1
CAPITOLO 1
LA SUPERFAMIGLIA ABC
La superfamiglia di proteine transmembranali dipendenti, detta
ATP-binding cassette (ABC) è una delle più grandi famiglie di proteine distribuite
nel regno vivente. Sono proteine transmembrana capaci di regolare il passaggio di diverse tipologie di sostanze attraverso numerose barriere fisiologiche: Barriera EmatoEncefalica (BEE), placenta, intestino, stomaco, fegato.
Queste proteine sono di solito costruite da 2 domini transmembrana (TM) e 2 domini nucleotide-binding (NB). Nei batteri, questi 4 domini possono esistere come subunità distinte, mentre nei mammiferi, le proteine ABC spesso sono formati da un singola catena polipeptidica. La maggior parte delle proteine ABC sono trasportatori di membrana, ed agiscono sia importando (batteri) o che esportando (mammiferi) i loro substrati, attraverso l’azione dall'energia d’idrolisi. La gamma di substrati trasportati da proteine ABC è sorprendente, e comprende ioni cloruro, aminoacidi, farmaci, piccoli peptidi e proteine di grandi dimensioni. Negli ultimi anni, significativi progressi sono stati fatti nella determinazione del strutture molecolari ad alta risoluzione di proteine ABC, che a sua volta ha portato ad una migliore comprensione del loro eventuale meccanismo di azione. Tuttavia, molti dettagli importanti restano ancora da chiarire.
Attualmente sono noti 49 geni per i trasportatori ABC, raggruppati in 7 sottofamiglie: ABCA, ABCB, ABCC, ABCD, ABCE, ABCF, ABCG.
2
Figura 1: Struttura a livello di membrana dei principali trasportatori ABC
1.2 LA GLICOPROTEINA P
Il gene ABCB1, anche noto come gene della resistenza multipla (MDR1), è il trasportatore meglio caratterizzato per la sua capacità di conferire un fenotipo MDR alle cellule tumorali che hanno sviluppato resistenza ai farmaci.
Il gene MDR1 codifica per la glicoproteina-P (P-gp), che è una glicoproteina con un peso molecolare di circa 170 kDa. E’ stata chiamata P-gp, dove P sta per permeability, in quanto fin dall’inizio risultò essere associata ad un’alterata permeabilità della membrana ai farmaci.
La Multifarmaco resistenza (MDR), spesso associata all’espressione della P-gp, è uno dei principali ostacoli alla chemioterapia per il cancro, e alle sfavorevoli risposte terapeutiche riscontrate in molte altre patologie come ad esempio nelle malattie parassitarie, e nell'AIDS.
Fisiologicamente ha un'espressione strategica sulle superfici luminali di organi deputati all'assorbimento, distribuzione ed eliminazione dei farmaci, quali la membrana canalicolare degli epatociti, le membrane ad orletto a spazzola degli enterociti dell'intestino tenue e delle cellule dei tubuli renali prossimali, le cellule endoteliali e gli astrociti della barriera ematoencefalica, la barriera ematotesticolare, il lato materno della placenta.
3
Figura 2: Tessuti dove è espressa la glicoproteina-P.
La P-gp è anche coinvolta nella secrezione degli steroidi surrenali e dei sali biliari. E' espressa anche nelle cellule immuni, dove sembra implicata nell'attivazione delle cellule T da alloantigeni e nella citotossicità mediata da cellule NK. Sono state ipotizzate anche altre attività della P-gp, come, per es., l'inibizione della morte cellulare programmata.
L’Efflusso del farmaco mediato dalla P-gp, spesso, determina anche una variazione della biodisponibilità orale dei farmaci, limitandone l'assorbimento intestinale.
Le conoscenze sugli aspetti strutturali e funzionali della P-gp sono decisamente migliorate negli ultimi anni, grazie alla decifrazione della struttura di alcuni trasportatori batterici che hanno aperto la strada per la costruzione di modelli di omologia per trasportatori più complessi.
4 La P-gp è una proteina la cui struttura primaria è rappresentata da un unico polipeptide di 1280 aminoacidi, suddiviso in 2 unità ripetute, ognuna di 610 aminoacidi, collegate da un segmento di 60 aminoacidi (linker region). Questa proteina è N-glicosilata sul lato extracellulare.
La minima unità funzionale consiste in 4 domini:
• 2 domini trans membrana (TMD), detti anche “membrane spanning domains” (MSD);
• 2 domini leganti il nucleotide (NBD).
La proteina ha una struttura pseudo-simmetrica costituita da due frammenti, ognuno dei quali include un dominio transmembrana (TMD) e un dominio di legame col nucleotide (NBD). I due frammenti interagiscono per formare un singolo trasportatore funzionale.
I dati di idrofobicità indicano che ogni TMD è costituito da 6 -eliche. I 12 domini transmembrana sono responsabili della formazione del canale transmembranale. Esso ha un diametro di 5 nm ed un’altezza di 8 nm.
Al dominio idrofobico segue il dominio idrofilo che contiene il sito di legame del nucleotide; quest’ultimo si trova sul lato citoplasmatico della membrana e accoppia l’idrolisi dell’ATP con il processo di trasporto.
La P-gp è una proteina di trasporto ATP-dipendente che presenta un’attività ATPasica basale anche in assenza di substrato; questa attività ATPasica aumenta in presenza del farmaco.
5
Figura 3: (A) la glicoproteina P consiste di 2 metà equivalenti, ciascuna con 6 segmenti TM e un dominio
citoplasmatico NB. (B) Un modello strutturale a bassa risoluzione della Pgp generato utilizzando misure di FRET delle distanze che separano regioni chiave della proteina (Lugo e Sharom 2005b). (C) Un modello strutturale a media risoluzione della Pgp ottenuta da studi di crio-microscopia elettronica (Rosenberg et al. 2005).
1.4 SITI di GLICOSILAZIONE
La P-gp è stata osservata per la sua capacità di essere glicosilata nei suoi tre residui di Asparagina (N91, N94, N99) presenti nel primo loop extracellulare dalla parte extracellulare della membrana, vicino all’ azoto-terminale.
Mentre, non si riscontra nessun cambiamento nel lato C-terminale, in presenza di Tunicamicina (inibitore della glicosilazione delle proteine), indicando chiaramente che la glicoproteina non viene glicosilata.
Sebbene la glicosilazione sembra essere necessaria per il corretto funzionamento di trasportatore sulla superficie cellulare, non è essenziale per la funzione di trasporto della P-gp in quanto la sua assenza non influisce direttamente sulla capacità della proteina di conferire farmaco resistenza. Di
6 conseguenza, si potrebbe ipotizzare che questi siti di glicosilazione potrebbero svolgere un ruolo importante nella selezione e stabilizzazione della P-gp nella membrana plasmatica. Come si vede in Figura, cerchi solidi grigi rappresentano le posizioni presumibili di mutazioni nella P-gp.
Figura 4: Posizioni presumibili di mutazioni nella P-gp
1.5 SITI DI FOSFORILAZIONE
E’ dimostrato che la P-gp è anche un potente substrato per la fosforilazione dalle proteine chinasi A e C a quattro residui di serina o treonina nelle regioni linker S661, S667, S671, S683
Una P-gp con mancanza di tutti i siti di fosforilazione presenta ancora la sua funzione di trasporto normale e persino conferisce resistenza ai farmaci alle cellule sensibili, ma il motivo esatto per questo fenomeno non è ancora chiaro.
7
1.6 TMDs
Secondo le trame di idropatia della P-gp, ciascun TMD (dominio transmembrana) comprende sei segmenti TM, (transmembrana) collegate da un elevato contenuto di -eliche, e diversi anelli intracellulari o extracellulari,tra cui TMs 4, 5, 6, 10, 11 e 12 che danno i maggiori contributi alla traslocazione e al legame del farmaco.
La ricerca ha rivelato che i residui di amminoacidi, come L65 in TM 1, S222 in TM 4, 1306 in TM 5, A342, F343, L339 in TM , F728 in TM7 1868, G872 in TM 10, F9 42 e T945 in TM 11, e anche L975, V982 , A985 in TM 12 , svolgono un ruolo importante nella struttura e la funzione della P–gp.
Gli NBDs non sono necessari per la funzione della P-gp, infatti una molecola deleta delle porzioni NBDs sulla P–gp, mantiene ancora la capacità di interagire con substrati.
1.7. NBDs
Gli NBDs (Domini di legame) posti sul lato della membrana citoplasmatica e capaci di essere regolatori, hanno dimostrato di giocare un ruolo cruciale nel legare e idrolizzare ATP (Adenosina Trifosfato).
