233 INTRODUZIONE
L’eziologia dell’infezione polmonare in Fibrosi Cistica (CF) è ascrivibile a diversi patogeni batte-rici ed esiste un preciso pattern batterico respon-sabile della malattia polmonare in CF, che ha, come caratteristica essenziale, l’essere età-speci-fico (12).
La prima infezione e colonizzazione in CF, che si manifesta in età infantile e pre-adolescenziale,
vede come agenti eziologici Staphylococcus aureus ed Haemophilus influenzae. Successivamente, in età adolescenziale, subentra l’infezione da parte di Pseudomonas aeruginosa e poi, con il progredire dell’età, si verificano gene-ralmente co-infezioni con altri batteri considerati opportunisti, in particolar modo Gram-negativi non fermentanti, come i batteri del Burkholderia cepacia complex (Bcc), Stenotrophomonas
malto-MICROBIOLOGIA MEDICA, Vol. 23 (4), 2008 S. AUREUS METICILLINO-RESISTENTE
In vitro biofilm formation by methicillin susceptible
and resistant Staphylococcus aureus strains isolated
from cystic fibrosis patients
Antonietta Lambiase1, Fabio Rossano1, Mariassunta Del Pezzo1, Valeria Raia2, Giovanna Pulcrano1, Massimiliano Marano1, Domenica Cerbone 1, Maria Rosaria Catania1
1Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare “Luigi Califano”, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università di Napoli “Federico II”
2Centro di Riferimento Regionale per la Fibrosi Cistica, Dipartimento di Pediatria, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università di Napoli “Federico II”
Key words: Fibrosi Cistica, Staphylococcus aureus meticillino-resistente, Biofilm
Formazione di biofilm in vitro da parte di ceppi di Staphylococcus aureus sensibili e resistenti alla meticillina isolati da pazienti con Fibrosi Cistica
SUMMARY
Staphylococcus aureus is one of the most common pathogens isolated from respiratory tracts of Cystic Fibrosis
patients (CF). The infection by this pathogen starts in early infancy, often preceding chronic infections by
Pseudomonas aeruginosa.
The infection and colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are, by then, events very fre-quent among CF patients and this bacterial isolation leads to complications in therapeutic management because of the limited treatment options.
Strains of Staphylococcus aureus are able to produce biofilms on natural or synthetic surfaces. Biofilms are sophis-ticated communities of matrix-encased bacteria and infections by biofilm-producing bacteria are particularly problematic because sessile bacteria can often withstand host immune responses and are generally much more tolerant to antibiotics.
The first aim of this work is to evaluate the ability of MRSA strains isolated from respiratory secretions of CF patients to develop biofilms in comparison with methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) strains obtained from respiratory secretions of CF patients.Therefore, our second aim is to evaluate the environmen-tal influence on this ability.
To evaluate the development of biofilm on solid matrix and the possible environmental influence, we applied the method described by Christensen et al.
We found that a significantly higher number of MRSA strains were biofilm positive compared with MSSA strains (p<0.05). The presence of glucose did not influence the ability to form biofilm in our MRSA strains (p=0.165). MSSA strains are not strong biofilm-producers, but, when grown in TSB added with 0.25% glucose, the number of biofilm-forming strains increases, as expected.
These data suggest a possible association between methicillin-resistance and biofilm formation.
Received February 13, 2008 Accepted July 24, 2008
S H O R T CC O M M U N I C AT I O N S
Corresponding author: Antonietta Lambiase
philia, Alcaligenes xylosoxidans e Chryseobacterium spp (1, 4, 5, 10, 11, 12, 15). L’isolamento sempre più frequente di ceppi di Staphylococcus aureus resistenti alla meticillina (MRSA) da campioni respiratori di pazienti CF determina difficoltà terapeutiche e, conseguente-mente, difficoltà di eradicazione del patogeno. La resistenza alla meticillina, e quindi a tutti i ß-latta-mici, è correlata alla produzione di una penicillin-binding protein (PBP2) con attività trans-peptida-sica necessaria alla sintesi del peptidoglicano anche in presenza di antibiotici ß-lattamici. Molti patogeni isolati dal polmone CF sono con-notati dall’abilità a formare biofilm, ossia comu-nità sessili di batteri che formano aggregati su superfici biologiche o sintetiche utilizzando una matrice polimerica di loro sintesi. Tale abilità con-ferisce vantaggi quali protezione dalla risposta immunitaria ed antibiotico-resistenza (14, 16). Primo scopo del presente studio è analizzare la capacità di produzione di biofilm da parte di ceppi di Staphylococcus aureus sia sensibili (MSSA) che resistenti alla meticillina (MRSA) isolati da campioni respiratori di pazienti CF. Inoltre, il secondo scopo è confermare una possibile influenza da parte delle condizioni di crescita bat-terica sull’abilità nella produzione di biofilm (6, 7, 9).
