LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Vykintas Liutkevičius
MATRIKSO METALOPROTEINAZIŲ
RAIŠKOS IR JŲ GENŲ POLIMORFIZMO
CHARAKTERISTIKA NEPIKTYBINIŲ
GERKLŲ DARINIŲ, IKIVĖŽINIŲ BŪKLIŲ
BEI GERKLŲ VĖŽIO ATVEJAIS
Daktaro disertacijaBiomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Disertacija rengta 2006–2010 metais Kauno medicinos universitete Ausų nosies ir gerklės ligų klinikoje.
Mokslinis vadovas
Prof. habil. dr. Virgilijus Ulozas (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B) Konsultantė
Prof. habil. dr. Vaiva Lesauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
TURINYS
SANTRUMPOS ... 2
1. ĮVADAS ... 6
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
3. MOKSLINIS NAUJUMAS IR AKTUALUMAS ... 9
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
4.1. Organinės (tūrinės) gerklų ligos ... 10
4.1.1. Balso klosčių polipai ... 10
4.1.2. Atsinaujinanti gerklų papilomatozė ... 11
4.1.3. Lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze ... 13
4.1.4. Gerklų plokščių ląstelių karcinoma ... 14
4.2. Gerklų karcinomos diagnostiniai žymenys ir prognoziniai veiksniai ... 16
4.3. Matrikso metaloproteinazės ... 17
4.4. Matrikso metaloproteinazių raiškos reguliavimas ... 21
4.4.1. Matrikso metaloproteinazių raiškos reguliavimas endogeniniais faktoriais ... 21
4.4.2. Neaktyvių matrikso metalo proteinazių (proMMP) formų indukcija ... 21
4.4.3. Matrikso metaloproteinazių genų aktyvacija ... 22
4.4.4. Matrikso metalo proteinazių genų aktyvavimas dėl promotoriaus srities polimorfizmo ... 23
4.5. Matrikso metaloproteinazės ir piktybinių navikų ląstelių infiltracinis augimas bei metastazavimas ... 27
4.6. Matrikso metaloproteinazių raiška galvos ir kaklo plokščių karcinomoje ... 30
4.7. Matrikso metaloproteinazių raiška sergant lėtinėmis nepiktybinėmis gerklų ligomis ... 31
5. TIRTASIS KONTINGENTAS IR TYRIMO METODAI ... 33
5.1. Tirtasis kontingentas ... 33
5.2. Tyrimo metodai ... 34
5.2.1. Klinikinė ir morfologinė diagnostika ... 34
5.2.2. Gerklų audinio imunohistocheminis ištyrimas ... 36
5.2.3. Pacientų DNR išskyrimas iš kraujo ir MMP genų polimorfizmo tyrimas ... 39
6. STATISTINĖ ANALIZĖ ... 43
7. REZULTATAI ... 44
7.1. Pacientų klinikinių tyrimų rezultatai ir jų charakteristikos ... 44
7.1.1. Balso klosčių polipų grupė ... 44
7.1.2. Sergančiųjų lėtiniu hiperplaziniu laringitu su keratoze grupė ... 46
7.1.4. Gerklų plokščių ląstelių karcinomos grupė ... 50
7.2. Matrikso metaloproteinazių raiška ... 53
7.2.1. Matrikso metaloproteinazių raiška balso klosčių polipų audinyje ... 53
7.2.2. Matrikso metaloproteinazių raiška, kai yra lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze ... 56
7.2.3. Matrikso metaloproteinazių raiška atsinaujinančiose gerklų papilomose ... 59
7.2.4. Matrikso metaloproteinazių raiška gerklų plokščių ląstelių karcinomos audinyje ... 62
7.2.5. Matrikso metaloproteinazių raiškų palyginimas tarp ligų grupių ... 66
7.3. Matrikso metaloproteinazių genų polimorfizmo tyrimo rezultatai ... 71
7.3.1. Matrikso metaloproteinazių genų polimorfizmas pacientų, sergančių organinėmis nepiktybinėmis gerklų ligomis ... 71
7.3.2. Matrikso metaloproteinazių genų polimorfizmas gerklų plokščių ląstelių karcinomos grupėje ... 74
7.4. Rezultatų apibendrinimas ... 84
8. REZULTATŲ APTARIMAS ... 86
8.1. Matrikso metalo proteinazių raiška sergant organinėmis nepiktybinėmis gerklų ligoms ... 86
8.1.1. Matrikso metaloproteinazių raiška balso klosčių polipų audinyje ... 86
8.1.2. Matrikso metaloproteinazių raiška, kai yra lėtinis hiperplazinis laringituas su keratoze ... 88
8.1.3. Matrikso metaloproteinazių raiška atsinaujinančiose gerklų papilomose ... 89
8.2. Matrikso metaloproteinazių raiška gerklų plokščių ląstelių karcinomos audinyje ... 90
8.3. Matrikso metaloproteinazių genų polimorfizmas sergant organinėmis nepiktybinėmis gerklų ligomis ir gerklų vėžiu ... 92
9. IŠVADOS ... 96
10. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 97
11. DISERTACIJOS TEMA SPAUSDINTI DARBAI ... 114
12. PRIEDAI ... 115
12.1. 1 priedas ... 115
SANTRUMPOS
AGP – atsinaujinanti gerklų papilomatozėBGPLK – burnos gleivinės plokščių ląstelių karcinoma BKP – balso klosčių polipai
COX-2 – „cyclooxygenase-2“ ciklooksigenazė-2
EGF – „epithelial growth factor“ epitelio ląsteles stimuliuojantis faktorius
EMMPRIN – „extracellular matrix metalloproteinase inducer“ tarpląstelinis MMP sužadintojas
FGF – „fibroblast growth factor“ fibroblastų augimo faktorius GKPLK – galvos – kaklo plokščių ląstelių karcinoma
GPLK – gerklų plokščių ląstelių karcinoma KG – kontrolinė grupė
LHLK – lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze
MAPK – „mitogen activated protein kinase“ mitogeniniu būdu aktyvuotos proteino kinazės
MMP – „matrix metalloproteinases“ matrikso metaloproteinazės MMP-2 – matrikso metaloproteinazė 2 arba želatinazė A
MMP-9 – matrikso metaloproteinazė 9 arba želatinazė B ONGL – organinės nepiktybinės gerklų ligos
RECK – „reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs“grįžtamąjį ryšį skatinantis cisteinu prisotintas baltymas
SIN – „squamous intraepithelial neoplasia“ plokščių ląstelių epitelio neoplazija
TIMP – „tissue inhibitors of matrix metalloproteinases“ audinių matrikso metaloproteinazių inhibitoriai
TJA – tarpląstelinis jungiamasis audinys (tarpląstelinis matriksas)
VEGF – „vascular endothelial growth factor“ kraujagyslių endotelinių ląstelių augimo faktorius
VNP – vieno nukleotido polimorfizmas ŽPV – žmogaus papilomos virusas
1. ĮVADAS
Gerklų plokščių ląstelių karcinoma (GPLK) pasaulyje sudaro 2–3 proc. visų piktybinių navikų. Pagal susirgimo dažnį tarp piktybinių kvėpavimo takų navikų GPLK užima antrą vietą po plaučių karcinomos. Gerklos – dažniausia sritis tarp visų galvos – kaklo piktybinių navikų, tuo tarpu balso klosčių lokalizacijos navikai sudaro apie 66 proc. visų gerklų vėžio atvejų [189]. Lietuvoje, onkologinio registro duomenimis, 2009 metais gerklų vėžys nustatytas 190 vyrų ir 4 moterims, sergamumo rodiklis vyrams sudarė 11,2 atvejo 100 000 gyventojų, o moterims – 0,2 [109].
Piktybinis navikas gerklose niekada neatsiranda visiškai nepakitu-siuose audiniuose. Veikiant žalingiems faktoriams (rūkymas, alkoholio var-tojimas), vėžys formuojasi kai yra hiperplaziniai (displazija, atipija) epitelio pakitimai. Išskiriamos dvi būklės iš kurių vystosi GPLK: lėtinis hiper-plazinis laringitas su keratoze ir suaugusiųjų papilomatozė.
Nors penkerių metų išgyvenamumo rodikliai sergančiųjų balso klosčių karcinoma geresni nei kitų anatominių gerklų sričių bei tolimosios meta-stazės diagnozuojamos retai, didžiausia problema išlieka lokalių vėžio recidyvų rizika. Kiekvienas atvejis yra individualus, neretai tokios pačios diferencijacijos ar stadijos gerklų vėžys pasižymi skirtinga klinikine eiga [161]. Pastarąjį dešimtmetį pastebima, kad nepaisant diagnostikos ir gydymo metodų tobulėjimo, sergančiųjų gerklų karcinoma išgyvenamumo rodiklis mažai pasikeitė lyginant su ankstesniu laikotarpiu [65;153;161]. Tokie faktai skatina ieškoti naujų prognozinių žymenų ir molekuliniame lygmenyje tirti procesus, vykstančius piktybinių bei nepiktybinių gerklų navikų audiniuose.
Tiek piktybinio tiek nepiktybinio proceso metu vyksta tarpląstelinio jungiamojo audinio (TJA) remodeliavimasis. Vieną svarbiausių vaidmenų šio proceso metu atlieka matrikso metalo proteinazės (MMP). Tai cinko molekulę turinčios proteazės, veikiančios platų spektrą baltymų, iš kurių sudaryta tarpląstelinė medžiaga [187]. Iš visų žinomų MMP rūšių didžiau-sias dėmesys tenka želatinazių pošeimio atstovams: MMP-2 ir MMP-9. Šių proteinazių padidėjusi raiška randama vystantis daugeliui piktybinių navikų, ne išimtis ir GPLK [13;28;149;166;185;186]. Tačiau žinant, kad piktybiniai gerklų navikai vystosi lėtai, dažnai esant lėtiniams gerklų epitelio pakiti-mams, tikslinga ištirti MMP raiškos ypatumus kai yra nepiktybiniai gerklų navikai ar ikivėžinė gerklų patologija. Mūsų žiniomis iki šiol atlikti tik keli tyrimai, siekiant nustatyti MMP raišką sergant lėtinėmis nepiktybinėmis gerklų ligomis [86;149;166].
Taip pat svarbu geriau suprasti MMP raiškos reguliavimo mechaniz-mus, vienas kurių – jų genų aktyvacija. DNR grandinės promotoriaus srities, kuri atsakinga už transkripciją, genų polimorfizmas gali turėti įtakos skirtingai MMP raiškai. Mūsų žiniomis, iki šiol pasaulyje atlikta nedaug studijų, siekiant nustatyti matrikso metalo proteinazių raišką koduojančių genų polimorfizmą, tarp sergančiųjų galvos – kaklo karcinoma, o doumenų apie MMP genų polimorfizmą tarp sergančiųjų gerklų karcinoma nėra.