Ciascun NBD è composto di circa 220 sequenze amminoacidiche altamente conservate che sono comunemente coinvolte nel processo dell’idrolisi dell’ATP, chiamate motivi Walker A (WA) e Walker B (WB) utilizzati per il legame fosfato dei nucleotidi, una sequenza dodecapeptide denominata regione linker C o dominio LSGGQ , e D, H,Q, e A loops. A causa dei domini descritti, la P-gp appartiene alla superfamiglia dei trasportatori ATP Binding Cassette (ABC). In generale, i residui amminoacidici del primo NBD
8 sono descritti come segue : Walker A (residui 427- 435 ), il principale sito di legame ATP che contiene una grande quantità di residui di lisina, e Walker B (residui 531 - 542 , contenente notevole quantità di acido aspartico e in grado di legarsi con Mg2, e LSGGQ (residui 551-556). Di conseguenza, i secondi residui di amminoacidi NBD sono elencati rispettivamente come 1.070-1.078 , 1.176-1.182 e 1.196 1.201.
Figura 5: Residui di amminoacidi NBD
1.8 LINKER
Le due metà della P-gp umana sono collegate tra loro da un peptide linker di circa 80 amminoacidi (633-709).
Attualmente i meccanismi di trasporto degli xenobiotici attraverso la P-gp non sono ancora del tutto noti, proprio a causa delle insufficienti informazioni riguardo la struttura della proteina stessa, anche se molteplici studi di fotoaffinità, mutagenesi, labeling e cross-linking hanno consentito di identificare i residui coinvolti nel legame con il substrato.
9
1.9POSSIBILE SACCA DI LEGAME DL FARMACO ALLA P-GP
L'esame dei siti attivi del legame del farmaco della P-gp è sempre stato un aspetto importante e interessante della ricerca sulla P-gp. L’aspetto generalmente accettato è che ci sono almeno tre siti di legame di farmaco / substrato e un sito allosterico della P-gp; questi sono indipendenti ma interagiscono tra loro per svolgere la funzione di trasporto della P gp. Molti inibitori della P-gp interagiscono principalmente reversibilmente con uno o più dei tre presunti siti di legame del farmaco / substrato e quindi sono inibitori competitivi. Studi con un substrato hanno mostrato che il sito di legame del farmaco è una "tasca a forma di imbuto ", circondata da 12 segmenti TM; il sito è stretto sul lato citoplasmatico, almeno 9~15 Å, ampia nel mezzo, e più ampia sul lato extracellulare. Il sito consente il passaggio solo ai dimeri stipiamide più grandi di 11 Å, ma inferiori a 35 Å di lunghezza che possono adattarsi alla tasca di legame del farmaco. Questa tasca di legame del farmaco potrebbe essere grande abbastanza per ospitare più di un substrato allo stesso tempo utilizzando una combinazione organica di residui amminoacidici di diverse regioni TM per formare uno specifico sito di legame del farmaco per un particolare farmaco. Così, diversi substrati possono occupare diversi siti di legame. Un meccanismo "substrato fit indotto " postula che i residui dai multipli segmenti TM contribuiscono a una tasca comune di legame del farmaco all’interfaccia, perché una delezione mutante perdendo NBDs potrebbe ancora interagire con substrati di farmaco. In questo meccanismo, un substrato genererebbe il suo sito di legame utilizzando varie combinazioni di residui da differenti TMs e il numero e i tipi di residui coinvolti nel legame del substrato determinerebbe la sua affinità per il substrato. Dal momento che la tasca di legame del farmaco è sorretta dall’'accerchiamento dei segmenti di TM, TW Loo et al. hanno proposto che TM7 è di importanza equivalente con TM1 nella metà C-terminale, che contribuisce contemporaneamente in parte al legame del farmaco.
10 Essi hanno inoltre sottolineato che durante l’idrolisi dell’ATP, dovrebbero verificarsi significativi cambiamenti conformazionali tra TMs 5 e 8 , mentre l’idrolisi dell’ATP promuove interazioni tra l’estremità extracellulare TM1 e TM 11. Nel 2005, K. Pleban et al. hanno confermato che la tasca di legame del substrato è all'interfaccia tra TMD1 e TMD2. Inoltre, la tasca di legame del farmaco è collegato all'esterno da una apertura laterale (partizione centrale) che è abbastanza larga da consentire il transito del substrato.
Figura 6: Modello di tasca di legame circondato da TMs.
Il gruppo di ricerca di Lugo ha rivelato l'esistenza di almeno due siti di legame, che cooperano e interagiscono positivamente, definiti siti H e R per la loro preferenza rispettivamente per Hoechst 33342 e rodamina 123,. Il sito R sembra essere posizionato vicino al confine della membrana citoplasmatica . La P-gp può operare come farmaco flippase, spostando substrati dal foglio interno al foglietto esterno della membrana plasmatica. La P-gp in stato di riposo è nella conformazione "chiusa". Una domanda imbarazzante è come i substrati entrano nella tasca di legame del farmaco quando è nello stato attivo. Una vista è che due "porte" si formano nel doppio strato lipidico, uno tra TM2 (TMD1) e TM11 (in TM2) ad un lato della tasca legame del farmaco, e l'altro tra TM5 (in TMD1) e TM8 (in TM2) sul lato opposto. Dato che la tasca di
11 legame del farmaco è più accessibile all'acqua e maggior parte dei substrati sono idrofobici, l’entrata di substrati nella tasca di legame del farmaco potrebbe essere bloccata e sarebbero invece inseriti nel doppio strato lipidico vicino alle “porte”. Quando le porte della tasca di legame del farmaco legano substrati, seguono significativi cambiamenti conformazionali e inizia il ciclo di trasporto.
Figura 6: Modello del legame farmaco e P-gp
1.10 PREVISTO TERZO MODELLO STRUTTURALE DELLA P-GP
Nonostante negli anni di sforzi si siano concentrati su una considerevole analisi biochimica e la funzione della sua struttura 2-D, le informazioni sulle strutture 3-D devono essere ancora completamente chiarite. Questo è, in gran parte, dovuto alla difficoltà di cristallizzazione del cristallo puro della glicoproteina perchè P-pg è una proteina chiusa nella faccia interna (citoplasmatica) della membrana. Fortunatamente, moderne tecnologie scientifiche in materia di computer e biochimica hanno contribuito a fornire ulteriori informazioni sulla struttura 3-D della P-gp attraverso le indagini del suo meccanismo funzionale. Diversi modelli strutturali 3-D a disposizione della P-gp a livello atomico sono state elaborate formando una camera
12 acquosa all'interno della membrana. Nel 1997, Rosemberg et al. usarono il microscopio elettronico e le analisi delle immagini per fornire le prime intuizioni strutturali della P-gp trasportatrice utilizzando la P-gp purificata di criceto cinese purificata derivata da microscopia elettronica ad una risoluzione di 2,5 nm. P-gp ha forma toroidale e diametro di circa 10 mm. C’è una largo poro centrale di diametro 5 mm con una profondità massima di 8 mm e due lobi 3 mm, che sono chiusi in corrispondenza della faccia della membrana citoplasmatica. Considerando la profondità del doppio strato lipidico (4 mm), almeno la metà della P-gp è intarsiata nella membrana. Inoltre, hanno presentato una ulteriore conferma 3-D dei cambiamenti della P-gp dopo il legame di nucleotidi al NBD intracellulare a una risoluzione limite di ~2 nm, determinata da elettroni cristallografi di cristalli di colorazione negativa. I loro dati hanno rivelato che quando i nucleotidi si legano, i TMDs si riorganizzano in tre domini compatti che sono ciascuno 2~3 mm di diametro e 5~6 nm profondi, aprendo il poro centrale lungo la sua lunghezza in modo che potrebbe consentire l'accesso di farmaci idrofobici direttamente dal doppio strato lipidico al poro centrale del trasportatore. In assenza di nucleotidi, i due TMDs formano un unico cilindro 5~6 nm di diametro e 5 nm profondo con un poro centrale che è aperto alla superficie extracellulare e che abbraccia gran parte della profondità di membrana. Nel 2002, J.K. pajeva et al. proposero un modello farmacoforico generale della P-gp con farmaci associati che coinvolge due punti idrofobici, tre punti di accettori di legame ad idrogeno, e un punto di donatore di legame ad idrogeno organizzata in una precisa geometria. A differenza di altri modelli il modello descritto da S. Vandevuer et al. fu creato usando una combinazione di diversi metodi in silico comprendendo tutte le possibili informazioni strutturali su entrambi i domini TM ei NBD derivanti da studi di cross-linking sulla P-gp. Questo modello a livello atomico della proteina in assenza di ATP è abbastanza completo e coerente perché i dati sperimentali per la P-gp relativi a questa
13 struttura sono stati accuratamente selezionati, i risultati del modello sono in buon accordo con la struttura della P-gp ottenuto per EM in un ambiente lipidico. Pertanto, questo modello ha forse fornito un valido punto di partenza per la comprensione di un completo quadro strutturale della P-gp insieme al suo meccanismo catalitico. Nel 2005, M.K. al- Shawi et al. hanno proposto un nuovo modello di farmaco trasporto della P-gp derivato dai risultati di studi mutagenici, quantitativi, termodinamici e cinetici che rappresentano in modo soddisfacente per la maggior parte della insolita cinetica, accoppiamento e funzionalità fisiologiche della P-gp . Questo dettagliato modello strutturale atomico suggerisce che residui di glicina 185 hanno un punto cardine nei cambiamenti di trasmissione conformazionali tra i siti catalitici e il dominio di legame del farmaco colchicina. Essi hanno inoltre postulato che l'ordine ottimale dei TMS dovrebbe essere 2,3,4,1,6,5 per la metà N-terminale e 8,9,10,7,12,11 per la metà C-terminale. Più di recente, nel 2006, S. Murakami et al. hanno descritto le nuove scoperte della P-gp in natura, fornendo informazioni utili per la designazione di inibitori potenti con strutture chimiche nuove. Un risultato significativo di questo lavoro è che una proteina molto simile è stata trovata nei batteri AcrB di Escherichiacoli; questa proteina non solo possiede un alto grado di similarità di sequenza con la P-gp, ma condivide anche notevolmente simili specificità di substrato. La struttura cristallina ad alta risoluzione della Escherichia coli proton-motive AcrB pompa di efflusso multifarmaco indica la presenza di una grande cavità (500 A cubica) circondato da eliche . Le strutture determinate indicano che i farmaci sono estromessi da un meccanismo rotante a tre stadi in cui substrati subiscono ordinati cambi di legami.