MATERIALI E METODI Ceppi batterici
Gli isolati di Staphylococcus aureus utilizzati in questo studio sono ottenuti da colture di campioni di espettorato naturale o indotto, di pazienti affe-renti al Centro di Riferimento per la CF della regione Campania, presso l’Università degli Studi di Napoli “Federico II”.
Sono stati utilizzati ceppi di MSSA (n=30) e ceppi di MRSA (n=30) isolati da pazienti in follow-up presso il Centro di Riferimento campano, colle-zionati nel periodo 2003-2006.
Colture dei microrganismi, analisi fenotipica e studio di antibiotico-resistenza
Per l’isolamento dei ceppi batterici, i campioni di espettorato naturale o indotto sono stati processa-ti per le analisi batteriologiche rouprocessa-tinarie.
In particolare, i campioni sono stati uniti ad un ugual volume di soluzione all’1% di Ditiotritolo (Merck) per la fluidificazione e poi incubati a 37°C per 30 min. ed esaminati microscopicamente. La semina per la ricerca di Staphylococcus aureus è fatta su terreno Agar Sangue. L’incubazione avvie-ne in aerobiosi a temperatura di 37°C per 24 ore. Gli isolati ottenuti dall’esame colturale sono stati sottoposti a test di catalasi e coagulasi, e successi-vamente ad identificazione biochimica tramite il
sistema automatico Phoenix (Becton Dickinson). Per lo studio di antibiotico-resistenza è stato uti-lizzato un metodo in micro-diluizione, effettuato dallo stesso sistema utilizzato per l’identificazio-ne. I ceppi di Staphylococcus aureus sono stati considerati resistenti alla meticillina se presenta-vano una MIC >2 nei confronti dell’oxacillina. I criteri di sensibilità adottati rispettano i criteri interpretativi stabiliti dal National Committee for Clinical Laboratory Standards (13).
Formazione di biofilm
Per valutare l’aderenza batterica, abbiamo utiliz-zato un metodo spettrofotometrico (2) per cui gli inoculi batterici sono fatti crescere in TSB. Aliquote di tali inoculi sono poi diluite con TSB fresco (1:100) e 200 μL di ogni inoculo sono posti in micro-piastre, incubate successivamente per 24 h a 37°C. Dopo un lavaggio con PBS, i pozzetti sono colorati con cristal-violetto e l’aderenza alle superfici è letta allo spettrofotometro (570 nm). Le misurazioni di aderenza sono effettuate in tri-plicato. Infine i valori di lettura sono mediati. In tal modo, i ceppi batterici sono stati infatti rag-gruppati in tre categorie:
1. Batteri non aderenti 2. Batteri debolmente aderenti 3. Batteri fortemente aderenti secondo i seguenti cut-off:
1. ODⱕ0.120→batteri non aderenti; 2. OD>0.240→batteri fortemente aderenti; 3. OD>0.120-0.240ⱕ→batteri debolmente aderenti Per valutare l’influenza delle condizioni di cresci-ta sull’abilità della produzione di biofilm, i ceppi batterici cresciuti in TSB sono poi diluiti con TSB addizionato con 0.25% di glucosio.
