KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Audrius Ivanauskas
ANKSTYVOS SKRANDŽIO VĖŽIO
BEI IKIVĖŽINIŲ BŪKLIŲ DIAGNOSTIKOS
GALIMYBIŲ ĮVERTINIMAS
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Disertacija rengta 2003–2007 metais Kauno medicinos universitete
Mokslinis vadovas
Prof. habil. dr. Limas Kupčinskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
Konsultantas
Doc. dr. Laimas Virginijus Jonaitis (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)
TURINYS
SANTRUMPOS...5
1. ĮVADAS ...7
1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai ...8
1.2. Darbo naujumas ...9
2. LITERATŪROS APŽVALGA ...11
2.1. Skrandžio vėžys ...11
2.2. Etiopatogenetiniai mechanizmai...12
2.2.1. Epigenetinės pažaidos ...12
2.2.2. H. pylori reikšmė skrandžio vėžio vystymuisi...20
2.2.3. Skrandžio gleivinės atrofija ir žarninė metaplazija...21
2.3. Skrandžio vėžio patomorfologija ...23
2.4. Ikivėžinių skrandžio būklių – gleivinės atrofijos ir žarninės metaplazijos invazinė diagnostika ...26
2.5. Neinvazinė serologinė atrofinio gastrito diagnostika...28
3. MEDŽIAGA IR TYRIMO METODAI ...30
3.1. Tiriamųjų kontingentas ...30
3.1.1. I dalis – epigenetinis tyrimas...30
3.1.2. II dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infekuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe...31
3.1.3. III dalis – neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas...31
3.2. Tyrimo metodai...32
3.2.1. I dalis – epigenetinis tyrimas...32
3.2.2. II dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infekuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe...43
3.2.3. III dalis – neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas...44
3.3. Matematinė-statistinė duomenų analizė...46
4. REZULTATAI ...48
4.1. I dalis – epigenetinis tyrimas ...48
4.2. II dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infekuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe ...52
4.3. III dalis – neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas...54
5. REZULTATŲ APTARIMAS ...60
5.1. I dalis – epigenetinis tyrimas ...60
5.2. II–III dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infekuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe, neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas ...62
6. IŠVADOS...66 7. REKOMENDACIJOS...67 8. PADĖKOS ...68 9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ...69 10. PUBLIKACIJOS...79 11. PRIEDAI...80
SANTRUMPOS
A – adeninas
APC – žarnų adenomatozinės polipozės (angl. adenomatous polyposis coli) genas aps./min. – apsisukimai per minutę
bp – bazių pora
C – citozinas
CpG – citozino ir guanino
CIMP – CpG salelių metilinimo fenotipas DNR – dezoksiribonukleorūgštis
RT-PGR – atvirkštinė transkriptazės polimerazės grandininė reakcija cDNR – viengrandė komplimentinė DNR
CDH1 – epitelinio kadherino (angl. E-cadherin) genas
G – guaninas
MgCl2 – magnio chloridas
mRNR – informacinė ribonukleorūgštis (angl. messenger ribonucleoacid) PGI – pepsinogenas I
PGII – pepsinogenas II
G-17 (F) – gastrinas 17, bazinis (angl. fasting-nevalgęs)
G-17 (S) – gastrinas 17, stimuliuotas (angl. stimulated-stimuliuotas) IgA – imunoglobulinas A
IgG – imunoglobulinas G H. pylori – Helicobacter pylori ŽM – žarninė metaplazija HCl – druskos rūgštis
HE – hematoksilinas eozinas EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis NSG – naviką slopinantys genai pav. – paveikslas
PGR – polimerazės grandininė reakcija PSO – Pasaulio sveikatos organizacija MSI – mikrosatelitinis nestabilumas
MSP – metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija p – paklaidos tikimybė, reikšmingumo lygmuo
ACTB, β2M – β aktinas
TPEF/HPP1 – genas, koduojantis transmembraninį baltymą, turintį epidermio augimo fakto-riaus ir folistatino modulius; žmogaus hiperplastinių polipų baltymo genas (angl. transmembrane protein containing epidermal growth factor and follista-tin domains/ hyperplastic polyposis protein)
n – atvejų skaičius, imties tūris NS – statistiškai nereikšminga SN – standartinis nuokrypis
T – timinas
x – vidurkis
ROC – ROC kreivė (angl. Receiver operating characteristic) TPV – teigiama prognostinė vertė
NPV – neigiama prognostinė vertė 5-FU – 5-fluorouracilas
1. ĮVADAS
Visame pasaulyje skrandžio vėžys yra didelė problema, kasmet diagnozuojama apie 875000 naujų atvejų ir 645000 miršta nuo šios ligos [1]. Sergamumas skrandžio vėžiu auga, daugelyje šalių jis išlieka viena dažniausių mirtį sąlygojančių priežasčių. Remiantis GLOBOCAN duomenimis, 2002 m. Vokietijoje sergamumas skrandžio vėžiu buvo 15,1 vyrų ir 8,8 moterų tarpe 100000 gyventojų, Lietuvoje, atitinkamai, 25,3 vyrų ir 13,0 moterų tarpe, Latvijoje 24,6 vyrų ir 11,1 moterų tarpe 100000 gyventojų [2]. Lietuvos vėžio registro duomenimis, 2005 m. Lietuvoje sergamumas skrandžio vėžiu buvo 35,0 vyrų ir 22,1 moterų tarpe 100000 gyventojų, mirtingumas nuo šios ligos 2004 m. – 30,4 vyrų ir 17,8 moterų tarpe 100000 gyventojų [3]. Šis susirgimas vis dar dažniausiai diagnozuojamas vėlyvose stadijose, kuomet radikali operacija jau nėra galima.
Šiuo metu pirminė ir antrinė skrandžio vėžio profilaktika yra labiausiai efektyvi mažinant ser-gamumą ir mirtingumą nuo šios ligos. Vis dėlto, sėkmingas šios strategijos vystymas labai priklau-so nuo suvokimo etiologinių faktorių ir patogenezinių mechanizmų, dalyvaujančių skrandžio kance-rogenezėje [4]. Skrandžio vėžio vystymasis yra kompleksinis ir šiuo metu dar pilnai neišaiškintas procesas.
Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) 1994 m. paskelbė Helicobacter pylori (H. pylori) I kla-sės kancerogenu, susijusiu su skrandžio vėžio išsivystymu [5]. Tačiau yra žinoma, kad be lėtinio gastrito, sukeliamo H. pylori, dietos (gausus druskos, nitratų vartojimas), rūkymo ir galimai pikt-naudžiavimo alkoholiu, egzistuoja papildomi skrandžio vėžio rizikos faktoriai [6-11].
Genetiniai faktoriai ir genetiškai nulemtas atsakas į aplinkos faktorius yra kertiniai skrandžio kancerogenezės mechanizmų supratime [12]. Genetinės ir epigenetinės pažaidos sukelia molekuli-nius pokyčius. Pagrindinis skirtumas tarp genetinių ir epigenetinių pažaidų yra tas, kad epigenetiniai pokyčiai yra grįžtami, eliminavus toksinį faktorių ar veikiant terapinėms priemonėms bei chemi-niams veikschemi-niams [13-15]. Dezoksiribonukleorūgšties (DNR) metilinimas – tai epigenetinė pažaida, kuri, nesukeldama DNR nukleotidų sekos pokyčių, lemia paveldimus genų ekspresijos pokyčius. Genų metilinimas yra ankstyvas bei vienas iš pagrindinių naviką slopinančių genų (NSG) inaktyva-vimo mechanizmų, nustatomas įvairių lokalizacijų navikų atvejais. Netipiškas CpG salelių metili-nimas demonstruoja genų, neabejotinai dalyvaujančių vėžio vystymęsi, transkripcinį ,,nebylumą“. Azotinės bazės citozino (C) metilinimas šiose salelėse sukelia geno ekspresijos nebuvimą ir yra su-sijęs su X chromosomos inaktyvacija [16,17]. Metilinimo proceso išaiškinimas yra labai svarbus klinikine prasme, įskaitant ankstyvą diagnostiką, chemoprevenciją, prognozę ir vėžio gydymą [18]. TPEF/HPP1 genas koduoja ląstelės paviršiaus receptorių su trumpa citoplazmos dalimi, trans-membraninę sritį ir ekstraląstelinį komponentą su dviem folistatino moduliais (epidermio augimo faktoriaus ir prijungimo glikozaminoglikanams vietos) [19]. Galimai TPEF/HPP1 genas atlieka
įvairias funkcijas ląstelės augimo, brendimo fazėse, adhezijos procese, šio geno inaktyvavimas yra ankstyvas įvykis virškinamojo trakto navikų vystymesi [20]. Nauji tyrimai patvirtino, kad TPEF/HPP1 geno metilinimas yra dažnas reiškinys tulžies ir šlapimo pūsles, kolorektalinio vėžio atvejais [19,21,22]. Šio geno metilinimas yra dažnas reiškinys kolorektalinio vėžio tolimosiose me-tastazėse [23]. Vis dėlto, nėra pakankamai duomenų apie TPEF/HPP1 geno metilinimo reikšmę skrandžio kancerogenezėje [20,24].
Kitas svarbus skrandžio vėžio rizikos faktorius yra H. pylori sąlygotas atrofinis gastritas. Kli-nikinėje praktikoje atrofinis gastritas patvirtinamas histologiškai ištyrus daugybines skrandžio glei-vinės biopsijas, paimtas endoskopijos metu, pagal 1994 m. Hiūstone modifikuotą Sidnėjaus klasifi-kaciją [25,26]. Šie tyrimai yra pakankamai brangūs naudoti atrankinei patikrai. Keletą dešimtmečių yra žinoma, kad skrandžio kūno ir dugno atrofiją galima nustatyti remiantis pepsinogeno I (PGI), pepsinogeno II (PGII) koncentracija kraujo plazmoje. Tačiau nebuvo žinoma serologinio žymens, kuris atspindėtų skrandžio antruminės dalies atrofijos. Pentti Ilmari Sipponen iš Jorvi ligoninės (Es-poo, Suomija) nustatė, kad skrandžio antruminės dalies atrofiją galima nustatyti remiantis gastrino-17 (G-gastrino-17) koncentracija kraujo plazmoje [27,28]. Remiantis šiais serologiniais žymenimis (PGI, PGII, PGI/PGII santykiu ir G-17), o taip pat antikūnių prieš H. pylori (IgA/IgG) koncentracija krau-jo plazmoje galima nustatyti bei atrinkti pacientus, kurie turi padidintą riziką sirgti skrandžio vėžiu, opalige ir nukreipti juos endoskopiniam tyrimui, o taip pat diagnozuoti neatrofinį H. pylori gastritą ir skirti H. pylori eradikacinį gydymą, neatliekant endoskopinio tyrimo. Atliktų tyrimų rezultatai rodo gerą šio testo diagnostinį jautrumą (79 proc.) ir specifiškumą (91 proc.), teigiamą prognostinę vertę (TPV) 64 proc., neigiamą prognostinę vertę (NPV) 93 proc. [29]. Tačiau nėra visiškai aišku, ar šis testas yra tinkamas Rytų Europos ir Tolimųjų Rytų gyventojų, turinčių padidintą riziką sirgti skrandžio vėžiu, atrankinei patikrai.