14 Ad oggi, prevalgono tre modelli di efflusso mediato del farmaco della P-gp, vale a dire il modello di pompa classica, "modello flippase" e il modello HVC (Hydrophobic vacuum cleaner). Nel " classico modello pompa," o " modello poro ", il trasportatore prende substrati dal compartimento citosolico e successivamente li trasloca attraverso un canale proteico acquoso nello spazio extracellulare. Nel modello flippase substrati lipofili devono essere incorporati nel foglietto interno della membrana plasmatica, successivamente legando alla proteina nel piano della membrana e poi ruotando gli agenti al foglietto esterno del doppio strato. L’ampiamente riconosciuto " modello HVC” integra le principali caratteristiche dei due modelli precedenti e suggerisce che la P-gp può raccogliere substrati lipofili da qualsiasi parte della membrana e di trasportarli attraverso un preposto canale centrale.
Figura 7: Pompa classica, aspirapolvere e modelli flippasi di azione della Pgp.
Pompe Classiche trasportano un substrato polare dalla fase acquosa su un lato della membrana alla fase acquosa sull'altro lato attraverso un percorso idrofilo formato dalle regioni TM del proteina. Nel modello aspirapolvere, i farmaci prima si ripartiscono nel doppio strato lipidico, e interagiscono con la glicoproteina P all'interno della membrana. Sono successivamente effllussi nella fase acquosa sul lato extracellulare. Nel modello flippasi, i farmaci si
15 ripartiscono nella membrana, interagiscono con la tasca di legame del farmaco in Pgp all'interno del foglietto citoplasmatico e sono poi traslocati nel foglietto della membrana esterna, dove possono ripartirsi nella fase acquosa extracellulare
1.12 CICLO CATALITICO
Il meccanismo riguardante il ciclo del trasporto mediato dalla P-gp è stato ampiamente studiato ma rimane controverso, e questo può essere attribuito al fatto che l’ analisi cinetica del trasporto della P-gp è stato sviluppato lentamente e perché lo studio di metodi specifici è lungi dall'essere completo e maturo. Dal momento che ogni modello del ciclo catalitico della P-gp deve essere testato contro una rigorosa analisi cinetica di attività di trasporto in condizioni in cui la P-gp agisce in un sistema di celle fisiologicamente rilevanti, la convalida in vivo è in ultima analisi necessaria. Diversi tipi di interazione sono coinvolti come, in particolare, il legame ad idrogeno, π- π, o catione –π, o carica-carica . In generale, un ciclo di trasporto in tre fasi è stato sempre più riconosciuto. Studi che usano le mutagenesi della cisteina e cross-linking ossidativa forniscono prove ulteriori che quando la P-gp si lega ad un particolare substrato, la sequenza dei segmenti TM nel sito di legame farmaco si trasformerà, con conseguente alterazione della conformazione della sacca di legame del farmaco. Come esempio, le porte chiuse e la sacca diventano accessibili al mezzo acquoso. Inoltre, la sequenza LSGGQ e siti Walker A contribuiscono nel trasmettere cambiamenti conformazionali dal sito di legame del farmaco ai siti di legame dell’ ATP; questo probabilmente per il legame del farmaco nelle NBDs. Di conseguenza, i composti che simulano / inibiscono l'attività ATPasi devono effettuare gli aggiustamenti corrispondenti a diminuire / aumentare rispettivamente la distanza tra Walker
16 A le sequenze LSGGQ. Inoltre, altri cambiamenti avvengono presso le interfacce tra i due ATP-ligandi, NBDs può effettuare attività ATPase, cosi come l'avvio di efflusso del farmaco, perché P-gp ha una bassa attività ATPasica in assenza di substrati di farmaco. È interessante notare che un precedente studio ha scoperto che l'attività basale ATPasi della P-gp può essere stimolata più di 20 volte dopo il legame ad un substrato in posizione di legame ad alta affinità, in confronto ad una relativamente bassa affinità.
Altri studi, come la ricerca che ha misurato il tasso di cross-linking in entrambi i siti di legame al contrario del cross-linking in assenza di un substrato di farmaco, suggerisce che i luoghi di legame ATP o l'attività di idrolisi può essere stimolata da certi substrati (e.g., verapamil, demecolcine e calceina-AM) o diminuisce (Hoechst 33342 e ciclosporina A), alla fine, controllando il tasso di idrolisi dell’ ATP .
La Seconda fase: un ciclo di legame di ATP e l’idrolisi causa l’ efflusso del farmaco
La seconda fase è il rilascio di substrati di farmaco ATP guidati nel mezzo extracellulare. Dato che l'ATP può legarsi a uno dei due siti ATP attraverso un meccanismo "sito alternato" nel processo, poi entrambi i siti possono idrolizzare l’ATP. Alcune domande rimangono ancora, compreso il modo come l’idrolisi dell’ATP è accoppiato all’ efflusso di farmaco e se c’è o no "cooperazione" tra i due siti all'interfaccia del dimero NDB . In passato, si credeva che l’idrolisi dell'ATP iniziasse nel sito ATP C-terminale, ma recenti risultati hanno suggerito che i due siti che partecipano all'avvio del legame ATP e l’idrolisi può essere casuale e irregolare, ma cambia alternativamente. TM11 e TM2 partecipano ai cambi conformazionali guidati dall’ATP perché contribuiscono alla formazione di aperture che permettono ai substrati di farmaco di entrare nella tasca di legame del farmaco comune con il solvente .
17 Inoltre, l’ATPasi idrolisi può risultare nel riarrangiamento dei segmenti TM intorno alla tasca-legame del farmaco, conducendo alla trasformazione della tasca di legame del farmaco da uno stato ad alta affinità a uno stato di bassa affinità. Mutagenesi di cisteina-scanning e oxidative cross-linking hanno dimostrato che il riarrangiamento di TM11 può anche contribuire al rilascio di substrato farmaco durante l’ idrolisi dell'ATP. Durante questo ciclo catalitico, però, P-gp non subisce modifiche strutturali secondarie e solo la sua stabilità e accessibilità vengono modificati per adattarsi all'ambiente esterno. Nel 2002, Loo & clarcke hanno scoperto che con l'idrolisi della prima molecola di ATP c'è un ulteriore cambiamento conformazionale come una rotazione α-elica tra TM6 e TM12, che può essere rilevata da cross-linking disolfuro tra cisteine (L332C residuo in TM6 e L975C in TM12) .