Mūsų darbe ištirti matrikso metaloproteinazių MMP-2 ir MMP-9 raiš-kos ypatumai tarp sergančiųjų nepiktybiniais gerklų darinias, ikivėžinėmis gerklų ligomis ir gerklų vėžiu, nustatytas jų ryšys su anamnezės ir kliniki-niais sergančiųjų duomenimis. Pirmą kartą nustatytas MMP-2 (-735C/T), MMP-2 (-1306C/T), MMP-9 (-1562C/T) ir MMP-3 (-11715A/6A) genų polimorfizmas tarp sergančiųjų nepiktybiniais gerklų darinias, ikivėžinėmis gerklų ligomis bei balso klosčių srities karcinoma.
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti gerklų audinio MMP-2 ir MMP-9 raiškos ir matrikso metaloproteinazes koduojančių genų MMP-2 (-735 C/T), MMP-2 (-1306 C/T), MMP-9 (-1562 C/T) ir MMP-3 (-1171 5A/6A) polimorfizmo reikšmę nepiktybinių gerklų darinių, ikivėžinių gerklų būklių ir gerklų plokščių ląstelių karcinomos klinikiniams ir morfologiniams požymiams. Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti gerklų audinio MMP-2 ir MMP-9 raiškos pokyčius kai yra nepiktybiniai gerklų dariniai (balso klosčių polipai), ikivėžinė gerklų patologija (atsinaujinanti gerklų papilomatozė ir lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze) bei gerklų plokščių ląstelių karcinoma ir įvertinti šių pokyčių diagnozinę vertę.
2. Įvertinti gerklų audinio MMP-2 ir MMP-9 raiškos pokyčių sąsajas su klinikiniais ir morfologiniais nepiktybinių gerklų darinių (balso klosčių polipai), ikivėžinės gerklų patologijos (atsinaujinanti gerklų papilomatozė ir lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze) bei gerklų plokščių ląstelių karcinomos požymiais.
3. Palyginti matrikso metaloproteinazes koduojančių genų MMP-2 (-735 C/T), MMP-2 (-1306 C/T), MMP-9 (-1562 C/T) ir MMP-3 (-1171 5A/6A) polimorfizmo dažnį, kai yra organinės nepiktybinės gerklų ligos bei gerklų plokščių ląstelių karcinoma.
4. Įvertinti matrikso metaloproteinazes koduojančių genų MMP-2 (-735 C/T), MMP-2 (-1306 C/T), MMP-9 (-1562 C/T) ir MMP-3 (-1171 5A/6A) polimorfizmo sąsajas su gerklų plokščių ląstelių kar-cinoma bei jos klinikiniais ir morfologiniais požymiais.
3. MOKSLINIS NAUJUMAS IR AKTUALUMAS
Šiuo metu pasaulyje plačiai nagrinėjami audinių remodeliavimosi pro-cese dalyvaujančių medžiagų raiškos dėsningumai. Didelis dėmesys krei-piamas naujų piktybinių navikų žymenų, kurie galėtų padėti prognozuoti piktybinių navikų ligos eigą paieškai. Tyrimų metu siekiama nustatyti naujas audinių ląstelių išskiriamų fermentų funkcijas bei savybes ir nusakyti šių fermentų raišką reguliuojančius mechanizmus.Gerklų vėžys – opi onkologinė problema, kurios sėkminga kontrolė ir gydymas priklauso nuo daugelio veiksnių. Dažnai pavėluoto diagnozės nu-statymo ir lokalių vėžio recidyvų problemos išlieka vienos aktualiausių otorinolaringologo – onkologo praktikoje. Literatūroje vienais iš galimų gerklų vėžio prognozinių žymenų įvardijamos matrikso metaloproteinazės. Pasaulyje atlikta keliolika studijų, siekiant nusakyti šių proteazių raiškos dėsningumus piktybinio gerklų proceso metu, tačiau pasigendama matrikso metaloproteinazių raiškos tyrimų, apimančių platesnį dar iki piktybinio naviko gerklų patologijos spektrą.
Mūsų darbe MMP-2 ir MMP-9 raiškos vertintos didelėje ir homoge-niškoje (n=112) gerklų balso klosčių vėžio grupėje. Taip pat šių proteazių raiška nustatyta balso klosčių audinyje, esant organinei nepiktybinei gerklų patologijai (balso klosčių polipai, atsinaujinanti gerklų papilomatozė, lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze). Mūsų darbe pirmą kartą MMP-2 ir MMP-9 raiškos rezultatai plačiai palyginti su klinikiniais rodikliais.
Mūsų žiniomis, iki šiol pasaulyje atlikta nedaug studijų, siekiant nu-statyti matrikso metalo proteinazių raišką koduojančių genų polimorfizmą, tarp sergančiųjų galvos – kaklo karcinoma. Didžioji dalis šių tyrimų atlikta Azijos žemyno šalyse, tyrinėta populiacija nehomogeniška, kai kurių studijų imtys nedidelės, nevertinti atskirai gerklų vėžio atvejai. Mūsų darbe pirmą kartą nustytas MMP-2 (-735 C/T), MMP-2 (-1306 C/T), MMP-9 (-1562 C/T) ir MMP-3 (-1171 5A/6A) genų polimorfizmas tarp sergančiųjų balso klosčių srities karcinoma.
Nors atliktas tyrimas pasižymi didesne moksline nauda, galima ir kli-nkinė tyrimo prasmė. Padidėjusios matrikso metaloproteinazių raiškos nu-statymas gerklų karcinomos audinyje gali padėti prognozuoti piktybinio proceso išplitimą, gali lemti gydymo taktikos ir apimties pasirinkimą indi-vidualiam pacientui.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. Organinės (tūrinės) gerklų ligosGerklos – kakle esantis neporinis organas, kurio pagrindinės funkcijos yra: balso generavimo, kvėpavimo bei trachėjos ir žemiau esančių kvėpa-vimo takų apsauga nuo aspiracijos ryjimo metu. Balsas yra pagrindinis žmonių bendravimo instrumentas, kurio generavime vieną didžiausių ir svarbiausių funkcijų atlieka tikrosioms balso klostės. Balso aparatą sudaro balso klostės ir tarp jų esąs balso plyšys, kuris yra siauriausia suaugusio žmogaus viršutinių kvėpavimo takų sritis [5]. Balso klostes dengia gleivinė, kurią sudaro dengiamasis epitelis, išsidėstęs ant bazinės membranos ir po ja esantis savasis dangalas [178]. Daugiasluoksnį plokščiąjį epitelį, kuriuo padengtos balso klostės, su savuoju dangalu jungia bazinė membrana, sudaryta iš tankaus plonų, taisyklingai išsidėsčiusių argirofilinių skaidulų tinklo: IV-o tipo kolageno, hialuroninės rūgšties, fibronektino ir kitų mukopolisacharidų [56;178]. Savasis dangalas sudarytas be griežtos orientacijos besidėstančių jungiamojo audinio skaidulų, kurios skirstomos į dvi grupes. Pirmąjai grupei priskiriami kolagenas ir elastinas, kurie atlieka savojo dangalo palaikomojo karkaso funkciją, antrai grupei – struktūriniai glikoproteinai ir proteoglikanai, užpildantys erdvę aplink kolageno ir elastino skaidulas [56;57;104]. Išskiriami trys savojo dangalo sluoksniai, kuriuose, nustatytas jungiamojo audinio skaidulų anatominis išsidėstymas fonacijos metu davė pagrindą dangalo - kūno (cover-body) balso atsiradimo teorijai [63].
Lėtinės gerklų ligos gali atsirasti dėl savojo dangalo struktūrų balanso pažeidimo ir epitelio ląstelių hiperplazijos, kuri gali progresuoti iki displa-zijos ir atipijos. Šiame darbe nagrinėjamos dažniausiai klinikinėje praktikoje sutinkamos organinės (tūrinės) gerklų ligos: pseudonavikai (balso klosčių polipai), nepiktybiniai navikai (atsinaujinanti gerklų papilomatozė), ikivė-žinės gerklų būklės (lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze) ir gerklų plokščių ląstelių karcinoma.
4.1.1. Balso klosčių polipai
Balso klosčių polipai (BKP) – vieni dažniausiai pasitaikantys nepikty-biniai gerklų dariniai, kurie apytiksliai sudaro nuo 39 iki 70 proc. visų ribotų balso klosčių darinių [91;178;200]. Dažniausiai polipai atsiranda ant vienos balso klostės priekinio, kiek rečiau vidurinio trečdalio laisvojo krašto. Netaisyklingos fonacijos metu, per stiprai ir per ilgai naudojant balsą, grubi
trinties jėga veikia balso klosčių savojo dangalo kapiliarus, sukelia jų sie-nelės vientisumo pažeidimą. Išliekant išoriniam kapiliarus traumuojančiam faktoriui, užsitęsus pakraujavimui per pažeistas kapiliarų sieneles į aplin-kinius audinius, formuojasi hematoma, atsiranda balso klostės deformacija. Rezorbuojantis krešuliui, vyksta stromos audinių remodeliavimasis: sutrinka polipo stromos audinių mityba, prasideda hipoksija, vystosi hialinozė, formuojasi naujos kraujagyslės, kurių plonos sienelės išlieka pralaidžios plazmos skysčiui ir kraujo forminiams elementams. Šio proceso pasekoje polipai auga, įgaudami dažniausiai ovalaus, lygiu pagrindu ir paviršiumi darinio formą [39;56]. Neseniai susiformavęs polipas dažniausiai būna minkštas, pilkšvos ar rausvos spalvos turi platų pagrindą, aiškią ribą su sveika balso kloste. Bėgant laikui polipas kietėja, jį dengiančiame epitelyje gali atsirasti ragėjimo plotelių [91;178]. Histologinio tyrimo metu nusta-tomas polipus dengiantis įvairaus laipsnio hiperplazavęs daugiasluoksnis plokščias epitelis, stromoje stebima puraus jungiamojo audinio edema arba fibrozė, kapiliarų proliferacija bei jų trombozė [171;178]. Elektroninės mikroskopijos metu išsskirtinai polipuose aptinkami buvusios hemoragijos ženklai fibrinas ir gausūs geležies pigmento intarpai makrofaguose, leidžia atskirti juos nuo kitų nepiktybinių balso klosčių darinių [39]. Polipų epitelio bazinės membranos ir stromos audinyje nustatyti kolageno ir fibronektino baltymų balanso pasikeitimai, lyginant su sveiku audiniu [40;56], leidžia nuspėti ir galimą kitų aktyvių medžiagų poveikį jų vystymuisi.