1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas
Ištirti naujas ankstyvos skrandžio vėžio bei ikivėžinių būklių diagnostikos galimybes, įvertinant skrandžio audinių epigenetinių pažaidų ypatumus bei ikivėžinės būklės – gleivinės atrofijos serologi-nės diagnostikos metodus.
Darbo uždaviniai
1. Nustatyti sergančiųjų skrandžio adenokarcinoma TPEF/HPP1 metilintų genų dažnumą navikiniame ir nenavikiniame skrandžio audinyje bei funkcine dispepsija sergančiųjų
2. Įvertinti sąsajas tarp tirtų epigenetinių pažaidų ir sergančiųjų skrandžio vėžiu (adeno-karcinoma) klinikinių ir morfologinių charakteristikų.
3. Nustatyti sergančiųjų skrandžio vėžiu (adenokarcinoma) TPEF/HPP1 metilintų genų ekspresiją navikiniame ir nenavikiniame skrandžio audinyje.
4. Ištirti I klasės kancerogeno (PSO, 1994) H. pylori bei ikivėžinės būklės – atrofinio gast-rito dažnumą sergančių funkcine dispepsija (vyresnių nei 55 metų amžiaus) ligonių tar-pe Lietuvoje, Latvijoje ir Taivanyje.
5. Įvertinti atrofinio gastrito neinvazinės serologinės diagnostikos metodą, tiriant PGI, PGII ir G-17 koncentracijas kraujo plazmoje ir palyginti rezultatus su skrandžio gleivi-nės bioptatų histologinio tyrimo duomenimis.
1.2. Darbo naujumas
Šiame darbe nagrinėjama viena sparčiausiai pastaraisiais metais mokslo pasaulyje besivystan-čių skrandžio vėžio molekulinės biologijos sribesivystan-čių – epigenetika. Epigenetinių pažaidų nustatymui taikytas šiuolaikinis pasaulinius standartus atitinkantis tyrimo metodas — metilinimui jautri po-limerazės grandininė reakcija (MSP). TPEF/HPP1 geno metilinimas gerai ištyrinėtas ir literatūroje aprašytas tulžies ir šlapimo pūslės, kolorektalinio vėžio (taip pat ir metastazėse kepenyse) atvejais [19,21,22,23]. Disertacijoje pateikti šio geno metilinimo tyrimai skrandžio adenokarcinoma sergan-čiųjų audiniuose vieni iš pirmųjų pasaulyje. Darbe kompleksiškai įvertintos TPEF/HPP1 geno me-tilinimo sąsajos su sergančiųjų skrandžio adenokarcinoma klinikinėmis ir morfologinėmis charakteristikomis.
Skrandžio vėžys yra labiau paplitęs vyresnių žmonių populiacijose. Tai leidžia daryti prielaidą, kad atrofija ir žarninė metaplazija (ŽM) labiau susijusios su vyresniu pacientų amžiumi, galbūt dėl ilgai besitęsiančio H. pylori sąlygoto gastrito. Literatūroje trūksta palyginamųjų duomenų apie H. pylori paplitimą vyresnių žmonių populiacijose tiek Lietuvoje, tiek ir Latvijoje bei Taivanyje. Gerai žinoma, kad vyresnių pacientų, sergančių atrofiniu gastritu, H. pylori diagnostika yra pakankamai sudėtinga dėl mažo šių patogenų kiekio. Vyresniems pacientams H. pylori nustatoma remiantis keliais skirtingais H. pylori diagnostiniais metodais. Būtent šiame darbe ir tirtas gyventojų, vyresnių nei 55 metai, infekuo-tumas H. pylori, atrofijos ir ŽM dažnumas ir sunkumas Rytų Europos šalyse (Lietuvoje, Latvijoje) bei Taivanyje. Nauja šiame darbe dar ir tai, kad visus histologinius skrandžio gleivinės pakitimus „ak-lai“ vertino 2 skirtingų šalių (Lietuvos ir Suomijos specialistai), o esant nuomonių skirtumui, spren-dimas buvo priimamas bendru 3 šalių (Suomijos, Latvijos ir Lietuvos) specialistų sutarimu. Tai už-tikrino duomenų standartizavimą ir rezultatų tikslumą.
Taip pat šiame darbe nagrinėjamos atrofinio gastrito neinvazinės serologinės diagnostikos, ti-riant PGI, PGII ir G-17 koncentraciją kraujo plazmoje, galimybės. Šis metodas yra atsiradęs nese-niai ir palaipsniui įdiegiamas ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse. Apie šio metodo galimybes šaly-se, kuriose yra didelis H. pylori infekuotumas, duomenų pateikiama nedaug ir nėra visai aišku, ar jis tinkamas šiems regionams. Lietuvoje atrofinio gastrito serologinės diagnostikos metodas pritaikytas pirmą kartą.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Skrandžio vėžys
Kasmet pasaulyje diagnozuojama apie 875000 naujų skrandžio vėžys atvejų ir 645000 miršta nuo šios ligos [1]. Sergamumas skrandžio vėžiu auga, daugelyje šalių jis išlieka viena dažniausių mirtį sąlygojančių priežasčių. Remiantis GLOBOCAN duomenimis, 2002 m. Vokietijoje sergamumas skrandžio vėžiu buvo 15,1 vyrų ir 8,8 moterų tarpe 100000 gyventojų, Lietuvoje, atitinkamai, 25,3 vyrų ir 13,0 moterų tarpe, Latvijoje 24,6 vyrų ir 11,1 moterų tarpe 100000 gyventojų [2]. Lietuvos vėžio registro duomenimis, 2005 m. Lietuvoje sergamumas skrandžio vėžiu buvo 35,0 vyrų ir 22,1 moterų tarpe 100000 gyventojų, mirtingumas nuo šios ligos 2004 m. – 30,4 vyrų ir 17,8 moterų tarpe 100000 gyventojų [3]. Šis susirgimas vis dar dažniausiai diagnozuojamas vėlyvose stadijose, kuomet radikali operacija jau nėra galima.
Vakarų šalyse daugumai pacientų nustatomas lokaliai išplitęs skrandžio vėžys, pagal TNM klasifikaciją apibūdinamas kaip T3-4N0-2M0. Radikali operacija galima maždaug pusei šių pacien-tų, o dviems trečdaliams 2-3 metų bėgyje stebimi recidyvai [30]. Panaši situacija ir Lietuvoje. Radi-kalus chirurginis gydymas galimas ir taikomas pacientams, sergantiems I-III stadijos skrandžio vė-žiu. Chirurginio gydymo tikslas – atlikti skrandžio rezekciją su plačiais sveiko audinio kraštais ir limfonodektomiją.
Pažengusio skrandžio vėžio sisteminė chemoterapija – dažniausiai paliatyvi priemonė.
Daugelio citostatikų poveikis tyrinėtas gydant skrandžio vėžį. 5-fluorouracilas (5-FU) ir šio-mis dienošio-mis išlieka centrine skrandžio vėžio chemoterapijos schemų ašimi. Klinikinis efektas (at-sakas) su 5-FU siekia 20-30 proc., tiek skiriant boliusu, tiek ilgalaikės infuzijos būdu. 5-FU pašali-niai reiškipašali-niai – mukozitas, viduriavimas, mielosupresija (kuomet taikoma ilgalaikės infuzijos būdu) ir taip vadinamas rankų-pėdų sindromas (angl. hand-foot syndrome). Kiti citostatikai, kurių akty-vumas buvo įrodytas gydant skrandžio vėžį, mitomicinas C, antraciklinai (doksorubicinas, epirubi-cinas), etopozidas. Klinikinis efektas, taikant šiuos medikamentus svyravo nuo 6 iki 30 proc. Kitas citostatikas plačiai naudojamas gydant skrandžio vėžį – cisplatina, naudojama kombinacijoje su kitais citostatikais schemose [31,32].
Buvo bandoma taikyti ir naujos kartos citostatikus gydant skrandžio vėžį: taksanus (paklitakselį ir docetakselį), irinotekaną, tačiau šių medikamentų klinikinis efektas monoterapija buvo nedidelis. II fa-zės klinikiniai tyrimai atskleidė docetakselio platų citotoksinį spektrą solidinių navikų (kiaušidžių, krū-ties, skrandžio, galvos-kaklo, plaučių) gydyme. Trijuose II fazės klinikiniuose tyrimuose (dalyvavusių pacientų skaičius 113), atliktuose JAV, Europoje ir Japonijoje, docetakselio monoterapija gautas 17–24
proc. klinikinis efektas gydant išplitusį skrandžio vėžį. Šie rezultatai vertė toliau tirti docetakselio kom-binacijas su kitais citostatikais [33].
Neseniai atliktas TAX 325 klinikinis tyrimas įrodė chemoterapijos docetakselio, cisplatinos, 5-FU schemos efektyvumą išplitusio skrandžio vėžio gydyme [34,35,36].
2.2. Etiopatogenetiniai mechanizmai
2.2.1. Epigenetinės pažaidos DNR metilinimas
Epigenetinės pažaidos – tai ląstelės genetinėje medžiagoje, DNR ir chromatine, paveldimi po-kyčiai, dėl kurių sutrinka genų raiškos reguliacija. Epigenetinės pažaidos, skirtingai nuo genetinių, nesukelia DNR nukleotidų sekos pokyčių – mutacijų, delecijų ir kitų [37].
Viena pagrindinių epigenetinių pažaidų yra pakitęs DNR metilinimas. DNR metilinimas – tai poreplikacinis cheminis DNR modifikavimas. DNR metilinimo metu metilo grupė (-CH3) kovalen-tiškai prijungiama prie citozino anglies molekulės 5 pozicijoje ir susidaro metilintas citozinas, arba metilcitozinas [38]. Reakcija katalizuojama vieno ar kelių fermentų – DNR metiltransferazių. Meti-lo grupių donoru ląstelėje esti adenozilmetioninas, kuris per metilinimo reakciją virsta S-adenozilhomocisteinu.
