Biotecnologie Alimentari

Orientamento Consapevole

Dott.ssa Maria Calasso

Ricercatrice in Microbiologia degli Alimenti

02 marzo 2021

Seminario online-piattaforma Teams

Biotecnologie Alimentari

Cosa sono le biotecnologie?

Uso di cellule o di enzimi di origine microbica, animale o vegetale, per ottenere la sintesi, la degradazione o la trasformazione di materie prime

Le Biotecnologie possono essere definite in molti modi...

 L’applicazione di organismi, di sistemi o di processi biologici alla produzione industriale di beni e servizi.

 Una tecnologia che sfrutta fenomeni biologici per copiare o per costruire vari tipi di sostanze utili.

 L’applicazione di principi tecnico-scientifici alla trasformazione di sostanze operata da agenti biologici, al fine di produrre beni e servizi.

La biotecnologia: una sfida interdisciplinare

L’ Organizzazione mondiale per la

cooperazione allo sviluppo economico (OCSE)

e la UE indicano le biotecnologie tra le

tecnologie più promettenti dell’immediato

futuro che potranno contribuire a

migliorare la qualità della vita e

dell’ambiente.

E' un treno da non perdere, quello delle biotecnologie…(ANSA.it)

Nel settore delle biotecnologie agroalimentaril’Italia può contare su condizioni assolutamente uniche e competitive, per varietà di microclimi e biodiversità.

Di qui la molteplicità dei filoni di ricerca che spaziano dal

• miglioramento genetico di specifiche varietà vegetali,

• al controllo dell’origine e della qualità degli alimenti,

• all’estrazione di sostanze bioattive limitatamente disponibili in natura.

• Per non dire dell’autentica galassia di nicchie di

Le biotecnologie rappresentano una risorsa importante per affrontare le sfide per la sicurezza alimentare e per una nutrizione adeguata dal punto di vista qualitativo e nutrizionale a livello globale.

10 billion people by

2050

3 billion overweight, 2 undernourished

25% of our food is

wasted

Cosa sono le biotecnologie?

Tradizionali

Insieme di tecniche convenzionali utilizzate da secoli per produrre birra, vino, pane ed altri alimenti

Avanzate

o Insieme di metodi di modificazione genetica

o Sviluppi innovativi dei processi biotecnologici tradizionali

Applicando le biotecnologie è possibile costruire “fabbriche biologiche” che possono produrre, a basso costo e su larga

scala, sostanze di interesse

Farmaci e vaccini Agricoltura

e zootecnia Tessuti

Alimenti

Cosmetici Ambiente

e Bio-polimeri

Linea del tempo della biotecnologia

• Nei processi biotecnologici la trasformazione della materia è realizzata da microrganismi viventi o dagli enzimi da essi estratti.

• Utilizzano le proprietà dei microrganismi per la fermentazione di cibi e bevande

Alimenti fermentati

(Lactic Acid BacteriaLAB )

Biotecnologie tradizionali in ambito alimentare

Branca della biologiache studia la struttura e le funzioni deimicrorganismi, cioè di tutti quegli organismi unicellulari, pluricellulari o acellulari, non visibili ad occhio nudo:batteri, alcuni

tipi di funghi, lieviti, alghe, protozoi, virus e i prioni

Microbiologia

Le caratteristiche chimico-fisiche degli alimenti sono tali da permettere la colonizzazione e lo sviluppo di un gran

numero di microrganismi

Quali microrganismi negli alimenti?

Non tutti i microrganismi presenti negli alimenti hanno lo stesso impatto nella loro

produzione, conservazione e consumo

Quali microrganismi negli alimenti?

2. INDIFFERENTI

Raramente causano percettibili alterazioni delle caratteristiche organolettiche...

