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I Gliomi sono tra i tumori primari maggiormente espressi a livello cerebrale. Tra questi il Glioblastoma Multiforme (GBM), il più maligno tra i gliomi, rappresenta quello più ricorrente (incidenza >del 50% tra i tumori del sistema nervoso centrale) ed è caratterizzato da intensa proliferazione e invasività cellulare. Nonostante l’avanzamento delle conoscenze e l’utilizzo di terapie innovative, i risultati ottenuti a seguito dei vari trattamenti oggi in uso clinico, non risultano ancora avere un’efficacia soddisfacente. La natura fortemente invasiva del tumore e la sua aggressività non rendono infatti risolutivo il ricorso alla chirurgia, radioterapia o chemioterapia, attualmente disponibili, garantendo quindi un tempo di sopravvivenza medio non superiore ai 12 mesi dal momento della diagnosi.
I processi metastatici e di neoangiogenesi hanno come fase iniziale la comune degradazione proteolitica della matrice extracellulare (ECM) ad opera delle metallo proteinasi (MMPs). Nel GBM, è stato osservato un significativo incremento nell’espressione di specifiche MMPs quali MMP-2 (Gelatinasi A) e MMP-9 (Gelatinasi B). La MMP-2 risulta essere la principale metalloproteinasi coinvolta nella degradazione della matrice extracellulare, mentre la MMP-9 media l’attivazione dell’angiogenesi. Vista l’implicazione di questi enzimi nella progressione del GBM la ricerca ha rivolto l’attenzione verso la formulazione di inibitori sintetici della attività delle MMPs (MMPIs), con lo scopo di sviluppare nuove terapie antitumorali. Uno studio che indagava l’associazione tra Temozolomide, un alchilante del DNA, con Marimastat, un MMPI che inibisce l’attività di molti tipi di MMPs e per questo definito a largo spettro, ha messo in evidenza un miglioramento nel tempo di sopravvivenza rispetto all’utilizzo della sola Temozolomide. Tuttavia la comparsa di tossicità muscolo
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scheletrica associata al Marimastat non ha reso possibile il suo impiego in terapia. Attualmente la ricerca è rivolta alla progettazione di inibitori più selettivi verso le specifiche MMPs, implicate nella progressione del GBM. I composti, appartenenti alla famiglia dei sulfonammido idrossammati, presi in considerazione nella presente tesi, sono stati progettati e sintetizzati nel laboratorio diretto dal Prof. Armando Rossello presso il Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’ Università di Pisa. Tali composti sono stati chiamati 4, 5a, 5b, 5c e 5d, 6, 7 e dei quali non è mostrata la struttura chimica in quanto esiste interesse per sottoporli ad un eventuale brevetto. Nella tabella 1 sono riportati i valori delle concentrazioni dei composti di nuova sintesi e dello standard CGS_27023A che inibiscono il 50% dell’attività proteolitica (IC50) delle metalloproteasi ricombinanti umane MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-14 verso il substrato peptidico sintetico. I valori di IC50 sono stati valutati, mediante saggio enzimatico fluorimetrico, nel laboratorio diretto dal Prof. Armando Rossello.
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Tabella 1: Attività inibitoria dei composti di nuova sintesi 4, 5a-d, 6, 7 e dello standard CGS_27023A, su alcune MMP ricombinanti umane, espressa come valore IC50 (nM).
IC50 Composti MMP-1 MMP-2 MMP-3 MMP-8 MMP-9 MMP-14 4 17000 1.5 46 200 79 700 5a 4800 22 1180 490 63 2100 5b 37000 4.0 84 440 50 6600 5c 2300 6.0 93 280 77 1700 5d 56000 17 320 1700 650 23000 6 21000 2.5 38 500 21 1600 7 6700 1.3 11 30 4.3 112 CGS_27023A 56 25 16 7.7 4.8 23
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Nella presente tesi è stato valutato se ciascun composto influenzasse:
1. l’attività proteolitica, verso il substrato naturale, della principale metalloproteasi implicata nella degradazione della matrice extracellulare nel GBM (MMP-2);
2. l’invasività della linea cellulare di GBM umano (U87MG). Inoltre è stato valutato se i composti avessero attività citotossica.
