LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Greta Norgailaitė
Kuilių spermos kokybės tyrimai
Analysis of boar semen quality
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. Neringa Sutkevičienė
2 DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kuilių spermos kokybės tyrimai“. 1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KLINIKOJE
(aprobacijos data) (Klinikos vedėjo vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai: 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3 TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 ĮVADAS ... 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8
1.1. KUILIŲ SPERMATOZOIDŲ KOKYBĖS RODIKLIAI ... 9
1.1.1. Spermatozoidų morfologija ... 9
1.1.2. Spermatozoidų koncentracija. ... 10
1.1.3. Spermatozoidų judrumas ... 10
1.1.4. Spermatozoidų patologijos. ... 10
1.2. VEIKSNIAI, ĮTAKOJANTYS KUILIŲ SPERMOS KOKYBĘ ... 12
1.2.1. Kuilių laikymo sąlygos. ... 12
1.2.2. Pašarų kokybė ... 12
1.2.3. Kuilių veislė. ... 13
1.2.4. Kuilių amžius. ... 13
1.2.5. Spermos ėmimo sezoniškumas. ... 14
1.2.6. Spermos ėmimo intervalas... 15
1.2.7. Skiediklio pasirinkimas. ... 15
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA... 17
3. TYRIMO REZULTATAI... 20
3.1. Spermatozoidų judrumas ... 20
3.2. Spermatozoidų koncentracija ... 21
3.3. Spermatozoidų morfologiniai pokyčiai ... 23
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32
5. IŠVADOS ... 34
4 KUILIŲ SPERMOS KOKYBĖS TYRIMAI
Greta Norgailaitė Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Šio darbo tikslas buvo išanalizuoti skiestą atvėsintą kuilių spermą ir jos kokybę trijuose skirtinguose ūkiuose.
Darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Ištirta 60 skiestos atvėsintos kuilių spermos dozių.
Laboratorijoje buvo vertinama spermatozoidų koncentracija ir spermos kokybė. Buvo vertinamas pradinis spermatozoidų judrumas, tik gavus spermos dozes ir po 72 val. inkubacijos 16 ± 0,5 oC
temperatūroje. Spermatozoidų koncentracija nustatyta NewBauer kameroje. Patologinių spermatozoidų galvutės vertinamos, nudažius spermatozoidus Anilino mėlynojo dažais. Patologinių spermatozoidų uodegėlių vertinimui naudojamas buferinio formalino tirpalas. Apskaičiuojamas kiekvienos patologijos procentas.
Tyrimo metu didžiausias spermatozoidų judrumas buvo nustatytas šviežioje B ūkio kuilių spermos dozėje, t.y.74,5 ± 5,89 proc. Didžiausia spermatozoidų koncentracija dozėje buvo iš C ūkio 3,76 ± 1,05 mlrd., o judrių spermatozoidų koncentracija dozėje didžiausia buvo B ūkio 2,7 ± 0,85 mlrd. Didžiausias bendras spermatozoidų patologijų skaičius nustatytas C ūkio dozėje 9,59 ± 4,24 proc. Daugiausiai uodegėlių patologijų buvo nustatyta C ūkio dozėje 7,1 ± 5,18 proc., daugiausiai galvučių patologijų nustatyta C ūkio dozėje 2,5 ± 0,89 proc. C ūkyje patologinių galvučių spermos mėginyje buvo 0,8 ± 0,18 proc. daugiau už A ūkio (p<0,05) ir 0,46 ± 0,4 proc. daugiau už B ūkio (p<0,05) mėginyje rastų galvučių patologijų. B ūkio spermos dozėje patologinių spermatozoidų buvo 0,34 ± 0,22 proc. (p<0,05) daugiau už patologijas, esančias A ūkio spermos dozėse.
5 ANALYSIS OF BOAR SEMEN QUALITY
Greta Norgailaitė Master‘s Thesis
SUMMARY
The goal of this thesis is to analyse the diluted, cooled boar semen and its quality in three different farms.
The thesis has been carried out in the Veterinary Academy’s Animal Reproduction Laboratory of Lithuanian University of Health Sciences. It has been researched 60 samples of diluted, cooled boar semen.
There has been analysed the concentration and the quality of semen in the laboratory. At first, the initial motility of spermatozoa has been analysed in the primary semen samples and later in the samples that have been kept in 16±0.5 oC temperature for 72 hours. The sperm concentration has been assessed using a NewBauer counting chamber. Pathological sperm heads have been evaluated using aniline blue staining. Pathological sperm tails have been evaluated using formolsaline bufferdehyde. The percentage of every pathology has been calculated.
During the research the highest semen motility has been estimated in a fresh sample of boar semen from the farm B, it was 74.5 ± 5.89 %. The biggest concentration of semen has been estimated in the sample from the farm C - 3.76 ± 1.05 billion, but the biggest concentration of motile spermatozoa has been found in the sample from the farm B, 2.7 ± 0.85 billion.The biggest common number of semen pathologies have been estimated in the sample from farm C and it was 9.59 ± 4.24%. The biggest number of semen tail pathologies has been found in the sample from the farm C and it was 7.1 ± 5.18%, and the biggest number of semen head pathologies have been estimated in the sample from the farm C 2.5 ±0.89%. It has been found that the number of pathological semen heads in one sample taken from the farm C is bigger for 0.8 ± 0.18% than in the farm A (p<0.05), and that it is bigger for 0.46 ± 0.4% than in the sample of the farm B (p<0.05). The number of pathological sperm in the sample of the farm B has been bigger for 0.34 ± 0.22% (p<0.05) than in the semen samples taken in the farm A.
6
SANTRUMPOS
AI - Dirbtinis apvaisinimas.
Judr_0 - pradinis spermatozoidų judrumas. Judr_72 - spermatozoidų judrumas po 72 val. K - spermatozoidų kiekis mililitre.
S - spermatozoidų skaičius 80-tyje mažų kvadratų. Pr - spermtozoidų praskiedimo laipsnis.
SK - spermatozoidų koncentracija spermos dozėje. SKJ - judrių spermatozoidų koncentracija dozėje. UTJ - uterotubalinė sankryža.
PMN - Polimorfonuklearinių neutrofilų. PUFA - n-3 polinesočiosios riebalų rūgštys. Se - Selenas.
GPx - glutationo peroksidazės. SP - sėklinės plazmos.
ST - trumpalaikis skiediklis.. MT - vidutinės trukmės skiediklis. LT - ilgalaikis skiediklis.
ĮVADAS
Per pastaruosius dešimtmečius labai padidėjo kiaulių spermos naudojimas dirbtiniam apvaisinimui (1, 2). Palyginus su natūraliu poravimusi, dirbtinis apvaisinimas sumažina ligų perdavimo riziką,
7 paršavedės apvaisinamos geresnės genetikos sėkla (3, 4). Todėl šalyse, kuriose labai dideli kiaulių laikymo kiekiai, yra atliekamas dirbtinis sėklinimas. Net du dešimtmečius vakarų Europoje dirbtinio sėklinimo apimtys siekė 90 proc. (1, 2). Sperma gaunama iš specialių dirbtinio apvaisinimo centrų. Tačiau dar yra ūkių, kurie tai atlieka fermoje. Įmonės, kurios prekiauja sperma, gali pasiūlyti įvairių veislių ir geresnės genetinės linijos kuilių spermą. Perkant spermą, ji jau būna paruošta tam tikromis dozėmis su užtikrinta kokybe. Norint gauti maksimalų produktyvumą, vien geros kokybės spermos neužtenka, didelis dėmesys turi būti skiriamas ir išoriniams veiksniams.
Kuilių spermatozoidų kokybės tyrimai ir jų analizavimas turi labai didelę reikšmę augintojams. Kuilio spermatozoidų kokybė apsprendžia visos bandos reprodukcines savybes, nes vieno kuilio sperma yra panaudojama daugumai patelių. Remiantis Robinson ir Buhr duomenimis, spermos kokybė priklauso nuo sugebėjimo tam tikru laikotarpiu gaminti spermą (5). Tyrimai rodo, kad spermos kokybė priklauso nuo kuilio veislės, sėklidžių dydžio, mitybos, amžiaus, spermos ėmimo intervalo, sezono, laikymo sąlygų, libido ir t.t. (6).
Labai svarbu kuo anksčiau atrinkti tinkamus kuilius spermos panaudojimui, taip sumažinant išlaidas netinkamų auginimui (7). Suprastėjus kuilio spermos kokybei, kurį laiką iš jo sperma nėra imama ir leidžiama atsikvėpti, tačiau jei spermos kokybė nepagerėja, toks kuilys tolimesniame veisime nedalyvauja. Todėl yra labai svarbu periodiškai atlikti kuilių spermos kokybės tyrimus, kad kuo sėkmingiau būtų išnaudota kokybiška ir genetiškai vertinga sperma.
Darbo tikslas: Atlikti skiestos atvėsintos kuilių spermos kokybės tyrimus trijuose skirtinguose ūkiuose. Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti kuilių spermatozoidų judrumą ir jo kitimą per 72 val. 2. Įvertinti kuilių spermatozoidų koncentraciją spermos dozėse. 3. Įvertinti kuilių spermatozoidų morfologiją spermos dozėse.
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
Pažanga ir didėjantis dirbtinio apvaisinimo poreikis skatina vis daugiau domėtis ir tirti spermos kokybę (8). Įvairių veislių kuiliai ejakuliuoja skirtingo tūrio, koncentracijos, judrumo spermatozoidus (9). Norint patekti į kiaušialąstę ir ją apvaisinti, yra svarbu, jog kuilio spermatozoidas būtų normalus, nepatologinis (10, 11). Pagrindinis vaisingumo įvertinimas – morfologinis tyrimas (12).
Spermatozoidai yra specializuotos ląstelės, kurių funkcija yra apvaisinti kiaušialąstę. Spermatozoidai turi galvutę, viduriniąją dalį ir uodegėlę. Spermatozoidą dengia plazminė membrana, palaikanti homeostazę, kuri dalyvauja medžiagų apykaitoje: prisitvirtinime ir prasiskverbime į kiaušialąstę. Spermatozoido galvutėje yra kuilio genetinė informacija, kuri perduodama kiaušialąstei apsvaisinimo metu. Galvutės priekį dengia akrosoma, kuri apvaisinimo metu tirpdo kiaušialąstės skaidrųjį dangalą. Mitochondrijos yra išsidėsčiusios spiraliniu būdu aplink išilginius uodegos pluoštus ir yra energijos šaltinis, reikalingas spermatozoidų judrumui. (13).