4.1.2. Atsinaujinanti gerklų papilomatozė
Atsinaujinanti gerklų papilomatozė (AGP) – virusinės kilmės nepikty-binis epitelinio audinio navikas, kuriuo serga tiek vaikai, tiek suaugusieji [38]. Ji yra dažniausias nepiktybinis gerklų navikas (apie 10 proc. visų gerklų navikų ir apie 87 proc. visų nepiktybinių gerklų navikų) [55;79;179]. Vaikų sergamumas AGP JAV siekia iki 4,3 atvejų 100 000 vaikų, o tarp suaugusiųjų – iki 2 atvejų 100 000 suaugusiųjų gyventojų [38]. Kanadoje vaikų sergamumo rodiklis siekia 1,11 atvejo 100 000 vaikų [21], o Danijos Karalystėje visų gyventojų sergamumo rodiklis nurodomas 3,84 atvejo 100 000 gyventojų [105]. Įrodyta, kad 6 ir 11 bei 16 ir 18 žmogaus papilomos viruso (ŽPV) tipai yra dažniausi AGP sukėlėjai [54;184;194;199]. Tačiau tarp juvenilinės formos AGP sukėlėjų atrasti ir kiti ŽPV tipai: 19, 39, 40 ir 56 [120]. Viruso genai inaktyvina ląstelių gaminamus neoplazminius proce-sus slopinančius baltymus, dėl ko suaktyvėja epitelio ląsteles stimuliuojantis faktorius (EGF), o tai skatina epitelio ląstelių proliferaciją [37;182]. Histologiškai tiriant, ŽPV įtakojama epitelio ląstelių proliferacija stebima kaip „lapų“ arba „pirštų“ kontūrų išsišakojusios kraujagyslių ir jungiamojo
audinio papilos, padengtos gerai diferencijuotu daugiasluoksniu plokščiuoju epiteliu (kuriame neretai būna keratozė), turinčiu nepažeistą pamatinę membraną [38]. Papilomos gali būti įvairaus dydžio: mažos, dažniausiai rausvos spalvos, plinta paviršiumi, didesnės dėl spartaus egzofitinio augimo įgauna nelygų smulkiai skiltėtą ar grublėtą paviršių, jų išvaizda primena žiedinį kopūstą ar avietę. Papilomų spalvinė paletė apima nuo pilkšvai rausvo iki ryškiai rausvo atspalvius, darinio ir sveiko audinio riba dažnai nėra aiški. Dažnai spalva, audinio kietumas priklauso nuo pacientų amžiaus bei ligos trukmės [91;178]. Išskiriamos dvi ligos klinikinės formos: juvenilinė ir suaugusiųjų AGP. Liga, kuri pacientams diagnozuota iki 20 metų amžiaus, priskiriama juvenilinei formai, vyresniems susirgusiems pacientams nustatoma klinikinė suaugusiųjų AGP forma [179].
AGP klinikinė eiga labai kintanti ir sunkiai nuspėjama. Ligos remisijos ir atsikartojimo epizodai dažnai keičia vienas kitą, galima malignizacijos rizika siekia 3–12 proc., dėl ko ši liga priskiriama ikivėžinei patologijai [50;64;112;179]. ŽPV vaidmuo gerklų karcinomos atsiradimo procese iki šiandien nėra visiškai aiškus. Manoma, kad virusas, įterpęs savo DNR į ląstelės genomą, sukelia naviką slopinančių baltymų genų p53 ir pRb (re-tinoblastomos baltymas) mutaciją. Viruso pažeistų ląstelių neatpažįsta žmo-gaus imuninė sistema, šios ląstelės dalyvauja vėžiniame procese [64; 154;176].
Pirmine ir viena pagrindinių papilomų lokalizacijų įvardijamos balso klostės, nes papilomos dažniau pažeidžia vadinamąsias „epitelio transfor-macijos zonas“, kur daugiasluoksnis plokščias epitelis ribojasi su dau-giaeiliu virpamuoju epiteliu. Tačiau neretai papilomų augimas išplinta į vir-šutinį ir apatinį gerklų aukštus, gali sukelti progresuojančią gyvybei pavojingą gerklų stenozę [38]. Nepaisant išbandytų ir siūlomų gydymo metodų – kaip chirurginis, konservatyvus ar kombinuotas – tenka konsta-tuoti, jog šiuo metu efektyvaus etiopatogenetiškai pagrįsto gydymo metodo dar nėra [38;50].
Svarbu pažymėti ir tai, kad etiologinis AGP agentas – ŽPV (11, 16 ir 18 tipai) gana neretai nustatomas ir plokščialąstelinio gerklų vėžio audinyje [7;112;176]. Nors vienareikšmio epidemiologinio patvirtinimo apie ŽPV reikšmę gerklų vėžio vystymesi nėra, naujausi moksliniai tyrimai patvirtina padidėjusią gerklų plokščių ląstelių karcinomos riziką tarp ŽPV užsikrėtusių pacientų. Literatūroje pateikiama prielaida, kad ŽPV gali būti abiejų minėtų ligų svarbus etiopatogenetinis faktorius [7;64;112;176].
4.1.3. Lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze
Lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze (LHLK) – viena iš obli-gatinių ikivėžinių gerklų ligų. Šia liga dažniau serga vyresni nei 40 metų vyrai, kurių skaičius ženkliai išauga peržengus 54 metų ribą [17]. Ser-gamumo šia liga rodiklis Slovėnijoje siekia 2,6 atvejo 100 000 gyventojų [49]. Neginčyjamai svarbiausi etiologiniai faktoriai įvardijami ilgalaikis gerklų gleivinės dirginimas tabako dūmais ir nesaikingas alkoholio varto-jimas, bei kiek rečiau gastroezofaginio refliukso liga (GERL) [16;52;107]. Nemažai atliktų studijų nurodo ligos atsiradimo tiesioginę priklausomybę nuo ankstyvos rūkymo pradžios ir trukmės, bei rūkomo tabako kokybės [16;31;96].
Pirmoji ligos pakopa yra atsiradęs nenormaliai didelis epitelinių ląs-telių skaičius t. y. epitelio ląsląs-telių hiperplazija. Šis procesas gali apimti abu epitelio ląstelių sluoksnius, tačiau bazinė epitelio membrana išlieka nepa-žeista. Būklė, kai ant hiperplazavusio epitelio pradeda kauptis keratinas, vadinama keratoze. Šį darinį sudaro gerai diferencijuotos, mitoziškai ak-tyvios epitelio ląstelės su keratino pertekliumi. Vėliau, ligai progresuojant, atsiranda epitelio ląstelių displazija – pasikeičia epitelio ląstelių poliariš-kumas, suardomas normalus ląstelių sluoksniuotumas. Sekantis galimas žingsnis – epitelio ląstelių atipija. Epitelio ląstelių branduolių padidėjimas ir hiperchromija, nenormalios dauginės mitozės, pakitusių ląstelių sankaupos nusako atipijos atsiradimą. Kadangi ligos metu bazinė epitelio membrana išlieka nepažeista, stromoje dažniau stebima tik vidutiniškai išreikšta lim-focitų infiltracija [49;84;178;170]. Remiantis histologinio tyrimo metu epitelyje nustatomais patologiniais pokyčiais, priskaičiuojama daugiau kaip 20 lėtinio hiperplazinio laringito klasifikacijų. Šiuo metu pasaulyje plačiausiai naudojamos trys histologinės ligos klasifikacijos:
1. Displazijos klasifikacija (Dysplasia system) 2. Liublijanos klasifikacija (Ljubljana clasification)
3. Dvinarė plokščių ląstelių epitelio neoplazijos klasifikacija (Binary system of squamous intraepithelial neoplasia (SIN))
Vieną pirmųjų displazijos klasifikaciją pateikė Kleinsasser išskirdamas tris epitelio diferencijacijos sutrikimo laipsnius: hiperplazija su keratoze ar be jos (I°), displazija su keratoze arba be jos (II°) bei intraepitelinis vėžys (III°) [92]. Kiek vėliau Kambič ir Lenart pasiūlyta „Liublijanos“ pava-dinimu lėtinio hiperplazinio laringito klasifikacija, išskyrė keturias ligos grupes: paprasta hiperplazija, displazija, hiperplazija su atipija ir neinvazinė karcinoma [83]. Dvinarė plokščių ląstelių epitelio neoplazijos klasifikacija nurodė šias ligos fazes: hiperplazija/keratozė, žemo laipsnio displazija ir aukšto laipsnio displazija [30]. Analizuojant kitas klasifikacijas, galima
išskirti keletą esminių kriterijų, kuriais remiantis klasifikuojamos epitelio ląstelių hiperplazijos. Vieni autoriai klasifikuodami kreipia dėmesį į keratino sluoksnio storį, kiti – remiasi epitelio ląstelių atipijos laipsniu ir keratino sluoksnio storiu, treti – daugiau dėmesio skiria epitelio ląstelių hiperplazijos ir atipijos laipsnio vertinimui [84]. Šios klasifikacijos, kaip ir dauguma kitų, tarpusavyje esminiais skirtumais nepasižymi. Dauguma autorių sutaria dėl vieno, kad neinvazinė karcinoma turėtų būti klasifi-kuojama atskirai nuo hiperplazijos su atipija [20;48;99;188]. Viliamasi, kad ateityje daugiau dėmesio skiriant molekulinei patologijai, bus prieita prie vieningos lėtinio hiperplazinio laringito klasifikacijos [49].
Keratozė dažniausiai atsiranda ant balso klosčių laisvojo krašto ir viršutinio paviršiaus. Mikrolaringoskopijos metu, keratozės panašios į varškės apnašą, rausvame uždegiminio audinio fone, riba tarp keratozės ir sveiko audinio ne visada aiškiai pastebima. Hiperplazijos su keratoze malignizacijos rizika, remiantis daugelio mokslininkų duomenimis, gali siekti nuo 3 iki 44,4 proc.. Laikotarpis nuo pradinės diagnozės iki karcinomos diagnozės gali siekti 5-10 metų, jis trumpėja ligos pradžioje histologinio tyrimo metu nustačius epitelio ląstelių displaziją ar atipiją [12;51;159;170].