1. Valutazione dell’effetto dei composti di nuova sintesi sull’attività proteolitica della MMP-2 verso il substrato naturale, gelatina: questa
valutazione è stata effettuata sull’enzima ricombinante umano MMP-2, che è stato incubato con ciascun composto di nuova sintesi, con lo standard CGS_27023A, alla concentrazione 5nM, o con il solvente (DMSO) con cui sono stati solubilizzati i composti e che rappresenta il campione di controllo. Al termine dell’incubazione di 3h, tali campioni sono stati processati come riportato in materiali e metodi e sottoposti ad analisi zimografica. In tabella 2 sono riportati i valori d’inibizione dell’attività gelatinolitica della MMP2 esercitata da ciascun composto di nuova sintesi o dallo standard CGS_27023A espressi come percentuale rispetto al controllo.
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Tabella 2: valori di inibizione, espressi in percentuale rispetto al controllo, dell’attività gelatinolitica della MMP-2 esercitata dai composti di nuova sintesi e dallo standard CGS_27023A.
% di inibizione dell’attività della MMP-2
DMSO 0 4 19.6±3.0 5a 42.9±6.0 5b 22.1±2.1 5c 29.2±4.7 5d 12.5±1.9 6 12.0±1.9 7 16.5±0.3 CGS_27023A 8.4±1.6
I valori di inibizione sono rappresentati anche come grafico a barre nella Figura 11.
Figura 11: percentuale di inibizione dell’attività gelatinolitica dell’enzima ricombinante umano MMP-2 esercitata dai composti in esame o dallo standard CGS_27023A. I risultati esprimono la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti condotti in duplicato.*** p<0.0001.**p<0.01. % In ib izion e M M P -2 T rat tat i VS DM S O DMSO 3 4 5a 5b 5c 5d 6 7 0 20 40 60 80 100 *** **
%
in
hi
bi
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M
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L’analisi statistica mediante ANOVA a un solo criterio di classificazione seguita da test di Bonferroni ha rivelato che il trattamento della MMP-2 con il composto 5a e 5c determina una riduzione statisticamente significativa dell’attività gelatinolitica di tale enzima.
Nella figura 12 è riportata un’analisi zimografica rappresentativa ottenuta per i composti 5c, 5a e per lo standard CGS_27023A.
MMP-2
ricombinante umana 62 KDa
Figura 12: analisi zimografica dell’inibizione dell’attività dell’enzima MMP-2 dopo trattamento con DMSO (controllo), con lo standard CGS_27023A (3) e con i composti 5a e 5c.
2. Valutazione dell’effetto esercitato dai composti di nuova sintesi sulla capacità invasiva e sulla vitalità della linea cellulare umana di glioblastoma multiforme U87MG: l’effetto dei composti sulla capacità
invasiva delle cellule U87MG è stato valutato mediante un saggio che viene comunemente utilizzato come modello di invasività di cellule tumorali, come riportato in materiali e metodi (test di chemio invasività su matrigel). In particolare, le cellule U87MG sono state incubate con ciascun composto di nuova sintesi (5nM), con lo standard CGS_27023A (5nM) o con DMSO (controllo). Al termine dell’incubazione di 24h le cellule che hanno attraversato il matrigel (cellule che sono invase) sono state fotografate e contate. Il numero delle cellule invase in seguito al trattamento con i composti sono state espresse come percentuale rispetto al controllo. Come visualizzato nel grafico a barre (Figura 13), il trattamento
CGS_27023 A
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delle cellule U87MG con i composti di nuova sintesi o con lo standard CGS_27023A ha evidenziato una riduzione statisticamente significativa della capacità invasiva delle cellule. In particolare, i composti 4, 5a e 5c sono risultati i più efficaci inibitori della invasività delle cellule U87MG.