Neaišku, kaip ir kodėl kai kurie konkretūs spermatozoidai pasiekia oocitą gimdoje. Iš milijardų spermatozoidų tik tūkstančiai pasiekia uterotubalinę sankryžą (UTJ) ir uodeginę sąsmauką (14). Polimorfonuklearinių neutrofilų (PMN) antplūdis ir retrogradinis srautas (atgalinis srautas) po apvaisinimo yra du pagrindiniai žinomi mechanizmai, kuriais spermatozoidai pašalinami iš lytinių takų. Nėra aišku, kurie spermatozoidai yra parenkami, tačiau akivaizdu, kad patelių reprodukcinė sistema ir pačios spermos savybės yra susijusios su natūraliu spermos selekcijos procesu, apvaisinant kiaušialąstę (15).
Kuilio pasirinkimas sėklinimui priklauso nuo jo anatomijos - abi sėklidės turi būti visiškai nusileidusios į kapšelį. Vienos ar abiejų sėklidžių nebuvimas kapšelyje rodo kriptorchidizmą - paveldimą būklę, dėl kurios turėtų būti užkirstas kelias tolesniam kuilio panaudojimui veisimo programose. Spermos gamyba tiesiogiai koreliuoja su Sertoli ląstelių skaičiumi sėklidėse. Sertoli ląstelių dauginimasis vyksta po gimimo, dviem skirtingomis fazėmis. Pradinė proliferacijos fazė prasideda nuo gimimo ir tęsiasi iki 1 mėnesio amžiaus, antroji ir paskutinė fazė vyksta 3-4 mėnesių amžiaus (16). Brendimas yra laikinas šerno lytinio brendimo etapas, kurio metu vyksta ryškūs anatominiai ir fiziologiniai pokyčiai. Šiuos pokyčius tiesiogiai veikia steroidų (t.y. androgenų) gamyba, kuri pirmiausia kyla iš sėklidėse esančių leidigo ląstelių (16).
Šiuo metu pagal VĮ Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro duomenis 2020-01-07, Lietuvoje yra laikoma 541,370 kiaulių, iš viso 96,88 bandų (17).
9
1.1.
KUILIŲ SPERMATOZOIDŲ KOKYBĖS RODIKLIAI
Norint nustatyti, kokie spermos bruožai daro įtaką kuilių vaisingumui, reikia suprasti, kaip atranka veikia spermos kokybę (18). Spermos morfologija yra vienas iš įprastų spermos tyrimų. Spermatozoidai, esantys sėklidėse, turi proksimalinį citoplazminį lašelį (už kaklo), kuris prieš patekdamas į galutinę brendimo vietą (cauda epididymis) - perkeliamas į distalinę padėtį. Tai, kad mažas skirtingų rūšių ejakuliacijos spermatozoidų procentas turi lašelius, rodo, kad jie pašalinami ejakuliacijos metu (19). Taigi, spermos citoplazmos lašelių (proksimalinių ar distalinių) buvimas ejakuliate paprastai laikomas žalingu spermos požymiu ir rodo: sumažėjusį galimą vaisingumą, spermos plazmos membranos pokyčius, arba sumažėjęs gebėjimas sąveikauti su patelių kiaušintakio epiteliu (20). Be to, anomalijos taip pat neleidžia spermatozoidams dalyvauti apvaisinime (21).
Iš anksto pasirenkant patinus ar ejakuliatus, ne tik pagerėja apvaisinimo dažnis, bet taip pat padidinamas ūkininko ekonominis pelnas. Spermos kokybė tik iš dalies atspindi vaisingumo rezultatus (22). Svarbi ne tik spermos sąveika su oocitu, bet ir patelių lytinių takų, bei spermos ląstelių ir embrionų sąveika. Išankstinis geros kokybės ejakuliato pasirinkimas sumažina spermos savybių kitimą ir apsunkina reikšmingos koreliacijos su vėlesniu vaisingumu, nustatymą. Veislės rezultatams didelę įtaką daro paršavedės ir techninė kompetencija, kurios veiksniai susiję su optimaliu rujos aptikimu ir sėklinimo laiku (23). Galiausiai pagrindinis vaidmuo tenka spermos savybių įvertinimo metodui (24).
1.1.1. Spermatozoidų morfologija
Pagrindinis indėlis į sėkmingą dirbtinį apvaisinimą yra aukštos kokybės spermos naudojimas sėklinant. Reguliarus spermos kokybės vertinimas yra standartinis procesas gyvulininkystės pramonėje (25). Atliekant bendrą kuilių spermos analizę, spermos kokybė laikoma normalia, jei nenormalių spermatozoidų galvučių dažnis neviršija 10 proc. Normalumas taip pat gali būti prielaida - jei akrosomų, vidurinių dalių, uodegų ar proksimalinių citoplazminių lašelių anomalijų dažnis yra mažesnis nei 5 proc. arba 15 proc. skaičiuojat visus bendrai. Nors kai kurios anomalijos, tokios kaip distalinių citoplazminių lašelių buvimas, laikomos nereikšmingomis vertinant vaisingumą, kitos anomalijos laikomos rimtais defektais, dėl kurių sutrinka apvaisinimo galia ir gali sukelti nevaisingumą. Kai kurie iš jų yra sutrumpėję spermatozoidai: akrosominiai defektai, branduolio defektai, vakuolės, trumpos uodegos, susisukusios uodegos ir susisukusios vidurio dalyje uodegos (26).
Spermos tyrimas yra pagrindas, norint numatyti vaisingumo rodiklius - visų gyvų ir negyvų spermatozoidų skaičių. Tiriami spermos rodikliai yra spermatozoidų skaičius, spermos tūris, spermos koncentracija, spermos judrumas ir spermos patologijos. Spermatozoidų skaičius turi svarbų vaidmenį apvaisinant (27).
10 1.1.2. Spermatozoidų koncentracija.
Spermos koncentracija yra svarbus spermos kokybės rodiklis, kuris atspindi pradinę laikymo technologiją, leidžiantis nustatyti atskiedimo lygį. Norėdami nustatyti spermatozoidų skaičių, dabartinėje praktikoje naudojami šie metodai: hemocitometrinis metodas, spektrofotometrinis metodas, spermiodensimetrinis metodas (Karras), kompiuterinis metodas (28).
Apvaisinimo procesui svarbus spermatozoidų skaičius spermos dozėje. Dirbtinio apvaisinimo centrai linkę kiek įmanoma labiau praskiesti ejakuliatus, kad spermos dozė būtų kuo didesnė. Spermatozoidų skaičiaus kitimas ejakuliate aprašytas tarp skirtingų kiaulių veislių, (29), kuris yra pirmasis faktorius, turintis įtakos spermos dozės gamybai. Spermos koncentracijai įtakos turi ne tik spermatozoidų skaičiaus, bet ir spermos kiekio skirtumai, svyruojantys nuo 100 iki 300 ml (30).
Morfologiją galima įvertinti naudojant dažymo metodus, kuriems nereikia aukštos kvalifikacijos darbuotojų (31). Normali morfologija yra susijusi su vaisingumu (24, 32), todėl turėtų būti atliekama reguliariai kiaulių dirbtinio apvaisinimo centruose (33).
1.1.3. Spermatozoidų judrumas
Vienas iš dažniausiai naudojamų kuilių spermos kokybės analizės parametrų yra judrumo tyrimas. Dar prieš keletą metų kuilių spermos judrumas buvo sunkiai nustatomas, nes šių ląstelių judėjimo charakteristikos apsunkina tikslų subjektyvų mėginių įvertinimą (34). Kompiuterinės spermos judrumo analizės (CASA) sistemų atsiradimas labai padėjo įveikti šią problemą, nes tai suteikia objektyvų ir tikslų mėginio judėjimo charakteristikos nustatymą. Norint, kad judrumas būtų nustatytas objektyviai, svarbu, tai laikyti funkciniu bandymu, nes didelė spermatozoidų energijos dalis yra skirta judrumui palaikyti (35).
Spermatozoidų judrumas visada buvo laikomas pagrindiniu kiaušialastės apvaisinimo reikalavimu. Nors spermatozoidai į apvaisinimo vietą patenka daugiausia dėl gimdos susitraukimų (36), spermatozoidų judrumas reikalingas prasiskverbti į zoną pellucida. Žinoma, kad judrumas yra svarbi savybė, prognozuojant ejakuliato apvaisinimo potencialą (22).
Spermos judrumas yra svarbus spermos kokybės vertinimo rodiklis, nes tai reiškia aktyvią medžiagų apykaitą, membranų vientisumą ir teigiamai koreliuoja su apvaisinimo pajėgumais (37).
1.1.4. Spermatozoidų patologijos.
Tiriant spermatozoidų išvaizdą mikroskopu, galima gauti informacijos apie morfologines anomalijas, ląstelių membranos vientisumą ir akrosomą. Tai trys svarbiausi parametrai, kurie prisideda prie spermatozoidų apvaisinimo pajėgumo. Morfologiniai nukrypimai rodo spermatogenezės proceso
11 sutrikimus. Kai kurie apsigimimai pažeidžia ląstelių funkciją ir trukdo apvaisinimo gebą, kuriai sutrikus, jos negalima konpensuoti ar pakeisti. Nenormali galvos forma, kurioje yra genetinė medžiaga, arba mitochondrijų anomalijos, svarbios flagelos funkcijai, vadinamos pirminėmis anomalijomis. Citoplazmos likučiai, proksimaliniai ar distaliniai lašeliai ir mažos uodegos - tai anomalijos vadinamos, antrinėmis, ir jas galima kompensuoti spermos doze (33). Be to, morfologinės anomalijos (pvz., susisukusios uodegėlės), atsiradusios netinkamai tvarkant spermą, vadinamos tretinėmis anomalijomis. Didžiausių pirminių ir antrinių anomalijų procentinės vertės kriterijai komerciniuose kiaulių AI centruose buvo nustatyti atitinkamai 10 proc. ir 20 proc. (31). Normalios morfologijos spermatozoidų procentas turėtų būti bent 70 proc. (31).
Kiaulių spermos naudojimo dirbtiniam apvaisinimui kriterijų apžvalga pateikta 1 lentelėje. (1)
1 Lentelė. Kiaulių spermos dirbtiniam apvaisinimui reikalavimai.
Spermos parametrai Reikalavimas (proc.)
Kuster and Althouse, 1999 Martin-Rillo et al., 1996 Shipley, 1999 Britt et al., 1999 Judrumas > 70 60-100 > 70 >60 Nenormali morfologija < 20 - < 20 - Normalios akrosomos - <10 - - Citoplazmos lašeliai < 15 - < 15 - Proksimaliniai lašeliai - 0-20 - <20 Distaliniai lašeliai - 0-30 - - Susisukusios uodegėlės - <5 - - Pirminės anomalijos - - - <10 Antrinės anomalijos - - - <20
12
1.2.