4.1.4. Gerklų plokščių ląstelių karcinoma
Gerklų plokščių ląstelių karcinoma (GPLK) pasaulyje sudaro 2–3 proc. visų piktybinių navikų. Pagal susirgimo dažnį tarp kvėpavimo takų piktybinių navikų GPLK užima antrą vietą po plaučių karcinomos. Gerklos – dažniausia sritis tarp visų galvos – kaklo piktybinių navikų, tuo tarpu balso klosčių lokalizacijos navikai sudaro apie 66 proc. visų gerklų vėžio atvejų [189]. Lietuvoje, onkologinio registro duomenimis, 2009 metais gerklų vėžys nustatytas 190 vyrų ir 4 moterims, sergamumo rodiklis vyrams sudarė 11,2 atvejo 100 000 gyventojų, o moterims – 0,2 [109]. Kitose Rytų ir Centrinės Europos šalyse situacija kiek blogesnė, 2000 metų duomenimis, Vengrijoje vyrų sergamumo rodiklis siekė 13,1, o Rusijoje 12,5 atvejo 100 000 gyventojų [60]. Kiek mažesnis sergamumo rodiklis Vakarų Europos valstybėse ir JAV, o Azijos šalyse, tarp Australijos bei Okeanijos salų gyventojų sergamumo rodiklis žemiausias – nuo 3,9 iki 0,1 atvejo 100 000 gyventojų [189]. GPLK dažniausiai diagnozuojama 50-70 metų amžiaus vyrams [23;93]. Dažnesnis vyrų sergamumas neabejotinai susijęs su pagrindiniais rizikos faktoriais – intensyviu rūkymu ir alkoholio vartojimu. Keletas epidemiologinių studijų nurodo vėžio lokalizacijos gerklose priklausomybę nuo rūkymo intensyvumo. Viršutinio gerklų aukšto vėžiu dažniau suserga intensyviai rūkantys lyginant su vidutiniais ir lengvais
rūkoriais, kuriems dažnesis balso klosčių ir paklosčio srities vėžys [155]. Metusiems rūkyti, vėžio rizika mažėja ilgėjant nerūkymo periodui [60]. GPLK atsiradimui taip pat svarbūs kiti dažniau su profesija ir darbu susiję etiologiniai faktoriai: asbestas, policikliniai aromatiniai hidrokarbonatai ir įvairūs tirpikliai [161].
Gerklose paprastai (90-95 proc.) formuojasi plokščių ląstelių karci-noma [93;189], kitų piktybinių navikų metastazės gerklose ypač retos [6]. Piktybinis navikas gerklose niekada neatsiranda staiga visiškai nepaki-tusiuose audiniuose. Veikiant žalingiems faktoriams, vėžys formuojasi lėtinių hiperplazinių (displazija, atipija) epitelio pakitimų fone. Išskiriamos dvi būklės iš kurių vystosi GPLK: lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze ir suaugusiųjų papilomatozė. GPLK gali būti ragėjanti ir neragėjanti [93;178]. Pagal diferencijacijos laipsnį plokščių ląstelių karcinoma skirstoma į: gerai, vidutiniškai ir blogai diferencijuotą. Balso klosčių srities navikai dažniau gerai diferencijuoti, ragėjantys. Mažiau diferencijuotai karcinomai ragėjimas nebūdingas, jos augimas ir invazija į aplinkinius audinius spartesnis. Naviko parenchimą sudaro atipiškos epitelinės ląstelės, kurios plinta per suardytą bazinę membraną, ardo ir perauga aplinkinius audinius. Naviko augimui svarbios navikinio epitelio priekinės linijos ląs-telės, kurios aktyviai skverbiasi per sveikus audinius sudarydamos nutįs-tančius tiltus primenančius plotus, bei atskiras navikinio epitelio ląstelių salas atokiau nuo pagrindinio naviko lokalizacijos. Dažnai šios ląstelės sudaro „vėžiniais perlais“ vadinamus lizdus, kurių centre kaupiasi keratinas [93;97;178]. Tikrųjų balso klosčių karcinomos dažniausia lokalizacija du priekiniai balso klosčių trečdaliai bei priekinės jungties sritis. Tiesioginės laringoskopijos metu gerklų karcinoma stebima, kaip chaotiškai grublėtas, nelygiu paviršiumi, netaisyklingos formos, egzofitiškai ir endofitiškai au-gantis darinys. Paviršinis kraujagyslių tinklas chaotiškas vingiuotas, kapilia-rai kontakto metu lengvai pažeidžiami, paliesti – kraujuoja. Paviršiaus spal-va dažniausiai pilkšspal-va su baltais keratozės ploteliais ir gelsvo atspalvio išo-pėjimo zonomis, riba tarp naviko ir paraudusių sveikų audinių neaiški [93;178].
Naviko metastazės sritiniuose kaklo limfmazgiuose vieningai laikomas blogu prognoziniu faktoriumi [22;156;158]. Lyginant su viršutinio gerklų aukšto srities vėžiu, balso klosčių vėžio eiga palankesnė. Šios srities blogiau išvystytas savojo dangalo kraujagyslių ir limfagyslių tinklas bei vyrau-jančios fibrozinės – elastinės skaidulos lemia lėtesnį naviko augimą ir me-tastazavimą. Naviko metastazavimo rizika auga didėjant naviko invazijos gyliui bei dydžiui. Literatūros šaltiniai, tarp sergančiųjų balso klosčių vėžiu, nurodo apie 14 proc. metastazių dažnį sritiniuose kaklo limfmazgiuose. Didesnio diametro karcinomos metastazavimo tikimybė išauga iki 40 proc.,
navikui peraugus balso klostės raumenis apie 14-32 proc. pacientų diag-nozujamos sritinių kaklo limfmazgių metastazės. Esant blogai diferenci-juotai balso klosčių karcinomai, sritinės metastazės limfmazgiuose aprašo-mos iki 52 proc. atvejų [93]. Nors 5 metų išgyvenamumo rodikliai sergančiųjų balso klosčių karcinoma geresni nei kitų anatominių gerklų sričių bei tolimosios metastazės pakankamai retos, didžiausia problema išlieka lokalių vėžio recidyvų rizika. Recidyvai dažniausi praėjus 2-3 me-tams po radikalaus gydymo, recidyvai po 5 metų – reti. Kiekvienas atvejis yra individualus, neretai tokios pačios diferencijacijos ar stadijos gerklų vėžys pasižymi skirtinga klinikine eiga [161]. Siekiant geriau suprasti vė-žinio proceso dėsningumus, didesnis dėmesys krypsta į subtilesnius vėvė-žinio proceso eigos kriterijus, kuriais galėtų tapti molekuliniai onkologinės ligos žymenys.
4.2. Gerklų karcinomos diagnoziniai žymenys ir prognoziniai veiksniai Šiuo metu diagnozuojant piktybinius navikus bei prognozuojant jų tolimesnę eigą remiamasi TNM klasifikacija [142], atsižvelgiama į naviko morfologinį tipą ir naviko ląstelių diferencijacijos laipsnį. Tačiau dažnai pastebima, kad piktybiniai navikai, pasižymintis identiškais klinikiniais ir morfologiniais parametrais, gali pasižymėti visiškai skirtinga ligos eiga bei skirtingai reaguoti į skiriamą gydymą. Tai leidžia suprasti, kad tradicinių prognozinių veiksnių nepakanka, norint nuspėti kiekvieno individualaus paciento, sergančio gerklų karcinoma, ligos eigą. Manoma, kad kai kurie molekuliniai vėžio diagnoziniai žymenys gali atlikti svarbų vaidmenį siekiant tiksliau prognozuoti gerklų karcinomos eigą, pasirenkant gydymo schemą, skiriant ilgalaikį stebėjimą.
Molekuliniai vėžio žymenys, atsižvelgiant į jų funkcijas, skirstomi į penkias grupes (4.2.1 lentelė):
1. naviko augimo, proliferacijos ir apoptozės, 2. naviką slopinantys,
3. imuninio atsako, 4. angiogenezės,
5. naviko invazijos ir metastazavimo [3;112;117].
Nors nei vieno šių žymenų nustatymas nėra taikomas rutiniškai kli-nikinėje praktikoje, daugelio atliktų studijų autoriai tiki jų sėkmingo panaudojimo galimybe įvertinant rizikos veiksnius, diagnozuojant, progno-zuojant, pasirenkant tinkamesnę medikamentinio gydymo schemą, pacien-tams, sergantiems gerklų plokščių ląstelių karcinoma [3;117;150;175].
4.2.1 lentelė. Tiriamieji veiksniai, galintys tapti gerklų plokščialąstelinės
karcinomos prognoziniais žymenimis
Žymenų grupė Žymenys Naviko augimo,
proliferacijos ir apoptozės EGF; Her-2/neu; c-erbB 3-4; Cyclin D1; Cyclin D3; REEP86; Ki67; Bcl-2; Fas/FasL (Apo-1/CD95) Naviką slopinantys genai P27; p53; p16
Su angiogeneze susijusios
medžiagos VEGF Naviko invazijos ir
metastazavimo MMP
Kiti žymenys COX-2; CA9; ŽPV-11, -16
4.3. Matrikso metaloproteinazės
Matrikso metaloproteinaės (MMP) sudaro didelę grupę proteazių, turinčių savo sudėtyje Zn ir Ca jonų, kurios ardo beveik visus TJA kom-ponentus tiek fiziologinėmis sąlygomis, tiek patologiškos audinių remo-deliacijos metu. Šiuo metu žinomi 24 genai koduojantys žmogaus MMP šeimai priklausančias proteazes, įskaitant dvigubą MMP-23 geną. Viso žinomos 23 MMP šeimos narės, kurios pagal struktūrines ypatybes ir ardo-mą substratą skirstomos į šešis pošeimius: kolagenazės, stromelizinai, mat-rilizinai, želatinazės, membraninio tipo ir kitos MMP [185;187]. Šiuo metu žinomos MMP, jų lokalizacija chromosomose, jų ardomi substratai, egzogeniniai MMP aktyvatoriai ir MMP aktyvuojamos proteazės pateiktos 4.3.1 lentelėje.
Visų žinomų MMP struktūra panaši. Pagrindiniai MMP molekulės komponentai yra (4.3.1 pav.):
- signalinis peptidas, kuris būtinas, kad MMP būtų išskirta iš ląstelės - propeptidas, jo dėka MMP yra neaktyvi;
- katalizinis metaloproteinazės domenas, turintis Zn2+ joną būtiną fermentiniam aktyvumui;
- ašinis peptidas, sujungiantis katalitinį domeną su hemopeksino do-menu;
- hemopeksino domenas, nulemiantis MMP gebą skaidyti atitinkamą substratą [128;186].