Terza fase: Ulteriori legami ATP e idrolisi che permette la conformazione allo stato originale
L'ADP e PI dissociati dal NBD tornano allo stato di "alta affinità", ma l’ affinità del substrato del farmaco rimane ancora bassa. Seguendo la dissociazione ADP, una molecola addizionale di NBD lega all’alternata NDB, e sarebbe direttamente coinvolta nella successiva ristrutturazione dei siti di legame della membrana e recuperando la loro stabilità iniziale e accessibilità alla membrana. Accoppiato con il rilascio di Pi, l’ATP è poi idrolizzato. L'energia generatrice e la dissociazione dell'ADP ripristina la conformazione della P-gp al suo stato originale, successivamente legandolo al substrato di nuovo per iniziare un altro ciclo. Durante l'intero processo ciclico, l’accoppiamento dell’idrolisi con l’efflusso del farmaco viene postulato che si verifichi tramite la conversione della tasca di legame da una alta affinità ad uno stato a bassa affinità alterando il modello di imballaggio dei segmenti TM. Si presume che questa fase di ristrutturazione consentirebbe il legame e
18 il trasporto di un'altra molecola del substrato. La convinzione generale è che durante il trasporto del farmaco, il substrato così come i siti ATP della P-gp potrebbero subire una serie di cambiamenti coordinati nei loro stati funzionali richieste per la traslocazione guidata dall’ATP, e una fase critica è la stimolazione dell'attività ATPasi . Brevemente, il ciclo di trasporto viene avviato dal legame del substrato nei domini TM della P-gp per aumentare l'affinità ATPasi per la proteina. Dopo il legame e/o idrolisi della prima molecola di ATP in una delle NBDs, diverse ristrutturazioni si verificano nei domini TM, formando una sorta di complesso intermedio enzima-substrato che è accoppiato al cambiamento conformazionale del sito di trasporto del substrato, e questo cambiamento conformazionale permette il rilascio del farmaco al mezzo extracellulare. Un altro presumibile modello meccanicistico enzima-substrato ben esposto, che riassume il ciclo di trasporto della P-gp sulla base del modello cross-linking di Cys332 (C332, TM6), proposto da TW Loo & D.M. Clark. Nello stato disimpegnato, C332 può essere cross-linked a Cys 856 (C856, TM10) con il coss-linker tiolo-reattivo M8M che è anche un substrato della P-gp. Successivamente il substrato del farmaco diffonderà nel doppio strato lipidico e si integra con i siti di legame-del farmaco nella tasca, con conseguente alterazione strutturale di NBDs, così come la stimolazione / inibizione dell’idrolisi. Il legame dell’ATP e l’idrolisi innesca il riarrangiamento conformazionale della tasca e i legame del farmaco e facilita l'interazione tra TM6 e TM12. Come risultato, C332 può essere cross-linked a Cys975 (C975, TM12) per promuovere l'efflusso di substrati (indicato come C). Nella fase finale, Vanadate (Vi) catturando di nucleotide inibisce l’attività della P-gp, e C 332 può essere cross-linked, con Cys 976 (C976, TM12), con la M6M cross-linker, facendo tornare la P-gp al suo stato iniziale. Nel 2006 Sauna et al. hanno suggerito che la formazione di una tale reazione attiva intermedia sembra fornire il forte colpo iniziale per il movimento di un substrato del farmaco dal foglio interno al foglietto esterno del doppio strato
19 lipidico. Infine, la conclusione dell’ idrolisi della seconda molecola di ATP indica il completamento di un singolo turnover del ciclo catalitico e la P-gp ritorna alla sua configurazione originale, successivamente resettando la proteina per un altro ciclo .
CAPITOLO 2
2.1 P-gp e malattie
Attualmente le proteine di trasporto ATP -binding cassette ( ABC) rappresentano ancora un campo di ricerca impegnativo a causa della loro ampia distribuzione in diversi distretti critici coinvolti nella protezione dei tessuti, in particolare nel sistema nervoso centrale (SNC). All'interno di questa classe di trasportatori, la Glicoproteina-P sembra essere particolarmente interessante, perché agisce non solo nel limitare la
20 penetrazione di molti agenti esogeni attraverso la barriera emato-encefalica (BEE), ma anche nell'eziologia di alcune disturbi neurologici. Di conseguenza oggi è uno delle pompe di efflusso ampiamente studiate.
La Glicoproteina-P è espressa anche dalle cellule endoteliali dei vasi sanguigni, specialmente capillari, e dalle cellule epiteliali del plesso coroide, dove trasporta substrati attraverso la barriera emato-fluido cerebrospinale. L’elevata ed omogenea distribuzione della la Glicoproteina-P nel SNC mostra che questo tipo di pompa di efflusso può essere essenziale sia per la disintossicazione del cervello e per la protezione contro xenobiotici.
La ridotta inaspettata permeabilità attraverso la BEE di diversi xenobiotici lipofilici e/o farmaci antitumorali (come vincristina e doxorubicina) può essere attribuibile soprattutto all’espressione della Glicoproteina-P che pompa fuori dai capillari cerebrali delle cellule endoteliali diversi farmaci come la doxorubicina, vincristina e ciclosporina A , limitando così l'accumulo di queste molecole all'interno cellule endoteliali. Se da un lato, questo effetto protegge il cervello da sostanze tossiche, dall'altro, può rappresentare il principale fattore limitante nella la ridotta efficacia di alcune terapie per il trattamento di malattie neurodegenerative (cioè Parkinson e malattia di Alzheimer). Diversi farmaci generalmente utilizzati per la trattamento di questi disturbi possono essere ostacolate dalla Glicoproteina-P, e di conseguenza la loro permeabilità attraverso la BEE potrebbe essere drasticamente ridotta.
Molte malattie neurologiche hanno un carattere multi- eziologico, e gli attuali approcci farmacologici che utilizzano farmaci orientati verso un unico obiettivo sono spesso inefficaci. Pertanto, la progettazione razionale e lo sviluppo di nuovi strategie terapeutiche che si indirizzano contemporaneamente a diversi target coinvolti in queste patologie, potrebbero offrire migliori benefici.
21 Recentemente è stato dimostrato che la funzione della Glicoproteina-P cerebrovascolare diminuisce con le fasi avanzate di malattie neurodegenerative come il Parkinson e l'Alzheimer. La disfunzione della Glicoproteina-P potrebbe contribuire al danno neuronale indotta dal maggiore accumulo di tossine, come accade nel morbo di Parkinson ( PD ) o dalla diminuzione della capacità del cervello di espellere le proteine che si accumulano lì, come nell’Alzheimer (AD ).
Inizialmente, in entrambe queste patologie neurodegenerative, si osservano un’induzione dell’espressione e quindi un incremento dell’azione della Glicoproteina-P, in seguito al danno neuronale: nel processo neuroinfiammatorio, si ha un’intensa attivazione di microglia, che esprime la P - gp , e anche altri fattori coinvolti nei processi infiammatori, come necrosi tumorale fattore alfa (TNF - α), interleuchina - 6 (IL- 6) e l'ossido nitrico, che possono aumentare l'attività della α -P l'attivazione di questa pompa di efflusso è in grado di favorire la clearance cerebrale di composti potenzialmente tossici.
A partire da questa intuizione, il miglioramento dell’efflusso dalla BEE mediato dalla P-gp nelle fasi iniziali di questi disturbi potrebbe costituire un possibile approccio terapeutico, utile per evitare l'accumulo di tossine e proteine responsabili dello sviluppo delle malattie neurodegenerative
2.2 Malattia di Alzheimer e la Glicoproteina-P
L’AD è un malattia eterogenea neurodegenerativa multi fattoriale, caratterizzata da una progressiva perdita di funzioni cognitive e che conduce alla demenza . Le principali caratteristiche sono:
(a) l'accumulo di peptidi β-amiloide (Aβ) aggregati nel cervello, formando placche amiloidi insolubili, e
22 (b) grovigli neurofibrillari ( NFTs ), costituiti da filamenti elicoidali e proteine-t anormalmente fosforilate.
Attualmente, prove convincenti suggeriscono che una secrezione di (Aβ) è l'evento scatenante nella patogenesi di AD, mentre la t- aggregazione può essere considerata come un importante evento secondario implicato nella neurodegenerazione. Le placche amiloidi sono per lo più composte dal β-amiloide peptide (Aβ-) , che è formato dal clivaggio proteolitico della proteina precursore amiloide (APP).La prima scissione di APP è effettuata da β- secretasi, (Beta-secretase APP Cleaving Enzyme) noto anche come BACE, che è il tasso limitativo enzima in questo processo catabolico. Successivamente, il clivaggio del frammento C - terminale di APP da y- secretasi genera A β-peptidi di 40 e 42 aminoacidi di lunghezza, Aβ 40 e Aβ 42 , rispettivamente. Questi sono peptidi di aggregazione e di deposito, formando placche senili insolubili.