VEIKSNIAI, ĮTAKOJANTYS KUILIŲ SPERMOS KOKYBĘ
1.2.1. Kuilių laikymo sąlygos.
Remiantis Europos teisės aktais (Komisijos direktyva 2001/93 / EB), laikant kuilius turi būti ne mažiau kaip 6 m2 kieto grindų ploto vienam kuiliui. Vieta turi būti tokia, kad kuilys galėtų apsisukti,
girdėti, užuosti ir matyti kitus kuilius. Netinkamas laikymas gali pakenkti kuilių sveikatai ir netiesiogiai paveikti spermos kokybę dėl bakterijų užteršimo. Prieš spermos surinkimą kuiliai turi būti švarūs - svarbiausia pilvas, kad būtų išvengta bakterijų užteršimo ejakuliate (38). Jaunų kuilių laikymas taip pat turi įtakos spermos gamybai. Įrodyta, kad grupinis kuilių laikymas ir auginimas yra naudingas vėlesnei reprodukcijai. Kuiliai, laikomi palaidai ir kartu su kitais kuiliais, pasižymi stipresnėmis kojomis, didesniu lytiniu potraukiu, didesniu spermatozoidų skaičiumi nei kuiliai, laikomi atskirai (39).
Šviesos ir tamsos periodai taip pat turi poveikį spermos kokybei. Laikant kuilius natūralioje šviesoje, papildomai palaikant dirbtinę, 15 valandų per dieną šviesą (10–500 lx) - nuo 11 savaičių amžiaus iki brendimo (24–26 savaitės) - lytinis brendimas buvo greitesnis ir libido buvo aukštesnis nei kuilių, gaunančių tik natūralią šviesą tuo laikotarpiu (40). Šviesos ekspozicijos ilgis turi įtakos spermos kokybei ekstremaliomis sąlygomis. Naujesnis tyrimas parodė (suaugę kuiliai buvo veikiami 24 valandas dirbtinės šviesos arba 24 val visiškos tamsos 3 mėnesių laikotarpiui), jog šie kraštutiniai režimai turėjo neigiamos įtakos spermos kiekiui ir koncentracijai, ypač kai kuliai buvo laikomi visiškoje tamsoje (41). Šiluma taip pat turi įtakos kuilių spermos kokybei. Kuiliai, veikiami 34,5°C temperatūros, 8 valandas ir 31,0°C, 16 valandų kasdien - 90 dienų iš eilės sumažino spermatozoidų judrumą ir jų apvaisinimo galią, palyginti su kontroliniais kuiliais, laikomais 23,0°C (42). Be to, ne tik pastovus šilumos palaikymas, bet ir didesni nei 10°C (25–35°C) temperatūros svyravimai tarp dienos ir nakties bei drėgmei esant virš 90 proc. gali sumažinti spermos gamybą (6).
1.2.2. Pašarų kokybė
Kalbant apie pašarų ir energijos suvartojimą, baltymų trūkumas racione turi įtakos kuilių libido ir spermos kiekiui, tačiau neturi įtakos spermos kokybei (43). Kuiliai, maitinami dietiniais pašarais, ir esant žemam baltymų kiekiui (13 proc.), padidino treonino, triptofano ir arginino baltymų kiekį, pagerindami kuilių spermos kokybę (44). Daugybė tyrimų ypač didelį dėmesį skyrė skirtingiems pašarų papildams kuilių pašaruose. Buvo atkreiptas ypatingas dėmesys antioksidantams, nes manoma, kad tai viena pagrindinių priežasčių, pažeidžiančių spermą, dėl kurių sulaikomi skysčiai ir vyksta spermos membranos lipidų peroksidacija. Skirtingi tyrimai parodė, kad spermos lipidų sudėtį galima modifikuoti pašarų papildais, n-3 polinesočiosiomis riebalų rūgštimis (PUFA). Vieno tyrimo metu tuno aliejaus papildas (30
13 g tuno aliejaus / kg dietos) per 6 savaites pagerino spermatozoidų judrumą, akrosomų vientisumą ir morfologiją. Selenas (Se) pasižymi antioksidacinėmis savybėmis - kaip glutationo peroksidazės (GPx) struktūrinis komponentas, fermentas, esantis kuilių spermoje, apsaugantis ląstelių ir membranas nuo peroksidacijos. Papildoma bazinė dieta (kurioje yra 0,06 ppm Se su 0,5 ppm Se nuo nujunkymo iki 9 mėnesių amžiaus) sukėlė didesnį spermatozoidų judrumą ir sumažino nenormalių spermatozoidų kiekį. Pastarajame tyrime buvo pastebėtas didesnis vaisingumo rodiklis. Suaugusiųjų racione keičiant neorganinį Se į organinį, spermos koncentracija padidėjo, bet sumažėjo judrumas ir atsparumas oksidaciniam stresui (45).
1.2.3. Kuilių veislė.
Tinkamas kuilių pasirinkimas yra labai svarbus. Tik geriausią spermos kokybę turintys kuiliai yra saugomi veisimui. Jei atranka atliekama pagal spermos kokybę, ji turi būti pasirinkta atsižvelgiant į tai, kad jaunesnių nei 8 mėnesių kuilių spermos kokybė yra mažesnė nei vyresnių kuilių (7). Todėl jaunų kuilių spermos kokybė gali būti klaidinanti. Tinkamai atrankai atlikti tenka laukti 8 mėnesius, o tai sumažina genetinio tobulėjimo greitį. Veisiant kuilius, sperma naudojama iš genetinių linijų, nes tai duoda gerus palikuonius mėsos gamybos potencialui. Pasirinkus ir veisiant kuilius, turinčius greitesnį augimo greitį, galimas neigiamas poveikis spermos kokybei (5,46). Taip pat buvo įrodyta, kad pasirinktas kuilių ovuliacijos dažnis ir gimdos pajėgumas sukuria daugiau spermatozoidų, palyginti su neatrinktomis linijomis. Be to, Pietrėnų ir Diurokų kuilių spermatozoidų skaičius yra mažesnis nei vokiečių vietinių, didžiųjų, baltųjų ir Jorkšyrų (7). Tame pačiame tyrime pastebėti tam tikri veislių skirtumai dėl judrumo ir morfologijos, tačiau skirtumai buvo nedideli. Atrodo, labiau tikėtina, kad individualūs pokyčiai gali viršyti veislės skirtumus (47). Per ilgą laiką buvo surinkta ir įvertinta daugybė skirtingų grynaveislių populiacijų kuilių ejakuliatų. Šių išsamių tyrimų duomenys rodo, kad Didžiojo baltojo kuilio sėklos tūris yra didžiausias, po to seka kitos veislės tokia eilės tvarka: Jorkšyras, Čekijos landrasas ir Čekijos didysis baltasis, Pietrėnas, Čekijos mėsinė kiaulė, Hempšyrai ir Diurokų kuiliai. Apskaičiuotas veislių variacijos koeficientas spermos kiekiui, kuris siekia 30–40proc. (8). Duroc veislės kuiliai gamina didesnės koncentracijos ir mažesnio tūrio spermatozoidus (48).
1.2.4. Kuilių amžius.
Kuilių lytinė branda būna įvairaus amžiaus, atsižvelgiant į veislę, aplinkos ir socialinius veiksnius (49). Kuiliai tampa paaugliais maždaug 9 mėnesių amžiaus, o brendimo metu pagerėja spermos kokybė (50). Iš subrendusių kuilių surinktų ejakuliatų kokybė buvo geresnė nei jaunesnių, 9 mėnesių amžiaus, o spermos kiekis palaipsniui didėjo su amžiumi. Vidutinio klimato regionuose maksimali spermos kokybė buvo pasiekta iš 24–29 mėnesių amžiaus kuilių. Įrodyta, kad amžius ir sezoniniai hormonų kiekio
14 pokyčiai daro įtaką kuilių spermos kokybei, o nuo amžiaus priklausomas testosterono ir estrogeno kiekio padidėjimas siejamas su sėklidžių vystymusi, brendimu, lytine branda ir spermos gamyba (51).
Dirbtinio apvaisinimo (AI) veikla kiaulininkystės ūkiuose reikalauja spermos charakteristikų vertinimo, siekiant užtikrinti jos kokybę prieš sėklinimą. Kuilių senėjimą lydi hormoniniai ir ląstelių pokyčiai, turintys įtakos spermos kokybei, taip pat jos apvaisinimo gebai ir tūriui. Kennedy ir Wilkinsas nustatė, kad maksimalų spermos tūrį ir spermos koncentraciją duoda 24–29 mėnesių amžiaus kuiliai, tuo tarpu, pasak Smitalo, spermatozoidų kiekis padidėjo 3,5 metų amžiaus sulaukusių kuilių. Pagrindinės spermos charakteristikos - su amžiumi susijęs testosterono kiekio mažėjimas, kuris priklauso nuo išorinių veiksnių leidigo ląstelėms (52). Paprastai kuiliai reprodukcijai naudojami iki 3 metų amžiaus, tačiau, jeigu kuilio spermos kokybė yra labai gera, tokiu atveju jie yra laikomi iki 5 metų amžiaus. Huang ir kt. pademonstravo, kad Duroc veislės kuiliai galėtų būti naudojami kaip spermos donorai iki 4 metų amžiaus. Jų reprodukcinis ilgaamžiškumas gali būti pratęstas iki 6 metų, jei jie laikomi griežtai žemesnėje nei 22°C temperatūroje (53).
Kuilio spermatozoidų skaičius ejakuliate priklauso nuo Sertoli ląstelių populiacijos ir kaip efektyviai jos veikia. Produktyviausias Sertoli ląstelių mitozės periodas prasideda apie 70 dieną ir tęsiasi maždaug 3 savaites (54). Vėliau seka antrasis laikotarpis, tarp 28 ir 50 dienų amžiaus, per kurį ląstelių dalijimasis mažėja ir tada visiškai nutrūksta (16). Dėl to visuotinai pripažįstama, kad produktyviausias Sertoli ląstelių komplementas kuiliams yra 2 mėnesiai. Kai kuiliai sulaukia brendimo nuo 5 iki 6 mėnesių, prasideda spermatozoidų bangos kas 3–4 dienas. Spermatozoidai išsiskiria iš „Sertoli“ ląstelių ir tampa pilnaverčiai, kurie jau gali apvaisinti po papildomų 5–7 savaičių brendimo (13). Šis procesas turėtų tęstis be pertraukos, kol sperma bus renkama. Tokie kuiliai naudojami iki 20–24 mėnesių amžiaus (55). 1.2.5. Spermos ėmimo sezoniškumas.