4.3.1 lentelė. Žmogaus MMP, MMP lokalizacija chromosomose, MMP ardomi substratai, egzogeniniai MMP
aktyvatoriai, MMP aktyvuojamos proteazės
MMP šeima
Proteazės Vieta chromosomoje Ardomi substratai Aktyvuojama Aktyvuoja Kolagenazės: Kologenazė-1 (MMP-1) Kologenazė-2 (MMP-8) Kologenazė-3 (MMP-13) Kologenazė-4 (MMP-18) 11q22.2-22.3 11q22.2-22.3 11q22.2-22.3 Žmoguje nerasta Fibrilinis kolagenas, želatina, lamininas, osteonektinas MMP-3, -7, -10, plazminas MMP-3, -10, plazminas MMP-2, -3, -10, -14, -15, plazminas MMP-2 ND MMP-2, -9 Stromelizinai: Stromelizinas-1 (MMP-3) Stromelizinas-2 (MMP-10) Stromelizinas-3 (MMP-11) 11q22.2-22.3 11q22.2-3 22q11.2 Nefibrilinis kolagenas,
lamininas, fibronektinas Plazminas, kalikreinas Elastazė, katepsinas G Furinas MMP-1, -9 MMP-1, -9 ND Matrilizinai: Matrilizinas (MMP-7) Matrilizinas-2 (MMP-26) 11q22.2-22.3 11q22.2 Kolagenas, želatina, elastinas MMP-3, plazminas ND MMP-9 ND Želatinazės: Želatinazė A (MMP-2) Želatinazė B (MMP-9) 16q13 20q12-13
Fibrilinis IV, V tipo
kolagenas, želatina MMP-1, -13, -14, -MMP-2, - 3, -7, -13, 15, -16 plazminas, tripsinas,
MMP-9, -13 ND
4.3.1 lentelės tęsinys
MMP šeima
Proteazės Vieta chromosomoje Ardomi substratai Aktyvuojama Aktyvuoja Membraninio tipo MMP: MT1-MMP (MMP-14) MT2-MMP (MMP-15) MT3-MMP (MMP-16) MT4-MMP (MMP-17) MT5-MMP (MMP-24) MT6-MMP (MMP-25) 14q12.2 16q12.2 8q21 12q24 20q11.2 16p13.3 Kolagenas, želatina, proteoglikanai, fibrinas, fibrinogenas, lamininas Plazminas, furinas ND ND ND ND ND MMP-2, -13 MMP-2, -13 MMP-2 MMP-2 MMP-2 Kitos MMP: Metaloelastazė (MMP-12) (MMP-19) Enamelizinas (MMP-20) XMMP (MMP-21) CA-MMP (MMP-23) CMMP (MMP-27) Epilizinas (MMP-28) 11q22.2-22.3 12q14 11q22.3 ND 1p36.3 11q24 17q21.1 IV tipo kolagenas, želatina, kazeinas, amelogeninas, lamininas ND Tripsinas ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND – nėra duomenų.
4.3.1 pav. MMP domeno strukūra (Hideaki Nagase et al. 2006)
sp – signalinis peptidas. pro – propeptidas. cat – katalizinis domenas. FNII – fibronektino II tipo domenas. L1 – 1-as ašinis peptidas. Hpx – hemopeksino domenas. L2 – 2-as ašinis peptidas. Mb – plazminė membrana. TM – transmembraninis domenas. Cy – citoplazminė dalis. CysR – cisteino prisotintas domenas. Ig – į imunoglobuliną G panašus domenas. GPI – glikozilfosfatidilinozitolio membraninis inkaras.
MMP-7 (matrlizinas), MMP-26 (matrilizinas-2) ir MMP-23 (CA-MMP) iš kitų MMP šeimos narių išsiskiria neturėdami ašinio peptido ir hemopeksino domeno, o MMP-23 turi unikalų cisteino prisotintą domeną ir į imunoglobuliną G panašų domeną. Sekretuojamų peptidazių, kurioms priskiriamos kolagenazės, stromelizinų ir neklasifikuojamų MMP struktūra panaši – jų molekulėse aptinkami keturi pagrindiniai domenai [128]. Mem-braninio pošeimio narės MMP-14, -15, -16 ir -24, turinčios transmem-braninius domenus, bei glikozilfosfatidilinozitolio membraninį inkarą turinčios MMP-17 ir MMP-25, dėka molekulės pirminės struktūros C-gale esančių fragmentų geba prisitvirtinti prie ląstelių membranų. Šios MMP aktyvuojamos ląstelėse, o aktyvios MMP formos išskiriamos į tarpląstelinį skystį [208]. MMP-2 ir MMP-9 (želatinazės A ir B) kataliziniame domene turi tris fibronektino II tipo domenus, kurių dėka gali geriau skaidyti kolageną ir želatiną. MMP-2 ir MMP-9 skaidomi substratai gali skirtis, MMP-2 gali pasižymėti kolagenazėms būdingomis savybėmis [146]. Rent-genologinės kristalografijos analizės ir branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopijos metodais nustatytos kai kurių MMP trimatės struktūros. Šiuo metu visiškai išaiškinta žmogaus MMP-2 molekulės sandara bei MMP-1, -3, -9 atskirų domenų erdvinė struktūra [126].
Tiriant MMP sandarą ir šių proteazių poveikį, didelis dėmesys kreipiamas į želatinazes MMP-2 ir MMP-9, siekiant nustatyti jų vaidmenį onkologiniame procese. Želatinazės ardo pagrindinius TJA komponentus IV, V tipo kolageną, dėl ko navikinės ląstelės įveikdamos TJA barjerą gali plisti. Šių proteinazių padidėjusi raiška randama progresuojant daugeliui piktybinių navikų [185;186]. Norint geriau suprasti šių MMP svarbą piktybinio naviko invazijai bei metastazavimui, būtina geriau pažinti jų raiškos reguliavimo mechanizmus.
4.4. Matrikso metaloproteinazių raiškos reguliavimas
MMP raiška nestimuliuojamose audinių kultūrų ląstelėse bei sveikame audinyje in vivo yra maža. Daugelis faktorių gali skatinti MMP produkciją: citokinai, augimo faktoriai, naviko augimą stimuliuojantys faktoriai, fizinis stresas, ląstelės-TJA ir ląstelės-ląstelės tarpusavio sąveika [192]. Išskiriami keletas pagrindinių MMP raiškos reguliavimo mechanizmų.
4.4.1. Matrikso metaloproteinazių raiškos reguliavimas endogeniniais faktoriais
Proteolizinis MMP aktyvumas slopinamas endogeninėmis medžia-gomis. Vienos iš jų tai – audinių MMP inhibitoriai (TIMP). TIMP šeimai priklauso TIMP-1, -2, -3 ir -4 [18]. TIMP TIMP-3 molekulė yra susijungusi su TJA baltymais, o kiti TIMP – sekretuojami ląstelių. Su aktyviomis MMP molekulėmis TIMP jungiasi santykiu 1:1, sudarydamos tvirtą jungtį. TIMP molekulės slopina visus šiuo metu žinomus MMP šeimos narius, o TIMP-1 gali inhibuoti neaktyvias MMP-2 ir MMP-9 formas. Esant patologinėms būklėms MMP produkcijos disbalansas tiesiogiai aktyvuoja TIMP raišką [187]. Nustatyta, kad TIMP gali slopinti piktybinių navikų augimą, invazyvumą bei metastazavimą, tačiau tai nėra vienintelė jų funkcija. Ląs-telių augimo stimuliavimas, dalyvavimas apoptozės procese taip pat susiję su TIMP veikla [58;203].
Žinomos kitos nespecifinės MMP slopinančios medžiagos - α2 plaz-mos makroglobulinas bei α1 proteinazės inhibitorius, veikiančios plazmoje ir tarpląsteliniame skystyje [185]. Nustatytas prie ląstelių membranų prisi-tvirtinančio glikoproteino (RECK) reguliuojamasis poveikis kai kurioms MMP. Šio baltymo daugiau nustatoma sveikame audinyje, o daugumoje navikinių ląstelių jo raiška mažesnė. Tyrimai su pelėmis parodė, kad RECK raiškos restitucija gali slopinti navikų augimą, invaziją bei angiogenezę. RECK neigiamai veikia MMP-2, MMP-9 ir MT1-MMP, turinčių įtakos vėžinio proceso vystymuisi bei metastazavimui, produkciją [137;174]. Literatūroje RECK/MMP-9 santykio išraiška vertinama kaip vienas galimų prognozinių žymenų sergant storosios žarnos vėžiu [174].
4.4.2. Neaktyvių matrikso metalo proteinazių (proMMP) formų indukcija
Ląstelės sintezuoja neaktyvias formas MMP vadinamas proMMP. Furinas aktyvuoja proMMP-13 intraląstelinėje erdvėje, kai tuo metu dau-guma akyvavimo procesų vyksta už ląstelės ribų [187]. Trylika MMP rūšių
sekretuojamos ląstelių kaip proMMP. Proteolizinis proMMP aktyvavimo procesas yra daugiapakopis. ProMMP-1, -3, -7, -9, -10 ir -13 už ląstelės ribų gali būti aktyvuojmi plazmino, kurį produkuoja plazminogenas [110]. Aktyvuotos MMP gali dalyvauti kitų MMP aktyvacijos procese [187]. Angiogenezės metu endotelinių ląstelių išskirtą proMMP-2 gali aktyvinti trombinas, kurio didesnės koncentracijos nustatomos sergant vėžiu. Trombinas, saveikaudamas su trombomodulinu, esančiu endotelinių ląstelių paviršiuje, aktyvina C baltymą, kuris aktyvina proMMP-2 [147;207]. Pastarąją taip pat gali aktyvuoti dauguma membraninio tipo MMP išskyrus MT4-MMP. MT1-MMP aktyvuoja proMMP-2 ląstelės paviršiuje, tačiau šiam procesui būtinas TIMP-2, kai tuo metu MT2-MMP sąveikai su proMMP-2, TIMP-2 reikšmės neturi [78;125]. TIMP-4, prisijungęs prie proMMP-2 hemopeksino domeno, slopina MT1-MMP, tačiau taip nenutinka, kai MT1-MMP aktyvuoja proMMP-2 [61]. MT1-MMP gali aktyvuoti proMMP-13 ląstelės paviršiuje, šis procesas yra efektyvesnis dalyvaujant jame MMP-2 [94]. Pastaroji proteazė aktyvuoja MMP-9, tai parodo svarbų želatinazių vaidmenį MMP reguliavimo procese [186].