Figura 13: : percentuale di inibizione dell’invasività cellulare.
Al fine di valutare se l’effetto osservato circa la riduzione della capacità invasiva delle cellule U87MG fosse dovuto ad una riduzione del numero di cellule, causata da un eventuale effetto citotossico dei composti, è stato effettuato un saggio per la valutazione della vitalità cellulare (saggio del Trypan blue). Il trattamento per 24 h delle cellule con un'unica concentrazione (5nM) di composto di nuova sintesi o dello standard CGS_27023A non ha determinato differenze statisticamente significative nella percentuale di cellule morte rispetto al campione di controllo (tabella 3) % In ib izion e in vas ivi tà ce ll u lare
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Tabella 3: percentuale di cellule morte rispetto al numero totale di cellule contate, dopo trattamento con il DMSO (controllo), con i composti (4, 5a-d, 6, 7) e con lo standard CGS_27023A, per 24 h. I dati riportati esprimono la media dei valori ± SEM ottenuti da tre esperimenti indipendenti condotti in duplicato.
Composti % di cellule morte
DMSO 10.0±1.04 4 11.5±0.20 5a 12.3±0.44 5b 14.4±0.07 5c 9.38±2.77 5d 6.80±1.24 6 17.8±1.28 7 13.6±4.15 CGS_27023A 10.8±1.81
Visto che l’analisi relativa alla citotossicità ha mostrato per i trattamenti con i composti una percentuale di cellule morte paragonabile ma non completamente sovrapponibile, è risultato opportuno normalizzare i dati ottenuti dall’analisi d’invasività, tenendo in considerazione la percentuale di cellule morte causata dal trattamento con ogni singolo composto (tabella 4).
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Tabella 4: percentuale di inibizione dell’invasività cellulare dopo trattamento con DMSO (controllo), con i composti (4, 5a-d, 6, 7) e con lo standard CGS_27023A, per 24 ore. I dati sono riportati come valore medio ± SEM e sono stati ottenuti da tre esperimenti indipendenti, condotti in duplicato.
Composti % d’inibizione dell’invasività cellulare, normalizzata in base alla % di cellule morte.
DMSO 0.00 4 39.5±1.55 5a 42.6±0.97 5b 27.5±1.66 5c 48.4±2.80 5d 34.0±1.45 6 16.0±0.60 7 35.9±1.45 CGS_27023A 28.3±0.40
Le percentuali di inibizione dell’invasività normalizzate sono riporatate anche come grafico a barre (Figura 14)
DMSO 3 4 5a 5b 5c 5d 6 7 0 20 40 60
***
***
***
***
***
***
***
***
%
in
hi
bi
ti
on
ce
ll
in
va
si
ve
ne
ss
Figura 14: percentuale di inibizione dell’invasività cellulare, normalizzata con la percentuale di cellule morte.
% In ib izion e in vas ivi tà ce ll u lare
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L’analisi statistica effettuata tramite ANOVA ha evidenziato una differenza statisticamente significativa tra le cellule trattate con DMSO (controllo) e le cellule trattate con ciascun composto (p<0.0001) (Figura 14). I dati ottenuti dopo la normalizzazione, non sono risultati essere molto discostanti da quelli evidenziati in precedenza senza la normalizzazione. Tale risultato era comunque prevedibile, in quanto la percentuale di cellule morte non differiva di molto né da un trattamento ad un altro, né rispetto al controllo. Tuttavia i composti che hanno mostrato una migliore attività inibitoria dell’invasività cellulare sono risultati essere il 5a ed il 5c, con una percentuale d’inibizione, rispettivamente del 42.6% e del 48.4%. Nella figura 15 sono riportate analisi di chemio invasività rappresentative ottenute per i composti 5c, 5a e per lo standard CGS_27023A.
