CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOKSINO NUSTATYMO DINAMIKA PENKERIŲ METŲ LAIKOTARPIU IR GALIMŲ POKYČIŲ PRIEŽASTYS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA

ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

Loreta Trotienė

CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOKSINO NUSTATYMO DINAMIKA

PENKERIŲ METŲ LAIKOTARPIU IR GALIMŲ POKYČIŲ

PRIEŽASTYS

Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas

TURINYS

7. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 9

7.1 Darbo tikslas ... 9

7.2 Tyrimo uždaviniai ... 9

8. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

8.1 Clostridium difficile charakteristika ir epidemiologija ... 10

8.2 Patogenezė ir klinikinė eiga ... 11

8.2.1 Clostridium difficile infekcijos išsivystymą lemiančios priežastys ... 12

8.2.2 C. difficile infekcijos klinikinė eiga ... 13

8.3. Daignostika ... 14

8.3.1 Laboratorinė diagnostika. ... 14

8.3.2 C. difficile infekcijos klinikinė diagnostika ... 16

8.4 C. difficile infekcijos gydymas ... 18

9. TYRIMO METODIKA ... 20

9.1 Tyrimo atlikimo vieta ... 20

9.2 Tyrimo metodika ... 20

9.2.1 Mėginių paruošimas ir C. difficile identifikavimas ... 20

9.2.2 Rezultatų pateikimas ir interpretavimas ... 21

9.3 Statistinė duomenų analizė ... 23

10. REZULTATAI ... 24

10.1 Clostridium difficile infekcijos atvejai ir lemiantys veiksniai Belgijoje, Šiaurės Italijoje ir Jungtinės Amerikos Valstijose ... 24

10.2 Clostridium difficile toksino nustatymo dažnis Lietuvoje 2013 – 2017 metais ... 28

10.2.1 C. difficile galimų pokyčių pagrindinės priežastys 2017 metais ... 31

11. REZULTATŲ APTARIMAS ... 35

12. IŠVADOS ... 37

1. SANTRAUKA

Darbo autorius: Loreta Trotienė

Darbo pavadinimas: Clostridium difficile toksino nustatymo dinamika penkerių metų laikotarpiu ir galimų pokyčių priežastys

Tyrimo tikslas: Įvertinti C. difficile toksino dinamiką penkerių metų laikotarpyje ir galimų pokyčių priežastis.

Darbo uždaviniai: 1) nustatyti Clostridium difficile (CD) nustatymo dažnį keleto metų eigoje remiantis literatūros duomenimis; 2) nustatyti Clostridium difficile toksino nustatymo dažnį 2013 - 2017 metais Kauno klinikose (KK) įvariuose skyriuose gydytų pacientų tarpe; 3) nustatyti dažniausiai naudojamų antibiotikų įtaką Clostridium difficile toksino išsivystimo dažniui.

Tyrimo metodika: atlikta retrospektyvi Clostridium difficile infekcijos (CDI) atvejų laboratorinių tyrimų dokumentacijos analizė, kuriuose CDI buvo patvirtinta mikrobiologiniu išmatų tyrimu, radus A ir B toksiną. Tyrimas buvo atliktas vieno veiksmo imunochromatografiniu testu – SIMPLE 2A – Bdiff/ STICK 2A – Bdiff Operon. Statistinė duomenų analizė atlikta SPSS duomenų paketu ir Excel programa. Skirtumai tarp grupių vertinti kaip reikšmingi, kai p<0,05.