Reprodukcinis sezoniškumas dėl fotoperiodo ir temperatūros svyravimų daro didelę įtaką kuilių spermos kokybei. Buvo pranešta, kad kuilio reprodukcinis sezoniškumas yra bruožas, paveldėtas iš protėvio - Europos šerno (Sus scrofa ferus) (56). Yra įvairių tyrimų, kuriuose aprašytas temperatūros poveikis ir sezoniniai kuilių spermos kokybės pokyčiai. Spermatozoidai bręsta ir yra laikomi sėklidėse. Jose yra sėklinės plazmos (SP) mišinys, kurį sudaro įvairios sėklidžių ir lytinių liaukų išskyros. Be to, kuilio SP sudėtyje yra įvairių biocheminių komponentų, kurie yra susiję su spermatozoidų kiaušialąstės apvaisinimo procesais. Sukaupti įrodymai rodo bendrą kuilio SP baltymų komponentų poveikį spermos kokybei ir jų poveikį spermos išlikimui, spermą laikant skirtingais sezono laikotarpiais. Be to, neseniai atliktas tyrimas parodė, kad spermatozoidai iš ejakuliatų, surinktų per vasarą, yra labiau jautrūs krio sukeltai žalai dėl ryškių SP biocheminės sudėties pokyčių. Spermatozoidų funkcija yra labiau
15 pažeidžiama dėl amžiaus ir su sezonu susijusių pokyčių nei sekrecinė papildomų lytinių liaukų veikla. Visai neseniai atliktas tyrimas parodė ryškų sezoninį poveikį spermos kokybės charakteristikoms ir SP proteomui frakcionuotuose atskirų kuilų ejakuliatuose (51).
1.2.6. Spermos ėmimo intervalas.
Dirbtinio apvaisinimo stočių tikslas yra numatyti visus veiksnius, galinčius turėti įtakos spermos kokybei. Surinkimo intervalas yra vienas iš svarbiausių išorinių veiksnių, atsirandančių dėl spermos surinkimo organizavimo ir sėklinimo dozių gamybos. Šis veiksnys labai priklauso nuo žmogaus. Vertingi kuiliai, gaminantys didelį kiekį spermos, turėtų būti pagrįstai naudojami per visą jų gyvavimo laiką. Tyrimo rezultatai apie ejakuliato parametrus su skirtingais rinkimo intervalais nėra pilnai išaiškinti. Tačiau autoriai aiškiai teigia, kad dažnas ejakuliato surinkimas turi įtakos spermos kokybei ir visam spermatogenezės procesui, taip pat dėl ilgų intervalų spermatozoidai kaupiasi sėklidėse. Surinkimo intervalai yra glaudžiai susiję su dirbtinio apvaisinimo stočių ekonominiais rezultatais, o tai atsispindi kuilių naudojimo trukmėje ir kokybiškos produkcijos rezultatuose. Dažnas ejakuliatų surinkimas leidžia pagaminti didelį kiekį spermos per palyginti trumpą laiką. Pagunda padidinti kuilių sėklinimo efektyvumą yra tokia didelė, kad nuolat atliekami tyrimai dėl galimybės sutrumpinti maksimalų poilsio laiką, nedarant neigiamos įtakos tolesnei reprodukcijai. (57)
1.2.7. Skiediklio pasirinkimas.
Įprastais kuilių spermos tyrimais komerciniuose ūkiuose siekiama įvertinti apvaisinimo pajėgumą ir kontroliuoti veisimo sąlygas (58). Spermos kokybės charakteristiką veikia daug veiksnių, įskaitant spermos skiediklio tipą, laikymo trukmę ir temperatūrą (59). Kuilių spermos skiediklius komerciniai tiekėjai skirsto į tris kategorijas: trumpalaikius (ST), vidutinės trukmės (MT) ir ilgalaikius (LT) užpildus/skiediklius pagal jų išsaugojimo pajėgumą (1–2, 3–4 ir 7–10 dienos po surinkimo). Ilgalaikiai skiedikliai leidžia gabenti spermą tolimus atstumus. Be to, įgytas laiko lankstumas leidžia surinkimo centrams atlikti specializuotus diagnostinius tyrimus (60).
Literatūroje aprašyta mažai tyrimų, kuriuose lyginami skirtingų skiediklių išsaugojimo pajėgumai laboratorijoje ir ryšys su fiziniais veiksniais. Duomenų apie kiaulių dirbtinio apvaisinimo (AI) veiksmingumą, praėjus 1–2 dienoms nuo surinkimo ir atskiedimo ilgalaikiais skiedikliais, yra nedaug. Ši skiediklių kategorija turi išlaikyti spermos kokybę tam tikru lygiu (t.y. bendras spermatozoidų skaičius> 35 × 109 spermatozoidai / ejakuliacija, bendras judrumas> 70proc., nenormali morfologija <20–25proc.), ilgą laiką (5–7 arba iki 10 dienų). Tačiau neaišku, ar LT skiedikliai turi pranašumą prieš kitus dėl laboratorinių ar vaisingumo rodiklių konservavimo pradžioje. Spermatozoidai, praskiesti ilgalaikiu skiedikliu, išlaikė savo priimtiną kokybę 3 dienas. Tai iš dalies patvirtina Kaeoket ir kt. tyrimą (2010),
16 (61) nustatyta, kad skiedikliai 8 dienas gali tinkamai palaikyti kuilio spermos judrumą 18°C temperatūroje.
Apibendrinant galima teigti, kad ilgalaikiai skiedikliai, skirtingai negu vidutinio ir trumpo termino skiedikliai, pasižymi didesniu efektyvumu, išlaikant kuilių spermos in vitro kokybę po 3 dienų, spermą išsaugant 18°C temperatūroje. Tačiau sėklinant kuilius praskiesta sperma, dvi dienas po surinkimo (naudojant vidutinės trukmės skiediklius), padidėjo gyvų paršelių skaičius, tai padidino ūkio reprodukcijos rodiklius (37).
17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tyrimas buvo atliekamas LSMU VA Stambiųjų gyvūnų klinikoje Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje. Mėginiai buvo pristatyti į laboratoriją iš trijų skirtingų ūkių: A, B, C. Spermos dozės buvo laikomos 16°C temperatūroje.
Ūkiuose sperma iš atrinktų kuilių buvo imama, vertinama ir skiedžiama pagal ūkyje naudojamas gamybos technologijas. Ūkyje A sperma iš kuilio imama kartą per savaitę, B ūkyje – tris kartus per dvi savaites ir C ūkyje – pagal poreikį, bet ne rečiau kaip kartą per savaitę (ūkio informacija). Visuose ūkiuose sperma buvo skiedžiama ilgalaikiais komerciniais skiedikliais ir išpilstoma į dozes, paruoštas paršavedžių sėklinimui. Spermos dozės iš ūkių buvo pristatomos į laboratoriją rutininiams kokybės tyrimams. Iš viso į laboratoriją pristatyta ir ištirta 60 spermos dozių. Pagrindiniai parametrai, kuriuos tyrėme, buvo spermatozoidų judrumas, jų koncentracija (dozes mililitre, dozėje ir judrių spermatozoidų dozėje) ir morfologiniai pokyčiai.
Į LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratoriją spermos dozės, spacialiose termo dėžėse, palaikančiose pastovią 16±2 oC temperatūrą, pristatytos per 2 val. nuo spermos atskiedimo ir dozių
paruošimo. Gavus dozes, jos pirmiausiai, lengvai pavartant flakonėlį, buvo gerai išmaišomos. Tuomet, į du atskirus eppendorf `o mėgintuvėlius buvo įpilama po 2 ml išmaišytos spermos. Vienas mėgintuvėlis skirtas tyrimams, atliekamiems iš karto, o kitas - inkubuojamas termostate 72 val. (Friocell, Vokietija), 16±0,5 oC temperatūroje, pavartant kartą per dieną. Pastarasis mėgintuvėlis buvo naudojamas spermatozoidų judrumo tyrimams atlikti po 72 val.
Spermatozoidų judrumo tyrimas.
Skiesta kuilių sperma į laboratoriją pristatoma specialiuose 90–100 ml talpos buteliukuose – dozėse, paruoštose kiaulių sėklinimui. Vertinant judrumą, naudojami 3ml tūrio mėgintuvėliai, į kuriuos įpilama 300 µl gerai išmaišytos spermos, sterilia lazdele nedidelis lašas šviežios spermos dedamas ant pašildyto (37 °C) mikroskopo stiklelio ir uždengiamas šiltu dengiamuoju stikleliu (18 mm x 18 mm). Spermatozoidų judrumas tiriamas naudojant fazių konstrasto mikroskopą ir vertinamas bent 4 skirtinguose matymo laukeliuose su 200 ar 400 mikroskopo padidinimu, išvedamas vidurkis. Spermos judrumas apskaičiuojamas 5 proc. tikslumu. Mėginio paėmimui ir tolimesniam tyrimui visos reikalingos priemonės, kurios turės kontaktą su sperma, turi būti pašildytos iki 37 oC. Judrumas tiriamas iškart
šviežios spermos mėginyje ir po 72 val. Spermatozoidų mėginiai iki kito tyrimo buvo laikomi termostate. Spermatozoidų koncentracijos tyrimai.
Spermatozoidų koncentracija buvo nustatoma NewBauer kameroje. Mėginiai prieš tiriant gerai sumaišomi, kad ląstelės pasiskirstytų visame mėginyje. Mėginys, praskiestas distiliuotu vandeniu,
18 dedamas ant skaičiavimo kameros, uždengiama dengiamuoju stikliuku ir mikroskopuojama. Skaičiuojami spermatozoidai, esantys penkiuose kameros kvadratuose, kurie sudaryti iš 80 mažesnių kvadratų. Galvutės, esančios kvadrato viduje, ant viršutinės ir dešinės kraštinės, yra įskaičiuojamos. Norint gauti tikslų rezultatą skaičiuojama tris kartus ir išvedamas vidurkis.
Formulė, pagal kurią skaičiuojama spermatozoidų koncentracija dozės mililitre. K = S × Pr × 5 ×10 × 1000
K – spermatozoidų koncentracija mililitre,
S – spermatozoidų skaičius 80-tyje mažų kvadratų, Pr – spermatozoidų praskiedimo laipsnis,
5 – koeficientas, spermatozoidų skaičius 0,2mm2 plote, 10 – daugiklis, nes kameros gylis yra 0,1 mm.,
1000 – daugiklis, spermatozoidų koncentracija 1ml.
Spermatozoidų koncentracija dozėje apskaičiuojama, spermatozoidų kiekį dozės mililitre padauginus iš dozės tūrio, t.y. 100 ml.