4.4.3. Matrikso metaloproteinazių genų aktyvacija
Vieni svarbiausių veiksnių MMP raiškos reguliavimui – jų genų aktyvacija. Nustatytos medžiagos (naviko nekrozės faktorius (TNF), naviko augimą keičiantis faktorius (TGF-β), forbolio esteriai ir interleukinai IL-1α, -1β, -8), kurios veikdamos humoraliniu būdu aktyvuoja už MMP raišką atsakingus genus [68;192]. Žinoma dar viena medžiaga, stimuliuojanti MMP genų raišką yra tarpląstelinis MMP induktorius (EMMPRIN) dar literatūroje aptinkamas kitu CD147 pavadinimu. Tai ant navikinių ląstelių membranų esantis glikoproteinas, stimuliuojantis stromos fibroblastus ir na-viko ląsteles produkuoti daugumą MMP. Nustatyta, kad EMMPRIN indu-kuoja kraujagyslių endotelinio augimo faktoriaus (VEGF) raišką skatinda-mas angiogenezę. Šios proteino savybės parodo jo neabejotiną svarbą vėžio progresavimui [127]. MMP genai aktyvuojami tiesiogiai transkripcijos lyg-menyje. DNR transkripcijai svarbi geno promotoriaus sritis, kurios specifinę nukleotidų seką atpažįsta transkripciją reguliuojantys ir ją atliekantys bal-tymai. Kai kurių MMP genų promotorių sritys pasižymi stebėtinai panašiu cis elementų, genų raiškos reguliavimo funkciją atliekančios tam tikros DNR sekos, išsidėstymu. Tačiau kai kuriuose pošeimiuose, kaip MMP-2/MMP-9 (želatinazės) ir MMP-1/MMP-8 (kolagenazės), MMP atsakingų už tas pačias funkcijas cis elementai ir jų išsidėstymas ženkliai skiriasi [68;192]. Pagal cis dalių išsidėstymą MMP promotoriai skirstomi į tris grupes. Didžiausią grupę sudarantys promotoriai turi TATA dėžutę, sritį nuo
kurios vyksta transkripcijos pradžia, bei aktyvaus baltymo-1 (AP-1) prisijungimo vietą. TATA dėžutė tai – vienas galimų cis elementų, turintis daug timino ir adenino nukleotidų. Kai kuriems šios grupės promotoriams būdinga kontroliuojančio transkripciją baltymo PEA3 (polyomos A jungia-mojo baltymo-3 enhancerio) prisijungimo vieta [10]. Kitos promotorių grupės atstovų (MMP-8, -11 ir -21), neturinčių proksimalinės AP-1 junties, tačiau turinčių TATA dėžutę, reguliavimas paprastesnis. Trečios grupės (MMP-2, -14 ir -28) promotoriai neturi TATA dėžutės, o tai gali įtakoti transkripcijos pradžią daugelyje šio promotoriaus vietų. Didžiausias šios grupės promotorių aktyvavimo darbas tenka reguliuojančiam Sp-1 baltymui, kuris jungiasi prie GC dėžutės, turinčios daugiau guanino ir citizino nu-kleotidų, kiek mažesnis indėlis tenka citokinams ir augimo faktoriams [24]. AP-1 transkripcijos faktorių kompleksas sudarytas iš dviejų protoonko-geninių šeimų Jun ir Fos heterodimerinių baltymų. AP-1 jungtis, padedant PEA3 baltymui ir trans – atyvatoriams aktyvuoja daugumos MMP genų raišką [10;24;192]. Prisijungdami prie AP-1 ir PEA3 jungčių trans – aktyvatoriai (citokinai, interleukinai, interferonai, augimo faktoriai ir kt.) aktyvuoja transkripciją. AP-1 baltymo raišką ir aktyvumą indukuoja trys mitogeniniu būdu aktyvuotos proteino kinazės (MAPK): ekstraląstelinio signalo pagalba aktyvuota kinazė 1, 2 (ERK-1, -2), streso aktyvuota Jun baltymo N-terminalinė kinazė bei p38 MAPK [68;136;192]. MMP-1, -3 ir -9 promotorių srityse transkripcija gali būti aktyvuojama PEA3 baltymui sudarius junginį su AP-1 [192;193].
4.4.4. Matrikso metalo proteinazių genų aktyvavimas dėl promotoriaus srities polimorfizmo
Žvelgiant į žmogaus genomą, natūraliai atsiradęs DNR polimorfizmas, nėra dažnas reiškinys. MMP raiškos aktyvumą gali sąlygoti įvairių genų polimorfizmas promotoriaus srityje, kai pažeidžiama transkripcijos faktorių ir kitų reguliacinių elementų prisijungimo vieta. Dažniausiai MMP genų polimorfizmas atsiranda dėl tam tikro nukleotido pokyčių promotoriaus srityje: insercijos, substitucijos arba dėl mikrosatelitų nestabilumo [71]. Apie 90 proc. atvejų polimorfizmas nustatomas tik viename nukleotide, pasikeičiant vienai iš bazių sekų DNR grandinėje [152]. Tačiau kai kuriuose MMP genų promotorių srityse aptinkamas kelių alelių polimorfizmas vienu metu. Manoma, kad didžioji dalis nustatomų polimorfizmų biologiškai aktyvios išraiškos nesukelia. Tik nedidelė dalis polimorfizmų, kurie keičia geno transkripcijos intensyvumą laikomi gyvybiškai svarbiais, jie gali įtakoti „genetinio polinkio“ sirgti tam tikromis ligomis formavimąsi [71]. Žvelgiant į ateitį, MMP genų polimorfizmo nustatymas galėtų pasitarnauti
kaip svarbus žymuo prognozuojant vėžio ir ikivėžinių susirgimų eigą. Padidintos rizikos pacientų grupei atsirastų daugiau galimybių pritaikyti ankstyvą diagnostiką ir geriau parinkti gydymą [26;71].
Vienas pirmųjų aprašytų atvejų – guanino insercija MMP-1 promo-toriaus -1607 geno sekos srityje (Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro duomenimis, vieno nukleotido polimorfizmo identifikacijos nr. rs1799750). Mutacijos pasekoje, įsiterpus vienam papildomam guanino nukleotidui, atsiradęs 2G alelis jungiasi su gretimu nukleotidu per ETS-1 jungtį [163]. Nustatyta, kad 2G genotipas sąlygoja didesnę MMP-1 raišką [85;163;196] ir didina riziką susirgti plaučių vėžiu [205]. Esant MMP-3 promotoriaus -1171 bazių porų pozicijoje adenino insercjai (rs3025039), įsiterpęs adeninas sudaro 6A alelį vietoje 5A [69]. Pastebėta, kad ZBP-89 transkripcijos faktorius, pasižymintis slopinančiu veikimu, lengviau jungiasi prie 6A alelio, taip sumažindamas promotoriaus transkripcinį aktyvumą [70]. Tiriant sergančiuosius nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu šiaurinės Kinijos gyventojų populiacijoje Fang su bendraautoriais (2005 m.), nusta-tyta galima 6A alelio polimorfizmo apspręsta mažesnė rizika susirgti plaučių vėžiu [44]. Kiek skirtingi rezultatai gauti tiriant MMP-3 -1171 srities geno polimorfizmą sergantiems galvos – kaklo plokščių ląstelių kar-cinoma (GKPLK) (4.4.4.1 lentelė). Graikų mokslininkų grupė, vadovaujama Vairaktaris (2007 m.), tarp sergančiųjų burnos gleivinės plokščių ląstelių karcinoma (BGPLK) nustatė didesnį skaičių pacientų heterozigotų 5A/6A lyginant su sveikų žmonių kontroline grupe. Rūkantiems pacientams homozigotams 5A/5A ir heterozigotams 5A/6A nustatyta du kartus didesnė rizika susirgti BGPLK [180]. Prancūzų tyrėjai, vadovaujami Zinzindohoué (2004 m.), 6A alelį sieja su sumažėjusia rizika sirgti GKPLK [206]. Japonų mokslininkai, vadovaujami Nishizawa (2007 m.), pateikia priešingus rezultatus: visi trys, sergančiųjų BGPLK grupės, MMP-3 genotipų variantai (5A/5A, 5A/6A ir 6A/6A) savo pasiskirstymo dažniu nuo sveikų asmenų kontrolinės grupės nesiskyrė [132]. Priešingi rezultatai ankščiau minėtiems pateikti Tu su kolegomis (2006 m.), ištyrus grupę Taivanio salos gyventojų: MMP-3 5A alelis rastas susijęs su dažnesniu burnos pogleivio jungiamojo audinio išvešėjimu, o įtakos didesnei rizikai susirgti BGPLK šis alelis neturėjo [177]. Chaudhary su bendradarbiais (2010 m.) Indijos gyventojų populiacijoje nustatytė, kad MMP-3 5A alelis gali įtakoti burnos pogleivio jungiamojo audinio išvešėjimą ir GKPLK išsivystymą [26].