Figura 1: Meccanismo di formazione delle placche fibrillari
Ad oggi, l'inibizione di BACE rimane ancora un attraente traguardo terapeutico per il trattamento e la prevenzione di AD. Ma questo tipo di approccio rimane ancora un pò infruttuoso, perché troppo spesso, gli inibitori
23 BACE sembrano essere anche substrati della glicoproteina-P. Studi recenti hanno dimostrato che la quantità di Aβ- depositato nel cervello è inversamente proporzionale alla espressione della P-gp cerebrovascolare, suggerendo un ruolo chiave della P-gp nella sua eliminazione. I β peptidi, potrebbero essere eliminati da degradazioni proteolitiche, flusso di massa passiva e trasporto attivo attraverso i BEE. Quest'ultimo meccanismo di eliminazione sembra essere il più significativo . La prima prova che Aβ può essere un substrato per la glicoproteina-P fu scoperto da Lam e colleghi con esperimenti in vitro . Essi hanno dimostrato che il trasporto di un fluorescenza marcata - peptide si verifica principalmente nella sua forma insolubile; inoltre, è ATP -dipendente e coinvolge la glicoproteina-P. Di conseguenza, una riduzione di espressione della glicoproteina-P al livello BEE riduce il passaggio di Aβ dal cervello al sangue, inducendo così l'accumulo nel cervello.
Poiché l’attività della glicoproteina P può essere modulata farmacologicamente, i farmaci in grado di aumentare la sua attività potrebbero migliorare l’Aβ clearance dal cervello. Questo effetto è stato osservato in un studio clinico condotto in pazienti con lieve o moderata AD con rifampicina, un potente induttore della P- gp . Questo studio ha mostrato un declino cognitivo ridotto dopo 12 mesi di trattamento con rifampicina, perché questo antibiotico era in grado di migliorare la clearance di Aβ dal cervello attraverso il miglioramento del trasporto mediato dalla P-gp. Analogamente, un riduzione è stata riscontrata a livello di Aβ nel fluido cerebrospinale di cavie indotte da alcuni inibitori della 3 - idrossi - 3 - metilglutarilcoenzima A reduttasi ( 3–HMG CoA ) , nota come statina; questo potrebbe essere spiegato, almeno in parte, da una modulazione espressa da P-gp al BE, poiché le le statine, come simvastatina , modulano l' espressione di P-gp e di conseguenza la sua attività. Su queste basi la rimozione di aggregati potenzialmente tossici (cioè, placche amiloidi) attraverso la valorizzazione
24 della P- gp , potrebbe aumentare l'efficacia della strategie terapeutiche già esistenti per il trattamento di AD.
Sebbene la possibilità di utilizzare induttori della P-gp può essere un valido approccio per ridurre il livello di Aβ nel cervello nelle prime fasi, durante le fasi avanzate della patologia la sovra espressione di P - gp rappresenta il limite principale per l'efficacia delle attuali terapie farmacologiche. In realtà, documenti recenti hanno dimostrato che molti inibitori BACE1 utilizzabili per ridurre la formazione Aβ, sono efficaci solo ad alte dosi , perché anche loro sono substrati della P-gp. La co–somministrazione di inibitori BACE1 insieme ad un inibitore di P - gp induce una forte riduzione di un Aβ nel cervello. Questo risultato è stato corroborato da una serie di BACE inibitori di nuova sintesi che ha rivelato una elevata attività in cellule coltivate in vitro, se la stessa attività è stata drammaticamente carente di prove effettuata su cervello di topo, perché queste molecole sono anche substrati della P-gp. La concomitante riduzione dell’efflusso fuori del cervello con l'uso di appropriati inibitori P-gp possono essere necessarie per migliorare l'assorbimento cerebrale di BACE – inibitori e quindi la loro efficacia.
In effetti, GSK188909 (1), un potente e selettivo non-pepitide inibitore BACE1 ha dimostrato di inibire in vitro il β clivaggio di APP e ostacolare una produzione Aβ nelle cellule. Questo composto può anche ridurre il livello Aβ in vivo, ma l'inibizione di β -clivaggio di APP era marcatamente rafforzata quando GSK188909 è stato somministrato in presenza di un inibitore della Pgp, suggerendo così che un inibitore della glicoproteina - P migliora la biodisponibilità del composto nel cervello. Analogamente, gli stessi risultati sono stati ottenuti da Meredith e colleghi per i composti 2-4 (Fig. 2) . Inoltre, queste molecole sono entrambi inibitori BACE e substrati della P-gp.
25
Figura 2:Composti attivi come inibitori BACE1 e substrati della P-gp.
2.3 P-gp e il morbo di Parkinson
Analogamente ad AD, anche PD è una patologia neurodegenerativa attualmente incurabile. E’ caratterizzata dalla perdita di cellule dopaminergiche nella substantia nigra, anche se altri neuroni catecolaminergici nel mesencefalo sono danneggiati. Come in AD, sono stati osservati anche nel PD la presenza di aggregati proteici noti come corpi di Lewy (LBS).
La patogenesi del PD è ancora sconosciuta; tuttavia, un ruolo chiave sembra essere giocato dalla formazione dei LBs composti prevalentemente da α -sinucleina, una proteina neuronale solubile che in condizioni patologiche viene convertita in insolubili oligomeri. Non è ancora noto se la α -sinucleina coinvolta nella neurodegenerazione in PD può essere trasportata dalla P-gp, ma al contrario, è stato ampiamente dimostrato che la P-gp contribuisce all’ efflusso cellulare di alcuni pesticidi e altre tossine ambientali responsabili
26 dell’insorgenza del PD. Infatti l'esposizione a neurotossine come il substrato P-gp MPP + (Fig. 3) potrebbero contribuire al malfunzionamento dei tessuti del cervello, e può causare una sindrome parkinsoniana fortemente simile a PD. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che alcuni pesticidi e i metalli interagiscono con α - sinucleina , promuovendo così la fibrillazione in vitro, e quindi inducendo sporadici PD .
Figura 3 : Agenti ambientali che inducono PD e dotati di proprietà P-gp inibitorie
L’Attività disfunzionale di P-gp in BBB può rappresentare una delle principali cause della insorgenza di malattie neurodegenerative come PD e AD , la correlazione è stata recentemente oggetto di valutazione tra invecchiamento e la diminuzione della funzione P-gp in BBB. Lo studio condotto in vivo indica che la funzione di P–gp a livello BBB diminuisce principalmente nella regione della materia bianca e nelle regioni orbito - frontale. Diverse le tossine, come manganese che porta a PD, può essere distribuito dalla cavità nasale, in cui è espresso P–gp , nel neurone olfattivo, raggiungendo la regione del cervello. Bartels e colleghi hanno dimostrato che la riduzione della funzione P–gp è dipendente dall'età, e si verifica anche a
27 livello di bulbi olfattivi, suggerendo così una stretta relazione tra invecchiamento e maggiore suscettibilità all'insorgenza di PD. Come P-gp è una componente importante della BEE, e ha un forte impatto sulla biodisponibilità di molti farmaci, è stata recentemente studiata per la sua rilevanza clinica e efficacia in alcune terapie esistenti per il trattamento di PD . In particolare, la bupidina, un N - metil – D aspartato ( NMDA ) antagonista che ha effetti indiretti dopaminergici si è rivelata essere anche un substrato P-gp, e pertanto è attivamente estrusa dal cervello. Anche se questo farmaco non è solitamente somministrato per il trattamento del PD, l'estrusione di bupidina fuori del cervello attraverso la glicoproteina-P potrebbe spiegare, almeno in parte, il fatto che non esiste nessun correlazione tra la biodisponibilità di farmaci del SNC e i loro benefici e/o i loro effetti non voluti. Inoltre, è stato osservato che anche altri farmaci antiparkinson come L-DOPA e bromocriptina (Fig. 4) sono substrati della P-gp. In particolare, una recente indagine sulla possibile interazione tra bromocriptina e P –gp al BEE in vivo ha dimostrato che questo farmaco è trasportato da Pgp, anche se l'inibizione chimica della pompa di efflusso con Inibitori della P- gp come valspodar o elacridar è solo parziale, indicando così che la P- gp non è l'unico meccanismo attaverso il quale la bromocriptina attraversa la BBB. Nel complesso, questi risultati evidenziano che la concentrazione cerebrale e la successiva tossicità di molti farmaci antiparkinsoniani potrebbero essere dovuti alla P-gp. Pertanto, la co-somministrazione di un modulatore o un inibitore di questo tipo di trasportatore possono essere strumento utile, sia per migliorare l'efficacia della terapia antiparkinson, o per ridurre la tossicità spesso associata all'uso di questi farmaci ( cioè bromocriptina ).