Rezultatai: Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninėje Kauno klinikose (LSMU KK) 2013 iki 2017 metų laikotarpyje buvo nustatyti 461 pacientams CDI atvejai, kas sudarė: 1 proc., n = 7 / 2013m., 8 proc. n = 35 / 2014 m., 26 proc. n = 122 / 2015 m., 35 proc. n = 160 / 2016 m. ir 30 proc. n = 137 / 2017 m. Sirgusiųjų CDI imtį sudarė 241 moterys (52 proc.) ir 220 vyrai (48 proc.). Dažniausi epidemiologiniai CDI rizikos veiksniai buvo: 1) amžius (dažniausiai sirgo ≥ 65 m. – 66 proc. (n = 90)); 2) antibiotikų vartojimas 32 proc. (n = 44) - fiksuoti patikimai dažniau antibiotikų vartojimas ITS skyriuje, kas turėjo įtakos CDI išsivystymui, lyginant su chirurginiame skyriuje gydomais pacientais (80 proc. (n = 4) ir atitinkamai 14,3 proc. (n = 2), p < 0,05). Dažniausiai tiriamųjų grupėje buvo nustatyti antibiotikai – cefuroksimas (34,6 proc.) ir ciprofloksacinas (11,5 proc.); 3) dažniausiai CDI sirgo gydydamiesi terapiniame skyriuje (82 proc.).

Išvados: 1) Remiantis literatūros duomenimis Clostridium difficile infekcijos dinamika paskutinį dešimtmetį sparčiai augo. Pastaraisiais metais Clostridium difficile infekcijos susirgimų skaičius šiose šalyse išliko stabiliai aukštas; 2) Nors didžiausias nustatytas antibiotikų vartojimas buvo Kauno klinikų Intensyvios terapijos skyriaus gydomų pacientų tarpe, tačiau C. difficile toksinas dažniausiai buvo nustatytas terapiniame skyriuje (dažniausiai Nefrologijos ir Gastroenterologijos skyriuose) gydytiems pacientams; 3) Kauno klinikose C. difficile toksinas dažniausiai buvo nustatytas pacientams, kurių gydymui buvo skirta cefuroksimo ir ciprofloksacino.

2. SUMMARY

Title: Dynamic of Clostridium difficile toxins and possible changes during five year period. Aim: Evaluate C. difficile toxic dynamic during five year period and to determine the reasons for possible changes.

Objectives: 1) to determine the frequency of detection of C. difficile toxin in past several years’ period based on scientific literature; 2) to identify the frequency of C. difficile toxin among patients treated in Kauno Clinics (KK) in different wards during 2013-2017 years; 3) to identify the most commonly used antibiotics influence for C. difficile toxin development frequency.

Methodology: A retrospective analysis of laboratory documentation for C. difficile infection cases was performed where the CDI was confirmed by a microbiological stool test for the detection of A and B toxins. The study was performed using a single-step immuno-chromatographic test - SIMPLE 2A - Bdiff / STICK 2A – Bdiff Operon. Statistical data analysis was performed with SPSS data packet and Excel program. Differences between groups are significant when p <0.05.

Results: A total of 461 patients with confirmed CDI were included in the study. All C. difficile strains were isolated from clinical samples of patients treated in the Hospital of LSMU KK from 2013 to 2017 year (1 %., n = 7 / 2013m., 8 %. n = 35 / 2014 m., 26 proc. n = 122 / 2015 m., 35 proc. n = 160 / 2016 m. ir 30 %. n = 137 / 2017 m.). Distribution by gender CDI’s were 241 female (52%) ir 220 male (48%). In this study we detect that the most common epidemiological risk factors causes for CDI were: 1) age (were most commonly ≥ 65 years old - 66% (n = 90)); 2) used of antibiotics 32% (n = 44). Reliably more often antibiotic therapy at ITS department had influence for CDI development compare to surgical treated patient (80% (n = 4) and accordingly 14.3%. (n = 2), p < 0.05). The most commonly used antibiotics in research group were cefuroxime (34.6%) and ciprofloxacin (11.5%); 3) treatment in therapeutic ward the highest morbidity (82%);

Conclusion: 1) According to literature data, the dynamics of C. difficile infection has been growing rapidly in the last decade. In recent years the number of C. difficile infectious diseases has been a steady rise; 2) Although the highest level of antibiotic use was detected in Kauno Clinics Intensive care unit (ICU) treated patients group, but diagnosed with C. difficile toxin were mostly detected in the therapeutic department (Nephrology and Gastroenterology department); 3) In Kauno Clinics C. difficile toxin were mostly observed in patients whose treatment was used to cefuroxime and ciprofloxacin.