CpG salos
Žmonių ir žinduolių ląstelėse dažniausiai metilinamas citozinas, esantis prieš guaniną (G), taip vadinamuosiuose citozino ir guanino dinukleotiduose arba CpG dinukleotiduose [39]. Žinduo-lių ląstelėse tik 3-5 proc. viso citozino yra metilinta [40]. Šios DNR sekos buvo pavadintos CpG salomis. CpG salose CpG dinukleotidai nustatomi penkis kartus dažniau palyginti su CpG dinukleo-tidų kiekiu visame genome, ir jose citozinas yra apsaugotas nuo metilinimo. Apie 60 proc. žmogaus genų, dalyvaujančių svarbiuose ląstelės procesuose, turi minėtas CpG salas.
Dažnai šios salos yra susijusios su šių genų 5’ galo reguliacinėmis sritimis – promotoriais ir (ar) pirmu egzonu [41]. Todėl manoma, kad nemetilintų CpG dinukleotidų skaičiaus išlaikymas reguliacinėse geno srityse yra svarbus šių genų raiškos procesui. Genomo sekvenavimo tyrimais nustatyta, kad žmogaus genome yra 29000 CpG salų. Jose yra daugiau kaip 19 milijonų CpG dinuk-leotidų [42,43].
CpG saloms apibūdinti buvo pasiūlyti keli apibrėžimai. CpG salos – tai trumpos (apie 200 ba-zių porų ilgio) DNR sritys. Šiose DNR srityse daugiau kaip 50 proc. visų baba-zių sudaro citozinas ir guaninas (o visame genome citozino ir guanino kiekis tesiekia 40 proc.). Jų faktinis, palyginti su
pasikartojančias DNR sekas ir palikti tik susijusias su genais CpG salas, vėliau buvo pasiūlytas griežtesnis CpG salų apibrėžimas. Tai – DNR sritys, ilgesnės kaip 500 bp, kuriose daugiau kaip 55 proc. visų bazių sudaro citozinas ir guaninas. Jų faktinis, palyginti su teoriniu, CpG dinukleotidų dažnio santykis lygus 0,65 arba yra didesnis [46].
DNR metilinimo reikšmė
Pirmą kartą metilintas citozinas buvo paminėtas ir išskirtas dar praėjusio amžiaus pradžioje, tačiau ilgą laiką jo biologinė reikšmė buvo neaiški [47]. Šiuo metu yra žinoma, kad DNR metilini-mas yra normalus procesas vykstantis įvairiuose organizmuose – nuo bakterijų iki žmogaus. Be to, vis daugiau duomenų rodo, kad DNR metilinimo pobūdis keičiasi sergant įvairiomis ligomis, tarp jų ir vėžiu [48].
DNR metilinimas taip pat dalyvauja genų imprintinge [49] ir genų, esančių moterų X chromo-somoje inaktyvinime [50]. Normaliose ląstelėse tai yra du išimtiniai atvejai, kai genų promotorių CpG dinukleotiduose esantis citozinas yra metilintas ir tada genų raiška vyksta tik nuo vieno alelio.
DNR metiltransferazės
Vienas svarbesnių epigenetikos mokslo laimėjimų buvo DNR metiltransferazių, kurios katali-zuoja citozino metilinimą, atradimas. 1988 metais nustatytas pirmasis DNR metiltransferazės genas, kurio koduojamas produktas, DNR metiltransferazė 1, ilgą laiką buvo vienintelė žinoma DNR me-tiltransferazė tarp žinduolių [51]. Šiuo metu yra žinomas dviejų tipų DNR metilinimas – palaikoma-sis (angl. maintenance methylation) ir de novo metilinimas. Palaikomapalaikoma-sis metilinimas apibūdinamas kaip procesas, kurio metu pusiau metilinta DNR virsta visiškai metilinta DNR arba kaip naujai sin-tezuotos dukterinės nemetilintos DNR grandinės metilinimas, metilinimo profilį nukopijuojant nuo motininės DNR grandinės. De novo metilinimas – DNR metilinimas, kai abi DNR grandinės yra nemetilintos. Manoma, kad DNR metiltransferazė 1 užtikrina DNR metilinimo palaikymą ląstelės ciklo S fazės metu ir yra nuo 5 iki 30 kartų aktyvesnė pusiau metilintos (angl. hemimethylated) pa-lyginti su nemetilintos (angl. nonmethylated) DNR atžvilgiu [52]. Vėlesnių tyrimų metu buvo nu-statyta DNR metiltransferazė 2 [53], DNR metiltransferazė 3a ir 3b. Šiuo metu DNR metiltransfera-zės 2 funkcija ir biologinė reikšmė neaiški, kadangi atliekant eksperimentinius tyrimus in vitro ne-nustatytas DNR metiltransferazės 2 metiltransferazinis aktyvumas.
DNR metilinimas ir genų raiškos reguliacija
Pirmieji tyrimai, nagrinėję DNR metilinimo reikšmę genų raiškos reguliacijai, paskelbti praė-jusio amžiaus septintajame dešimtmetyje, nustatė tiesioginį priklausomumą tarp bendro metilcitozi-no kiekio sumažėjimo gemetilcitozi-nome (DNR hipometilinimo) ir genų raiškos [54]. Papildomi duomenys gauti atlikus eksperimentinius tyrimus su DNR metiltrasferazių inhibitoriais, citozino analogais
5-azacitidinu ir 5-aza-2-deoksicitidinu. Klasikiniai pavyzdžiai, kaip genų promotorių DNR metilini-mas dalyvauja šių genų raiškos slopinime, yra genų imprintingas ir X chromosomos inaktyvinimetilini-mas. Todėl neatsitiktinai pirmą kartą geno raiškos indukcija DNR metiltransferazės inhibitoriumi 5-azacitidinu buvo įrodyta ištyrus inaktyvintos X chromosomos genus [55].
Mokslinė literatūra aprašo mechanizmus, kuriais DNR metilinimas, gali slopinti genų raišką: 1. Tiesioginis mechanizmas. DNR metilinimas blokuoja specifiškų tam tikroms DNR
se-koms transkripcijos veiksnių (AP-2, c-Myc/Myn, CREB, E2F, NFkB) prisijungimą prie geno promotoriaus metilintos DNR [47,56,57].
2. Netiesioginis mechanizmas, kai dalyvauja su metilcitozinu sąveikaujantys baltymai (angl. methylcytosine-binding proteins ir methylcytosine-binding domain proteins), pvz., MeCP1, MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, Kaiso. Šie baltymai nėra specifiški DNR sekoms, tačiau pasirinktinai jungiasi su metilinta DNR. Be to, baltymai sudaro kompleksus su histonų deacetilazėmis HDAC1, HDAC2 ir įvairiais transkripcijos ko-represoriais [58,59]. Žinduolių ląstelėse DNR ir histonai sudaro nukleosomas. Nukleo-soma – tai 146 bp ilgio DNR, apsisukusi apie baltymų oktamerus, sudarytus iš histonų H2A, H2B, H3 ir H4 molekulių. Histonų deacetilazės deacetilina histonų lizino liekanas ir palengvina sąveiką tarp gretimų histonų. Taip formuojasi transkripciškai neaktyvus kondensuotas chromatinas [60].
DNR metilinimo tyrimo metodai
Šiuo metu egzistuoja daugybė kokybinių ir kiekybinių DNR metilinimo tyrimo metodų. Pra-diniais metodais buvo nustatomas bendras metilcitozino kiekis genome, o šiuolaikiniais metodais daugiau tyrinėjamas specifinių DNR sekų metilinimas. Pagrindiniai DNR metilinimo tyrimo meto-dai [61,62,63] yra šie:
1. Bendro metilcitozino kiekio genome nustatymo metodai:
1.1. Efektyviosios chromatografijos metodai (efektyvioji skysčių chromatografija, efekty-viosios skysčių chromatografijos ir masės spektrometrijos derinys, efektyvioji kapiliari-nė elektroforezė), pagrįsti DNR chemine hidrolize iki bazių, jų frakcionavimu ir kieky-biškai įvertinamu metilcitozino kiekiu.
1.2. Fermentiniai-cheminiai metodai: metilo grupių akceptoriaus analizė (angl. Methyl-acceptor assay), besiremianti tričiu žymėtos metilo grupės perkėlimu ant nemetilinto ci-tozino CpG dinukleotiduose naudojant bakterijų DNR metiltransferazę, bei fluorescen-cinis DNR žymėjimas chloroacetaldehidu, pagrįstas chloroacetaldehido kiekybine reak-cija sudaryti fluorescencinius etenocitozino ir etenoadenino aduktus.
1.3. In situ hibridizacijos metodas, panaudojant metilcitozinui specifinius polikloninius ar monokloninius antikūnus.
2. Specifinių DNR sekų metilinimo tyrimo metodai:
2.1. Nebisulfitiniai metodai, panaudojant metilinimui jautrias ir nejautrias restrikcijos endo-nukleazes, kurios kerpa DNR tam tikroje vietoje priklausomai nuo DNR metilinimo būklės.
2.2. Bisulfitinio modifikavimo metodai. Denatūravus DNR, natrio bisulfitas paverčia nemetilin-tą citoziną uracilu, o metilintas citozinas lieka nepakitęs. Taip atsiranda skirtingos DNR se-kos, priklausomai nuo metilinimo būklės. Yra daugybė metodų, kuriais toliau gali būti nu-statoma, ar natrio bisulfitu modifikuotos DNR specifinės sekos yra metilintos ar nemetilin-tos. Tai sekvenavimas, kombinuota bisulfitinio modifikavimo ir restrikcijos analizė, (angl. Combined bisulfite restriction analysis – COBRA), metilinimui jautri vieno nukleotido ilgi-nimo reakcija (angl. Methylation-sensitive single nucleotide primer extension), metilinimui jautri DNR grandinės konformacijos analizė (angl. Methylation-sensitive single-strand con-formation analysis). Tačiau plačiausiai šiuo metu taikomas metodas – metilinimui jautri po-limerazės grandininė reakcija ir jos modifikacijos [64]. Po DNR modifikavimo natrio bisul-fitu metilinta DNR seka skiriasi nuo nemetilintos „laukinės“ (angl. wild type) DNR sekos. Šiuos pokyčius atpažįsta specifiniai pradmenys (angl. primers). Rezultatai dokumentuojami atlikus elektroforezę gelyje. Yra keletas šio metodo modifikacijų: „pusiau lizdinė“ (angl. seminested), „lizdinė“ (angl. nested) dviejų etapų, MSP ir in situ hibridizacijos ar efektyvio-sios skysčių chromatografijos derinys, kiekybinis MethyLight metodas [65].