1. ALTERANTI E PATOGENI

Responsabili di infezioni ed intossicazioni alimentari

3. UTILI o PROtecnologici

1. Funzione fisiologica: soddisfare la fame

rispondere alle esigenze nutrizionali

2. Funzione sociale: promuovere l’unità familiare fornire ospitalità

fonte di amicizie

4. Funzione psicologica: esprimere una condizione di prestigio conferire sicurezza personale

esprimere emozioni

allentare le tensioni e condizioni di stress

“anestetico”

5. Funzione politica: strumento di protesta

6. Funzione artistica: soggetto per esprimere la creatività (arte, cucina, fotografia)

Alimento e funzioni . . . .

3. Funzione religiosa: significato simbolico

Alimenti fermentati

Fermentazione

La trasformazione degli alimenti per via fermentativa è il più antico processo

biotecnologico utilizzato per la

conservazione di alimenti e bevande nel quale l’attività microbica svolge il ruolo

chiave

Fermentazione

Fermentazione

La fermentazione è utilizzata dall’uomo da almeno 10.000 anni

La parola è antica, deriva dal latino fermentum, dalla radice del verbo fervere che significa muoversi, bollire.

Nasce dall’osservazione di quanto succede in modo

chiaramente visibile durante il processo: il pane lievita, si gonfia e si espande, il vino (o la birra) bolle!

Fermentazione

Studi di

Pasteur

Fermentazione del mosto d’uva in vivo

La trasformazione di mosto in vino è un fenomeno biologico dal nome di

fermentazione alcolica

Gli zuccheri contenuti nel mosto vengono trasformati in alcol Etilico e in CO2 (anidride carbonica) a causa dell’azione dei

lieviti

Punti salienti della storia della Fermentazione del mosto d’uva

Nelle tombe degli antichi Egizi già si trovano raffigurazioni nell’atto di pigiare l’uva

Dall’Asia Minore la coltivazione della “Vitis vinifera” si diffuse in tutti i paesi

Punti salienti della storia della Fermentazione del mosto d’uva

Furono i Greci i primi veri maestri nella coltivazione e vinificazione, producevano vini molto alcolici, dolci

I greci portarono in Italia (colonia greca) le loro abitudini, compreso quella di coltivare la vite e produrre del vino.

Mosaico d'epoca romana con la torchiatura dell'uva, Israele

Gli antichi romani migliorarono la qualità del vino, introducendo: l’invecchiamento, la potatura, la scelta di vitigni che meglio si adattavano alla tipologia del terreno

Fermentazione del mosto d’uva in vivo

Saccharomyces cerevisiae

Microrganismi di interesse nei processi fermentativi

 LATTOBACILLI

 LIEVITI

MUFFE

LATTOBACILLI

Caratteristiche generali

•forma bastoncellare o coccica.

•Gram positivi

•catalasi negativi

•anaerobi facoltativi

•fermentano gli zuccheri

•esigenze nutrizionali complesse

•esistono oltre 100 specie

•distribuiti in natura in differenti habitat

•pH ottimale di crescita:: - acidofili - acidurici

•temperatura di crescita

LIEVITI

Caratteristiche generali

• funghi unicellulari

• riproduzione per gemmazione o scissione

• aerobi e microaerofili

• in anaerobiosi fermentazione

• catalasi positivi

• mesofiti

• generi e specie di interesse nel settore alimentare:

- Saccharomyces, - Debaryomyces, - Kluyveromyces, - Hansenula

fermentazione alimenti

alterazione alimenti

MUFFE

Caratteristiche generali

• funghi multicellulari

• struttura vegetativa detta micelio

• grande interesse nel settore alimentare

fermentazione alimenti -insaccati carnei

formaggi Penicillium camemberti, P. roqueforti,

P. nalgiovense.

patogene per l’uomo

alterazione alimenti

Fermentazione cibi e bevande

- esempi di processi trasformativi utili

Produzione pane, birra, vino, formaggi, molte bevande alcoliche;

produzione industriale di etanolo, acetone, glicerina, butanolo, acido citrico, antibiotici, amminoacidi, vitamine, steroidi…