3. PADĖKA

Už pagalbą ruošiant šį darbą noriu padėkoti dabo mokslinei vadovei prof. Astrai Vitkauskienei.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

5. SANTRUMPOS

CD – Clostridium difficile

CDI – Clostridium difficile infekcija CHL - chloramfenikolis

ESCMID - Europos Klinikinių Mikrobiologų ir Infektologų draugija FDX - fidaksomicinas

GDH - glutamato dehidrogenazės testas

H2 – histamino blokatoriai - skrandžio sulčių sekreciją slopinantis vaistas IFT – imunofermentinis tyrimas

IL-8 - interleukinas 8

ITS – intensyvios terapijos skyrius JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos KK – Kauno klinikos

KT – kompiuterinė tomografija

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas MTZ - metronidazolis

NAP1 - pulsinės gelio elektroforezė

NRAT - nukleino rūgšties amplifikacijos tyrimai

PSI – protonų siurblio inhibitoriai - skrandžio sulčių sekreciją slopinantis vaistas RIF - rifampicinas

SIMPLE 2A – Bdiff - vieno veiksmo imunochromatografinio testo pateikimo formatas (paprastas)

STICK 2A – Bdiff - vieno veiksmo imunochromatografinio testo pateikimo formatas (lazdelės) TET - tetraciklinas

TPI - triozių fosfatų izomerazė VAN – vankomicinas

SĄVOKOS

Egzogeniškai – išorinių veiksnių sąlygota infekcija ar liga. Endogeniškai – vidinių veiksnių sąlygota infekcija ar liga. Hematochezija – neskausmingas rektalinis kraujavimas.

Melena – juodos spalvos išmatos dėl jose esančių apvirškintų kraujo priemaišų. Mikrobiota – tam tikroje aplinkoje esantys mikroorganizmai.

Mikrobiomas - reiškia tų mikroorganizmų ir jų genų katalogą. Recidyvas – atsinaujinantis, pasikartojantis.

Reinfekcija – pakartotinis užsikrėtimas tais pačiais ligos sukėlėjais. Retrospektyvinis – grupė tiriamųjų praeityje.

6. ĮVADAS

Clostridium difficile (CD) yra vis dažniau pripažįstama pagrindiniu virškinimo trakto infekcijų sukelėju visame pasaulyje, iš kurių net 70-80 proc. C. difficile sukeltų infekcijų pasireiškia 65 metų ir vyresniems žmonėms [24]. C. difficile išskiria du toksinus: A (TcdA) ir B (TcdB), kurie pažeidžia žarnyną ir sukelia CD infekciją. Šių toksinų poveikis yra atsakingas už klinikinius ligos simptomus, pradedant nuo lengvo viduriavimu iki gyvybei pavojingų uždegiminių komplikacijų.

Nepaisant to, kad per pastaruosius metus antibiotikų vartojimas turėjo neabejotinai teigiamą poveikį žmonių sveikatai, tačiau pernelyg didelis jų varotjimas visuomenėje, tapo pagrindine CD infekcijos priežastimi. Pagrindiniai C. difficile infekcijos rizikos veiksniai be minėtų amžiaus > 65 metai ir neteisingas antibiotikų vartojimas, skatinantis atsaprių antibiotikams ir virulentiškų bakterijų padermių plitimą, yra ir hospitalizacija.