3. Genominiai tyrimo metodai [66]. DNR metilinimas ir kancerogenezė
Daugiau nei prieš 17 metų buvo pastebėta, kad vėžinėse ląstelėse yra įvykę DNR metilinimo pokyčiai, kurie skiriasi nuo normalių ląstelių DNR metilinimo pobūdžio.
Vėžinėse ląstelėse gali būti trys procesai, susiję su DNR metilinimo pokyčiais [47]:
1. Bendro metilcitozino kiekio sumažėjimas genome – genomo hipometilinimas (angl. ge-nome-wide hypomethylation).
2. Genų promotorinių sekų CpG salų metilinimas (angl. hypermethylation, aberrant me-thylation).
3. DNR metiltransferazių aktyvumo padidėjimas.
Šie procesai vėžinėje ląstelėje gali vykti kartu, dominuojant genomo hipometilinimui. Tačiau dar nėra aišku, ar genomo hipometilinimas ir genų promotorių metilinimas yra vieno proceso atski-ros dalys, ar tai atskiri nesusiję procesai. Žinant, kad šie procesai vyksta skirtingose DNR vietose,
manoma, jog minėti procesai tarp savęs nesusiję. Yra duomenų, kad CpG salų metilinimas gali įvykti anksčiau nei genomo hipometilinimas [67].
Genomo hipometilinimas
Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad koduojančių geno sričių, kurios daugiausia būna meti-lintos, hipometilinimas menkai koreliuoja su genų raiškos reguliacija. O reguliacinės geno sritys (geno promotoriai) normaliomis sąlygomis yra nemetilintos ir neveikiamos hipometilinimo proceso. Manoma, kad tuo gali būti paaiškinamas silpnas ryšys tarp DNR hipometilinimo ir genų raiškos aktyvinimo [68].
Genų promotorių CpG salų metilinimas
Kaip minėta, per septintąjį ir aštuntąjį praėjusio amžiaus dešimtmečius nustatytas ryšys tarp DNR metilinimo ir genų raiškos pokyčių. Buvo iškelta hipotezė, kad ir vėžinėse ląstelėse gali vykti panašūs procesai. Baylin su bendraautoriais pirmieji praėjusio amžiaus aštuntąjį dešimtmetį tai patvirtino, nustatydami metilintą kalcitonino geno promotorių 11 chromosomos trumpajame petyje solidiniais navikais ir leukemijomis sergantiems ligoniams [69,90]. Kalcitonino geno reikšmė kancerogenezei abejotina, tačiau buvo rasta ir daugiau metilintų CpG salų 11q chromosomoje, kurioje yra daugelis NSG [71]. Tuo metu prieita išvados, kad 11q chromosomoje yra genų promotorių CpG salų metilinimo „karštieji taškai“, ir DNR metilinimas gali būti vienas esminių NSG inaktyvinimo mechanizmų navikuose [72]. Iki devintojo praėjusio amžiaus dešimtmečio tiesioginių tyrimų, patvirtinančių minėtą hipotezę, nebuvo. Pirmasis klasikinis NSG, kurio promotoriuje 1991 metais rasta metilinta DNR, buvo retinoblastomos genas [73]. 1993 metais atliekant eksperimentus in vitro buvo įrodyta, kad šio geno promotoriaus metilinimas blokuoja transkripcijos veiksnių sąlygojamą promotoriaus aktyvinimą [74]. Tačiau visiškai aiškus ryšys tarp geno promotoriaus metilinimo ir geno raiškos slopinimo buvo įrodytas ištyrus kitą klasikinį NSG – von Hippel-Lindau geną, būdingą inkstų vėžiui [75]. Remiantis šio geno tyrimais, buvo apibrėžti klasikiniai teiginiai, apibūdinantys NSG inaktyvinimo ir šių genų promotorių DNR metilinimo ryšį [75]:
1. Pažeidžiami NSG.
2. Metilinta genų promotorių DNR nustatoma tik navikiniame audinyje, tačiau ne atitinkamame sveikame audinyje.
3. Navikuose, kuriuose nustatytas metilintas genas, nerandama atitinkamo geno alelio koduojančios srities mutacijos.
4. Nenustatoma metilinto geno raiška informacinės ribonukleorūgšties (mRNR) lygyje. 5. Metilintų genų raišką galima atnaujinti paveikus juos demetilinančiais preparatais.
Normaliose (nevėžinėse) ląstelėse genų promotorių CpG salų DNR yra nemetilinta, o histonų molekulės – acetilintos. Tai sąlygoja transkripciškai aktyvią nekondensuoto chromatino struktūrą, transkripcijos veiksnių (pirminio transkripcijos veiksnio, histono acetiltrasferazių, transkripcijos koaktyvatorių) prieinamumą prie nemetilintos DNR ir aktyvią geno raišką.
Nemetilintas genų promotorių CpG salas iš abiejų pusių supa metilinti CpG dinukleotidai, susiję su anksčiau minėtų baltymų ir histono deacetilazių kompleksais, kompaktiška nukleosomų sandara, deacetilintais histonais. Normalios ląstelės tarp šių sričių turi barjerą, neleidžiantį plisti metilinimui į geno promotoriaus sritį. Iki šiol nėra visiškai aiškūs šio barjero molekuliniai mechanizmai, tačiau manoma, kad egzistuoja lokalūs veiksniai, apsaugantys genų promotorių CpG salas nuo metilinimo. Prie tokių veiksnių priskiriamos transkripcijos veiksnių, pvz., specifinio baltymo 1 (angl. specific protein 1 – Sp-1), ir CTCCC sujungiančio veiksnio (angl. CTCCC binding factor – CTCF) prisijungimo prie DNR sritys [76,77,78], taip pat kai kurie baltymai (pvz., histonas H1e) [79,80]. Keli autoriai nurodo, kad barjerui palaikyti taip pat svarbi aktyvi transkripcija, aktyvus demetilinimas, replikacijos laikas, lokali chromatino struktūra [81]. Manoma, kad vėžinėse ląstelėse yra apeinamas šis apsauginis barjeras ir metilinimas plinta į geno promotoriaus sritį. Nors molekuliniai mechanizmai nėra aiškūs, galvojama, kad tai gali vykti dėl DNR metiltransferazės aktyvumo padidėjimo arba minėtų transkripcijos veiksnių ir baltymų pokyčių [77,82].
DNR metiltransferazių aktyvumo padidėjimas
T. L. Kautiainen ir P. A. Jones (1986 m.) pirmieji nustatė, kad pelių ir žmogaus navikinėse ląstelėse DNR metiltransferazės aktyvumas yra daug kartų didesnis nei normaliose ląstelėse. Tai buvo netikėtas atradimas, nes tose pačiose navikinėse ląstelėse kartu buvo nustatytas genomo hipometilinimas. Autoriai padarė prielaidą, kad padidėjęs DNR metiltrasferazių aktyvumas sąlygoja DNR metilinimą „karštuose taškuose“ [83].
Po kelių metų pirmieji duomenys apie padidėjusį DNR metiltransferazės aktyvumą vėžinėse ląstelėse buvo patvirtinti kitų mokslininkų tyrimais, kuriuose įvairių tipų navikinėse ląstelėse nusta-tytas didesnis DNR metiltransferazės, mRNR kiekis palyginti su nenavikinių ląstelių kultūromis [84]. T. Matsumura su bendraautoriais ir vėliau P. M. Vertino su kolegomis nustatė, kad fibroblas-tams senėjant vyksta DNR hipometilinimas ir mažėja DNR metiltransferazės geno aktyvumas. O užkrėtus fibroblastus SV40 virusu, išvengiama fibroblastų senėjimo, pailgėja ląstelių gyvenimo trukmė, kai kurie fibroblastai išvengia krizės ir tampa imortalizuotais. Šiuose SV40 virusu užkrės-tuose fibroblasužkrės-tuose, palyginti su normaliais fibroblastais, nenustatytas DNR metiltransferazės geno aktyvumo sumažėjimas [85,86,87]. DNR metiltransferazės aktyvumo padidėjimas yra ankstyvas kancerogenezės procesas. DNR metiltransferazės taip pat susijusios su vėžio plėtotės procesu. Dau-gelis mokslininkų, tyrinėdami storžarnės vėžio genezės ir plėtotės procesus, nustatė, kad DNR
me-tiltransferazės kiekis didėja pradedant nuo storžarnės normalios gleivinės, toliau – adenomos ir bai-giant storžarnės vėžiu [84,88].
Manoma, kad padidėjęs DNR metiltransferazės aktyvumas tiesiogiai dalyvauja kancerogenezės procese, sukeldamas NSG inaktyvinimą dėl šių genų promotorių metilinimo. Atliekant tyrimus su SV40 virusu užkrėstais fibroblastais, pastebėta, kad fibroblastuose ne tik nemažėja DNR metiltransfe-razės aktyvumas, bet vyksta „jautrių“ metilinimui CpG salų de novo metilinimas, kai DNR metiltrans-ferazės aktyvumas padidėja daugiau kaip devynis kartus. Šių pokyčių daugėja laikui bėgant [82]. Kla-sikiniai eksperimentiniai tyrimai, kuriuose nustatytas ryšys tarp DNR metiltranferazės aktyvumo ir NSG promotorių metilinimo, buvo atlikti Jaenisch laboratorijoje. Eksperimentinėms pelėms, kurios turėjo žarnų adenomatozinės polipozės (angl. Adenomatous polyposis coli – APC) geno ir DNR me-tiltransferazės geno heterozigotines mutacijas, nustatyta 50 proc. mažiau adenomų 6 mėnesius po gi-mimo ir visiškai nerasta papildomai skiriant 5-azadeoksicitidiną [89]. Iš pradžių manyta, kad mažes-nis DNR metiltransferazės aktyvumas lemia mažesnį DNR mutacijų dėl metilcitozino virtimo timinu skaičių. Vėliau prieita išvados, kad eksperimentinėms pelėms mažiau adenomų susiformavo dėl ma-žesnio NSG inaktyvinimo [89].