28
Figura 4 : La bupidina antagonista NMDA con proprietà di substrato P-gp.
2.4 ALTRE MALATTIE NEURODEGENERATIVE E P-GP
2.4.1. Malattia di Huntington e malattia di Creutzfeldt-Jakob
La Malattia di Huntington (HD) e la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) condividono alcune caratteristiche con i disturbi neurodegenerativi precedentemente discussi. HD è una condizione neurodegenerativa caratterizzata da disturbi del movimento, declino cognitivo e disturbi psichiatrici, mentre CJD è la forma più comune di encefalopatie spongiformi umane trasmissibili, nota anche come malattia da prioni, che alla fine si traduce nella morte. La caratteristica principale di entrambe le neuropatie è l'accumulo di proteine dispiegate all'interno del cervello. Infatti, la causa primaria di HD è un disfunzione molecolare e cellulare indotta da una anomala proteina huntingtina (htt), che induce la proteina a ripiegarsi e aggregazione. Il meccanismo con cui il mutato HTT induce questi tipi di cambiamenti a livello cellulare non è stato ancora chiarito. È stato suggerito che piccoli aggregati di htt mutato potrebbero essere responsabili di effetti tossici che portano alla comparsa di HD. Attualmente, il coinvolgimento della P-gp in questa patologia non è ancora stata studiata. Uno studio recente riguarda il ruolo neuroprotettivo emergente di HMG-CoA reduttasi in un modello murino di HD ha dimostrato che la neuroprotezione indotta dalla simvastatina in relazione alla espressione della proteina Bcl-2 , un regolatore
29 della sopravvivenza cellulare associata a disturbi neurologici. Gli autori hanno valutato che la neuroprotezione raggiunta da simvastatina non riguardano i livelli di colesterolo nel cervello, ma piuttosto ai suoi effetti pleiotropici. Poiché la simvastatina è stato anche implicata in malattie neurodegenerative quali malattia di Alzheimer, la ricerca di nuovi possibili ruoli della simvastatina fornirà ulteriori informazioni, per capire l'espressione di P-gp simvastatina indotta che viene osservato in AD, rimane ancora un ipotesi possibile anche spiegare, almeno in parte, la neuroprotezione contro HD, ma questa difesa accademica ha bisogno di ulteriori indagini al fine di essere provata. Diversamente per la malattia di Huntington, il coinvolgimento della P-gp nella malattia di Creutzfeldt -Jacob ( CJD) è stato dimostrato da Vogelgesang e colleghi . Questa malattia neurodegenerativa è caratterizzata da un accumulo di un anormale isoforma (PrPsc) della proteina prionica (PrP) che forma aggregati responsabili per il progresso patologico della malattia. Come AD, l'aumento della concentrazione della proteina prionica nel cervello è associata con una riduzione nell'espressione vascolare P-gp. Coerentemente, una terapia efficace per il trattamento o nel prevenire questo tipo di malattia neurodegenerativa potrebbe essere rappresentata dall'utilizzo di induttori di espressione di P-gp, oppure modulatori appropriati in grado di migliorare la sua funzione a livello del cervello. Anche se non vi sono prove che PrP è un substrato di P–gp, due percorsi sono stati ipotizzati secondo cui una riduzione della P-gp può essere correlata alla formazione di aggregati PrPSc tossici. Un meccanismo si basa sull'ipotesi che la perdita della funzione P -gp migliora l’aggregazione PrPSc, mentre un'altra teoria riguarda l’indebolimento tra l'accumulo di PrPSc e sua degradazione indotta in base all’età dalla perdita della funzione P-gp .
30 La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa a lenta insorgenza caratterizzata da una progressiva perdita di neuroni motori nel cervello e nel midollo spinale, che porta alla paralisi e alla morte. Sebbene le cause molecolari della SLA sembrano essere ancora oscure, anche in questa malattia neurodegenerativa, il ripiegamento e la conseguente aggregazione di proteine è stato osservato come in AD, PD e HD. Superossido dismutasi 1 ( SOD1 ), una proteina citosolica prodotta dai mitocondri, che converte l'anione superossido ad H2O2, sembra avere un ruolo significativo nella patogenesi della SLA. In particolare, l’aggregazione intracellulare e/o il deterioramento di SOD1 ripiegato è associato ad una tossicità motoneuronale. Tuttavia, il meccanismo molecolare di ripiegamento e aggregazione di SOD1, e le diverse mutazioni che potrebbero portare alla formazione di queste aggregazioni tossiche, non sono ancora state pienamente rivelate. Oltre alla mutazione di SOD1, altri meccanismi sono coinvolti nella SLA come l'attivazione di proteasi, nucleasi e lipasi dovuti all'aumento dell’afflusso di calcio. Tutti questi effetti sembrano essere correlati alla eccessiva stimolazione indotta dal glutammato dei recettori postsinaptici del glutammato, in particolare recettori AMPA. Altre caratteristiche come l'alterazione dello stato ossidativo cellulare e disfunzione mitocondriale, sono state osservate nella patogenesi SLA.
Attualmente, il riluzolo ( Fig. 5 ) è l'unico agente terapeutico testato in studi clinici in pazienti con SLA. Questo farmaco ritarda la degenerazione della patologia . A causa dei suoi modesti benefici, riluzolo è stato studiato in un modello animale SLA , in combinazione con minociclina , una tetraciclina con ampio spettro di attività antimicrobica . Questa combinazione ritarda l'insorgenza della SLA, riduce il deficit motorio e prolunga la sopravvivenza del paziente. Questi effetti possono essere attribuibili del tutto alla proprietà anti- neurodegenerativa insita della minociclina e del riluzolo. Sulla base del fatto che la minociclina presenta molti effetti utili sul sistema nervoso
31 centrale, le interazioni tra riluzolo, minociclina e P-gp recentemente sono stati studiati in vivo .
Questo studio focalizza che la combinazione di questi farmaci aumenta la concentrazione di riluzolo nel cervello a causa della inibizione della funzione P gp mostrata dalla minociclina . Il ruolo della P-gp nel trattamento SLA è stato studiato dalla Kirkinezos et al. con ciclosporina A ( CsA ) , un noto substrato della P-gp.
La neuro protezione indotta da CsA era chiaramente visibile soltanto qualora la BEE è stata compromessa, e questo fatto suggerisce che l’ efficacia della terapia SLA potrebbe essere opportunamente aumentata attraverso la co-somministrazione di un inibitore della P-gp, che potrebbe creare farmaci efficientemente utili per il trattamento SLA per raggiungere il SNC.
Figura 5 : Struttura del riluzone (substrato P-gp) e minociclina (inibitore della P-gp).
2.5 EPILESSIA E P-GP
L'epilessia è una malattia neurologica che colpisce circa 1-2 % della popolazione mondiale, ed è caratterizzata da generalizzate crisi ricorrenti. Attualmente, molti progressi sono stati fatti nella ricerca per innovativi trattamenti farmacologici per l’ epilessia a causa della ridotta efficacia del soliti agenti terapeutici, strettamente connessi alla farmaco resistenza. Anche se i farmaci antiepilettici (AED) agiscono attraverso diversi meccanismi, l'insorgenza di una farmaco resistente epilessia sembra essere una caratteristica comune. Uno dei meccanismi alla base della resistenza AED è la
32 limitazione dell’accesso di questi farmaci per la regione epilettogena , risultante da una sovraespressione di trasportatori di efflusso come la P-gp a livello BBB . La prima prova di una elevata espressione di P-gp nel cervello di pazienti epilettici refrattari sono state fornite da Tishler et al., e successivamente confermato da altri. Allo scopo di valutare il coinvolgimento della P-gp nell'insorgenza della farmaco-resistenza epilessia, molti studi sono stati effettuati, al fine di valutare gli effetti della co-somministrazione di farmaci antiepilettici e gli inibitori della P-gp. Recentemente, è stato esaminato se la P-gp è coinvolta nel trasporto efflusso di fenobarbital (PB), un farmaco di prima scelta per l'epilessia generalizzata. Uno studio effettuato su ratti PB-resistenti ha dimostrato che la co-somministrazione di tariquidar, un inibitore selettivo della P-gp, e PB erano in grado di superare la resistenza farmacologica stabilita suggerendo un coinvolgimento della P-gp nel trasporto efflusso di PB dalla BEE. Molti altri studi sostengono l'esistenza di una correlazione diretta tra la sovraespressione della P–gp e la resistenza AED. In particolare, è stato dimostrato che l'inefficacia della fenitoina nella epilessia refrattaria è legata al suo modesto ingresso nel SNC per l’attività della P-gp. Inoltre, molti altri farmaci come la lamotrigina, carbamazepina, felbamato, e topiramato confermano che diversi farmaci antiepilettici sono in grado di interagire con la P–gp. Fino ad oggi, i risultati di molti studi pubblicati sembrano essere piuttosto controversi. L’evidente discrepanza tra i dati eterogenei ottenuti utilizzando diverse linee cellulari che sovraesprimono la P-gp non rende possibile estendere qualsiasi conclusione della P-gp umana espressa al livello BEE. Tutti questi risultati indicano che la co-somministrazione degli inibitori Pgp insieme a PB o fenitoina può migliorare la proprietà anti-epilettica di farmaci anti-convulsivanti, per crescenti concentrazioni locali di farmaci antiepilettici per interferenza con P-gp, con conseguente miglioramento del controllo delle crisi in pazienti con epilessia refrattaria. Oltre alla sovraespressione della P-gp nelle regioni epilettogene di
33 pazienti con epilessia AED-resistente, recenti evidenze suggeriscono inoltre che alcuni farmaci antiepilettici di prima linea sembrano essere substrati della glicoproteina-P .