Per pastaruosius kelerius metus C. difficile infekcija (CDI) tapo vis dažnesnė, sunkesnės formos ir sunkiai pasiduodanti net standartiniam medikamentiniam gydimui. Nepaisant sėkmingo pirminio gydymo epizodo, maždaug 14-26 proc. pacientų patiria CDI pasikartojimą. Tiems pacientams, kurie jau patyrė vieną recidyvą, papildomų pasikartojimų rizika gali siekti net 65 proc. [15]. Taigi ligos atsinaujinimas yra dažnas ir brangus CDI rezultatas. Taip pat pasikartojanti CDI yra susijęs su sunkiomis komplikacijomis, tokiomis kaip pseudomembraninis kolitas, žaibinis kolitas ir toksinis megakolonas, sepsinis šokas, žarnyno perforacija ar mirtis.

CDI šiuo metu gydomas metronidazoliu ir vankomicinu, tačiau jis yra neoptimalus, ypač dėl didelių pasikartojimų, dėl to gydimui yra nadojami keleta empirinių metodų.

Dėl pastarųjų priežasčių Clostridium difficile infekcijos paplitimas ir susijęs mirštamumas vis labiau didėja JAV, Kanadoje ir Europoje. Ligos kontrolės ir prevencijos centrai praneša, kad CDI yra susijusi su 14 000 mirčių kasmet Jungtinėse Amerikos Valstijose ir daugiau kaip 1 milijardas dolerių viršija medicinines išlaidas. Nepaisant klinikinės praktikos gairių, skirtų C. difficile infekcijos prevencijai, diagnozei ir gydymui, CDI lygis Jungtinėse Amerikos Valstijose ir toliau didėja [25].

Šiame tyrime analizuosime 2013 m. – 2017 m Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoj nustatytų CDI atvejų, kurie buvo patvirtinti išmatų tyrime radus A ir/arba B toksinų dinamiką.

Tyrimo tikslas – nustatyti CDI išsivystymą penkerių metų laikotarpyje, įvertinti rizikos veiksnių paplitimą, ypač naudojamų antibiotikų įtaką. Atliktas tyrimas aiškiai parodė, kad nagrinėjama tema aktuali ir svarbi, vis dėl didėjančio sergamumo.

7. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

7.1 Darbo tikslas

Įvertinti Clostridium difficile toksino dinamiką penkerių metų laikotarpyje ir galimų pokyčių priežastis.

7.2 Tyrimo uždaviniai

1. Nustatyti Clostridium difficile nustatymo dažnį keletos metų eigoje remiantis literatūros duomenimis.

2. Nustatyti Clostridium difficile toksino nustatymo dažnį 2013 - 2017 metais Kauno klinikose įvariuose skyriuose gydytų pacientų tarpe.

3. Nustatyti dažniausiai naudojamų antibiotikų įtaką Clostridium difficile toksino išsivystimo dažniui.

8. LITERATŪROS APŽVALGA

8.1 Clostridium difficile charakteristika ir epidemiologija

Clostridium difficile (C. difficile) (1 pav.) yra griežtai anaerobinė, sporas sudaranti gramteigiama lazdelės formos bakterija, kuri įprastinėmis sąlygomos vegetuoja žmogaus storajame žarnyne. Sporos yra atsparios karščiui, rūgščiai ir antibiotikams. Dėl savo sporų bakterija gali išgyventi sudėtingomis sąlygomis ir įprastus sterilizavimo būdus: aukštą temperatūrą, ultravioletinius spindulius, stiprius chemikalus ir antibiotikų poveikį. Šie veiksmai lemia didelį paplitimą visuomenėje ir ligoninės aplinkoje. Kadangi sporos yra atsparios antibiotikams, jos gali likti virškinimo trakte ir gali prisidėti prie pasikartojančios ligos [6].

C. difficile bakterija gamina dviejų rūšių toksinus (A ir B), kurie pažeidžia žarnyną ir sukelia įvairaus sunkumo viduriavimus (diarėjas). Daugeliu atveju bakterijų išskiriami toksinai sąlygoja sunkią klinikinę eigą, žarnų uždegimą (kolitą) su galimomis komplikacijomis, įskaitant toksinį megakoloną,

žarnyno perforaciją, sepsį, sepsinį šoką ir mirtį. Vaikams ir sveikiems suaugusiesiems infekcijas C. difficile sukelia retai, tačiau kai kurie asmenys, taip pat ir kūdikiai, gali nešioti bakterijas be ligos

simptomų, bet daugeliu atvejų išsivysto infekcija.