Batteri lattici

Lieviti

Biotecnologie alimentari

Settore Lattiero-caseario

Canestrato pugliese Caciocavallo silano Burrata Cacioricotta

Giuncata Manteca Mozzarella

(fiordilatte) Ricotta marzotica Leccese

Ricotta Scamorza Caprino Caciocavallo podolico

dauno

Tradizione pugliese

Microbiota filo-caseario

Starter primari Starter secondari Microbiota avventizia

Batteri lattici

1. Appiattimento organolettico dei formaggi tipici causato dalla perdita della biodiversità microbica, dovuta all’eccessivo uso di starter commerciali

2. Ottenimento di produzioni tipiche con una qualità standardizzatanel tempo (difficoltà nell’ottenere riconoscimento di mercato)

Problematiche del settore

Studio delle relazioni causa-effetto tra fattori ambientali e microbiota del latte vaccino e dei formaggi

Studio delle relazioni causa-effetto tra fattori ambientali e microbiota del latte vaccino e dei formaggi

Quesito scientifico

E’ possibile produrre la tradizionale Mozzarella pugliese con caratteristiche di tipicità?

Isolamento e identificazione dei microrganismi del sieroinnesto

Selezione dei batteri lattici in base alle principali proprietà tecnologiche

Prove di caseificazione e panel test

Produzione di un sieroinnesto con i batteri lattici selezionati

Uso di un siero-innesto

selezionato per la produzione di mozzarella tradizionale pugliese

Siero fermento

Quesito scientifico

E’ possibile produrre formaggio a ridotto contenuto di grasso?

Quesito scientifico

I formaggi possono essere veicolo di microrganismi probiotici?

Formaggi probiotici

- equilibrio microbico intestinale - attività antimicrobica

- attività antipertensiva - produzione di GABA, CLA …

Quesito scientifico

E’ possibile estendere in maniera considerevole la conservabilità dei prodotti lattiero caseari “freschi”

senza il ricorso a sostanze chimiche?

Quesito scientifico

E’ possibile condizionare e/o accelerare la stagionatura di un formaggio tramite l’impiego di diversi

microrganismi ?

LATTE

Raffreddamento a 37°C

CALDAIA Latte 37°C

STARTER:

S. thermophilus L. delbrueckii subsp.

lactis

Lact. lactis attenuato

LATTE Starter + enzima CAGLIO

LIQUIDO

CAGLIATA

ROTTURA / FORMATURA

SALATURA Salamoia 37NaCl wt/Vol

MATURAZIONE INOCULO

MICRORGANISMI IN SUPERFICIE

PASTORIZZAZIONE 71°C x 15 sec.

Incubazione 30 min.

CONDIZIONAMENTO T° Ambiente per 12h

Settore prodotti lievitati da

forno

Lievitanti chimici

(es. acido tartarico, bicarbonato di sodio)

Lievito naturale Lievito di birra Prodotti lievitati da forno: Agenti lievitanti

- Più di 50 specie di LAB

(appartenenti al genere Lactobacillus) - Più di 20 specie di lieviti

(appartenenti ai generi Saccharomyces, Candida)

Prodotti lievitati da forno: Lievito naturale

LIEVITO NATURALE: impasto a base di acqua e farina contenente batteri lattici e lieviti.

Complesso ecosistema biologico

Selezione di batteri lattici del lievito naturale da impiegare nella produzione di pane

VANTAGGI DERIVANTI DALL’USO DI LIEVITO NATURALE RISPETTO AL LIEVITO DI BIRRA

Migliore aroma e sapore

Maggiore conservabilità Maggiore digeribilità Migliore struttura

Esigenze dell’industria dei prodotti lievitati da forno

 Migliorare e standardizzare gli aspetti organolettici dei prodotti lievitati da forno

 Standardizzare l’impiego del lievito naturale

 Aumentarne la conservabilità

Quesito scientifico

E’ possibile migliorare le caratteristiche sensoriali e strutturali del pane di frumento, tramite l’impiego di

diversi microrganismi ?