Spermatozoidų koncentracija (SKJ). Judrių spermatozoidų skaičius kuilių spermos dozėje apskaičiuojamas naudojant šią formulę:
SKJ = Judr_0 × SK / 100
Judr_0 – pradinis spermatozoidų judrumas,
SK – spermatozoidų koncentracija spermos dozėje, 100 – daugiklis.
Spermatozoidų morfologinis tyrimas.
Spermatozoidų galvučių vertinimas, nudažius spermatozoidus tam tikslui skirtais dažais - Anilinu. Kiekviena patologija buvo skaičiuojama atskirai. Ant objektinio stiklelio uždedamas lašas spermos ir lašas Anilino mėlynojo dažų, švelniai pamaišoma, palaukiama 2 – 3 min., kol nusidažys, ir padaromas tepinėlis. Išdžiovinamas ore. Objektinis stiklelis su nudažytu spermos mėginiu ir užlašinta imersija dedamas ant šviesinio mikroskopo ir tiriamas naudojant 1000 kartų padidinimą. Skaičiuojama slenkant stiklelį iki viršaus, tada dešiniau ir vėl žemyn, taip suskaičiuojant viso 500 sveikų ir patologinių spermatozoidų. Kiekviena galvutės patologija registruojama į kategorijas: kriaušės formos, siauru pagrindu, nenormaliais kontūrais, neišsivystę, palaidos galvutės, siauros, didelės, mažos, normalios,
19 trumpos-plačios, paracentriniais implantavimaisi. (Apskaičiuojamas kiekvienos patologijos procentas). Suskaičiuojama, kiek iš viso buvo galvučių patologijų iš visų paminėtų kategorijų.
Spermatozoidų uodegėlių vertinimas, naudojant buferinioformalino tirpalą, kuris spermą atskiedžia 1:10 santykiu. Atskiestos spermos mėginio lašas pipete dedamas ant objektinio stiklelio ir uždengiamas objektiniu stikliuku. Prieš mikroskopavimą palaukiama, kol spermatozoidai nusės. Mėginys mikroskopuojamas fazių mikroskopu 400 padidinimu. Vertinama 200 sveikų ir su uodegėlių patologijomis spermatozoidų suma. Išskiriamos 10 patologijų: proksimalinis lašas, distalinis lašas, palaidos galvos, akrosomos defektai, akrosomos pakitimai, vakuolės, vidinės dalies pakitimai, paprastai suktos uodegėlės, po galva susisukusios uodegėlės, dvigubai susisukusios uodegėlės.
Spermatozoidų galvučių ir uodegėlių procentas vertinamas ir apskaičiuojamas atskirai. Bendras patologinių spermatozoidų kiekis mėginiuose buvo apskaičiuotas sekančiai: (spermatozoidų galvučių patologijos + spermatozoidų uodegėlių ir kitos patologijos) / 2
Statistinė duomenų analizė.
Gautiems duomenims ir statistinei analizei apdoroti buvo naudojama programa „Microsoft Excel“ (Microsoft Office Excell, 2016). Išanalizuoti duomenys buvo aprašinėjami taikant aprašomąją statistiką, kurios metu buvo apskaičiuojamas ir aprašomas aritmetinis vidurkis, standartinis nuokrypis bei maksimalios ir minimalios reikšmės. Skirtumai tarp ūkių buvo skaičiuojami ir analizuojami taikant LSD daugybinio palyginimo metodą. Duomenys buvo laikomi statistiškai patikimi, kai p<0,05.
20
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Spermatozoidų judrumas
Tyrimas buvo atliktas panaudojus 60 spermos dozių iš trijų skirtingų ūkių. Spermos judrumas vertintas šviežioje, tik ką gautoje spermos dozėje iš skirtingų ūkių ir praėjus 72 val., inkubuojant spermos dozes 16±0,5 oC temperatūros termostate. Spermatozoidų judrumo šviežioje spermos dozėje vidurkis A ūkyje buvo 65 ± 12,74 proc. (svyravo nuo 30 proc. iki 80 proc.), B ūkio dozėje 74,5 ± 5,89 proc. (nuo 60 proc. iki 80 proc.), C ūkyje 71,5 ± 4,97 proc. (nuo 60 proc. iki 80 proc.) (1 pav.). Inkubavus mėginį 72 val. judrumas spermos dozėje iš A ūkio buvo 55,8 ± 12,14 proc. (nuo 25 proc. iki 70 proc.), B ūkyje 63,1 ± 5,80 proc. (nuo 50 proc. iki 70 proc.), C ūkyje 62,9 ± 5,70 proc. (nuo 50 proc. iki 75 proc.). Mėginiuose iš A ūkio pradinis spermatozoidų judrumas buvo 9,5 ± 6,85 proc. mažesnis už B ūkio pradinį judrumą (p<0,05), taip pat 6,5 ± 7,77 proc. mažesnis už C ūkio pradinį judrumą (p>0,05). B ūkio spermatozoidų pradinis judrumas 3 ± 0,92 proc. didesnis už C ūkio (p>0,05). Praėjus 72 val. po spermos inkubavimo A ūkyje spermatozoidų judrumas buvo 7,3 ± 6,34 proc. mažesnis už B ūkio (p<0,05) ir 7,1 ± 6,44 proc. mažesnis už C ūkio spermatozoidų judrumą (p<0,05). B ūkio spermatozoidų judrumas dozėje po 72 val. buvo 0,2 ± 0,1 proc. didesnis už C ūkio judrumą po 72 val. inkubavimo (p>0,05)
1 pav. Spermatozoidų judrumas skirtingų ūkių spermos dozėse. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 A B C P ro ce n tai Ūkis Average of Judr_0 Average of Judr_72
Judrumas šviežioje spermoje Judrumas po 72 val.
21 3.2. Spermatozoidų koncentracija
Spermatozoidų koncentracija A ūkio dozėse mililitre buvo 31,9 ± 9,20 mln (nuo 20 iki 52 mln./ml.), B ūkyje 35,9 ± 9,71 mln/ml. (nuo 16 iki 53 mln/ml.), C ūkyje 37,6 ± 10,6 mln/ml. (nuo 17 iki 58 mln/ml.) (2 pav.). A ūkio spermatozoidų koncentracija buvo 4,00 ± 0,69mln/ml mažesnė už B ūkio koncentraciją (p>0,05). Taip pat A ūkio spermatozoidų koncentracija buvo 5,7 ± 1,4 mln/ml mažesnė nei C ūkio koncentracija mililitre (p>0,05). B ūkio koncentracija buvo 1,7 ± 0,89 mln/ml mažesnė nei C ūkio koncentracija (p>0,05).
2 pav. Spermatozoidų koncentracijos dozės mililitre vidurkių palyginimas tarp skirtingų ūkių.
Judrių spermatozoidų koncentracija dozėje iš A ūkio buvo nustatyta 2,07 ± 0,62mlrd (nuo 0,60 iki 3,06 mlrd), dozėse iš B ūkio 2,7 ± 0,85 mlrd (nuo 1,20 iki 4,24 mlrd), C ūkyje 2,69 ± 0,77 mlrd (nuo 1,19 iki 4,35 mlrd) (3 pav.). A ūkio koncentracija buvo 0,63 ± 0,23 mlrd/judrių dozėje mažesnė nei B ūkio (p<0,05). B ūkio koncentracija buvo 0,01 ± 0,08 mlrd/judrių dozėje didesnė nei C ūkio judrių dozėje (p>0,05). C ūkio spermatozoidų koncentracija buvo 0,62 ± 0,15 mlrd/judrių dozėje didesnė už A ūkio koncentraciją judrių spermatozoidų dozėje (p<0,05).
0 10 20 30 40 50 60 A B C m ln /m l Ūkis
22
3 pav. Judrių spermatozoidų koncentracijos dozėje vidurkių palyginimas tarp trijų skirtingų ūkių.
Spermatozoidų koncentracija A ūkio dozėse buvo 3,19 ± 0,92 mlrd. (nuo 2 iki 5,2 mlrd.), B ūkyje 3,59 ± 0,97 mlrd (nuo 1,6 iki 5,3 mlrd), C ūkyje 3,76 ± 1,05 mlrd (nuo 1,7 iki 5,8 mlrd) (4 pav.). A ūkio spermatozoidų koncentracija buvo 0,4 ± 0,05mlrd mažesnė už B ūkio koncentraciją dozėje (p>0,05). Taip pat A ūkio spermatozoidų koncentracija buvo 0,57 ± 0,13 mlrd mažesnė nei C ūkio koncentracija dozėje (p>0,05). B ūkio koncentracija buvo 0,2 ± 0,08 mlrd mažesnė nei C ūkio koncentracija spermos dozėje (p>0,05). 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 A B C m lr d Ūkis
23
4 pav.Spermatozoidų koncentracijos dozėje vidurkių palyginimas tarp skirtingų ūkių.
3.3. Spermatozoidų morfologiniai pokyčiai
Spermatozoidų morfologiniai pokyčiai buvo nustatyti mėginiuose, gautuose iš trijų skirtingų ūkių. Iš viso nustatytų patologinių spermatozoidų skaičiaus vidurkis A ūkio dozėje buvo 7,95 ± 4,45 proc. (nuo 3 iki 19,5 proc.), B ūkio dozėje 7,97 ± 3,45 proc. (nuo 2,5 iki 15 proc.), C ūkio dozėje 9,59 ± 4,24 proc. (nuo 3 iki 19,5 proc.) (5 pav.). A ūkio spermos dozėje patologijų buvo 0,02 ± 1,00 proc. mažiau už B ūkio dozėje esančias (p>0,05) ir 1,64 ± 0,21proc. mažiau už C ūkio dozėje nustatytas (p>0,05). B ūkio dozėje patologijų buvo 1,62 ± 0,79 proc. mažiau už C ūkyje esančias patologijas (p>0,05).
0 1 2 3 4 5 6 A B C m lrd /d o zėje Ūkis
24
5 pav. Bendras patologijų vidurkis spermos dozėje tarp skirtingų ūkių.
Spermatozoidų uodegėlių patologijų skaičiaus vidurkis A ūkyje buvo 5,4 ± 6,43 proc. (nuo 0 iki 26 proc.), B ūkyje 6,5 ± 5,57 proc. (nuo 1 iki 18 proc.), C ūkyje 7,1 ± 5,18 proc. (nuo 0 iki 22 proc.) (6 pav.). A ūkio mėginyje patologinių spermatozoidų buvo 1,1 ± 0,86 proc. mažiau už B ūkio (p>0,05) ir 1,7 ± 1,25 proc. mažiau už C ūkio mėginius (p>0,05). B ūkio patologinių spermatozoidų buvo 0,6 ± 0,39 proc. mažiau nei C ūkio spermos mėginiuose (p>0,05).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 A B C P roc en ta i Ūkis
25
6 pav. Patologinių uodegėlių palyginimas spermos dozėse iš trijų skirtingų ūkių.