1 pav. Clostridium difficile morfologija: lazdelės formos, gramteigiama anaerobinė bakterija

(Nuotrauka: Dr. Dovinová P., https://microbiologyinpictures.com/bacteria-micrographs/gramstain/gram-positive/clostridium-difficile-gram-stain.html)

Per pastaruosius 10-15 metų C. difficile infekcija tapo vis svarbesnė dėl padažnėjusių sunkių susirgimo atvejų. Dėl CDI paplitimo atsirado dažnesnės medicininės ir chirurginės komplikacijos, išaugo papildomos sveikatos priežiūros išlaidos ir padidėjo mirtingumas.

Nuo XX a. pradžios Kanadoje, JAV ir Europoje nuolat daugėjo sunkių CDI atvejų, o remiantis pastarųjų šalių pranešimais, per pastarąjį dešimtmetį CDI paplitimas išaugo 2 - 40 kartų [9].

Europoje CDI atvejų nuolatinis augimas pirmiausia prasidėjo Jungtinėje Karalystėje 2003 - 2004 m., tada nuo 2005 m. Olandijoje ir Belgijoje ir ko pasekoje sekė Prancūzija ir kitos Europos šalys [2]. Remiantis tyrimų duomenų baze, kurią pateikė Christoph Lübbert ir kt., buvo pranešta apie CDI paplitimą Vokietijoje, 2012 m. buvo nustatyta mažiausiai 83 susirgimo atvejai 100 000 gyventojų palyginus su 2006 m., kur buvo nustatyta 14,8 susirgimo atvejai 100 000 gyventojų Saksonijoje, Vokietijoje. Padidėjęs sergamumas buvo stebimas ir Strausberge 82 atvejai 100 000 gyventojų 2015 m. [26]. Nacionaliniai epidemiologiniai tyrimai parodė, kad pastaraisiais metais Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV) išaugo susirgusių CDI skaičius. Šiaurės Amerikoje, pavyzdžiui Kvebeke, CDI paplitimas padidėjo 4 kartus, o bendras mirštamumas siekė 6,9% nuo 1998 iki 2004 metų laikotarpyje [9].

Pastarąjį dešimtmetį CDI susirgimų skaičius nuolatos auga, nors nuo 2008 m. iki 2010 m. laikotarpyje buvo pastebimas infekcijos susirgimų sumažėjimas, tačiau aukštas paplitimo lygis išliko. Tačiau nacionaliniai epidemiologiniai tyrimai parodė, kad pastaraisiais metais (t. y. nuo 2009 m.) išaugo CDI atvejų Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV) [15]. Panašios tendencijos pastebimos ir kai kuriose Europos šalyse. 2007-2010 m. Anglijoje buvo pastebėtas 61 proc. CDI paplitimo sumažėjimas, tačiau Ispanijoje, Vokietijoje ir Prancūzijoje jų dažnis padidėjo, kai Belgijoje atvejų skaičius išliko stabilus [16].

Padidėjusio sergamumo ir mirštamumo priežastimi JAV, Kanadoje ir Europoje daugiausia buvo susijęs su hipervirulentine CD forma su nustatytu 078 ribotipu ir BI / NAP1 / 027, kuri identifikuota trimis tyrimais: restrikcinės DNR analizės (BI), pulsinės gelio elektroforezės (NAP1), ar polimerazės grandininės reakcijos (027) [16].