Successivamente si adotta la stessa procedura e gli stessi cut-off descritti precedentemente. Analisi statistica dei dati
Al fine di valutare la significatività statistica dei dati ottenuti, i ceppi in studio sono stati divisi in quattro gruppi:
• Gruppo 1: ceppi MRSA coltivati in TSB
• Gruppo 2: ceppi MRSA coltivati in TSB+gluco-sio 0.25%
• Gruppo 3: ceppi MSSA coltivati in TSB
• Gruppo 4: ceppi MSSA coltivati in TSB+gluco-sio 0.25%
I dati in aderenza di ogni gruppo sono stati così confrontati tra loro attraverso analisi di varianza (ANOVA) per misure ripetute. Infine, sono stati considerati “statisticamente significativi” valori di p inferiori a 0.05.
MICROBIOLOGIA MEDICA, Vol. 23 (4), 2008 LAMBIASE A, ROSSANO F, DEL PEZZO MA, et al
235 RISULTATI
I risultati ottenuti dalla tecnica applicata in tale studio (tabella 1 e 2) indicano che i ceppi di MRSA sono fortemente produttori di biofilm, indipendentemente dall’influenza che il glucosio può avere sulla crescita batterica (gruppo 1 vs gruppo 2, p=0.165).
Dal confronto fra ceppi MRSA e ceppi MSSA risulta che i primi sono spiccatamente produttori di biofilm rispetto ai secondi (gruppo 1 vs gruppo 3, p<<0.05; gruppo 2 vs gruppo 3, p<<0.05 ). Inoltre i ceppi di MRSA sono maggiormente pro-duttori di biofilm anche rispetto a ceppi di MSSA coltivati in mezzo addizionato con glucosio (grup-po 1 vs grup(grup-po 4, p<<0.05; grup(grup-po 2 vs grup(grup-po 4, p<<0.05 ).
I ceppi di MSSA, invece, non mostrano tale carat-teristica (gruppo 3, 8/30 ceppi; 26.6%).
Nel contempo, però, è molto interessante notare
che, in terreno addizionato con glucosio, risulti statisticamente significativa la quota di ceppi MSSA che divengono produttori di biofilm (grup-po 3 vs grup(grup-po 4, p<<0.05).
DISCUSSIONE
L’incremento della sopravvivenza media dei pazienti CF è un dato correlabile sia alle nuove strategie terapeutiche adottate, sia alla disponibili-tà di centri di riferimento specializzati. Nel con-tempo, però, la pressione selettiva esercitata pro-prio dai trattamenti chemioterapici ha inevitabil-mente dato la possibilità dell’emersione di ceppi con particolari resistenze.
Staphylococcus aureus rappresenta, insieme a Pseudomonas aeruginosa, uno dei maggiori pato-geni responsabili di infezioni polmonari in CF e tale consistente contributo nello sviluppo della patologia infettiva polmonare in CF è proprio
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ascrivibile alla capacità di produrre biofilm. I dati mostrati indicano che ceppi di Staphylococcus aureus caratterizzati dalla resi-stenza alla meticillina sono, nel nostro caso, anche caratterizzati da una spiccata capacità di formare biofilm almeno in vitro. È noto che nella produ-zione di biofilm da parte di Staphylococcus aureus è coinvolto il locus genico di adesione intracellu-lare (ica operon) (3) così come per la resistenza alla meticillina sono coinvolte le cassette geniche mec (SCCmec tipo I, II, III) (8), ma non vi sono dati in letteratura riguardo una possibile ed even-tuale correlazione anche biochimica fra resistenza alla meticillina in ceppi di Staphylococcus aureus produttori di biofilm. Ciò nonostante, i nostri dati sono suggestivi di una stringente correlazione, almeno in termini di prevalenza, fra queste due caratteristiche.
Inoltre, tali dati confermano anche che la com-plessa regolazione della formazione del biofilm dipende fortemente anche dalle condizioni ambientali.
In conclusione, i nostri dati indicano che lo studio quantitativo della produzione di biofilm da parte di ceppi di MRSA isolati dal polmone CF risulta essere un importante tassello nel complessivo stu-dio fenotipico, rappresentando anch’esso uno strumento di conoscenza necessario per caratteriz-zare ulteriormente i ceppi responsabili di infezio-ni polmonari in pazienti CF.
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