96,56-105,1 procentų ribose. Glaudumas neviršijo 7,12 proc. Gauti rezultatai patvirtina ESC metodikos tinkamumą 10-HDA nustatinėjimui.
Pagal gautus duomenis buvo nustatytas 10-HDA kiekis bičių pienelyje. Atliktus efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimą gauta, kad 1-ame mg bičių pienelio yra ~22 µg 10-HDA. Tai yra apie 2 procentus, kas patvirtina su rezultatais gautais Brazilijos mokslininkų, kurių 10-HDA kiekis svyravo nuo 1.8 proc iki 3 proc. [13]. Pagal mokslinius standartus, kokybiškame bičių pienelyje 10-HDA kiekis turi būti > 1,4 proc [7].
38.5 31.3 44.4 44.6 55.2 49.34 0 10 20 30 40 50 60
mėginys Nr. 1 mėginys Nr. 2 mėginys Nr. 3
In ak ty vi nta pr oc . 2016 BP 2017 BP
3.3. Bičių pienelio antioksidacinio tyrimo rezultatai
Laisvojo radikalo surišimo metodas yra vienas paprasčiausių metodų norint įvertinti antioksidacinį poveikį bičių pieneliui [17]. Jo metu yra nustatoma, kiek laisvojo radikalo suriša bičių pienelis. Laisvieji radikalai yra inaktyvinimai paverčiant juos stabiliais DPPH-H junginiais. DPPH redukcija yra stebima prie tam tikro bangų ilgio. Naudojant 2016 metais vasario mėnesio ir 2017 metai lapkričio mėnesio gautus lietuviškus bičių pienelius buvo įvertintas antioksidacinis poveikis vertinant gautų 2016 ir 2017 metais tris mėginius. Atlikus antioksidacinį tyrimą su bičių pieneliu buvo gauta, kad 2016 metų lietuviškas bičių pienelis DPPH inaktyvinta nuo 31,3 proc. iki 44.4 proc., o 2017 lietuviškas bičių pienelis inaktyvina DPPH nuo 44,6 proc. iki 55.2 proc. Gautus rezultatus galite matyti apačioje (13 pav.). Šie lietuviško bičių pienelio rezultatai yra panašūs su kitų mokslininkų skelbiamais tyrimų duomeninis, kurie taip pat atliko bičių pienelio antioksidacinį aktyvumą naudojant laisvojo radikalo surišimo metodą [14, 15].
13 pav. Lietuviškų bičių pienelių antioksidacinis poveikis
Galime teigti, kad vertinant lietuviško bičių pienelio antioksidacinį poveikį pagal laisvojo radikalo (DPPH) metodą, tiek 2016 metų tiek 2017 metų lietuviški bičių pieneliai turi antiradikalinį poveikį. Tačiau senesnis lietuviškas bičių pienelis pasižymi šiek tiek silpnesniu poveikiu, tai gali būti, nes 2016 metais vasario mėnesį gautas lietuviškas bičių pienelis buvo pradėtas naudoti kovo mėnesį ir naudotas periodiškai iki 2018 metų pradžios, o 2017 metais lapkričio mėnesį gautas lietuviškas bičių pienelis buvo pradėtas periodiškai naudoti tik iki 2018 metų pradžios.
Kiekvieną kartą bičių pienelį atšildant ir vėl atšaldant struktūra gali šiek tiek pasikeisti, nes ši medžiaga yra nestabili, todėl ją reikia visuomet laikyti ne žemesnėje nei -18 °C laispnių temperatūroje. Todėl bičių pienelį būtų tikslinga naudoti mažesnes pakuotėmis, kad žmogus galėtų jį greičiau suvartoti, kad šio natūralaus produkto antioksidacinis aktyvumas išliktų veiksmingumas.
3.4. Bičių pienelio antimikrobinio tyrimo rezultatai
Vertinant biologinį pienelio aktyvumą buvo atliktas antimikrobinis tyrimas. Bandymai vykdyti in vitro su grynu nepraskiestu lietuvišku bičių pieneliu. Kontrolei naudojant 1 proc. chlorheksidino gelį. Tyrimai vykdyti nustatant poveikį bičių pienelio gram neigiamoms Eschericia coli, Pseudomona aeruginosa ir gram teigiamoms bakterijoms Staphylococcus aureus, Enteroccucs faecalis.