8.2 Patogenezė ir klinikinė eiga

Tam, kad CD sukeltų kliniškai pasireiškiančią infekciją reikalingos dvi sąlygos – sporos, kurios padeda CD persistavimui bei plitimui ir toksinų gamyba [17]. Taigi, kaip minėta, sporos labai atsparios sudėtingoms aplinkos sąlygoms ir galinčios išlikti mėnesius ar net metus. Kai sąlygos yra palankios, endogeniškai arba egzogeniškai įgytos C. difficile sporos plinta ir vegetatyvinės ląstelės dauginasi bei kolonizuoja žarnyną. Sutrikus normaliai žarnyno bakterijų pusiausvyrai, C difficile sporos pradeda greitai daugintis ir gaminti toksinus.

Pagrindiniai C. difficile virulentiškumo veiksniai yra 2 toksinai, enterotoksinas A (TcdA) ir citotoksinas B (TcdB). C. difficile toksinai gali sukelti citopatinį ir citotoksinį efektą. Šie toksinai dažniausiai sutrikdo citoskeleto struktūrą, sukelia ląstelių sąveikos sutrikimus, kurie gali prisidėti prie padidėjusio epitelio pralaidumo, tokiu būdu inicijuodami ląstelių mirtį. Tai pat didina citokinų gamybą, tumoro nekrozės faktoriaus α sekreciją, stimuliuoja makrofagus, ko pasekoje skatinamas uždegimas [11]. Manoma, kad ypač svarbų esminį vaidmenį patogenezėje atlieka interleukinas 8 (IL-8), kuris dalyvauja neutrofilų, C. difficile uždegiminėse vietose, įdarbinimui ir aktyvavimui [14]. Gausi infiltracija neutrofilais, sukelia CDI kolitui būdingą, pseudomembranų susiformavimą [11, 18]. Taigi šie toksinai pažeidžia žarnyną bei sukelia jos gleivinės uždegimą, padidėjusią gleivių sekreciją bei išopėjimą.

Nors TcdA ir TcdB turi tą patį bendrą veikimo mechanizmą, tačiau jie turi keletą fenotipinių skirtumų. Tyrimais įrodyta, kad daugelyje ląstelių tipų TcdB yra 100-10 000 kartų stipresnis nei TcdA [14]. Nustatyta, kad, ne TcdA, o TcdB yra pagrindinis C. difficile virulentiškumo faktorius [14]. Dar visai neseniai buvo manoma, kad visos toksininės padermės, susijusios su CDI, atsirado tiek dėl TcdA, tiek dėl TcdB. Tačiau daugelis naujausių tyrimų rodo, kad TcdA neigiamos TcdB teigiamos (TcdA-/TcdB+) padermės gali būti randamos pacientams, kuriems aiškiai pasireiškė CDI [6]. TcdA-/TcdB+ padermė pirmą kartą identifikavo Depitre ir kt Belgijoje [13]. Ji laikoma patogenine, nors ir negamina toksino A, tačiau ribotipo 027 padermės, priklausančios šiai grupei ir Šiaurės Amerikoje sukėlė daug endeminių ligos protrūkių [27]. O TcdA+/TcdB+ padermės yra dažniausios CDI sukeliančios padermės, kurių ribotipai 001, 014 ir 078 yra labiausiai paplitę Europoje.

Daugelyje JAV valstybių, tiek Europoje ir Kanadoje nustatyta hipervirulentiška C. difficile atmaina BI / NAP1/027, kuri sukelia sunkios formos infekciją ir jos protrūkius. Ši padermė virulentiškesnė, lemia sunkesnę ligos eigą, atsparumą antibiotikams, sunkiau gydoma ir blogesnes ligos baigtis. Nors visais atvejais absoliutus ryšys tarp BI / NAP1 / 027 padermių ir padidėjusios ligos sunkumo nebuvo atliktas, tačiau plati klinikinė priežiūra, per pastaruosius dešimt metų, parodė stiprią koreliaciją tarp BI / NAP1 / 027 dažnio ir mirtingumo [19].