Figura 15: I pannelli mostrano le cellule colorate con il cristal violetto e fotografate al microscopio,dopo trattamento con il DMSO (controllo) e con i composti CGS_27023A, 5a e 5c, che hanno degradato lo strato di matrigel.
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Il saggio di invasività è stato effettuato utilizzando una concentrazione dei composti vicina al valore di IC50 per la MMP-2, essendo questa metalloproteasi quella maggiormente implicata nel processo metastatico. Tuttavia, non è da escludere che i risultati ottenuti sull’inibizione dell’invasività siano correlabili al coinvolgimento di altre metalloproteasi, oltre alla MMP-2. Infatti, studi recenti hanno evidenziato una sovra espressione della metalloproteasi 25 nel GBM (MMP-25). La MMP-25 (metalloproteasi di membrana), oltre ad avere un ruolo nella degradazione della matrice extracellulare, agisce come attivatore della pro-gelatinasi A ad MMP-2 attiva. Vista l’implicazione di questa metalloproteasi nella progressione della malattia e del suo ruolo nel processo metastatico, abbiamo voluto valutare se i composti 5a e 5c, che sono risultati essere più attivi nell’inibizione dell’invasività, andassero ad agire sulla MMP-25. A tale scopo, è stato effettuato il test in tube su un enzima ricombinante umano MMP-25, nel laboratorio diretto dal Prof. Fridman, presso il dipartimento di Patologia della Weyne State University di Detroit, e sono stati calcolati i valori di IC50 per i composti 5a e 5c (Tabella 5).
Tabella 5: Attività inibitoria dei composti di nuova sintesi 5a e 5c, sulla MMP-25 ricombinante umana, espressa come valore IC50 (nM).
Composti MMP-25
5a 10
5c 20
I valori ottenuti hanno mostrato che tali composti risultano essere molto efficaci anche nell’inibire MMP-25, con concentrazioni simili a quelle riscontrate per la MMP-2, e questo potrebbe contribuire al blocco
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dell’invasività riscontrato dopo trattamento con i composti in esame. Inoltre il risultato ottenuto sull’inibizione dell’invasività potrebbe essere causato da un duplice meccanismo d’azione, infatti i composti testati, da un lato bloccano l’attività proteasica degli enzimi, dall’altro potrebbero inibire l’espressione della metalloproteasi stessa. In un lavoro effettuato in precedenza nel nostro laboratorio, infatti è stato osservato che il trattamento della linea cellulare U87MG con composti sintetici appartenenti alla classe dei N-O-isopropil sulfonammide idrossammati non solo determina una inibizione dell’attività proteolitica della MMP-2 ma determina anche la riduzione della sua espressione.
In conclusione, tutti i composti testati hanno mostrato una riduzione dell’attività gelatinolitica della MMP-2 ricombinante umana sul proprio substrato naturale ed una riduzione dell’invasività su matrigel delle cellule di glioma umano U87MG. I composti maggiormente attivi sono risultati essere i composti 5a e 5c. Inoltre studi preliminari, eseguiti nel laboratorio diretto dal Prof. Ettore Novellino, presso il Dipartimento di Chimica Farmaceutica e Tossicologica dell’Università di Napoli “Federico II, volti a determinare le caratteristiche chimico-fisiche e le proprietà di attraversamento della BEE, hanno evidenziato che queste molecole sono idonee ad attraversare la BEE.
Alla luce dei risultati ottenuti, questi composti risultano essere efficaci nell’inibire l’invasività delle cellule tumorali U87MG e potrebbero quindi aprire la strada per lo sviluppo di nuove terapie antitumorali, volte alla riduzione della forte diffusione metastatica che caratterizza i gliomi, ed alla limitazione degli effetti collaterali riscontrati nei trials clinici con l’utilizzo di MMPI a largo spettro.