Figura 6: Farmaci antiepilettici e substrati della Pgp.
La disfunzione della P-gp è stata implicata nella malattia di Alzheimer così come nel morbo di Parkinson. Queste patologie risultano dalla polimerizzazione aberrante e accumulo di proteine dispiegate all'interno del cervello. Da questo punto di vista, l'integrità della BEE è stata intensamente studiata. In particolare, il trasporto BEE attira sempre maggiore attenzione come un potenziale meccanismo coinvolto nella patogenesi di questi disfunzioni neurodegenerative. Uno degli approcci principali discussi si concentra sulla P-gp come un trasportatore di proteina che è poco attiva, o non adeguatamente espressa, a livello cerebrale. Di conseguenza, può rappresentare il fattore causale per la maggiore quantità di Aβ-aggregati nel CNS (in AD), aumento delle concentrazioni cerebrali di tossine ambientali (in PD), o accumulo di una isoforma anomalo della PrPSc (in CJD) nel cervello stesso. E’ chiaro che i livelli di espressione ridotti della P-gp possono essere implicati nell'eziologia di tutti questi disturbi, e la possibilità di organizzare
34 modulatori della P-gp potrebbe rappresentare uno strumento innovativo per favorire la rimozione delle alcune proteine patogeni dal cervello.
Inoltre, la sovraespressione della Pgp si verifica durante gli stadi avanzati di queste patologie, nonché in altri malattie neurodegenerative come l'epilessia. In quest'ultimo stato patologico, P-gp limita il trasporto di efflusso e/o impedisce ai farmaci -SNC di entrare nel cervello. Pertanto, una inibizione di questa proteina di trasporto efflusso può migliorare l'attività di alcuni farmaci antiepilettici nell'epilessia refrattaria.
Alla luce di queste considerazioni, P-gp rappresenta ancora un obiettivo innovativo, che può offrire nuovi strumenti per sviluppare più efficaci e preventive strategie terapeutiche per le malattie neurodegenerative.
2.6 P-GP ED ALTRE MALATTIE
2.6.1. Pgp e cancro
E’ stato verificato che la sovraregolazione della P-gp è implicata nella multi farmaco resistenza delle cellule tumorali maligne portando ad una forte domanda per i composti efficaci che specificamente bloccano la funzione di P-gp . Poiché la maggior parte degli studi clinici coinvolgono pazienti affetti da cancro, esiste una stretta correlazione tra l'espressione della Pg e un basso tasso di remissione e una maggiore incidenza di malattia refrattaria, pensando che questo meccanismo mediato della P-gp di MDR è di clinica rilevanza. Inoltre molti studi hanno messo in evidenza che l’ espressione della P-gp può essere un indicatore prognostico in alcune neoplasie come il neuroblastoma, sarcoma dell’ infanzia, e il cancro al seno. D'altra parte, recenti studi hanno trovato che la P-gp non solo contribuisce alla resistenza antineoplastica in qualche forma elevando la soglia apoptotica cellulare , ma è anche costitutivamente espressa su alcune cellule normali, comprese le cellule che costituiscono la barriera e funzioni metaboliche nell’ intestino, reni, fegato e endotelio microvascolare cerebrale. Coerentemente con questa premessa,
35 l'espressione della P-gp in questi tessuti porta a prevenire l’ esposizione dei tessuti sensibili agli agenti xenobiotici.
2.6.2. P-gp e HIV
Dalla metà degli anni 1990 una attiva terapia altamente antiretrovirale (HAART) è stata ampiamente usata nel trattamento e nell’epidemiologia dell'infezione da virus dell'immunodeficienza umana, con la conseguente drastica diminuzione dell’associata morbosità e mortalità dell’ HIV in tutto il mondo. Tuttavia, la resistenza virale continua a limitare l'efficacia di agenti antivirali attualmente disponibili, come gli inibitori delle proteasi antiretrovirali HIV (PLS), CCR5, e antagonisti integrasi . Simile al meccanismo della MDR mediata da Pgp nel cancro, la sovraregolazione di P-gp in cellule infettate da HIV è anche in grado di diminuire le concentrazioni intracellulari di agenti antiretrovirali nel plasma. Inoltre, in vitro e in vivo esperimenti simultanei hanno dimostrato che l’efflusso mediato della P-gp presso la barriera emato-encefalica (BBB) è un ostacolo fondamentale nel limitare la distribuzione di PLs nel cervello e la loro consegna al CNS (al sistema nervoso centrale). P-gp e il citocromo P450 (CYP3A4), un noto enzima indispensabile farmaco metabolizzante che è in grado di metabolizzare gli agenti più antiretrovirali, insieme portano alla grande limitazione per l’efficacia terapeutica rispetto all’ infezione da HIV, perché la maggior parte dei farmaci anti-HIV possono interagire con CYP3A o P-gp attraverso processi metabolici e processi di efflusso dopo somministrazione orale . Dato che la sovra espressione di P-gp ha implicazioni sostanziali in termini di conferire vantaggio selettivo alle cellule infettate da HIV nella forma di MDR, modulatori sia per P-gp e del CYP3A4 si prevedeno essere chemosensitizers sia per il cancro e per la terapia HIV-MDR. Recenti indagini di A. Maffeo et al. hanno dimostrato, inoltre, che la maggior parte dei potenziali farmaci anti-HIV, ad esempio, amprenavir (141W94), indinavir, ritonavir, lamivudina, zidovudina, e saquinavir (SQV),
36 sono tutti i supporti di prim'ordine di P-gp. P-gp contribuisce significativamente a questi farmaci rispetto al loro scarso assorbimento e conseguente elevato metabolismo delle cellule infette nell’HIV, risultando una ridotta abilità anti-HIV. Ad esempio, SQV nel primo HIV PI approvato dalla FDA, ma la sua piuttosto bassa biodisponibilità orale dovuta alla trasportazione della P-gp (con solo circa 0,74% della dose orale) limita l'ulteriore utilizzo clinico. L'inibizione di P-gp può ovviamente rivelarsi utile nel migliorare chemioterapici, e lo sviluppo di modulatori P-gp potrebbe essere un modo utile per risolvere i problemi clinici pressanti della terapia HIV.
2.6.3. P-gp e Malattie Parassitarie
Le infezioni parassitarie, come la malaria e la leishmaniosi si trovano sia negli esseri umani che negli animali di fattoria, sono malattie comuni emergenti e infettive incontrollate, di solito in aree rurali o in aree in via di sviluppo di Africa, Asia e America Latina e meno comuni nelle ree industrializzate. Tuttavia, il rapido emergere della resistenza ai farmaci è ancora un fastidio riguardo la chemioterapia per alcune malattie parassitarie, a causa della loro crescente resistenza ai farmaci terapeutici . Tra diversi meccanismi coinvolti nella resistenza di antielmintici, l’aumento dell’efflusso del farmaco dal trasportatore di membrana P-gp, rappresenta un meccanismo molto comune che contribuisce un fenotipo MDM. Alla luce di questi risultati, l’adeguata interferenza delll’ espressione della P-gp nei parassiti offre , in larga misura, una possibile strategia di inversione di lotta contro la resistenza all’antielmintico. Un buon esempio è il successo dell'interferenza di espressione della P-gp nei parassiti; questo è stato realizzato utilizzando la tecnologia RNA interferenza (RNAi), che può aiutare a ripristinare l'efficacia dei farmaci che vengono trasportati dalla P-gp, e ha portato a un rapido
37 sviluppo negli ultimi anni. Molti agenti P-gp mediati di inversione / modulazione usati nel trattamento del cancro, come il verapamile (VPL), sembrano avere effetti simili nella terapia protozoo parassitaria. Purtroppo, quasi tutti i P-gp-MDR convenzionali modulatori / inibitori del mammifero hanno dimostrato di essere inefficaci nel trattamento del protozoo parassita leishmania. Di conseguenza, c’ è ancora la necessità di trovare efficaci modulatori P-gp per protozoi parassiti. Nel 2005, F. Cortes-Selva et al. hanno analizzato la predittiva 3-D Relazione quantitativa struttura-attività (QSAR) di diversi segnalati sesquiterpeni diidro-beta agarofurani naturali e semisintetici dalle piante Celastraceae; che caratterizzano i necessari requisiti di questi sesquiterpeni come modulatori della P-gp in Leishmania, fornendo informazioni utili per ulteriori modifiche strutturali di questi sesquiterpeni nonché per la progettazione di nuovi modulatori P-gp al fine di fornire una migliore attività inibitoria .