TPEF/HPP1 geno charakteristikos ir metilinimas biologiniuose mėginiuose
Kaip buvo minėta, genų metilinimas yra ankstyvas bei vienas iš pagrindinių NSG inaktyvavimo mechanizmų. Pasitelkus MSP, metilintas DNR fragmentas buvo išskirtas ir vėliau nustatyta, kad tai yra genas, koduojantis transmembraninį baltymą, turintį epidermio augimo faktoriaus ir folistatino modu-lius, pavadintas TPEF [19,21]. Šis genas yra 2q33 chromosomoje, kurioje dažnai nustatoma vieta, pra-randanti heterozigotiškumą įvairios lokalizacijos navikų, tokių kaip stemplės, storžarnės, prostatos, krū-ties, atvejais. Jo struktūra panaši į tomoregulino, kuris randamas ne tik centrinės nervų sistemos neuro-nuose ir neuroglijos ląstelėse, bet ir virškinamojo trakto perikriptiniuose miofibroblastuose [90]. Vėlesni tyrimai parodė, kad TPEF , kuris taip pat žinomas kaip HPP1, yra ekspresuojamas normalioje storžar-nės gleivinėje, storžarstoržar-nės vėžio metu jo ekspresijos nelieka. Įdomu tai, kad TPEF/HPP1 geno ekspresi-jos išnykimas yra susijęs su šio geno 5' regiono metilinimu [19,91]. Taip pat nustatyta, kad TPEF/HPP1 genas dažnai metilinamas tulžies, šlapimo pūslės, skrandžio vėžio atvejais [19,21,22,24]. Šio geno meti-linimas yra dažnas reiškinys kolorektalinio vėžio tolimosiose metastazėse [23].
Tiksli šio geno funkcija nėra visiškai aiški, tačiau ištyrus jo struktūrą, manoma, kad jis veikia kaip augimo faktoriaus inhibitorius [21]. Liang'o [21], Young'o [19], Sato [91] atlikti tyrimai byloja, kad TPEF/HPP1 geno metilinimas yra susijęs su šio geno ekspresijos išnykimu storžarnės vėžio atve-jais.
karci-mikrosatelitinis nestabilumas (MSI) [92]. TPEF/HPP1 geno metilinimas gali atspindėti ankstyvą įvykį skrandžio vėžio evoliucijoje. Papildomi skrandžio vėžio tyrimai nustatė metilinimo fenomeno egzistavimą skrandžio onkogenezėje [20]. Prielaida šiai teorijai išplaukia iš CpG salelių metilinimo fenotipo (CIMP) ir MSI tarpusavio ryšio, kuris buvo nustatytas storžarnės vėžio atveju [93,94]. Šio skrandžio vėžio patogenetinio mechanizmo išaiškinimas gali suteikti galimybę kryptingai tirti priešvėžinius pakitimus, tokius kaip skrandžio adenoma ir displazija, siekiant nustatyti jų piktybiš-kumo potencialą ir prognozę [20].
TPEF/HPP1 geno metilinimo vaidmuo sveikame audinyje dar tik tyrinėjamas ir šio geno funkcija nėra pilnai išaiškinta. TPEF/HPP1 pristatoma kaip transmembraninė tirpi molekulė, turinti epidermio augimo faktoriaus modulį ir du folistatino modulius ekstraceliulinėje terpėje. Be to, ji turi G baltymą, aktyvuojantį motifą citoplazomos terpėje. TPEF/HPP1 funkcionuoja ir kaip epidermio augimo faktorius, ir kaip receptorius. Tyrimai pademonstravo, kad TPEF/HPP1 skrandžio ląstelėse indukuoja ergB4 fosforilinimą iš tirozino [90]. TPEF/HPP1 gali prailginti nervinių ląstelių gyvavi-mo laiką [95]. Tiksli TPEF/HPP1 geno funkcija nėra išaiškinta, tačiau, kaip ir tugyvavi-moregulino, epi-dermio augimo faktoriaus dalis yra c-erbB-4 ligandas, folistatino dalis gali sujungti ir reguliuoti transformuojamą augimo faktorių β [19]. Galimai TPEF/HPP1 genas atlieka įvairias funkcijas ląs-telės augimo, brendimo fazėse, adhezijos procese, šio geno inaktyvavimas yra ankstyvas įvykis virškinamojo trakto navikų vystymesi [20]. Kartu sudėjus, šie duomenys leidžia teigti, kad TPEF/HPP1 vaidmuo yra svarbus proliferacijos, diferenciacijos ir apoptozės procesuose.
E-cadherino (CDH1) geno mutacijos ir skrandžio vėžys
Nuo 1 iki 3 proc. pacientų, sergančių skrandžio vėžiu, turi vienoką ar kitokią genetinę skrandžio vėžio predispoziciją. E-cadherino (CDH1) geno mutacijos nustatomos 25 proc. šeimų, turinčioms au-tosominę dominantinę difuzinio tipo skrandžio vėžio predispoziciją. Ši skrandžio vėžio rūšis vadina-ma paveldimu (šeimyniniu) difuziniu skrandžio vėžiu. CDH1 yra transmembraninis homodimerinis baltymas, atsakingas už epitelinių ląstelių adheziją, jis yra chromosomoje 16q22.1 ir yra NSG.
Šeimyninio skrandžio vėžio forma pirmą kartą literatūroje aprašyta 1800 m., kai Bonaparte šeimoje nustatyti daugybiniai skrandžio vėžio atvejai. 1998 m. P.Guilford su kolegomis pateikė il-galaikio (nuo 1964m.) Maori genties šeimų (Naujoji Zelandija) stebėjimų duomenis ir pirmasis nu-statė CDH1 mutacijas [96]. Jauniausias asmuo, kuris sirgo skrandžio vėžiu, buvo 14-metis, o dau-guma individų gentyje mirdavo iki 40 metų amžiaus.
Paveldimo (šeimyninio) difuzinio skrandžio vėžio diagnostiniai kriterijai [97]:
• du arba daugiau dokumentuotų difuzinio skrandžio vėžio atvejų pirmos arba antros eilės giminaičių tarpe, vienam iš jų vėžys nustatytas iki 50 metų amžiaus arba
• trys ar daugiau dokumentuotų difuzinio skrandžio vėžio atvejų pirmos arba antros eilės giminaičių tarpe nepriklausomai nuo amžiaus.
2.2.2. H. pylori reikšmė skrandžio vėžio vystymuisi
Visuotinai pripažinta, kad H. pylori yra pagrindinis veiksnys daugiapakopiame skrandžio vė-žio atsiradimo procese, ypač kai jis yra žarninio tipo ir vystosi distalinėje skrandvė-žio dalyje. 1994 m. Tarptautinis vėžio tyrimo centras prie PSO H. pylori pripažino I klasės kancerogenu [5]. Šį postula-tą patvirtina ir pastarojo dešimtmečio tyrimų duomenys [98,99,100]. Skrandžio vėžys išlieka viena iš pagrindinių mirties priežasčių nuo vėžio išsivysčiusiose Vakarų šalyse, kuriose, kaip pastebėta, H. pylori užsikrečiama vaikystėje [101].
Sergamumas skrandžio vėžiu tiesiogiai koreliuoja su skrandžio opaligės ir atvirkščiai kore-liuoja su dvylikapirštės žarnos opaligės sergamumu [102]. Ilgą laiką buvo dirbama šios bakterijos išnaikinimo linkme, kuriami įvairūs antibiotikų deriniai. Bene daugiausiai Europoje šioje srityje nuveikė Europos H. pylori studijų grupė, vadovaujama P. Malfertheiner, F. Megraud, O'Morain. Ši studijų grupė yra detaliai apibrėžusi H. pylori eradikacijos indikacijas [103,104,105]. MALT lim-fomos gydymą taip pat siūloma pradėti nuo H. pylori eradikacijos [105,106,107].
Apie 50 proc. pasaulio gyventojų yra infekuoti H. pylori [108]. Išsivysčiusiose šalyse infe-kuotumas šiuo mikroorganizmu dramatiškai mažėja ir siekia 10–30 proc. Lietuvos mokslininkų duomenimis, infekuotumas tarp sergančiųjų funkcine dispepsija 1995–1998 m. sieke 80 proc., tarp 20–22 metų studentų medikų – 60 proc.[109], tarp 11–12 metų vaikų – 30 proc. [110], tarp 50–60 metų kraujo donorų – 70–80 proc.[111]. Tačiau nėra duomenų apie pastarųjų metų vyresnių žmonių infekuotumą šia bakterija.
Skrandžio vėžys yra vyresnių žmonių liga. Iš to galima daryti prielaidą, kad skrandžio gleivi-nės atrofija ir ŽM taip pat susijusi su amžiumi, galbūt su ilgai besitęsiančiu H. pylori gastritu. Gerai žinoma, kad H. pylori diagnostika yra apsunkinta asmenims, kuriems yra skrandžio gleivinės atrofi-ja, dėl mažo šio mikroorganizmų kiekio. Todėl įvairių H. pylori diagnostinių testų duomenys gali būti skirtingi ir H. pylori nustatoma remiantis kelių teigiamų testų duomenimis. 1 paveiksle (pav.) pateikiamas histologinis H. pylori diagnostikos metodas.
1 pav. H. pylori skrandžio epitelio paviršiuje, dažyta Gimza metodu. H. pylori, pažymėtos
raudo-nom rodyklėm, lyg mažytės „drumzlės“ epitelio paviršiuje, gleivėse
2.2.3. Skrandžio gleivinės atrofija ir žarninė metaplazija
Atrofija – gleivinės liaukučių skaičiaus sumažėjimas ar visiškas išnykimas, kuris gali būti daugiažidininis (tiek kūne, tiek antruminėje srityje) ar lokalizuotas tik druskos rūšties (HCl) sekre-tuojamoje gleivinėje. ŽM vystosi, kai skrandžio gleivinės epitelyje atsiranda taurinių ląstelių. Atro-finio gastrito mikroskopinis vaizdas pateikiamas 2 pav.
2 pav. Atrofinis gastritas, dažymas hematoksilinu eozinu (HE), matosi šviesios taurinės ląstelės,
pažymėtos baltomis rodyklėmis
Atrofija ir ŽM apibūdinamos kaip ikivėžinės būklės [4]. Skrandžio gleivinės atrofija ir ŽM yra dažnesnės šalyse, kuriose yra didelis sergamumas skrandžio vėžiu. Iki šiol nėra žinoma, ar atrofija yra grįžtamas procesas ar ne, ir kokio laipsnio atrofija yra ta riba, kai dar galimas grįžtamasis procesas. Skrandžio vėžys yra dažnesnis vyresnių asmenų populiacijose, taigi galima daryti prielaidą, kad atro-fija ir ŽM tiesiogiai susijusi su amžiumi, galbūt dėl ilgai besitęsiančio H. pylori gastrito. Taip pat mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie atrofijos ir ŽM dažnumą vyresnių asmenų populiacijose. Nedaug duomenų yra pateikiama apie atrofijos ir ŽM dažnumą Rytų Europos šalyse, kuriose serga-mumas skrandžio vėžiu yra pakankamai didelis, kaip ir Baltijos šalyse bei Taivanyje [2,112].