Estratti citoplasmatici

Estratti citoplasmatici

Lactobacillus sanfranciscensis A4 Estratti

citoplasmatici

Impasto Controllo

37,20% ± 1,9 19,71% ± 1,00 18,32% ± 1,00 20,12 % ± 1,5 Lactobacillus

Sanfranciscensis Hafnia alvei Debaryomyces hansenii

Quesito scientifico

E’ possibile mangiare un alimento comune (es. Pasta) e apportare benefici al nostro microbiota intestinale?

Quesito scientifico

E’ possibile estendere in maniera considerevole la conservabilità dei prodotti lievitati da forno a “lunga

conservazione” senza il ricorso a sostanze chimiche?

CONSERVABILITA’ DEI PRODOTTI LIEVITATI DA FORNO

Agenti fungini maggiormente responsabili del deterioramento:

Eurotium, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Monilia, Mucor, Rhizopus

- off-flavors - micotossine - allergeni

Prevenzione della contaminazione microbica

Sintesi di COMPOSTI

ANTIMICROBICI ACIDIFICAZIONE,

PROTEOLISI e EPS

Ritardo del raffermimento BATTERI LATTICI

EFFETTI POSITIVI DEL LIEVITO NATURALE

Inhibitory activity on Penicillium roqueforti DPPMAF1 by water-soluble extracts from various vegetable species, as determined by agar diffusion assay.

Botanical name Part of the plant pH of the extracts Inhibitory activity

Cucurbita pepo fruit 6.35 -

Phaseolus vulgaris beans, seeds 6.07 -

Phaseolus vulgaris cv. Pinto seeds 6.36 ++++

Vigna unguiculata seeds 6.50 +++

Pisum sativum seeds 6.94 -

Vicia faba seeds 6.49 -

Brassica oleracea cv. Botrytis cauliflaura bloom 6.31 -

Spinacia oleracea leaves 6.83 -

Asparagus officinalis bloom, shaft 5.69 +

Solanum melongena fruit 4.85 -

Aloe arborescens leaves 4.10 +

Camellia sinensis leaves 5.10 +

Inhibitory activity was scored as follows: -, no inhibition; +, very weak inhibition; ++, low inhibition with a little clear zone near the rim of the colony; +++ strong inhibition, with large clear zone near the rim of the colony; ++++, very strong inhibition, with no growth near the rim of the colony.

Screening su matrici vegetali _A

B

A

St 1 2 3 4

97.4 66.2 45.0

21.0 31.0

14.0 MrKDa

Control

sourdough + W.E. of Amaranthus spp (30%) SDS-PAGE di 1:EA di semi di amaranto;

2: proteine totali estratte da pane GF CT;

3: da pane GF con EA amaranto;

4: pane GF con EA amaranto + lievito naturale St:standard

BAKING TEST

Pani gluten-free conservati a temperatura ambiente per 28 gg

Quesito scientifico

E’ possibile applicare la biotecnologia del “lievito naturale”

per degradare completamente il glutine e rendere i cereali tollerati dai soggetti celiaci?

Glutine:

1. Industria

2. Biochimica

Frazione proteica di riserva dei cereali, costituita da gliadine e glutenine

3. Codex Alimentarius (celiachia)

Frazione proteica di frumento, segale, orzo, [avena] e delle varietà da esse derivanti per incrocio, verso la quale alcune persone sono intolleranti e che risulta non solubile in acqua e soluzioni saline (NaCl).

Sottoprodotto proteico della produzione di amido, insolubile

Grano, Segale, Orzo, Farro, Spelta, Kamut,Triticale

Riso, Mais, Grano saraceno, Manioca, Miglio, Amaranto, Quinoa, Sorgo, Legumi Avena

anche…

birra, salumi, preparati carnei e salumi, sughi pronti, salse, creme, surrogati del caffe, piatti precotti, cioccolato, farmaci e integratori in tavoletta…