Antimikrobinio tyrimo rezultatus būtų galima suskirstyti į kelis tipus. Lietuviškas bičių pienelis veikė taip: apie šulinėlius dalyje bandinių buvo didesnė ar mažesnė sterili zona, kurioje bakterijos visai neaugo. Tai vertintina, greičiausiai, kad nedideliame plote lietuviškas bičių pienelis veikė baktericidiškai. Pateikiant rezultatus bus nurodomas skersmuo ( ∅, mm) ir žodis „cidinis“ (nurodantis galimą poveikį).
Už vadinamos (menamos) „cidinės“ zonos buvo skirtingo skersmens (priklausomai nuo bakterijos padermės) zona, kurioje bakterijos augo, bet labai vangiai (jų kolonijos buvo labai smulkios, vos matomos). Toks veikimas laikytas bakteriostatiniu.
Palyginimui naudotas 1 proc. chlorheksidino gelis (1 % CHX ), tiriamoji medžiaga buvo neskietas bičių pienelis.
Iš 8 lentelėje pateiktų duomenų matyti, kad lietuviškas BP pasižymėjo stipresniu poveikiu klinikinei padermei lyginant su referentine. Lentelėje apačioje, galime matyti, kad S. aureus klinikinei padermė buvo veikiama tiek bakteriocidiškai, tiek bakteriostatiškai, o S. aureus referentinė padermei bičių pienelio poveikis buvo tik bakteriostatinis.
8 lentelė. Lietuviško bičių pienelio poveikis S. aureus Bakterijų padermės
S. aureus Kl. padermė N37g, MASA S. aureus Ref. padermė ATCC 25923 ∅, mm – statinis ∅, mm – cidinis ∅, mm – statinis ∅, mm – cidinis
14 9 12 -
16 9 13 -
16 12 12 -
17 12 12 -
15 11 10 -
17 10 8 -
14 11 10 -
Teig. kontrolė: 1 % CHX – ∅ 21 mm (cidinis) Teig. kontrolė: 1 % CHX – ∅ 24 mm (cidinis)
Bakterijos En. faecalis klinikinė bei referentinė paermės buvo paveiktos tiek baktericidiškai, tiek bakteriostatiškai. Iš šios lentėlės apačioje galime teigti, jog lietuviškas bičių pienelis puikiai pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš šias baterijų padermes. Bičių pienelis pasižymėjo bakterijos En. faecalis augimą slopinančių poveikiu (9 lentelė).
9 lentelė. Lietuviško bičių pienelio poveikis En. faecalis Bakterijų padermės
En. faecalis Kl. padermė 01 En. faecalis Ref. padermė ATCC 29212 ∅, mm – statinis ∅, mm – cidinis ∅, mm – statinis ∅, mm – cidinis
22 10 15 10 24 9 12 10 24 9 16 9 24 9 15 10 24 9 14 8 22 10 16 9 22 10 15 9 24 9 17 9
Teig. kontrolė: 1 % CHX – ∅ 24 mm (cidinis) Teig. kontrolė: 1 % CHX – ∅ 19 mm (cidinis)
Lietuviškas bičių pienelis prieš Ps. Aeruginosa klinikinę ir referentinę padermę pasižymėjo tik bakteriostatiniu poveikiu. Tai gali būti priežastis, kad ši bakterija yra gram neigiama, o tyrimais yra įrodyta, kad bičių pienelis pasižymi didesniu poveikiu gram teigiamoms bakterijoms [25]. 10 lentelėje galite matyti rezultatus gautus uždėjus neskiestą bičių pienelį ant šios bakterijos skirtingų padermių.
10 lentelė. Lietuviško bičių pienelio poveikis Ps. aeruginosa Bakterijų padermės
Ps. aeruginosa Kl. padermė 17–331 Ps. aeruginosa Ref. padermė ATCC 27853 ∅, mm – statinis ∅, mm – cidinis ∅, mm – statinis ∅, mm – cidinis
12 - 15 - 12 - 12 - 12 - 14 - 12 - 14 - 13 - 15 - 12 - 13 - 12 - 15 - 12 - 13 -
Teig. kontrolė: 1 % CHX – ∅ 20 mm (cidinis) Teig. kontrolė: 1 % CHX – ∅ 19 mm (cidinis)
Ta pati priežasti gali būti ir bičių pienelį uždėjus ant bakterijos E. coli. Ši bakterija yra taip pat gram neigiama. E. coli buvo pavekta tik bakteriostatiškai tik klinikinė padermė. Baktericidiniu poveikiu bičių pienelis prieš šią bakteriją nepasižymėjo (11 lentelė).