2.3. Skrandžio vėžio patomorfologija
Skrandžio vėžio išplitimas vertinamas pagal TNM klasifikaciją [113]. Patologinė pTNM klasifikacija:
pT – pirminis navikas
pTX – pirminio naviko neįmanoma įvertinti histologškai pT0 – pirminio naviko histologinių požymių nėra
pTis – carcinoma in situ
pT1 – navikas infiltravęs lamina propria ar pogleivį
pT2 – navikas infiltravęs raumeninį sluoksnį (pT2a) ar subserosą (pT2b)
pT3 – navikas infiltravęs serozą (visceralinę pilvaplėvę) neinfiltruodamas gretimų struktūrų1,2,3 pT4 – navikas infiltravęs gretimas struktūras1,2,3
Pastabos:
1. Navikas gali infiltruoti raumeninį sluoksnį išplisdamas į gastrokolinį ir gastrohepatinį raiščius arba didžiąją bei mažąją taukines neperforuodamas dengiančios šias struktūras visceralinės pilvaplėvės. Šiuo atveju navikas klasifikuojamas kaip T2. Jei navikas penet-ruoja dengiančią raiščius ir taukinę visceralinę pilvaplėvę, jis klasifikuojamas, kaip T3. 2. Skrandžio gretutinės struktūros yra blužnis, gaubtinė žarna, diafragma, kasa, pilvo
sie-na, antinkstis, inkstas, plonosios žarnos ir retroperitoninis tarpas.
3. Išplitimas į dvylikapirštės žarnos ar stemplės sienelę klasifikuojamas pagal gylį invazijos į bet kurį iš šių organų, taip pat į skrandžio sienelę.
pN – metastazės sritiniuose limfmazgiuose
pNX – metastazių sritiniuose limfmazgiuose neįmanoma įvertinti histologiškai pN0 – metastazių sritiniuose limfmazgiuose histologinių požymių nėra
pN1 – yra metastazių 1-6 sritiniuose limfmazgiuose pN2 – yra metastazių 7-15 sritiniuose limfmazgiuose pN3 – yra metastazių daugiau kaip 15 sritinių limfmazgių. M – tolimosios metastazės.
Naviko diferenciacijos laipsnis nustatomas remiantis PSO klasifikacija [114]. Naviko diferen-ciacijos laipsnis G:
GX – naviko diferenciacijos laipsnio neįmanoma įvertinti G1 – gerai diferencijuotas navikas
G2 – vidutiniškai diferencijuotas navikas G3 – blogai diferencijuotas navikas G4 – nediferencijuotas navikas
Histologinis tipas nustatomas remiantis PSO klasifikacija skirta adenokarcinomoms [114] ir Lauren'o klasifikacija [115].
Žarninio ir difuzinio tipo skrandžio vėžys
1965 m. Lauren pateikė skrandžio vėžio histologinę klasifikaciją, paremtą vėžinių ląstelių di-ferenciacijos laipsniu ir stromos reakcija [115]. Pagal Lauren klasifikaciją išskiriami šie tipai:
1. Žarninis (intestinalinis) tipas: gerai diferencijuotas, su žarnine metaplazija ir stipria stro-mos reakcija, navikinės ląstelės sudaro tubulines, į liaukutes panašias struktūras (3 pav.).
3 pav. Žarninio tipo adenokarcinoma, dažymas HE, plonom rodyklėm pažymėta ŽM, t. y. skrandžio
gleivinės liaukų epitelis su žarninio tipo taurinėm ląstelėm, o storos rodyklės nukreiptos į navikines liaukutes, t. y. vidutiniškai diferencijuotą žarninio tipo adenokarcinomą pagal Lauren
2. Difuzinis tipas: blogai diferencijuotas, be liaukinės struktūros, blogai ribotas, be stro-mos reakcijos, pavienės navikinės ląstelės infiltruoja sienelę, išsidėstydastro-mos tarp fibro-zinio audinio ir nesudarydamos naviko (4 pav.).
4 pav. Difuzinė žiedinių ląstelių blogai diferencijuota adenokarcinoma, atlikta imunohistocheminė
reakcija su plataus spektro citokeratinų žymekliu, žydra spalva dažosi normalaus ir navikinio epite-lio citoplazma bei citoplazminė membrana, rodyklėmis pažymėtos navikinės ląstelės
3. Mišrus tipas – tai tarpinis variantas tarp šių dviejų tipų.
Žarninio tipo skrandžio vėžys gali vystytis iš šių ikivėžinių ligų: atrofinio gastrito, perniciozinės anemijos, skrandžio opos, skrandžio polipų, Menetrier ligos. Gerai žinomas skrandžio vėžio rizikos faktorius yra H. pylori infekcija, dėl kurios vystosi atrofija, atsiranda kita ikivėžinė būklė – ŽM. 1992 m. Correa pasiūlė kaskadinį žarninio tipo skrandžio vėžio patogenezės modelį, pavaizduotą 5 pav. [116]. Correa su bendraautoriais atžymi, kad egzistuoja nuosekli seka histomorfologinių pokyčių, ve-dančių į skrandžio vėžį. Remiantis šia teorija, išsivysčius lėtiniam gastritui, atrofijai, ŽM ir galiausiai displazijai, išsivystys skrandžio vėžys. Šis modelis vis dar diskutuojamas, nes nėra visiškai aišku, ar išvardinti pokyčiai vystosi nuosekliai, pereidami iš vienos pakopos į kitą, ar galima tiesioginė trans-formacija į skrandžio vėžį. Šios teorijos autoriai pateikia rizikos faktorių koncepcinį modelį, kaip įvai-rios histomorfologinių pokyčių pakopos skirtingai padidina skrandžio vėžio vystymosi riziką [117].
Skrandzio vezys Sunki epitelio displazija
Zarnine metaplazija Hipochlorhidrija (pH > 5) Letinis atrofinis gastritaas
Pavirsinis gastritas H.pylori
Normali skrandzio gleivine
5 pav. Correa kaskadinis žarninio tipo skrandžio vėžio patogenezės modelis
Difuzinio tipo skrandžio vėžio atveju H. pylori gastritas yra neatrofinis, nesivysto metaplazija. Šios rūšies skrandžio vėžiui prasidėti svarbiausi yra molekuliniai mechanizmai – specifiniai ląstelių sulipimo (adhezijos ) pokyčiai.
2.4. Ikivėžinių skrandžio būklių – gleivinės atrofijos ir žarninės
metaplazi-jos invazinė diagnostika
Klinikinėje praktikoje atrofija ir ŽM patvirtinama histologiškai ištyrus daugybines skrandžio gleivinės biopsijas, paimtas endoskopijos metu, pagal 1994 m. Hiūstone modifikuotą Sidnėjaus kla-sifikaciją [25,26].
Atrofijos ir ŽM gradacijos laipsniai pagal Hiūstone modifikuotą Sidnėjaus klasifikaciją patei-kiami 2.4.1 lentelėje ir 6 pav.
2.4.1 lentelė. Atrofijos ir ŽM gradacijos laipsniai pagal Hiūstone modifikuotą Sidnėjaus klasifikaciją
Histologinis skyrius Endoskopinis skyrius
ūminis gastritas lėtinis gastritas specialios formos antruminis gastritas pangastritas kūno gastritas topografija
etiologija topografija morfologija aprašomieji terminai endoskopinės gastritų formuluotės H. pylori, autoimuninis, vaistai (NPV), alkoholis, tulžies refliuk-sas, infekcija (ne H. pylori) kriptogeninis pangastritas antruminis gastritas kūno gastri-tas graduojami morfologiniai požymiai: • uždegimas • aktyvumas • atrofija • ŽM • H. pylori tankis negraduojami morfologi-niai požymiai: • nespecifiniai erozijos edema hemoragijos • specifiniai granuliomos • edema • eritema • gleivinės trapumas • eksudatas • paviršinės erozijos • tikrosios erozijos • grūdėtumas • raukšlių hiperplazija • raukšlių atrofija
• matomas pogleivio krau-jagyslių tinklas
• pogleivio hemoragijos
• eriteminis/eksudacinis • erozinis tikrosios
pa-viršinės • atrofinis • hemoraginis • refliuksinis • hiperplastinis
Gradacijos laipsniai: nėra, lengvas, vidutinis, sunkus
6 pav. Vizualinės histologinių lėtinio gastrito požymių gradavimo skalės
2.5. Neinvazinė serologinė atrofinio gastrito diagnostika
Kraujo plazmos pepsinogenas I ir pepsinogenas II
Pepsinogenas (pepsino pirmtakas) yra dviejų pagrindinių tipų I ir II. Elektroforezeje išssiskiria septynios skirtingos PG izoformos: penkios PGI ir dvi PGII. PGI yra sitezuojamas išimtinai skrandžio kūno gleivinėje, tuo tarpu PGII gali būti sintezuojamas ne tik skrandžio kūno gleivinėje, bet ir antruminėje dalyje bei pradinėje dvylikapirštės dalyje Brunner’io liaukų. Didesnė dalis PG yra sekretuojama į skrandžio spindį ir metabolizuojama į aktyvų pepsiną, labai maža dalis PG patenka į kraują. Skrandžio gleivinės atrofijos atveju sumažėja liaukučių, gaminančių PG, jos pakeičiamos piliorinėmis liaukomis ar ŽM. Tai sąlygoja PGI koncentracijos sumažėjimą, tuo tarpu PGII koncentracija išlieka stabili arba sumažėja nežymiai, arba netgi padidėja. PGI koncentracija kraujo plazmoje arba PGI/PGII santykis atspindi skrandžio kūno gleivinės liaukučių skaičių, tuo remiantis nustatomas skrandžio gleivinės atrofijos laipsnis. Kuo atrofija labiau išreikšta, tuo plazmos PGI koncentracija ir PGI/PGII santykis mažesnis [118].