4.4.4.1 lentelė. Funkcinis MMP-1(-1607 1G/2G), MMP-2 (-1306 C/T), MMP-3 (-1171 5A/6A), MMP-9 (P574R C/G;
-1562 C/T) ir TIMP-2 (-418 G/C ar C/C) polimorfizmas piktybiniuose galvos – kaklo navikuose ir esant ikivėžiniams susirgimams. (Pagal Ajay Kumar Chaudhary et al. 2010 [25])
Tyrėjai Šalis Data MMP Polimorfizmo vieta
Tirtieji/
kontrolė GS 95%PI p Naviko sritis Chaudhary A.K. ir bendr. Indija 2010 MMP–3 –1171 5A/6A 101/126
135/126 2,26 1,94 1,22–4,20 0,01 0,03
GKPLK BPJAI Shimizu Y. ir bendr. Japonija 2008 MMP–1 –1607 1G/2G – – – 0,001 GTPLK
Wu J. ir bendr. Kinija 2008 MMP–9 P574R C/G – 4,1 1,58–10,52 0,00 SPLK Tu H.F. ir bendr. Taiva–nis 2007 MMP–9 –1562 C/T 192/191
73/91 – – 0,029 BGPLK BPJAI Nasr H.B. ir bendr. Tunisas 2007 MMP–9
MMP–1 –1562 C/T –1607 1G/2G 174/171 – 2,9 – – 0,02 – NRK Vairaktaris E. ir bendr. Graikija 2008 MMP–9 –1562 C/T 152/162 1,9 1,21–3,06 0,05 BGPLK Vairaktaris E. ir bendr. Graikija 2007 MMP–3 MMP–1 ––1171 5A/6A 1607 1G/2G 160/156 141/156 2,2 – 1,0–– 4,5 <0,05 <0,05 BGPLK Nishizawa R. ir bendr. Japonija 2007 MMP–1 MMP–3 ––1607 1G/2G 1171 5A/6A 170/164 2,4 – 1,5–4,6 – 0,000 – BGPLK O–Charoenrat P. ir P. Khantapura Tailan–
das 2006 TIMP–2 MMP–2 –418 GC/CC –1306 C/T 239/250 239/250 1,43 1,97 0,98–2,08 1,23–3,15 – – GKPLK Tu H.F. ir bendr. Taiva– 2006 MMP–3 –1171 5A/6A 150/98
71/98 1,7
0,84–3,44
1,20–5,71 0,18 BGPLK BPJAI
4.4.4.1 lentelės tęsinys
Tyrėjai Šalis Data MMP Polimorfizmo vieta
Tirtieji/
kontrolė GS 95%PI p Naviko sritis Cao Z.G. ir Li C.Z. Kinija 2006 MMP–1 –1607 1G/2G 96/120 2,2 1,5–3,4 0,000 BGPLK Zinzindo–houe F. Ir bendr. Prancū–zija 2004 MMP–1
MMP–3 –1607 1G/2G –1171 5A/6A 126/249 0,37 – 0,2–0,7 – 0,003 – GKPLK Lin S.C. ir bendr. Taiva–nis 2004 MMP–2 –1306 C/T 121/147 58/147 2,0 – – BGPLK BPJAI Hashimoto T. Ir bendr. Japonija 2004 MMP–1 MMP–3 ––1171 5A./6A 140/2231607 1G/2G 1,6 NP – – 0,04 NP GKPLK GKPLK – galvos ir kaklo plokščių ląstelių karcinoma; BPJAI – burnos pogleivio jungiamojo audinio išvešėjimas; GTPLK – gomurinių
Tiriant MMP-2, -9 ir -12 genų polimorfizmą nustatytos galimos nukleotido substitucijos jų promotoriaus srityje. Britų mokslininkai vadovaujami Prince (2001 m.) pirmieji aprašė MMP-2 promotoriaus regiono -1306 eilės C (citozino) nukleotido tranziciją į T (timino) nukleotidą (rs243865) [151]. Netrukus Vasků su bendradarbiais (2002 m.) nustatytė analogišką MMP-2 geno polimorfizmą -735 promotoriaus regione (rs2285053) [183]. Citozino pakeitimas timinu keičia promotoriaus akty-vumą, nes suardoma Sp-1 transkripcijos prisijungimo vieta, o T alelelis sąlygoja sumažėjusį promotoriaus aktyvumą ir mažesnę MMP-2 raišką. Vadovaujami Yu Kinijos mokslininkai (2004 m.) nustatė padidėjusią stemplės plokščių ląstelių karcinomos atsiradimo ir jos metastazavimo riziką esant C(-1306)-C(-735) haplotipui MMP-2 promotoriaus regione [76]. O-Charoenrat su kolegomis (2006 m.) ištyrę grupę tailandiečių sergančių GKPLK, nustatytė MMP-2 (-1306 C/C) genotipą susijusį su didesne rizika susirgti GKPLK nei T/T ir C/T genotipai [133]. Panašius dėsningumus nurodo Lin su bendradarbiais (2004 m.), tyrę grupę Taivanio salos gyventojų, sergančių burnos gleivinės plokščių ląstelių karcinoma. Suskirstę sergančiuosius į dvi grupes (sergantys skruosto gleivinės karcinoma ir sergantys ne skruosto gleivinės karcinoma) nustatė, kad C/C genotipas keturis kartus didina burnos dugno karcinomos riziką grupėje sergančiųjų ne skruosto gleivinės karcinoma [113].
MMP-9 geno aktyvumą gali įtakoti -1562 bazių poros mutacija pro-motoriaus srityje. Mutacijos metu įvyksta citozino tranzicija į timiną (rs3918242). T alelis promotoriaus aktyvumą padidiną 1,5 karto [201]. Vadovaujami Vairaktaris graikų mokslininkai (2008 m.), tyrę -1562 bazių poros MMP-9 promotoriaus polimorfizmą, nustatė T alelio padidintą riziką susirgti BGPLK [181]. Tuniso mokslininkai, vadovaujami Nasr (2007 m.), tyrę grupę nosiaryklės karcinoma sergančių pacientų, MMP-9 polimorfizmo įtakos šio vėžio atsiradimui nenustatė [129].
Kaip matyti 4.4.4.1 lentelėje, dauguma MMP genų polimorfizmo tyrimų sergantiems GKPLK atlikta Azijos šalyse. Skirtingų žemynų ir regionų gyventojų genų polimorfizmo pasiskirstymas populiacijoje skiriasi, taip pat galimi skirtumai tarp skirtingų lyčių atstovų [148]. Medicininių šaltinių žiniomis, iki dabar pasaulyje nėra atlikta MMP genų polimorfizmo tyrimo sergantiems gerklų vėžiu.
4.5. Matrikso metaloproteinazės ir piktybinių navikų ląstelių infiltracinis augimas bei metastazavimas
Piktybinių navikų infiltracinis augimas – daugiapakopis procesas, ku-riame navikinių ląstelių plitimas priklauso nuo proteolizės proceso sąlygoto
ląstelės-TJA tarpusavio sąveikos. Vėžinės ląstelės atsidalinusios nuo pir-minio naviko skverbiasi per bazines membranas ir stromos TJA. Navikui progresuojant aplinkiniai audiniai intensyviai ardomi dėl naviko išskiriamų aktyvių medžiagų, kurios ardo TJA, stimuliuoja MMP gamybą stromos ląstelėse ir angiogenezę. Daugumoje piktybinių navikų MMP padidėjusi raiška pirmiausia stebima stromos audinyje dėka jos fibroblastų aktyvumo [33;81;192]. Nemažas indėlis produkuojant MMP tenka uždegiminėms ląstelėms: limfocitams, makrofagams, neutrofilams, kurios infiltruoja svei-kus audinius aplink piktybinį naviką. Uždegiminės ląstelės produkuoja cito-kinus, kurie indukuoja MMP gamybą naviko ir stromos ląstelėse [9;160]. Savo ruožtu navikinės ląstelės šį procesą palaiko išskirdamos EMMPRIN baltymą, kuris stimuliuoja stromos ląsteles gaminti MMP [127]. MMP taip pat skaldo su ląstelių membranomis susijusius baltymus (IV tipo kolageną, lamininą-5), šio proceso metu atskeltos aktyvios baltymų dalys bei susi-dariusios aktyvios medžiagos veikia ląsteles ne tik tiesioginio kontakto bū-du, bet ir stimuliuoja toliau esančias humoraliniu keliu. Tokiu būdu MMP dalyvauja ląstelių paviršiaus proteoliziniame procese, kurio metu atsiradu-sios įvairios aktyvios medžiagos, sudaro sąlygas geresnei navikinių ląstelių migracijai (4.5.1 pav.) [160]. Naviko metastazavimui į sritinius limfmazgius ir tolimesnius organus taikinius svarbūs keletas aspektų. Visų pirma MMP aktyvina neoangiogenezę aplink navikinį audinį, vėžinės ląstelės gali greičiau patekti į mikrokraujagysles, kuriomis pasiekia savo taikinius [131]. Nuo imuninio atsako ląstelių sunaikinimo vėžines ląsteles gali apsaugoti trombocitai, kurių skaičius ir agregacija padidėja vėžinio proceso metu. Imuninės ląstelės aplipusių trombocitais navikinių ląstelių gali neatpažinti, pastarosioms tai padeda lengviau hematogeniniu keliu pasiekti savo taiki-nius [167]. MMP taip pat slopina T limfocitų proliferaciją ir diferencijaciją, netiesiogiai veikia kaip natūralių žudikų supresoriai [87;168]. Metastazės vietoje, mikrotrombui užkimšus kapiliarą, navikinės ląstelės adhezinėmis molekulėmis jungiasi prie endotelinių ląstelių receptorių ir skverbiasi už kapiliaro ribų.
4.5.1 pav. Daugialypė MMP veikla vėžio progresijos metu (pagal Roopali
Roy et al. 2009)
MMP ardo tarpląstelinio jungiamojo audinio (TJA) komponentus, palengvindamos angiogenezės procesą, vėžio ląstelių plitimą, metastazavimą (1). MMP moduliuoja ryšį tarp vėžio ląstelių atskylant E-kadherinui, bei reguliuoja santykį tarp vėžio ląstelių ir TJA, produkuojant integrinus, kurie skatina vėžio ląstelių plitimą (2). MMP aktyvuoja signa-linius peptidus – augimo faktorius, citokinus, labiau juos priderindamos ląstelių taikinių receptoriams (3) bei atskiria augimo faktorius (VEGF, FGF) nuo supančio TJA (4).
Kai kurių MMP svarba piktybinio naviko augimui ir plitimui nustatyta atlikus tyrimus su geneteškai modifikuotomis pelėmis. Pelės, neturinčios MMP-7 geno, linkusios rečiau sirgti žarnyno vėžiu [195]; neturinčių MMP-2 geno pelių organizme lėčiau vyksta angiogenezė ir naviko progresavimas [66]. Pelėms, neturinčioms MMP-9 geno, retesnės melanomos metastazės [67], o pelėms neturinčioms MMP-11 geno sulėtėja cheminiu būdu sukelto naviko progresija [121]. Priešingas efektas pastebėtas tiriant MMP-3 geno neturinčias peles, kurioms cheminiu būdu sukelta odos plokščių ląstelių kar-cinoma pasižymėjo agresyvesne eiga, buvo blogesnės diferencijacijos [122]. Tiriant MMP raišką pacientams sergantiems vėžiu, pastebėta, kad produ-kuojamų MMP raiška skiriasi priklausomai nuo naviko tipo ir jo
loka-lizacijos. Želatinazės (MMP-2 ir MMP-9) įvardijamos, kaip vienos svar-biausių daugelio piktybinių navikų atsiradimui ir progresavimui [185]. Daugelio atliktų studijų nustatyta padidėjusi želatinazių raiška: kasos, storosios žarnos, plaučių, krūtų ir kt. lokalizacijų įvairių histologinių formų piktybiniuose navikuose [62;72;95;103;173]. Dažnai padidėjusi želatinazių raiška siejama su bloga piktybinių navikų prognoze, ne išimtis galvos ir kaklo plokščių ląstelių karcinoma [13;46;82;130;169;173].