11 lentelė. Bičių pienelio poveikis E. coli tyrimo rezultatai Bakterijų padermės
E. coli Kl. padermė 18–15 E. coli Ref. padermė ATCC 25922 ∅, mm – statinis ∅, mm – cidinis ∅, mm – statinis ∅, mm – cidinis
20 - 16 - 19 - 17 - 22 - 15 - 20 - 18 - 19 - 17 - 19 - 14 - 20 - 15 - 22 - 17 -
Neskiestas bičių pienelis didžiausią baktericidinį poveikį turėjo S. aureus klinikinei padermei (sterilios zonos skersmuo 10,625 ± 1,2 mm, p<0,05). Labai panašiu bakteriocidiniu poveikiu pasižymėjo prieš bakteriją En. faecalis klinikinę bei referentinę padermes (sterilios zonos skersmuo 9,375 ± 0,5 mm, p<0,05ir 9,25 ± 0,7 mm, p<0,05). Kitų bakterijų neskiestas bičių pienelis bakteriocidiškai neveikė.
Bakterijos S. aureus klinikinę bei referentinę padermes veikė bakteriostatiškai (zona, kurioje augo bakterijos, bet labai vangiai yra 15,375 ± 1,2 mm, ir 11,25 ± 1,71 mm) galime matyti, kad klinikė padermė buvo labiau nuslopinta lyginant su referentine. En. faecalis klinikinės padermės bakteriostatinė zona buvo – 23,25 ± 1,01 mm, o referentinė – 15 ± 1,5 mm,. Vėl galime matyti, kad klinikė padermė buvo paveikta labiau nei referentinė. Vertinant Ps. aeruginosa bakteriostatinį povekį, rezultatai yra tokie: klinikinės padermės zona, kurioje bakterijos augo vangiai uždėjus bičių pienelio buvo 12,125 ± 0,35 mm, o referentinės 13,875 ± 1,1 mm. E. Coli bakterijų klinikinės ir referenitinės padermės buvo slopintos taip: klinikinė - 20,125 ± 1,2 mm, o referetinė - 16,125 ± 1,35 mm.
Atsižvelgiant į visus pateiktus rezultatus matoma, kad lietuviškas bičių pienelis pasižymi labiau bakteriostatiniu nei baktericidiniu poveikiu. Neskiestas lietuviškas bičių pienelis slopina klinikinės padermės bakterijas stipriau lyginant su referentinės padermės išskyrus Ps. aeruginosa bakterijų atveju kuomet neskiestas bičių pienelis labiau slopino referentinės padermės bakteriją nei klinikinės. Tačiau lietuviško bičių pienelio baktericidinis poveikis buvo statistiškai reikšmingai mažesnis (p<0,05) lyginant su kontrole 1 proc. CHX. Gauti rezultatai panašūs su kitų mokslininkų paskelbtais duomenimis. Lietuviškas bičių pienelis poveikis panašus su kitų mokslininkų tirtų bičių pieneliais [18, 19, 21 , 22, 25].
3.5. 10-HDA ir bičių pienelio poveikis ląstelių gyvybingumui nustatant MTT
metodu
Eksperimentų serijose buvo naudojamas 10-HDA ir lietuviškas bičių pienelis. Buvo norima nustatyti, kaip šios medžiagos veikia C6 vėžinių ląstelių kultūros gyvybingumą. Gyvybingumo tyrimai atlikti MTT metodu. Rezultatai pateikti 14 ir 15 paveikslėlyje matuojant ląstelių gyvybingumą po 24 valandų.
Paveikslėlyje apačioje (14 pav.), galite matyti kaip bičių pienelis paveikė C6 ląsteles. Poveikis buvo lyginimas su kontrole t. y. etanoliu 96%.