Kraujo plazmos gastrinas 17
G-17 sekretuojamas išimtinai skrandžio antruminės dalies G ląstelių, G-17 koncentracija sumažėja skrandžio antruminės dalies atrofijos atveju. Jeigu yra antruminės dalies gleivinės atrofija, G-17 koncentracija nepasikeičia po stimuliacijos baltymu, kai tuo tarpu sveikų asmenų G-17 koncentracija po stimuliacijos baltymu padidėja nuo 4 iki 5 kartų lyginant su bazine koncentracija. Dėl nepaaiškinamų priežasčių skrandžio antruminės dalies atrofija susijusi su didesne skrandžio vėžio rizika, ši rizika, sergant atrofiniu gastritu, daug didesnė negu tų asmenų, kurių antruminės dalies gleivinė yra normali [119].
Atrofinio gastrito serologinė diagnostika GastroPanel testu
Sipponen su kolegomis iš Helsinkio Centrinės universitetinės ligoninės Patologijos skyriaus bei BIOHIT kompanijos pateikė duomenis, kaip remiantis PGI, PGII, PGI/PGII santykio, G-17, o taip pat antikūnių prieš H. pylori (IgA/IgG) koncentracija kraujo plazmoje, galima nustatyti: ar yra gastritas, ar jis atrofinis, ar ne, kurioje skrandžio dalyje yra atrofija, ar pacientas infekuotas H. pylo-ri. Skrandžio gleivinės atrofijos serologinių žymenų koncentracijų tikėtini pokyčiai įvairių skran-džio patologijų atvejais pateikiami 2.5.1. lentelėje.
2.5.1 lentelė. Skrandžio gleivinės atrofijos serologinių žymenų koncentracijų tikėtini pokyčiai įvai-rių skrandžio patologijų atvejais
PGI PGII PGI/PGII G-17
(F) G-17 (S) H. pylori IgA/IgG Skrandžio kūno atrofinis gastritas maža maža didelė
Skrandžio antruminės dalies atrofinis gastritas maža maža didelė Skrandžio kūno ir antruminės dalies atrofinis
gastri-tas maža maža maža maža
Neatrofinis gastritas didelė
Neatrofinis gastritas H.pylori infekuotumas didelė didelė
Gastroezofaginio refliukso liga maža
F – bazinis (angl. fasting-nevalgęs); S – stimuliuotas (angl. stimulated-stimuliuotas).
Normali serologinių žymenų koncentracija nurodo, kad skrandžio gleivinė sveika ir funkcio-nuoja gerai. Maža PGI koncentracija ir/ar mažas PGI/ PGII santykis atspindi skrandžio kūno atrofi-nį gastritą, sąlygotą H. pylori. Retais atvejais tai gali būti sąlygota autoimuninės ligos. Skrandžio vėžio rizika padidėjusi. Didelė PGI koncentracija atspindi didelę HCl sekreciją, kuri gali pažeisti ir stemplės gleivinę. Protonų siurblio inhibitoriai taip pat gali padidinti PGI lygį. Maža G-17 F kon-centracija atspindi didelę bazinę HCl sekreciją. Yra padidėjusi gastroezofaginio refliukso ligos, Bar-rett metaplazijos ir kitų ligų, susijusių su padidintu rūgštingumu, rizika. Didelė G-17 F koncentraci-ja atspindi skrandžio kūno atrofiją arba protonų siurblio inhibitorių vartojimą. Maža G-17 S kon-centracija atspindi antruminės skrandžio dalies atrofiją ir/ar H. pyliori sąlygotą antruminės dalies gastritą. Didelis antikūnių prieš H. pylori IgA/IgG titras atspindi H. pylori infekcijos buvimą arba tai, kad šios bakterijos eradikacija buvo nesėkminga. Tačiau ir po sėkmingos H. pylori eradikacijos ilgą laiką (mėnesiais) antikūnių prieš H. pylori IgA/IgG titras lieka padidėjęs. Didelė PGII koncent-racija atspindi uždegiminį procesą, sąlygotą bakterijos, priešuždegiminių medikamentų, stiprių al-koholinių gėrimų.
Suomių atliktame multicentriniame klinikiniame tyrime, kuriame dalyvavo 404 funkcine dis-pepsija sergantys pacientai, buvo palygintas atrofinio gastrito serologinės diagnostikos metodas GastroPanel sistema su skrandžio gleivinės bioptatų histologiniu tyrimu [29]. Nustatytas testo 79 proc. jautrumas, 91 proc. specifiškumas, TPV 64 proc., NPV 93 proc. palyginus su histologinio ty-rimo rezultatais [29]. Be to pagerėja gastroskopijos tikslumas, kai papildomai atliekamas GastroPa-nel testas, kadangi tyrėjas gauna papildomos informacijos apie atrofijos lokalizaciją ir sunkumą.
3. MEDŽIAGA IR TYRIMO METODAI
Disertacija sudaryta iš trijų dalių:
1. Epigenetinio tyrimo, nustatant TPEF/HPP1 metilintų genų ekspresiją navikiniame ir nenavikiniame skrandžio audinyje bei sergantiems funkcine dispepsija.
2. Atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumo ir sunkumo, infekuotumo H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe tyrimo,
3. Neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimo, tiriant PGI, PGII, G-17 koncentraciją kraujo plazmoje, tyrimo.
3.1. Tiriamųjų kontingentas
3.1.1. I dalis – epigenetinis tyrimas
Epigenetiniame tyrime dalyvavo pacientai, sergantys skrandžio vėžiu (adenokarcinoma), ku-rie buvo gydyti Kauno medicinos universiteto Gastroenterologijos ir Chirurgijos klinikose bei Kau-no mediciKau-nos universiteto onkologijos ligoninėje. Visiems ligoniams skrandžio vėžio diagKau-nozė bu-vo patvirtinta histologiškai. Skrandžio audiniai bubu-vo paimti 48 pacientams (28 vyrams ir 20 mote-rų), sergantiems ne kardijinės dalies skrandžio vėžiu, endoskopijos arba chirurginės operacijos me-tu. Pacientų amžiaus vidurkis – 65 metai (amžius nuo 26 iki 84 metų). Skrandžio audiniai imti iš pačio naviko ir histologiškai normalaus audinio, mažiausiai 2 cm atstumu nuo naviko krašto, t.y. be navikinių ląstelių infiltracijos. Papildomai skrandžio audiniai buvo imami endoskopijos metu iš 11 pacientų, sergančių funkcine dispepsija, be vėžio anamnezėje (6 moterų ir 5 vyrų, kurių amžiaus vidurkis 46 metai, amžius nuo 24 iki 66 metų). Operacijos ar endoskopijos metu paimti audiniai buvo tuoj pat užšaldyti skystame azote ir iki tyrimo laikomi – 80°C temperatūroje.
Skrandžio vėžio išplitimas vertintas pagal TNM klasifikaciją [113]. Histologinis tipas nustaty-tas remiantis PSO klasifikacija skirta adenokarcinomoms [114] ir Lauren'o klasifikacija [115]. Na-viko diferenciacijos laipsnis nustatytas remiantis PSO klasifikacija [114]. Tirtų asmenų klinikinės morfologinės charakteristikos pateiktos 3.1.1.1 lentelėje. Visų 48 skrandžio vėžiu ir 11 funkcine dispepsija sergančių pacientų paimti audiniai buvo skirti molekulinės biologijos tyrimams.
3.1.1.1 lentelė. Tirtų asmenų skrandžio vėžio klinikinės morfologinės charakteristikos
Požymis Pacientai, sergantys skrandžio vėžiu adenokarcinoma (n=48) Amžius (metai) vidurkis 65 nuo iki 26–84 Lytis vyrai/ moterys 28/20 Lauren'o klasifikacija
žarninis/ difuzinis/ mišrus tipas 21/19/ 8 Naviko diferenciacijos laipsnis G
1 / 2 / 3 / 4 / x 5 / 18 / 19 / 2 / 4 TNM pT kategorija
1 / 2 / 3 / 4 / x 3 / 17 / 22 / 3 / 3 TNM pN kategorija
0 / 1 / 2 / 3 / x 9 / 23 / 10 / 2 / 4
3.1.2. II dalis – atrofinio gastrito ir žarninės metaplazijos dažnumas ir sunkumas, infe-kuotumas H. pylori dispepsijos simptomų turinčių pacientų tarpe
Atrofinio gastrito tyrime dalyvavo dispepsijos simptomų turintys pacientai, vyresni nei 55 metai. Tyrime negalėjo dalyvauti asmenys, sirgę pepsine opalige, skrandžio vėžiu bei skrandžio vėžiu sirgusių asmenų pirmos eilės giminaičiai, pacientai po skrandžio rezekcijos, po H. pylori era-dikacijos, vartoję protonų siurblio inhibitorius ir (ar) antibiotikus likus mažiau kaip 1 mėn. laiko iki įtraukimo į tyrimą.
Iš viso atrofinio gastrito tyrime Lietuvije, Latvijoje, Taivanyje dalyvavo 322 pacientai: 52 iš Taivanio, 171 iš Latvijos, ir kaip jau buvo minėta 99 iš Lietuvos. Pacientų amžiaus vidurkis – 66,4 ± 7,5 metų. Iš jų 227 (70 proc.) moterys ir 95 (30 proc.) vyrai. Lietuvių amžiaus vidurkis – 66,5 ± 7,5 metai, (amžius nuo 55 iki 88 metų), 73 (74 proc.) moterys ir 26 (26 proc.) vyrai. Taivanio paci-entų tarpe – 24 (46 proc.) moterys ir 28 (54 proc.) vyrai, Latvijos pacipaci-entų tarpe – 130 (76 proc.) moterų ir 41 (24 proc) vyras.
3.1.3. III dalis – neinvazinės serologinės atrofinio gastrito diagnostikos galimybių įvertinimas
Serologinių žymenų tyrimas buvo atliktas 80 Lietuvos, Latvijos, Taivanio atrofinio gastrito tyrime dalyvavusių Lietuvos pacientų, kurių amžiaus vidurkis 66,5 ± 7,5 metai (amžius nuo 55 iki 88 metų), iš jų – 20 vyrų ir 60 moterų. Visiems pacientams buvo paimtas iš venos kraujas. Iš kraujo išskirta plazma saugota šaldiklyje –80°C temperatūroje Kauno medicinos universiteto Gastroentero-logijos klinikoje iki tolimesnių tyrimų BIOHIT kompanijos laboratorijoje Helsinkyje (Suomija).