8.2.1 Clostridium difficile infekcijos išsivystymą lemiančios priežastys

Dažniausias CD kolonizaciją žarnyne skatinantis veiksnys yra ilgalaikis ir/ar neracionalus antibiotikų vartojimas. Antibiotikai silpnina natūralios žarnyno mikrofloros barjerą ir sukuria idealias sąlygas CD kolonizavimui bei skatina toksinų gamybą, didindami riziką susirgti CDI. Kiekvienas antibiotikas yra susijęs su CDI išsivystymu, tačiau kai kurie iš jų kelia didesnę riziką nei kiti, įskaitant

klindamiciną, plataus spektro penicilinus, cefalosporinų grupės antibiotikus ir fluorhinolonus [4]. CDI atsiradimo riziką taip pat didina metronidazolis ir vankomicinas, kurie naudojami kaip pagrindiniai medikamentai CDI gydymui [20].

Be antibiotikų vartojimo, pagrindiniai rizikos veiksniai, susiję su CDI vystymu, yra paciento amžius. Didėjant amžiui, didėja sergamumas CDI, o ypač didesnis tarp vyresnių nei 65 m. asmenų. Nors priežastys nėra aiškiai nustatytos, tačiau manoma, kad CDI sergamumas šioje grupėje labiausiai susijęs su amžiumi silpnėjančiu imunitetu, gretutinėmis ligomis ir dažnesne bei ilgesne trukmės hospitalizacija. Hospitalizacija yra dar vienas svarbus rizikos veiksnys. Pagrindinės to priežastys: sporomis užteršta aplinka, galimas tiesioginis kontaktas tarp sergančių arba kolonizuotų ir nekolonizuotų asmenų bei netiesioginis kontaktas per aplinkos daiktus ir nepakankamai optimali rankų higiena, tarp mdicinos personalo darbuotojų.

Kitas svarbus CDI rizikos veiksnys – gretutinės ligos. Pavyzdžiui gydant gastroezofaginį refliuksą, skiriama skrandžio sulčių sekreciją slopinančių vaistų ( H2 blokatorių ir PSI), tai padidina sunkių infekcinių komplikacijų, tarp jų visuomenėje įgytos ir hospitalinės C. difficile infekcijos atsiradimo riziką [4]. Tai pat C. difficile dauginimuisi įtakos turi žarnyno išemija, uremija ir kiti metaboliniai sutrikimai bei inkstų nepakankamumas.

Kiti papildomi rizikos faktoriai yra transplantacija, nutukimas, virškinimo trakto operacija, imunosupresija, chemoterapija.

8.2.2 C. difficile infekcijos klinikinė eiga

Clostridium difficile infekcija skirstoma į tirs klinikinius požymius: 1) asimptominis nešiojimas; 2) nuo lengvo ar vidutinio viduriavimo; 3) nuo sunkaus bei gyvybei pavojingų būklių, tokių kaip pseudomembraninis kolitas ir toksiškas megakolonas.

Tyrimai įrodė, kad 50 proc. ar daugiau C. difficile kolonizuoti ligoninės pacientai yra simptomų neturintys nešiotojai [1]. Asimptominių nešiojimo atveju, išmatose randama C. difficile, bet tokiu atveju nėra viduriavimo ar kitų simptomų ir dėl to gydyti nereikia.

CDI simptomai dažniausiai prasideda netrukus po kolonizacijos. Inkubacinis ligos periodas nėra aiškus (nuo 1 d. iki 6 ir daugiau savaičių), kai kurių tyrimų duomenimis, vidutiniškai 2-3 dienos [1]. Pagrindinis simptomas yra vandeningas viduriavimas, daugiau nei 3 kartus per parą. Klinikinė CDI kolito eiga gali kisti nuo lengvo trumpalaikio viduriavimo iki sunkaus, gyvybei grėsmingo kolito. C. difficile viduriavimas gali būti susijęs su gleivių ar slapto kraujo priemaišomis išmatose, tačiau

melena ar hematochezija yra reta [1]. Kiti simptomai yra pilvo skausmas, pilvo pūtimas, pykinimas, leukocitozė, hipoalbuminemija. Labai retai pasitaiko bakteremija [1].