Celiac Disease

CD is an inflammatory disorder of the small intestine that affects genetically predisposed individuals when they ingest

gluten and similar proteins Iceberg Model

Mexico 1:39

Estonia 1:50

Finland 1:50

Italy 1:84

Iran 1:114

Ireland 1:122

Libya 1:127

Australia 1:131 New Zealand 1:131

USA 1:133

India 1:143

Argentine 1:167

Tunisia 1:167

Turkey 1:167

Egypt 1:189

Sweden 1:190

Netherlands 1:203

Brazil 1:214

More than 1 celiac on 100 people From 1:100 to 1:150 cases From 1:150 to 1:200 cases Less than 1:200 cases

Produzione lievitati da forno

Agenti lievitanti chimici (es. acido tartarico + bicarbonato di sodio)

Lievito naturale (cocktail di batteri lattici

e lieviti)

• assenza di fermentazione

• processo istantaneo

• nessuna degradazione delle componenti proteiche

• processo rapido (0.5 – 1 h)

• fermentazione alcolica

• nessuna degradazione delle componenti proteiche

• processo multi-step piuttosto prolungato (ca. 24 h)

• fermentazioni lattica ed alcolica

• proteolisi intensa Lievito di birra

Lb. brevis 14G Lb. alimentarius 15M Lb. hilgardii 51B Lb. sanfranciscensis 7A

Lb. sanfranciscensis E14 Lb. sanfranciscensis E21 Lb. sanfranciscensis 174 Lb. sanfranciscensis 13 Lb. sanfranciscensis A1 Lb. sanfranciscensis 274

+

Fungal proteases

+

Pool 1

Pool 2

v -gliadins a, b, v -gliadins

hydrolized gliadins

St 1 2

St,European gliadin standard;

1,chemically acidified dough (CAD);

2,fermented dough (20% wheat flour) with pool 1, 2 and proteases (SLP) (SLP)

(CAD)

controllo

Water salt soluble Glutenins Glutenins

Gliadins Alb.-Glob.

Organic nitrogen concentration of spray-dried flour (ca. log 9/ml)

(ca. log 8/ml)

R5-ELISA SLP < 10 ppm

pH 11 pH 6

(A)

MrkDa 200

10

pH 11 pH 6

(B)

200

10

Elettroforesi bidimensionale di gliadine: (A) impasto acidificato chimicamente e (B) impasto al 20% di farina fermentato con batteri lattici selezionati e proteasi per 48 h a 37°C

Proteolytic events during fermentation

Primary proteolysis by cereal proteinases, Microbial reduction of disulfide bonds

Fungal enzymes

Aspergillus oryzae(500,000 HUT/g) Aspergillus niger(3,000 SAPU/g), (BIO-CAT Inc.,USA)

gliadin LMW glutenin y-HMW glutenin x-HMW glutenin degradation products

peptide (Adapted from Ganzle et al., 2008)

Recipe

- Fermented wheat flour (50%, w/w), - Sucrose (11.3%, w/w),

- Eggs (8.8%, w/w),

- Pasteurized yolk (1.2%, w/w), - Egg white (13%, w/w), - Butter (7.3%, w/w), - Milk cream (7.3%, w/w), - Sodium bicarbonate (1%, w/w), -Vanilla beans and lemon peel as

flavoring agents. Sweet baked goods (200 g)

corresponding to 100 g of processed wheat flour which contained 10 g of hydrolyzed gluten

Clinical challenge -Eight CD patients

(age median 13, range 8-17 years), -Daily consumption of ca. 200 g of Sweet baked goods,

- The challenge lasted 60 days

Clinical Challenge 1: Department of Pediatric, Sapienza - University of Roma

Clinical Gastroenterology Hepatology

Safety for celiac patients of baked goods made of wheat flour hydrolyzed during food processing.