Visi tyrimai atlikti gavus leidimus iš Kauno regiono Biomedicininių tyrimų etikos komiteto (protokolo Nr. 12/2004 (tyrimo protokolo pakeitimai patvirtinti etikos komiteto protokolu Nr.P1-12/2004) ir Nr. 41/2005) ir paciento sutikimą. Kiekvienas pacientas užpildė informuoto asmens
su-3.2. Tyrimo metodai
3.2.1. I dalis – epigenetinis tyrimas Skrandžio audinių histologinis tyrimas
Įtariant skrandžio vėžį (adenokarcinomą) endoskopijos metu paimta nuo 5 iki 10 skrandžio gleivinės gabalėlių iš naviko kraštų histologiniam ištyrimui.
Operacijos metu skrandžio audiniai histologiniam ištyrimui dėl navikinių ląstelių infiltracijos paimti iš vizualiai normalaus skrandžio audinio mažiausiai 2 cm atstumu nuo naviko krašto, t.y. be tikėtinos navikinių ląstelių infiltracijos.
Iškart po paėmimo skrandžio gabalėliai patalpinti fiksavimui į neutralaus 10 proc. buferinio formalino tirpalą stikliniuose buteliukuose. Buteliukai su fiksuotais skrandžio audiniais pristatyti į Kauno medicinos universiteto klinikų ir Kauno medicinos universiteto onkologijos ligoninės Pato-logijos skyrius. PatoPato-logijos skyriuose skrandžio gabalėliai buvo dažomi HE. Skrandžio vėžio histo-loginis tipas nustatytas remiantis PSO klasifikacija skirta adenokarcinomoms [114] ir Lauren'o kla-sifikacija [115]. Naviko diferenciacijos laipsnis nustatytas remiantis PSO klakla-sifikacija [114]. Prepa-ratus vertino Kauno medicinos universiteto klinikų Patologijos skyriaus gydytojas patologas Dai-nius Jančiauskas ir Kauno medicinos universiteto onkologijos ligoninės Patologijos skyriaus vado-vas gydytojas patologas Vidmantas Baltrėnas.
Skrandžio audinių paėmimas epigenetiniam tyrimui
Operacijos metu iš pačio skrandžio naviko ir histologiškai normalaus skrandžio audinio, esan-čio mažiausiai 2 cm atstumu nuo naviko krašto, t. y. be navikinių ląstelių infiltracijos, paimti 0,25– 0,5 cm2 audinių gabalėliai. Skrandžio gabalėliai nedelsiant dedami į kriomėgintuvėlius, kurie tuoj pat užšaldomi skystame azote ir iki tyrimo laikomi šaldiklyje – 80°C temperatūroje.
Endoskopijos metu tiriamoji medžiaga buvo imama standartinėmis Olympus arba Pentax kompanijų biopsinėmis žnyplėmis, paimti skrandžio gleivinės gabalėliai nedelsiant dedami į krio-mėgintuvėlius, kurie tuoj pat užšaldomi skystame azote ir iki tyrimo laikomi šaldiklyje –80°C tem-peratūroje.
Molekulinės biologijos tyrimai buvo atliekami Magdeburgo Otto-von-Guericke universiteto Gastroenerologijos, hepatologijos ir infekcinių ligų klinikos mokslinėje laboratorijoje (Vokietija).
DNR išskyrimo etapai:
1. Tiriamosios medžiagos degradavimas. 2. Tiriamosios medžiagos lizavimas.
DNR išskyrimas iš šviežiai šaldyto skrandžio audinio
Genominės DNR išskyrimui iš audinio buvo naudotas rinkinys “NucleoSpin® Tissue“ (Ma-cherey-Nagel, Vokietija). DNR iš audinių išskirta taikant proteinazės K metodiką [28].
Šviežiai šaldyti navikinio ir nenavikinio skrandžio vėžiu (adenokarcinoma) sergančiųjų bei funkcine dispepsija sergančiųjų skrandžio audinio gabalėliai (masė ~25 mg) susmulkinami, atitirpi-nami kambario temperatūroje, ir sudedami į mėgintuvėlius. Į mėgintuvėlius su skrandžio audinio gabalėliais įpilama 180 μl lizavimo buferinio tirpalo T1 (tirpalo sudėtis - Macherey-Nagel kompani-jos nuosavybė) ir 25 μl proteinazės K. Mėgintuvėlio turinys sumaišomas purtykle ir inkubuojamas termostate per naktį 56°C temperatūroje, kas 20 min. centrifuguojant 10 sekundžių 1350 aps./min. greičiu. Kitą dieną į mėgintuvėlius su lizuotais skrandžio audinio gabalėliais, po tirpalo maišymo purtykle 15 sekundžių, įpilama 200 μl lizavimo buferinio tirpalo B3 (tirpalo sudėtis – Macherey-Nagel kompanijos nuosavybė). Tirpalas 15 sekundžių maišomas purtykle ir inkubuojamas termosta-te 10 min. 70°C termosta-temperatūroje. Po inkubavimo į mėgintuvėlius įpilama 210 μl 96–100 proc. etano-lio tirpalo. Gautas tirpalas 15 sekundžių maišomas purtykle. Tirpalas supilamas į filtravimo stulpe-lius (NucleoSpin®Tissue column), patalpintus į centrifugavimo mėgintuvėlius. Filtravimo stulpeliai centrifuguojami 1 min. 9000 aps./min. (11000×g) greičiu. Gautas filtratas su centrifugavimo mėgin-tuvėliais pašalinamas. Filtravimo stulpeliai įdedami į naujus centrifugavimo mėgintuvėlius, atsar-giai įpilama 500 μl plovimo buferinio tirpalo BW (tirpalo sudėtis – Macherey-Nagel kompanijos nuosavybė) ir centrifuguojama 1 min. 9000 aps./min. (11000×g) greičiu. Gautas filtratas pašalina-mas. Įpilama 600 μl plovimo buferinio tirpalo B5 (tirpalo sudėtis – Macherey-Nagel kompanijos nuosavybė). Filtravimo stulpeliai centrifuguojami 1 min. 9000 aps./min. (110000×g) greičiu. Gautas filtratas pašalinamas ir filtravimo stulpeliai dar kartą centrifuguojami 1 min. 9000 aps./min. (110000×g) greičiu siekiant pašalinti etanolio likučius. Tuomet filtravimo stulpeliai įdedami į nau-jus mėgintuvėlius ir DNR išplaunama tiesiai ant filtravimo stulpelio gelio-silikono membranos su-pylus 100 μl eliuavimo buferinio tirpalo BE (tirpalo sudėtis – Macherey-Nagel kompanijos nuosa-vybė), pakaitinto iki 70°C. Filtravimo stulpeliai su mėginiais 1 min. inkubuojami kambario tempe-ratūroje, po to centrifuguojami 1 min. 9000 aps./min (11000×g) greičiu. Ši procedūra iš viso buvo atliekama du kartus. Iš kiekvieno mėginio eliuavimo metu gauta po 100 μl eliuato su išskirta DNR.
DNR modifikavimas natrio bisulfitu atliekamas iš karto arba eliuatas laikomas – 20°C tempe-ratūroje iki tyrimo.
Išskirtos DNR koncentracijos ir kokybės nustatymas
Prieš DNR modifikavimą natrio bisulfitu spektrofotometru buvo išmatuota DNR, išskirtos iš šviežiai šaldyto navikinio ir nenavikinio skrandžio audinio bei funkcine dispepsija sergančiųjų skrandžio audinio, koncentracija.
DNR koncentracijai matuoti spektrofotometru 5 μl tirpalo su išskirta DNR atskiedžiama su 65 μl dukart distiliuotu vandeniu. Dukart distiliuotas vanduo naudojamas kaip kontrolė.Mėginių optinis tankis matuojamas spektrofotometru esant bangos ilgiui 260 nm ir 280 nm. DNR tirpalai sugeria ultravioletinius spindulius 260 nm srityje. Optinių tankių santykis 260 nm/280 nm rodo DNR tirpa-lo švarumą. Šis santykis turėtų būti ne mažesnis kaip 1,8.
Siekiant įvertinti DNR vientisumą ir kokybę taip pat atliktas išskirtos DNR elektroforetinis frakcionavimas agarozės gelyje ir vizualizavimas.
Agarozės gelis ruošiamas iš 1 gramo agarozės miltelių (Universal Agarose, PeQlab Biotechno-logie GmbH, Erlagen, Vokietija, katalogo Nr. 35–1030) ir 100 ml buferio 1×TAE. Mišinys pašildo-mas 3 min. 800 W mikrobangų krosnelėje. Įdedama 3 μg etidžio bromido tirpalo (Merck, Darmstadt, Vokietija, katalogo Nr. 1116080030). Agarozės tirpalas išmaišomas, išpilamas į gelio formą, įstato-mos šukutės ir paliekama sustingti kambario temperatūroje (apie 45 min.). Iš sustingusio gelio ištrau-kiamos šukutės ir padėkliukas su paruoštu agarozės geliu įdedamas į elektroforezės aparatą, užpila-mas 1×TAE buferinio tirpalo, kad visiškai apsemtų gelį. Į kiekvieną DNR mėginį (10 μl tirpalo) įde-dami 4 μl nešančiojo buferinio tirpalo (Loading Mix). Šio buferinio tirpalo sudėtis: dažai – 0,03 proc. bromfenolio mėlynasis ir 0,03 proc. ksileno cianolis, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 60 proc. glicerolis, 60 mM EDTA. Jis su 30 proc. glicerolio tirpalu skiedžiamas santykiu 1:10. Elektroforezei agarozės gely-je vartotas molekulinės masės žymuos L, turintis skirtingo ilgio fragmentus: 1118, 881, 692, 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67 bp. 1 μl molekulinio masės žymens tirpalo sumaišomas su 19 μl dukart distiliuoto vandens bei 4 μl nešančiojo buferio. Mėginiai ir molekulinės masės žymuo įneša-mas į gelio šulinėlius. Elektroforezė vykdoma režimu: įtampa – 90 V, trukmė – 45 min. DNR elektro-foretinis frakcionavimas agarozės gelyje vizualizuojamas ultravioletiniais spinduliais, naudojant vaiz-do vaiz-dokumentacijos sistemą, pateikiamas 7 pav. Duomenys išsaugomi.
7 pav. DNR elektroforetinis frakcionavimas agarozės gelyje
DNR modifikavimas natrio bisulfitu
DNR, išskirta iš skrandžio audinio, buvo modifikuota natrio bisulfitu. Dėl šios modifikacijos nemetilintas citozinas virsta uracilu, kuris PGR ciklo metu virsta timinu, o metilintas citozinas lieka nepakitęs. Šis modifikavimas atliktas naudojant CpGenomeTM DNR modifikavimo rinkinį (angl.