Galvučių patologijų skaičiaus vidurkis spermos dozėje iš A ūkio buvo 1,7 ±1,07 proc. (nuo 0 iki 4 proc.), B ūkyje 2,04 ±1,29 proc. (nuo 0 iki 5 proc.), C ūkyje 2,5 ±0,89 proc. (nuo 1 iki 4 proc.) (7 pav.). C ūkyje patologinių galvučių spermos mėginyje buvo 0,8 ± 0,18 proc. daugiau už A ūkio (p<0,05) ir 0,46 ± 0,4 proc. daugiau už B ūkio mėginyje rastų galvučių patologijų (p<0,05). B ūkio spermos dozėje patologinių spermatozoidų buvo 0,34 ± 0,22 proc. daugiau už patologijas, esančias A ūkio spermos dozėse (p<0,05). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A B C P ro ce n tai Ūkis
26
7 pav. Patologinių galvučių palyginimas spermos dozėse iš trijų skirtingų ūkių.
Kitų patologijų skaičiaus vidurkis spermos dozėje iš A ūkio buvo 8,7 ± 5,02 proc. (nuo 2 iki 22 proc.), B ūkio 7,33 ± 3,54 proc. (nuo 1 iki 14 proc.), C ūkio 9,5 ± 6,04 proc. (nuo 1 iki 25 proc.) (8 pav.). A ūkio spermos dozėje kitų patologijų buvo rasta 1,37 ± 1,48 proc. daugiau nei B ūkio dozėje (p>0,05). Tačiau dozėje iš B ūkio kitų patologijų buvo 2,17 ± 2,5 proc. mažiau už C ūkio dozėje rastas patologijas (p>0,05). Dozėje iš C ūkio kitų patologijų buvo 0,8 ± 1,02 proc. daugiau už A ūkio (p>0,05).
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 A B C P ro ce n tai Ūkis
27
8 pav. Kitų patologijų palyginimas spermos dozėse iš trijų skirtingų ūkių.
Palyginus visas pasitaikiusias patologijas spermos dozėse iš trijų ūkių, matoma, kad visose dozėse uodegėlių ir kitų patologijų buvo daugiau (nuo 13,9 iki 16,6 proc) nei galvučių patologijų ( nuo 1,7 iki 2,5 proc.) (9 pav.). Galvučių patologijų dozėje iš A ūkio buvo 1,7 ± 1,07 proc. (nuo 0 iki 4 proc.), B ūkio 2,04 ± 1,29 proc. (nuo 0 iki 5 proc.), C ūkio 2,5 ± 0,89 proc. (nuo 1 iki 4 proc.). Uodegėlių ir kitų patologijų dozėje iš A ūkio buvo 14,1 ± 8,5 proc. ( nuo 5 iki 35 proc.), B ūkyje 13,9 ± 6,8 proc. (nuo 4 iki 29 proc.), C ūkyje 16,6 ± 8,2 proc. (nuo 3 iki 35 proc.). A ūkio dozėje uodegėlių patologijų buvo 12,4 ± 7,43 proc. daugiau nei galvučių patologijų. B ūkio dozėje uodegėlių patologijų buvo 11,86 ± 5,51 proc. daugiau nei galvučių patologijų. C ūkio dozėje uodegėlių patologijų buvo 14,1 ± 7,31 proc. daugiau nei galvučių patologijų. A ūkio spermos mėginyje patologinių galvučių buvo 0,34 ± 0,22 proc. mažiau už B ūkio ir 0,8 ± 0,18 proc. mažiau už C ūkio. B ūkio dozėje patologinių galvučių buvo 0,46 ± 0,4 proc. mažiau už C ūkio dozėje rastas. A ūkio spermos dozėse uodegėlių patologijų buvo 0,2 ± 1,7 proc. daugiau už B ūkio dozėje esančias, bet 2,5 ± 0,3 mažiaus už C ūkio. B ūkio dozėje buvo 2,7 ± 1,4 proc. mažiau už C ūkyje esančias uodegėlių patologijas.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B C P ro ce n tai Ūkis
28
9 pav. Patologinių galvučių ir uodegėlių palyginimas spermos dozėse iš trijų skirtingų ūkių.
Dažniausiai rastos uodegėlių patologijos kuilių spermos dozėse pavaizduotos 10 paveiksle. Tiriant spermatozoidų uodegėlių patologijas, nustatyta, kad A ūkio spermos dozėje didžiausią patologijų dalį sudarė distaliniai lašeliai 4,2 ± 3,8 proc. (nuo 2 iki 17 proc.) ir proksimaliniai lašeliai 3,7 ± 3,1 proc. (nuo 0 iki 12 proc.), mažiausią dalį sudarė palaidos galvos 0,7 ± 1,09 proc. (nuo 0 iki 4 proc.). B ūkyje didžiausią dalį spermos dozėje sudarė proksimaliniai lašeliai 3,7 ± 2,5 proc. (nuo 0 iki 10 proc.) ir distaliniai lašeliai, kurie sudarė 3,04 ± 1,8 proc. (nuo 1 iki 7 proc.), mažiausią dalį sudarė palaidos galvos 0,57 ± 0,97 proc. (nuo 0 iki 3 proc). C ūkio spermos dozėje didžiausią dalį sudarė distaliniai lašeliai 4,2 ± 4,26 proc. (nuo 0 iki 18 proc.) ir proksimaliniai lašeliai 4,1 ± 4,2 proc. (nuo 0 iki 15 proc.), mažiausią dalį sudarė palaidos galvos 1,04 ± 2,01 proc. (nuo 0 iki 7 proc.). A ūkio dozėje distalinių lašelių buvo 1,16 ± 2 proc. daugiau už B ūkio dozėje esančius (p>0,05). B ūkio dozėje distalinių lašelių buvo 1,16 ± 2,46 proc. mažiau už C ūkio dozėje esančius (p>0,05). A ūkio dozėje proksimalinių lašelių buvo 0,4 ± 1,1 proc. mažiau už C ūkio dozėje esančius (p>0,05). A ūkio dozėje palaidų spermatozoidų galvų buvo 0,13 ± 0,12 proc. daugiau už B ūkio dozėje esančias (p>0,05), tačiau 0,34 ± 0,92 proc. mažiau už C ūkio dozėje esančias(p>0,05). B ūkio dozėje palaidų spermatozoidų galvų buvo 0,47 ± 0,07 proc. mažiau už C ūkio dozėje esančias (p>0,05).
0 5 10 15 20 25 30 A B C P ro ce n tai Ūkis Average of GALVUTĖS Average of Uodegėlės ir kita
Galvučių patologijos Uodegėlių patologijos
29
10 pav. Dažniausiai pasitaikiusių uodegėlių patologijų palyginimas spermos dozėse iš skirtingų ūkių.
Taip pat dažnai spermos dozėje buvo rastos uodegėlės, suktos po galva, suktos paprastai ir vidurinės dalies pakitimai (11 pav.). A ūkio dozėje daugiausiai rasta paprastai suktų uodegėlių 4,11 ± 6,4 proc. (nuo 0 iki 25 proc.), vidinės dalies pakitimų 0,73 ± 1,03 proc. (nuo 0 iki 4 proc.) ir uodegėlės suktos po galva 0,58 ± 0,71 proc. (nuo 0 iki 2 proc.). B ūkio dozėje daugiausiai rasta paprastai suktų uodegėlių 5,9 ± 5,7 proc. (nuo 0 iki 18 proc.), uodegėlės suktos po galva 0,52 ± 0,74proc. (nuo 0 iki 2proc.), ir vidinės dalies pakitimų 0,14 ± 0,47 proc. (nuo 0 iki 2 proc.). C ūkio dozėje daugiausiai rasta paprastai suktų uodegėlių 3,8 ± 4,1 proc. (nuo 0 iki 13 proc.), vidinės dalies pakitimų 2,8 ± 5,4 proc. (nuo 0 iki 22proc.), uodegėlės suktos po galva 0,45 ± 1,5proc. (nuo 0 iki 7proc.). A ūkio dozėje paprastai suktų uodegėlių buvo 3,38 ± 5,37 proc. daugiau nei vidinės dalies pakitimų (p>0,05) ir 3,53 ± 5,69 proc. daugiau nei uodegėlių suktų po galva (p<0,05). B ūkio dozėje paprastai suktų uodegėlių buvo 5,38 ± 4,96 proc. daugiau nei uodegėlių suktų po galva (p<0,05), ir 5,76 ± 5,23 proc. daugiau nei vidinės dalies pakitimų (p<0,05). C ūkio dozėje paprastai suktų uodegėlių buvo 1,00 ± 1,3 proc. daugiau nei vidinės dalies pakitimų (p>0,05) ir 3,35 ± 2,6 proc. daugiau nei uodegėlių suktų po galva (p<0,05). A ūkio dozėje paprastai suktų uodegėlių buvo 1,79 ± 0,7 proc. mažiau už B ūkyje esančias paprastai suktas uodegėles
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B C P ro ce n tai Ūkis
Average of Pal path galv Average of Dist las Average of Prox las
Palaidos galvos Distaliniai lašeliai Proksimaliniai lašeliai
30 (p>0,05, bet 0,31 ± 2,3 proc. daugiau už C ūkio dozėje (p>0,05). A ūkio dozėje vidinės dalies pakitimų buvo 0,59 ± 0,56 proc. daugiau nei B ūkio (p<0,05), bet 2,07 ± 4,37 proc. daugiau už C ūkio dozėje (p>0,05). A ūkio dozėje uodegėlių suktų po galva, buvo 0,06 ± 0,03 proc. daugiau už B ūkio dozėje (p>0,05) ir 0,13 ± 0,79 proc. daugiau už C ūkio dozėje esančias galvučių patologijas (p>0,05). B ūkio dozėje paprastai suktų uodegėlių buvo 2,1 ± 1,6 proc. daugiau už C ūkio dozėje (p>0,05). B ūkio dozėje vidinės dalies pakitimų buvo 2,66 ± 4,93 proc. mažiau už C ūkio dozėje (p<0,05). B ūkio dozėje uodegėlių suktų po galva, buvo 0,07 ± 0,76 proc. daugiau už C ūkio dozėje esančias (p>0,05).
11 pav. Dažniausiai pasitaikančių uodegėlių patologijų palyginimas spermos dozėse iš skirtingų ūkių.