100.00 98.41 94.58 83.02 77.09 71.64 67.46 61.80 57.31 53.12 52.12 51.40 50.44 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ląs te lių g yv yb in gu m as p ro c. Koncentracija µg/ml
14 pav. Lietuviško bičių pienelio poveikis C6 ląstelių gyvybingumui, nustatytam MTT metodu
14 paveikslėlyje matyti, kad ląsteles paveikus lietuvišku BP 0,1 ir 0,5 µg/ml koncentracija gyvybingumo sumažėjimas beveik nepastebimas. Toliau tesiant eksperimentus su 1 µg/ml, ląstelių gyvybingumas lyginant kontrole sumažėjo 17,98 procentų. Nustatyta, kad šis ląstelių gyvybingumo sumažėjimas yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Naudojant 20 µg/µl koncentraciją, gyvybingų ląstelių lieka tik 50,44 procentų, tačiau paveikslėlyje galima pastebėti, kad naudojant koncentracijas nuo 12 iki 20 µg/µl ląstelių gyvybingumo sumažėjimą matome panašų apie 50 proc.
10-HDA poveikis C6 ląstelių gyvybingumui yra pateiktas 15 pav. Iki tam tikros koncentracijos, ląstelių gyvybingmas nemažėjo. 0,01 ir 0,05 µg/ml 10-HDA koncetracijos buvo per mažos, kad C6 ląsteles paveiktų citotoksiškai. Uždėjus koncentraciją 0,5 µg/ml jau buvo matomas ląstelių gyvybingumo sumažėjimas 4,6 procentų. Ši koncentracija, buvo mažiausia, kuri pradėjo veikti C6 ląsteles citotoksiškai. Koncentraciją didinant iki 10 µg/µl gyvybingumas sumažėjo 38,4 procentų lyginant su kontrole t.y. H2O.
Ląstelių gyvybingumo statistiškai reikšmingas (p<0,05) sumažėjimas buvo nustatytas, kai buvo naudojama 5 µg/µl 10-HDA koncentrija, ląstelių gyvybingumas sumažėjo 26,6 procento.
15 pav. 10-HDA poveikis C6 ląstelių gyvybigumui, nustatytam MTT metodu
Apskaičiuotas lietuviško bičių pienelyje esančios 10-HDA kiekis, sumažinantis ląstelių gyvybingumą ~40% procentų lyginant su kontrole yra – 0,152 µg/ml. Tai yra mažesnis kiekis nei vykdant tyrimus su gryna 10-HDA. Galima daryti prielaidą, kad lietuviško bičių pienelio sudėtyje esančios kitos medžiagos taip pat veikia ląstelių gyvybingumą.
Mokslinėje literatūroje nepavyko rasti duomenų apie bičių pienelio poveikį šioms C6 vėžinėms ląstelėms išgautoms iš žiūrkių smegenų auglio.
100 113.8 117.8 107.2 95.4 88.2 73.4 61.6 0 20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 5 6 7 8 Ląs te lių g yv yb in gu m as p ro c. Koncentracija µg/ml Kontrolė 0,01 0,05 0,1 0,5 1 5 10
4. IŠVADOS
1. Ištyrus lietuviško bičių pienelio fizikines savybes buvo nustatyta, kad bičių pieneliui yra būdinga gelsva spalva, klampi konsistencija. Tyrimo rezultatai parodė, kad lietuviškas BP pasižymi rūgštinėmis savybėmis, o didinant temperatūrą klampa mažėja, nes struktūra silpnėja.
2. Pritaikytas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas 10-HDA nustatymui lietuviškame bičių pienelyje ir atlika validacija, pagal kurią buvo nustatyta, kad 1-ame mg lietuviško bičių pienelio yra ~22 µg 10-HDA.
3. Ištyrus bičių pienelio antimikrobinį aktyvumą buvo gauta, kad bičių pienelis yra efektyvus prieš gram neigiamas Eschericia coli, Pseudomona aeruginosa ir gram teigiamas Staphylococcus aureus, Enteroccucs faecalis bakterijas. Didesnis antimikrobinis aktyvumas pastebėtas prieš gramteigiamas bakterijas, nes nustatytas baktericidinis poveikis.
4. Atlikus antioksidacinį tyrimą su skirtingais metais gautu lietuvišku bičių pieneliu buvo pastebėta, kad šviežesnis lietuviškas bičių pienelis pasižymi didesniu antioksidaciniu poveikiu. Kartotinis pienelio naudojimas atšlidant ir vėl užšaldant pasireiškia antioksidacinio poveikio sumažėjimu, nes bičių pienelis yra termolabilus.