2.6.4. P-gp Nella Fibrosi Cistica
La CF, una malattia ereditaria letale, è la più comune malattia autosomica recessiva tra la popolazione Caucasica e la popolazione del Nord america; la malattia è causata da un deficit del regolatore della conduttanza transmembrana del gene della fibrosi cistica (CFTR) . Nella maggior parte dei casi CF, c'è una delazione di Phe508 nella proteina CFTR (ΔF508 CFTR) i risultati sono piegatura difettosa e la ritenzione intracellulare della proteina. Un potenziale trattamento per la maggior parte dei pazienti con FC sarebbe usare ligando (s) di CFTR, che agisce come uno chaperone farmacologico per correggere il difetto di piegatura. Presumibilmente P-gp può integrare le funzioni CFTR carenti a causa di omologie strutturali e funzionali, e questo potrebbe essere la base per una nuova terapia per la fibrosi cistica.
Substrati P-gp o modulatori sono stati trovati per salvare il difetto della piegatura in ΔF508 CFTR. Ad esempio, chinazolina derivato CFcor 325, il migliore composto identificato tramite la tecnica dello screening ad alto
38 rendimento, si spera sia un importante composto terapeutico per il trattamento della FC .
Tuttavia, il meccanismo relativo alla secrezione ATP rimane una questione controversa. Utilizzando una stabile P-gp-sovraespressa linea cellulare CF, Naumann et al. hanno dimostrato che la sovraespressione di P-gp può causare un aumento significativo nel rilascio cellulare ATP, che potrebbe anche essere migliorata dalla stimolazione con mezzo ipoosmolare. Così, manipolando moderatamente l'eccessiva espressione di P-gp si potrebbe avere un beneficio terapeutico in CF.
2.6.5. P-gp e Altre Malattie
La sovraespressione di P-gp è stata identificata come una delle principali cause di resistenza ai farmaci nei pazienti con leucemia mieloide acuta (AML) e la sindrome mielodisplasica(MDS) . Lazarowky et al. hanno trovato che la P-gp è espressa nel mioocardio ischemico suino. Pertanto, la modulazione dell'attività P-gp potrebbe essere utile per la terapia dei cardiomiociti ischemici . Tuttavia, se o no il suo ruolo nel cuore ischemico nonché in condizioni come sospensione miocardica, stordimento e precondizionamento, può avere potenzialità rilevanti in implicazioni cliniche c’è bisogno ancora di ulteriori indagini.
La malattia infiammatoria intestinale (IBD), la malattia di Crohn e la colite ulcerosa sono tutte le sindromi caratterizzate da infiammazione cronica del tratto gastrointestinale con una eziologia sconosciuta. Studi recenti suggeriscono che la P-gp può essere un fattore importante nella patogenesi delle IBD, che può rappresentare un meccanismo adattativo per compensare la ridotta attività di P-gp nel colon. Tuttavia, se l'espressione P-gp e la funzione all'interno della mucosa sono alterati in funzione del grado di infiammazione rimane poco chiaro.
39
CAPITOLO 3
3.1 Substrati della P-gp
La P-gp è nota per espellere una vasta gamma di xenobiotici (es. composti citotossici) in particolare agenti idrofobici, con un'ampia specificità di substrato, nel tratto gastrointestinale, bile e urine. Una delle caratteristiche più interessanti della P-gp è quella di riuscire a trasportare un gran numero di composti molto diversi tra loro per funzione e struttura, ma accomunati da alcune caratteristiche quali un alto grado di idrofobicità, un basso peso molecolare (tra 250 Da e 900 Da), la tendenza ad essere carichi positivamente a pH neutro e la capacità di attraversare la membrana cellulare per diffusione passiva. Tra le diverse classi di substrati trasportati si trovano cationi organici, carboidrati, aminoacidi e alcuni antibiotici di macromolecole quali polisaccaridi e proteine.
Fra i subtrati della P-gp troviamo farmaci appartenenti a molte categorie terapeutiche, come antineoplastici quali gli alcaloidi della vinca (vinblastina, vincristina), le antracicline (doxorubicina, daunorubicina, epirubicina), i taxani (paclitaxel, docetaxel) ed anche antiaritmici, antistaminici, immunosoppressori, antivirali e farmaci utilizzati nella terapia del Parkinson, dell’Alzheimer, e di altre malattie.
Inoltre, sebbene i substrati di P-gp hanno dimostrato di essere chimicamente diversi, essi sono specifici modelli di legame idrogeno accettori che possono essere riconosciuti da catene laterali di legame a idrogeno donatori, che sono disposti in modo anfipatico nelle eliche transmembrana della P-gp .Decine di substrati putativi della P-gp sono stati gradualmente identificati e possono essere suddivisi in diverse famiglie fisico-chimiche:
40 (b)cationi lipofili, come rodamina-123 e tetrafenilfosforo;
(c)composti policiclici neutri come aldosterone, steroidi, anfifilici come Triton X-100, o a catena corta di fosfolipidi; e
(d)peptidi idrofobici come valinomicina o peptidi lineari sintetici.
Antitumorali CA-bloccanti Inibitori della proteasi HIV
Actinomicina D Daunorubicina Doxorubicina Etapaside
Diltiazem Nicardipina
Verapamil Indinavir Ritonavir Saquinavir
Paclitaxel (taxol) Tamoxifen Cardiaci Morfine
Topotectan Vinblastina Vincristina
Propaferone Amiodarone Quinidina
Digossina
Morfina-6-glucuronide Morfina Loperamide
Antiallergici Attivi sul SNC Peptidi
Terfenadina Domperidone Gramicina D Valinomicina
Antibiotici Flufenazina N-acetil-leucil-leucil-norleucina
Cefazolin Ondansetron Steroidi
Cefoperazone Perfenazina Aldosterone
Immunosoppressori Fenoxazina Dexametasone
Ciclosporina A Tacrolimus Fenitoina Idrocortisone
Figura 1 : Substrati della glicoproteina-P.
3.2 Inibitori di prima generazione
I primi modulatori utilizzati in terapia, già dagli anni ’80, sono stati i bloccanti dei canali del calcio (verpamile), anti-steroidi (tamoxifene), immunosoppressori (ciclosporina A) e una serie di antagonisti della calmodulina.
Fu stabilito anche che un composto, per essere considerato un inibitore, deve produrre uno o più dei seguenti effetti:
• Aumentare la potenza del farmaco contro cellule resistenti • Aumentare la sua concentrazione all’interno di tali cellule
41 • Dimostrare interferenza con la P-gp durante le analisi di “photoaffinity labeling” (tecnica utilizzata per evidenziare i siti di legame delle proteine)
Questa prima generazione d’inibitori non-specifici, però, ha prodotto risultati deludenti in vivo perché hanno bassa affinità e, quindi, necessitano di alte dosi di farmaco per raggiungere la concentrazione plasmatica necessaria per bloccare la P-gp. Molti di questi agenti, inoltre, sono il substrato per altri trasportatori e sistemi enzimatici, perciò risulta impossibile prevedere le loro interazioni farmacocinetiche. N OCH3 OCH3 CH3O CH3O CN (CH3)2CH CH3 VERAPAMIL Me CICLOSPORINA A N NH N N Me Me O N Me N N Me Me Me Me Me Me O O H H O Me Me Me O Me Me Me O N O Me H Me Me HO N N H C2H5 N O O O Me Me Me Me O TAMOXIFENE CH3 O N CH3 CH3
Figura 2: Struttura chimica di alcuni inibitori di prima generazione