Dažniausiai pasitaikiusios galvučių patologijos A ūkio dozėje patologijas sudarė kriaušės formos 0,5 ± 0,66 proc. (nuo 0 iki 2proc.), nenormalaus kontūro 0,55 ± 0,78 proc. (nuo 0 iki 2 proc.), didelės galvos 0,05 ± 0,24 proc. (nuo 0 iki 1 proc.), mažos normalios 0,32 ± 0,58 proc. (nuo 0 iki 2 proc.) (12 pav.). B ūkio dozėje patologijas sudarė kriaušės formos 0,23 ± 0,62 proc. (nuo 0 iki 2 proc.), nenormalaus kontūro 0,80 ± 0,74 proc. (nuo 0 iki 3 proc.), didelės galvos 0,14 ± 0,35 proc. (nuo 0 iki 1 proc.), mažos normalios 0,38 ± 0,66 proc. (nuo 0 iki 2 proc.). C ūkio dozėje patologijas sudarė kriaušės formos 0,27 ± 0,55 proc. (nuo 0 iki 2 proc.), nenormalaus kontūro 0,81 ± 0,79 proc. (nuo 0 iki 2 proc.), didelės galvos
0 2 4 6 8 10 12 14 A B C P ro ce n tai Ūkis
31 0,54 ± 0,96 proc. (nuo 0 iki 3 proc.), mažos normalios 0,22 ± 0,52 proc. (nuo 0 iki 2 proc.). A ūkio dozėje kriaušės formos patologijų buvo 0,27 ± 0,04 proc. daugiau už B ūkio dozėje (p>0,05) ir 0,23 ± 0,11 proc. daugiau už C ūkio dozėje (p>0,05). C ūkio dozėje nenormalaus kontūro patologijų buvo 0,01 ± 0,05 proc. daugiau už A ūkio dozėje (p>0,05) ir 0,26 ± 0,01 proc. daugiau už B ūkio dozėje (p>0,05). C ūkio dozėje didelių galvučių patologijų buvo 0,4 ± 0,61 proc. daugiau už B ūkio dozėje (p>0,05) ir 0,49 ± 0,72 proc. už A ūkio dozėje esančias (p<0,05). B ūkio dozėje mažų normalių galvučių buvo 0,06 ± 0,08 proc. daugiau už A ūkyje esančias (p>0,05) ir 0,16 ± 0,14 proc. daugiau už C ūkyje esančias (p>0,05).
12 pav. Dažniausiai pasitaikančių galvučių patologijų palyginimas spermos dozėse iš skirtingų ūkių. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 A B C Pro ce n ta i Ūkis
32
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Mokslinėje literatūroje randama nemažai informacijos apie tai, kokie veiksniai ir kokią įtaką kuilių spermos parametrams jie daro. Mūsų darbo tikslas buvo atlikti skirtinguose ūkiuose paimtos šviežios atvėsintos kuilių spermos kokybės tyrimus; nustatyti, kaip kinta spermatozoidų judrumas šviežioje ir praėjus 72 val., inkubuojant spermos dozes; įvertinti koncentraciją spermos dozėse ir patologinių spermatozoidų buvimą.
Vertinant spermatozoidų judrumą, didžiausias judrumas nustatytas šviežioje spermoje iš B ūkio dozės 74,5 ± 5,89 proc. Praėjus 72 val. po spermos inkubavimo judrumas sumažėjo iki 63,1 ± 5,80 proc. Mažiausias spermatozoidų judrumas buvo nustatytas A ūkio dozėje 65 ± 12,74 proc. Didžiausias spermatozoidų judrumo sumažėjimas po 72 val. įvyko dozėje iš A ūkio iki 55,8 ± 12,14 proc. Spermatozoidų judrumo kitimą tyrė ir mokslininkas Damian Knecht su bendraautoriais, kurie, kartu atlikę tyrimą, nustatė didžiausią judrumą 71,53 ± 29,24 proc., o mažiausias judrumas tyrime buvo 58,89 ± 24,79 proc. (57) Taip pat mokslininkas Krzysztof Gorski su bendraautoriais tyrime didžiausią judrumą nustatė 79,16 ± 2,8 proc., mažiausias judrumas buvo 78,81 ± 2,27 proc. (48). Mūsų tyrime judrumo skirtumui tarp ūkių dozių galėjo turėti tai, kad A ūkyje sperma imama iš kuilio kartą per savaitę, o B ūkyje – tris kartus per dvi savaites. Atlikus daug tyrimų, kaip judrumas įtakoja apvaisinimo pajėgumą, buvo galima spęsti, jog judrumas negali būti mažesnis nei 70 proc., kad pasiekti geriausius rezultatus.
Atlikus spermos koncentracijos tyrimą, nustatyta, kad didžiausia koncentracija dozėje buvo nustatyta C ūkyje 3,76 ± 1,05 mlrd, o mažiausia koncentracija A ūkio dozėje 3,19 ± 0,92 mlrd. Pagal Lietuvoje galiojantį Kiaulių spermos kokybės standartą (62), spermatozoidų koncentracija šviežioje skiestoje kuilių spermos dozėje turi būti ne mažesnė kaip 2 mlrd. Taigi visuose mūsų tirtuose ūkiuose sperma skiedžiama tinkamai. Spermatozoidų koncentracijos kitimą tyrė ir mokslininkas Damian Knecht su bendraautoriais, kurie, kartu atlikę tyrimą, nustatė didžiausią koncentraciją 4,37 ± 1,45mlrd., o mažiausia buvo 3,70 ± 1,52mlrd. (57) Taip pat mokslininkas Krzysztof Gorski su bendraautoriais didžiausią koncentraciją nustatė 5,45 ± 1,61 mlrd., mažiausia koncentracija buvo – 4,96 ± 0,84 mlrd. (48) Tyrimai rodo, kad optimalių kiaulių sėklinimo rezultatų galima pasiekti kiaules sėklinant spermos doze su 1,5 – 6 mlrd. spermatozoidų. Mokslinėse ataskaitose dauguma selekcijos kompanijų siunčia sėklinimo dozes, kuriose spermatozoidų koncentracija yra 2,2–3 mlrd. (63). Pagal Maes Dominiek ir bendraautorius kiekvienoje spermos dozėje turi būti 2–3 mlrd. spermatozoidų (1).
Atlikto tyrimo metu buvo gauti rezultatai, rodantys, kad didžiausias bendras spermatozoidų patologijų skaičius spermos dozėje nustatytas C ūkio mėginiuose 9,59 ± 4,24 proc., mažiausias A ūkio dozėje ir buvo 7,95 ± 4,45 proc. C ūkio mėginiuose spermatozoidų galvučių patologijų buvo 2,5 ± 0,89
33 proc., iš kurių didžiausią dalį sudarė nenormalaus kontūro 0,81 ± 0,79 proc. ir didelės galvos 0,54 ± 0,96 proc. patologijos. Uodegėlių patologijų C ūkyje nustatyta 7,1 ± 5,18 proc., iš kurių didžiausią dalį sudarė paprastai suktos uodegėlės 3,8 ± 4,1 proc. ir vidinės dalies pakitimai 2,8 ± 5,4 proc. A ūkio dozėje spermatozoidų galvučių patologijų buvo 1,7 ±1,07 proc., iš kurių didžiausią dalį sudarė kriaušės formos 0,5 ± 0,66 proc. ir nenormalaus kontūro 0,55 ± 0,78 proc. Uodegėlių patologijų A ūkio dozėje nustatyta 5,4 ± 6,43 proc., iš kurių didžiausią dalį sudarė paprastai suktos uodegėlės 4,11 ± 6,4 proc. ir vidinės dalies pakitimai 0,73 ± 1,03 proc. Tokiems rezultatams įtakos galėjo turėti spermos ėmimo intervalas, esant ilgesniam ėmimo intervalui; kaip matoma, pagal C ūkio duomenis patologinių galvučių ir uodegėlių buvo daugiau, nei imant trumpesniais intervalais. Šiai išvadai pritaria ir mokslininkas J. Čerovsky su bendraautoriais, kad kuo ilgesnis spermos ėmimo intervalas, tuo spermos dozėje daugiau randama patologinių spermatozoidų (64).
34
5. IŠVADOS
1. Didžiausias pradinis spermatozoidų judrumas (74,5 ± 5,89 proc.) buvo nustatytas B ūkio dozėje, mažiausias judrumas dozėje buvo iš A ūkio ir siekė 65 ± 12,74 proc. Praėjus 72 valandoms po spermatozoidų laikymo, visose dozėse judrumas sumažėjo, bet labiausiai A ūkio dozėje ir liko 55,8 ± 12,14 proc.
2. Spermatozoidų koncentracija C ūkio dozėse buvo vidutiniškai 3,76 ± 1,05 mlrd. A ir B ūkių dozėse koncentracija nustatyta atitinkamai 0,57 ± 0,13 mlrd. ir 0,2 ± 0,08 mlrd. mažesnė (p>0,05).
3. Didžiausias bendras spermatozoidų patologijų skaičius spermos dozėje nustatytas C ūkio mėginiuose ir siekė 9,59 ± 4,24 proc. A ūkio mėginiuose ir spermatozoidų galvučių bei uodegėlių patologijų nustatyta mažiausiai, atitinkamai 1,7 ±1,07 proc. ir 5,4 ± 6,43 proc. (p>0,05).
35
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Vyt P, Maes D, Rijsselaere T, Dewulf J, de Kruif A, Van Soom A. Semen handling porcine artificial insemination centres. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 2007; 76: 195–200. 2. Riesenbeck A, Schulze M, Rudiger K, Henning H, Waberski D. Quality control of boar sperm
processing: implications from European AI Centres and two Spermatology Reference laboratories. Reprod Domest Anim. 2015; 50(2):1–4.
3. Maes D, Nauwynck H, Rijsselaere T, Mateusen B, Vyt P, de Kruif A, et al. Diseases in swine transmitted by artificial insemination: an overview. Theriogenology. 2008; 70: 1337–45.
4. Maes D, Van Soom A, Appeltant R, Arsenakis I, Nauwynck H. Porcine semen as a vector for transmission of viral pathogens. Theriogenology. 2016; 85: 27–38.
5. Robinson J.A.B, Buhr M.M. Impact of genetic selection on management of boar replacement. Theriogenology. 2005; 63: 668–678.
6. Smital J. Effects influencing boar semen. Animal Reproduction Science. 2009; 110: 335–346. 7. Schulze M, Buder S, Rudiger K, Beyerbach M, Waberski D. Influences on semen traits used for
selection of young AI boars. Anim Reprod Sci. 2014; 148: 164–70.
8. Smital J, De Sousa LL, Mohsen A. Differences among breeds and manifestation of heterosis in AI boar sperm output. Anim Reprod Sci. 2004; 80: 121–130.