5. Atlikus tyrimus su C6 ląstelių gyvybingumu buvo įvertinta, kad lietuviškas bičių pienelis ir 10-HDA turi įtakos vėžinių ląstelių gyvybingumo sumažėjimui. Tyrimo rezultatai parodė, kad vėžinių ląstelių įtakos turėjo ir kitos lietuviško bičių pienelyje esančios medžiagos, nes lietuviškas BP slopino stipriau ląstelių gyvybingumą lyginant tik su 10-HDA tirpalu.
5. REKOMENDACIJOS
Lietuviškas bičių pienelis yra perspektyvi veiklioji medžiaga, kuri gali būti naudojama preparatuose pasižyminčiuose antimikrobiniu, antioksidaciniu bei priešvėžiniu poveikiu. Tikslinga pratęsti tolimesnius tyrimus su lietuvišku BP atliekant ląstelių gyvybingumo vertinimą taikant propidžio jodido/Hoechst 33528 metodą, kuris leistų papildomai įvertinti lietuviško bičių pienelio poveikį ląstelių gyvybingumui fluorescencinės mikroskopijos metodu. Tyrimo rezultatai parodė, kad biologinį lietuviško BP poveikį lemia ne tik 10-HDA, bet galimai ir kitos medžiagos, todėl tikslinga išsamiau analizuoti bičių pienelio cheminę sudėtį ir nustatyti kitų komponentų biologinį poveikį
6. PUBLIKACIJOS DARBO TEMA
1. Vitkauskas M., Ramanauskienė K. Lithuanian Royal jelly quality and stability researches The 8th International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practice. 2017, Kaunas. Publikuotos tezės ir stendinis pranešimas.
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Cornara, Laura, Marco Biagi, Jianbo Xiao, and runo Burlando. „Therapeutic Properties of Bioactive Compounds from Different Honeybee Products“. Frontiers in Pharmacology, 2017; 8.
2. Popescu Olimpia, Marghitas L. AL. DD. „A study about physicochemical composition of fresh and lyophilized Royal Jelly”. Zootehnie şi Biotehnologii, 2008; 41: 328–32.
3. Garcia-Amoedo LH, Almeida-Muradian LB. „Physicochemical composition of pure and adulterated Rojal Jelly”. Quim. Nova 2007; 30: 257–9.
4. Ramadan MF, Al-Ghamdi A. „Bioactive compounds and health-promoting properties of royal jelly: A review”. Journal of Functional Foods 2012; 4: 39–52.
5. Bărnuţiu I L, Al L, Dezmirean DS, Mihai CM, Bobi O. „Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Royal Jelly – Review”. Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies, 2011; 44. 6. Stefan Bogdanov. „Royal Jelly, Bee Brood: Composition Health, Medicine: A Review”.
http://www.bee-hexagon.net/files/file/fileE/Health/RJBookReview.pdf
7. Sabatini AG. „Quality and standardisation of Royal Jelly”. Journal of ApiProduct and ApiMedical Science 2009; 1: 16–21.
8. Pavel I, Al L, Bobi O, Dezmirean DS, Agripina Ş, Radoi I. „Biological Activities of Royal Jelly – Review”. Animal Sciences and Biotechnologies, 2011; 44.
9. Fahad M. Alreshoodi and Yasmina Sultanbawa. „Antimicrobial Activity of Royal Jelly”. Anti-Infective Agents, 2015; 13: 50-59
10. Dr. Mohamad Yosof Rezk “A comparative study on the effect of Royal jelly on blood glucose and serum lipids in streptozotocin induced diabetic rats”. European Journal of Pharmaceutical and Medical Research. 2017; 4 (4): 39-44.
11. Mukthi Thammana. „A Review on High Performance Liquid Chromatography (HPLC)”. Research & Reviews: Journal of Pharmaceutical Analysis, 2016, 5 (2).
12. Arsenault, Joseph C., and Patrick D. McDonald. „Begginers Guide to Liquid Chromatography“. Elstree: Waters, 2014; 20-23.
13. Garcia Amoedo, Luis Henrique, and Ligia Bicudo De Almeida-Muradian. „Determination of Trans-10-hydroxy-2-decenoic Acid (10-HDA) in Royal Jelly from Sao Pau State, Brazil“. Ciencia E Tecnologia De Alimentos, 2003; 23: 62-65.
14. Liu, Je-Ruei, et al. „Antioxidant Properties of Royal Jelly Associated with Larval Age and Time of