Greco L, Gobbetti M, Auricchio R, Di Mase R, Landolfi F, Paparo F, Di Cagno R, De Angelis M,

Recipe

- Fermented wheat flour (100g), - Sucrose (50 g),

- Butter (50 g), - Water (as required)

Clinical Challenge 2: Pediatrics and European Laboratory for the Study of Food Induced Diseases University of Naples, Federico II, Italy

Clinical challenge -Sixteen CD patients

(age median 19, range 12-23 years), -Daily consumption of ca. 200 g of biscuits,

- The challenge lasted 60 days Biscuits (200 g)

corresponding to 100 g of processed wheat flour which contained 8 g of hydrolyzed gluten

Quesito scientifico

E’ possibile applicare ingredienti non convenzionali secondo la biotecnologia del “lievito naturale” per ottenere nuovi

prodotti lievitati da forno?

A protocol for sourdough fermentation of a mixture of wheat and legume flours was set up.

• The lactic acid bacteria microbiota of wheat–legume sourdough was characterized.

• Legume and sourdough fermentation increased functional compounds of wheat bread.

• Wheat–legume sourdough increased phytase and antioxidant activities of wheat bread.

• Wheat–legume sourdough decreased the hydrolysis index of wheat bread.

Representative images of breads made by wheat flour alone (control wheat bread) (A), wheat flour added of 5 (B), 7.5 (C) or 1 0% (w/w) (C) of each legume (chickpea, lentil and bean) flour.

Microbiota analysis Proximate composition

Screening for EPS producing strains

Nuovi ingredienti da farine di lenticchie intere e germogliate mediante fermentazione a lievitazione naturale per migliorare il pane di frumento

DEXTRAN

COMUNICAZIONE CELLULARE

I batteri hanno la capacità di “sentire” ed adattarsi ai cambiamenti ambientali

Quesito scientifico

La co-abitazione di un stesso ecosistema/nicchia con altre specie/biotipi è una forma di stress ambientale, la cui risposta dipende da meccanismi di comunicazione

cellulare?

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Time (h)

Δ log CFU/mL

Condizioni

colturali Cellule vive (log cell/mL)^*

Cellule morte/

danneggiate (log cell/mL)^*

Cellule coltivabili (logCFU/mL)^*

CB1 9.30^a 7.93^c 9.10^a

CB1 - DC400 8.45^c 9.32^a 8.40^c

CB1 - CR13 8.83^b 8.94^b 8.8^b

CB1 - A7 9.33^a 8.0^c 9.04^a

Cinetica di crescita di L. sanfranciscensis CB1

( ) = monocoltura

( ) = co-coltura con L. plantarum DC400 ( ) = co-coltura con L. brevis CR13 ( ) = co-coltura con L. rossiae A7

(A) (B)

Quesito scientifico

E’ possibile usare batteri lattici per prolungare la conservabilità di frutta e verdura comunemente

presenti sulle nostre tavole ?

Effetto della fermentazione lattica sulla conservabilità

Giorni di conservazione

2 – 3 giorni

5 – 6 giorni

5 – 6 giorni

3 giorni In frigorifero Dopo fermentazione

4 – 5 giorni 40 giorni

30 giorni 30 giorni

6 – 7 giorni 30 giorni

Quesito scientifico

È possibile valorizzare i sottoprodotti naturali da matrici vegetali mediante le biotecnologie alimentari?

 Creare una filiera viti-vinicola innovativa con uve e vini ricchi di metaboliti secondari per la produzione di preparazioni ad azione salutistica;

 Utilizzo dei sottoprodotti di origine ortofrutticoli (invenduto e/o scarti di lavorazione) al fine di valorizzare le proprietà nutraceutiche delle matrici vegetali;

 Introdurre la coltivazione di Stevia rebaudiana nel panorama produttivo pugliese come possibile opportunità per fronteggiare la crisi delle aziende flotrovivaistiche.

SOTTOPRODOTTI NATURALI DA MATRICI VEGETALI VALORIZZATI PER PREPARAZIONI DALLE ELEVATE PROPRIETÀ SALUTISTICHE (SNIPS)

SOGGETTO CAPOFILA: Farmalabor SRL

RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof.ssa Maria De Angelis

BMC Systems Biology, 2011

Ask both what you can do for your microbes

and what your microbes can do for you