9. Gorski K, Kondracki S, Wysokinska A, Nazaruk A. The importance of ejaculate volume for the physical parameters of ejaculates and sperm morphology of Hypor boars. Kafkas Univ Vet Fak Derg. 2016; 22: 493–501.
10. Waberski D, Magnus F, Ardon F, Petrunkina AM, Weitzke KF, Topfer-Petersen E. Binding of boar spermatozoa to oviductal epithelium in vitro in relation to sperm morphology and storage time. Reproduction. 2006; 131: 311–318.
11. Wolf J. Genetic parameters for semen traits in AI boars estimated from data on individual ejaculates. Reprod Domest Anim. 2009; 44: 338–344.
12. Kondracki S, Iwanina M, Wysokinska A, Gorski K. The use of sexual activity measurements to assess ejaculatory performance of boars. Arch Tierzucht. 2013; 56: 1052–1059.
13. Garner DL, Hafez ESE. Spermatozoa and seminal plasma. Reproduction in Farm Animals. 2000; 6: 165– 187.
14. Sumransap P, Tummaruk P, Kunavongkrit A. Sperm distribution in the reproductive tract of sows after intrauterine insemination. Reprod Domest Anim. 2007; 42: 113-117.
36 15. Alberto F, Garcia-Vazquez, Hernandez-Caravaca I, Carmen M, Soriano-Ubeda C, Abril-Sanchez S, et. al. Morphological study of boar sperm during their passage through the female genital tract. 2015: 61(5): 407–413.
16. Franca LR, Silva VA, Chiarini-Garcia H, Garcia SK, Debeljuk L. Cell proliferation and hormonal changes during postnatal development of the testis in the pig. Biol Reprod. 2000; 63: 1629–1636. 17. VĮ Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras. [Prieiga per internetą]. [žiūrėta 2020 11 04]..Adresas:.https://www.vic.lt/gpsasapskaita/wpcontent/uploads/sites/6/2020/01/29_kiaules_b andos_200101.pdf
18. Fitzpatrick JL, Lupold S. Sexual selection and the evolution of sperm quality. Mol Hum Reprod. 2014; 20: 1180–1189.
19. Cooper TG. The epididymis, cytoplasmic droplets and male fertility. Asian J Androl. 2011; 13: 130–138.
20. Amann RP, Seidel GE, Jr, Mortimer RG. Fertilizing potential in vitro of semen from young beef bulls containing a high or low percentage of sperm with a proximal droplet. Theriogenology. 2000; 54: 1499–1515.
21. Holt WV, Van Look KJ. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 2004; 127: 527–535.
22. Gadea J. Sperm factors related to in vitro and in vivo porcine fertility. Theriogenology. 2005; 63: 431-444.
23. Gadea J, Selles E, Marco M. The predictive value of porcine seminal parameters on fertility outcome under commercial conditions. Reproduction in Domestic Animals. 2004; 39: 303-308. 24. Alm K, Peltoniemi O, Koskinen E, Andersson M. Porcine field fertility with two different
insemination doses and the effect of sperm morphology. Reproduction in Domestic Animals. 2006; 41: 210-213.
25. Lopez Rodriguez A, Rijsselaere T, Beek J, Vyt P, Van Soom A, Maes D. Boar seminal plasma components and their relation with semen quality. Systems Biology in Reproductive Medicine. 2013; 59: 5–12.
26. Saravia F, Nunez-Martinez I, Moran J, Soler C, Murielb A, Rodriguez-Martineza H et al. Differences in boar sperm head shape and dimensions recorded by computer-assisted sperm morphometry are not related to chromatin integrity. Theriogenology. 2007; 68: 196–203
37 27. Saacke RG, Nadir S, Nebel RL. Relationship of semen quality to sperm transport, fertilization
and embryo quality in ruminants. Theriogenology. 1994; 41: 45– 49.
28. Mortimer ST. CASA practical aspects. Journal of Andrology. 2000; 21: 515 -524;
29. Kommisrud E, Paulenz H, Sehested E, Grevle I. Influence of boar and semen parameters on motility and acrosome integrity in liquid boar semen stored for five days. Acta Veterinaria Scandinavica. 2002; 43: 49–55,
30. Kondracki S. Breed differences in semen characteristics of boars used in artificial insemination in Poland. Pig News and Information. 2003; 24: 119-122.
31. Shipley C. Breeding soundness examination in the boar. Swine Health and Production. 1999; 7: 117–120.
32. Xu X, Pommier S, Arbov T, Hutchings B, Sotto W, Foxcroft G. In vitro maturation and fertilization techniques for assessment of semen quality and boar fertility. Journal of Animal Science. 1998; 76: 3079-3089.
33. Donadeu, M. Advances in male swine artificial insemination (AI) techniques. The Pig Journal. 2004; 54: 110-122.
34. Rigau T, Piedrafita J, Reverter A, Canal M, Rodrı́guez-Gil J.E. The rate of l-lactate production: a feasible parameter for the fresh diluted boar semen quality analysis. Anim. Reprod. Sci. 1996; 43: 161-172.
35. Roldan ERS. Signal transduction during mammalian sperm acrosomal exocytosis. 1998; 219–28. 36. Langendijk P, Bouwman E, Kidson A, Kirkwood R, Soede N, Kemp B. Role of myometrial activity in sperm transport through the genital tract and in fertilization in sows. Reproduction. 2002; 123: 683-690.
37. Karageorgiou MA, Tsousis G, Constantin M, Boscos, Eleni D, Tzika, et. al. A comparative study of boar semen extenders with different proposed preservation times and their effect on semen quality and fertility. 2016; 85: 23–31.
38. Althouse GC, Kuster CE, Clark SG, Weisiger RM. Field investigations of bacterial contaminants and their effects on extended porcine semen. Theriogenology. 2000; 53: 1167–76.
39. Hacker RR, Du Z, Darcy CJ. Influence of penning type and feeding level on sexual behavior and feet and leg soundness in boars. J Anim Sci. 1994; 72: 2531–7.
40. Berger T, Mahone JP, Svoboda GS, Metz KW, Clegg ED. Sexual maturation of boars and growth of swine exposed to extended photoperiod during decreasing natural photoperiod. J Anim Sci. 1980; 51: 672–8.
38 41. Sancho S, Rodriguez-Gil JE, Pinart E, Briz M, Garcia-Gil N, Badia E, et al. Effects of exposing boars to different artificial light regimens on semen plasma markers and "in vivo" fertilizing capacity. Theriogenology. 2006; 65: 317–31.
42. Wettemann RP, Wells ME, Omtvedt IT, Pope CE, Turman EJ. Influence of elevated ambient temperature on reproductive performance of boars. J Anim Sci. 1976; 42: 664–9.
43. Kemp B, Soede NM. Feeding of developing and adult boars. Swine nutrition. 2001; 771. 44. Ren B, Cheng X, Wu D, Xu SY, Che LQ, Fang ZF, et al. Effect of different amino acid patterns
on semen quality of boars fed with low-protein diets. Anim Reprod Sci. 2015; 161: 96–103. 45. Rodriguez AL, Soom AV, Arsenakis I, Maes D. Boar management and semen handling factors
affect the quality of boar extended semen. 2017; 3–15.
46. Hoflack G, Van den Broeck W, Maes D, Van DK, Opsomer G, Duchateau L, et al. Testicular dysfunction is responsible for low sperm quality in Belgian blue bulls. Theriogenology. 2008; 69: 323–32.
47. Flowers WL. Genetic and phenotypic variation in reproductive traits of AI boars. Theriogenology. 2008; 70: 1297–303.
48. Gorski K, Kondracki S, Wysokinska A. Ejaculate traits and sperm morphology depending on ejaculate volume in Duroc boars. 2017; 61: 121-125.
49. Huang YH, Lo LL, Liu SH, Yang TS. Age-related changes in semen quality characteristics and expectations of reproductive longevity in Duroc boars. Anim Science Journal 2010; 81: 432-7. 50. Pinart E, Puigmule M. Factors affecting boar reproduction, testis function, and sperm quality.
Springer. 2013; 109–202.
51. Fraser J, Strzezek K, Filipowicz M, Mogielnicka-Brzozowska L, Zasiadczyk. Age and seasonal-dependent variations in the biochemical composition of boar semen. 2016; 86(3): 806-16.
52. Midzak A, Chen H, Papadopoulos V, Zirkin B. Leydig cell aging and the mechanisms of reduced testosterone synthesis. Mol Cell Endocrinol. 2009; 299: 23-31.
53. Wolf J, Smital J. Effects in genetic evaluation for semen traits in Czech Large White and Czech Landrace boars. Czech J Anim Sci. 2009; 54: 349-358.
54. McCoard SA, Wise TH, Lunstra DD, Ford JJ. Stereological evaluation of sertoli cell ontogeny during fetal and neonatal life in two diverse breeds of swine. J Endocrinol. 2003; 178: 395–403. 55. Knox R, Levis D, Safranski T, Singleton W. An update on North American Boar stud practices.
39 56. Kozdrowski R, Dubiel A. The effect of season on the properties of wild boar (Sus scrofa L.)
semen. Anim Reprod Sci 2004; 80: 281–9
57. Knecht D, Jankowska-Makosa A, Duzinski K. The effect of age, interval collection and season on selected semen parameters and prediction of AI boars productivity. Institute of Animal Breedin. 2017; 14-20.
58. Tsakmakidis IA, Lymberopoulos AG, Khalifa TA. Relationship between sperm quality traits and fieldfertility of porcine semen. J Vet Sci. 2010; 11: 151-154
59. Fraser L, Strzezek J. The use of comet assay to assess DNA integrity of boar spermatozoa following liquid preservation at 5 °C and 16 °C. Folia Histochem Cyto. 2004; 42: 49-55
60. Gadea J. Semen extenders used in the artificial insemination of swine. Span J Agric Res. 2003; 1: 17-27
61. Kaeoket K, Srisowanna T, Wichaidit U, Chanapiwat P, Manee-in S. Comparative study on six different long term commercial extenders for fresh boar semen. Thai J Vet Med. 2010; 40: 257-263
62. LST 1574:2003. Kuilių sperma. Bendrieji reikalavimai: Boar's sperm. Common requirements. Vilnius: Lietuvos standartizacijos departamentas; 2003.
63. Watson et al. VIIth International Conference on Pig Reproduction, University of Missouri. 2001; 135.
64. Čerovsky J, Frydrychova S, Lustykova A, Rozkot M. Changes in boar semen with a high and low level of morphologically abnormal spermatozoa. Research Institute of Animal Production. 2005; 289-299.