4.6. Matrikso metaloproteinazių raiška galvos ir kaklo plokščių ląstelių karcinomoje
Galvos ir kaklo plokščių ląstelių karcinoma (GKPLK) – dažnas pik-tybinis navikas; naviko lokalizacija, naviko ląstelių diferencijacijos laipsnis ir naviko invazijos gylis laikomi svarbiais prognoziniais faktoriais [93;134]. Didžiausia problema renkantis galvos – kaklo navikų chirurginį gydymą yra naviko invazija į gretimą kraujagyslių ir nervų pluoštą. Padidėjusi želatinazių ir kitų MMP raiška stebima esant lokaliam naviko recidyvui [73;74] ir metastazėms sritiniuose limfmazgiuose [13;87;124;141;135]. Radikaliai pašalinto naviko rezekcinio krašto audinyje nustačius padidintą MMP-9 raišką galima prognozuoti didesnę naviko recidyvo tikimybę poo-peraciniame randiniame audinyje [130]. Kadangi lokalūs GKPLK recidyvai dažnesni nei tolimosios metastazės, stebimas padidėjęs proteinazių, skati-nančių naviko ląstelių invaziją per bazines membranas – MMP-2 ir MMT1-MMP aktyvumas nekelia abejonių [74;124]. Tikėtina, abi šios proteazės gali vaidinti svarbų vaidmenį naviko infiltraciniam augimui ir recidyvavimui. Tai patvirtina atlikti tyrimai burnos dugno [73;87;124], gerklų [13] ir liežuvio [74] plokščių ląstelių karcinomos audinyje. Kitos MMP taip pat svarbios GKPLK procesui: MMP-13 aktyvumas gali įtakoti gydymo nesėk-mę nepriklausomai nuo diagnozuotų metastazių kaklo limfmazgiuose ir jų dydžio [118] bei skatinti gerklų karcinomos didesnį invazyvumą [32]. MMP-8 ir MMP-3 raiška tiesiogiai koreliuoja su naviko T (tumour, TNM klasifikacija) dydžiu ir metastazėmis sritiniuose kaklo limfmazgiuose [100-102]. Tiesioginis MMP-3 raiškos ryšys su sritinių kaklo limfmazgių metastazėmis nustatytas tik sergant burnos gleivinės karcinoma, o esant kitų sričių galvos – kaklo navikams toks ryšys nenustatytas [43;135].
MMP ne mažiau svarbios vystantis gerklų plokščių ląstelių karcino-mai. Vienos svarbiausių ir dažniau literatūroje minimos želatinazių pošei-mio atstovės – MMP-2 ir MMP-9 [13;28;35;116;119;149;166;197]. Daugu-ma atliktų tyrimų patvirtina padidėjusią MMP-2 ir MMP-9 raišką gerklų karcinomos audinyje lyginant su sveiku gerklų audiniu [28;35;116;149; 166;197]. Keletas autorių atkreipia dėmesį į stromos ląstelių padidėjusią
želatinazių raišką šalia naviko parenchimos ląstelų [13;28;35;149], kuri kartais raiškos intensyvumu pralenkia navikines ląsteles [28]. Nuosekliai tirdami gerklų epitelio ląstelių pokyčius vėžinio proceso metu, turkų moks-lininkai pastebi, kad MMP-2 raiškos didėjimas yra nuoseklus: mažiausias displaziniame epitelyje, vidutinis gerklų neinvazinės karcinomos parenchi-mos ląstelėse, o didžiausias – gerklų karcinoparenchi-mos parenchiparenchi-mos ląstelėse. Displaziniame epitelyje didžiausią MMP-2 raišką autoriai nurodo epitelio bazinio sluoksnio ląstelėse, invazinėje karcinomoje – plintančio navikinio epitelio (parnchimos) priekinės linijos ląstelėse [166]. Graikų tyrėjai teigia, kad MMP-9 raiška padidėja esant dviem gerklų malignizacijos proceso fazėms: pirmiausia atsiradus epitelio displazijai, vėliau displazijai progre-suojant iki invazinės karcinomos [149]. Metais vėliau publikuoti kitos graikų mokslininkų grupės tyrimo rezultatai pažymi priešingą dėsningumą – MMP-2 ir MMP-9 raiška naviko ląstelėse mažėja didėjant gerklų karcino-mos stadijai, kai tuo metu aplinkinėse strokarcino-mos ląstelėse išlieka raiškos didėjimo tendencija [28]. Prieštaringi rezultatai pateikiami lyginant klinikinius – morfologinius duomenis su želatinazių raiška. Keletoje studijų nurodomas MMP-2 ir MMP-9 ryšys su metastazėmis sritiniuose kaklo limfmazgiuose – esant metastazėms limfmazgiuose, stebima didesnė MMP raiška gerklų naviko ląstelėse [13;35;98;197]. Kiti autoriai nurodo šių pro-teinazių raiškos ryšį su ligos stadija, tačiau neranda statistiškai reikšmingo ryšio su proceso invazija į sritinius limfmazgius [29;157]. Daugelio paminėtų studijų autoriai užsimena, kad želatinazių vaidmuo nėra visiškai aiškus gerklų karcinomos genezėje, reikalingi tyrimai apimsiantys didesnes tiriamųjų grupes, išskiriant smulkiau anatomines gerklų sritis [28;116].
Norint aiškiau apibrėžti MMP svarbą gerklų piktybinių navikų vysty-muisi, tikslinga žinoti jų raiškos dėsningumus esant nepiktybinėms gerklų ligoms.
4.7. Matrikso metaloproteinazių raiška sergant organinėmis nepiktybinėmis gerklų ligomis
Remiantis literatūros šaltiniais, iki dabar atlikta tik keletas studijų siekiant nustatyti MMP raišką sergant organinėmis nepiktybinėmis gerklų ligomis [86;149;166]. Karahan (2009 m.) su kolegomis pirmieji nustatė MMP-2 ir MMP-9 raišką balso klosčių polipuose. Jie nustatė, kad MMP-2 raiška BKP epitelyje didesnė nei sveikame epitelyje, o BKP stromos ląstelės pasižymi didesne MMP-2 ir MMP-9 raiška lyginant su sveikos balso klostės stromos ląstelėmis [86]. Peschos su bendradarbiais (2006 m.) MMP-9 raišką nustatė esant balso klosčių keratozei, gerklų papilomose, displazavusiame gerklų epitelyje, neinvazinėje ir invazinėje gerklų karcinomoje. Jie teigė,
kad MMP-9 raiška padidėja esant dviem gerklų malignizacijos proceso fazėms: pirmiausia atsiradus epitelio displazijai, vėliau displazijai progre-suojant iki invazinės karcinomos. Displazavusiame epitelyje šių tyrėjų nustatyta didesnė MMP-9 raiška lyginant su hiperplazavusiu keratoze pa-dengtu epiteliu bei hiperplazavusiu papilomų epiteliu [149]. Kiek anks-tesnėje studijoje Sarioğlu su kolegomis teigia, kad MMP-2 raiškos didė-jimas yra nuoseklus: mažiausias displaziniame epitelyje, vidutinis gerklų neinvazinės karcinomos parenchimos (epitelio) ląstelėse, o didžiausias – gerklų karcinomos parenchimos ląstelėse. Nedidelė MMP-2 raiška displa-zavusio epitelio ląstelėse ryškiai kontrastavo su didesniu MMP-2 aktyvumu stromos ląstelėse [166].
Keletoje studijų aprašoma MMP-2 ir MMP-9 raiškos amžiniai ypa-tumai laboratorinių pelių sveikose balso klostėse. Ding (2001 m.) su bendra-autoriais [42] ir Ohno (2009 m.) su kolegomis [138] nustatė mRNR MMP-2 ir MMP-9 raiškos mažėjimą balso klosčių stromos ląstelėse ilgėjant pelių amžiui. Sumažėjus aktyvumui MMP-2 ir MMP-9, kurie pagrinde atsakingi už TJA kolageno ardymą, balso klosčių stromoje daugėja kolageno skaidulų kiekis. Tai leidžia daryti prielaidą, kad MMP-2 ir MMP-9 gali būti svarbios ir žmogaus balso klosčių amžinės audinių remodeliacijos metu. [138;139].
5. TIRTASIS KONTINGENTAS IR TYRIMO METODAI
5.1. Tirtasis kontingentasTyrimo metodai patvirtinti ir tyrimas pradėtas 2007 m. gegužės 03 d. gavus Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (protokolo Nr. BE-2-34). Į tyrimą įtraukti pacientai pasirašę informuoto asmens sutikimo formą. Tyrimo eigoje suformuotos trys tiriamųjų grupės.
1. Pagrindinė grupė. Į šią grupę įtraukti 217 pacientų, kurie gydyti 2007–2009 metais KMU Ausų nosies ir gerklės ligų klinikoje bei KMUK filiale Onkologijos ligoninėje, pacientai atrinkti vadovaujantis tiriamųjų atrankos kriterijais (5.1.1 lentelė).
5.1.1 lentelė. Pacientų įtraukimo ir neįtraukimo į tyrimą kriterijai
Įtraukimo į tyrimą kriterijai Neįtraukimo į tyrimą kriterijai Verifikuota pirminė plokščių ląstelių
karcinoma vidurinio gerklų aukšto (glottis) srityje
Anksčiau diagnozuotas kitos lokalizacijos piktybinis navikas ir taikytas priešnavikinis gydymas
Diagnozuota gerklų patologija: gerklų balso klosčių polipas, lėtinis hiperplazinis laryngitas su keratoze, atsinaujinanti gerklų papilomatozė
Anksčiau taikytas gerklų vėžio gydymas (radioterapija, chemoterapija)
Pacientų amžius daugiau kaip18 metų Pacientų amžius mažiau nei18 metų
Visi šios grupės tirti pacientai suskirstyti į keturis pogrupius pagal diagnozuotą gerklų ligą.
1.1. Balso klosčių polipų (BKP) grupė – pacientai, kuriems pagal kli-nikinius požymius nustatyta ir histologiškai patvirtinta balso klosčių polipų diagnozė (n = 39).
1.2. Lėtinio hiperplazinio laringito su keratoze (LHLK) grupė – pacientai, kuriems diagnozuotas lėtinis hiperplazinis laringitas su keratoze (n = 36).
1.3. Atsinaujinančios gerklų papilomatozės (AGP) grupė – pacien-tai, kuriems diagnozuota gerklų papilomatozė (n = 30).
1.4. Gerklų plokščių ląstelių karcinomos (GPLK) grupė – pacientai, kuriems iki gerklų plokščių ląstelių karcinomos diagnozės nustatymo, netai-kytas gydymas (n = 112).
2. Matrikso metaloproteinazių genų polimorfizmo palyginamoji grupė (referentinė grupė). Mūsų tyrime MMP genų polimorfizmo geno-tipų pasiskirstymo palyginimui, panaudota atsitiktinė Kauno miesto