Sunkūs CDI atvejų simptomai yra pilvo skausmai, kartais - žarnų nepraeinamumas, su nedaug išreikštu viduriavimu ar be viduriavimo, karščiavimas, tai pat ženkli leukocitozė - 15 x 109/l arba kreatinino koncentracijos kraujyje padidėjimas - >1,5 karto, negu buvo iki susirgimo, tai pat hipoalbuminemiją - <30 g / l [1]. Komplikuotu CDI atveju, be išvardintų simptomų, gali pasireikšti dehidratacija, elektrolitų disbalansu, toksiniu žarnų išsiplėtimu ir žarnų perforacija, hipotenzija, inkstų funkcijos nepakankamumu, sisteminiu uždegiminiu atsaku, sepsiu bei mirtimi [1].

Iš visų sergančių CDI, 20 proc. pacientų galimas infekcijos požymių pasikartojimas (recidyvas arba reinfekcija). Praktikoje sunku atskirti recidyvą nuo reinfekcijos. Pasikartojusi C. difficile infekcija nustatoma, jei liga atsinaujina praėjus 8 sav. po visiško pasveikimo [21].

8.3. Daignostika

CDI diagnozė yra pagrįsta klinikinių ir laboratorinių tyrimų deriniu:

1. Laboratorinai tyrimai, nustatant C. difficile specifinius A(TcdA) ir/arba B(TcdB) toksinus išmatose.

2. CDI būdingi žarnų audinių pakitimai, kurie randami kolonoskpu, endoskopija, kolektomija, tai pat rentgenografija ir kompiuterine tomografija.

8.3.1 Laboratorinė diagnostika.

Mikrobiologiniai tyrimai leidžia nustatyti ar bakterijos gamina toksinus ar ne, kadangi bakterijų aptikimas koprologiniu tyrimu nėra informatyvus rodiklis leidžiantis prognozuoti tam tikrų ligų eigą. Mikrobiologinai tyrimai atliekami tik esant kliniškai reikšmingam viduriavimui.

CDI kontrolei yra svarbi itin ankstyva diagnostika, taikant kuo jautresnius ir greitesnius metodus. Kuo jautresnis yra tyrimas, tuo didesnė tikimybė nustatyti CDI bei bus pritaikytas tinkamas gydymas, taip išvengiant rimtų komplikacijų ar net mirties. Yra įvarių metodų nustatyti C. difficile infekciją:

1. Išmatų pasėlis dėl C. difficile;

3. C. difficile toksinų tyrimas (imunofermentinis ir imunochromatografijos tyrimas dėl A ir B toksinų )

4. C. difficile toksinų tyrimas (ląstelių citotoksiškumo tyrimas dėl toksino B);

5. C. difficile A ir B toksinus, koduojančių genų molekulinis tyrimas, kurio metu amplifikuojama nukleino rūgštis polimerazės grandinine reakcija (PGR) ir DNR amplifikacija izoterminėmis sąlygomis testas.

Kad būtų užtikrinta geresnis diagnostinis veikimo procesas, siekiant optimizuoti CDI diagnostiką, atliekamas dviejų ar trijų etapų algoritmų tyrimai pagal Europos Klinikinių Mikrobiologų ir Infektologų draugijos (ESCMID) gaires. Tai atliekama, nes yra naudinga dėl įvairių priežasčių: 1. Ekonomiška; 2. Išvengiama nereikalingo arba netinkamo gydymo ir jo pasekmių [22].

Ląstelių citotoksiškumo tyrimas buvo „auksinis“ standartas, kuris yra labai jautrus ir specifiškas, tačiau turi trūkumų, tai yra, kad užima daug laiko (paprastai 24 – 48 val.) ir darbo sąnaudų bei brangiai kainuojantis [10]. Jis vis dar jautriausias tyirmas C. difficile B toksino aptikimui.

Išmatų pasėlis dėl C. difficile yra labai jautrus metodas, dažniausiai naudojamas kaip pamatinis metodas naujiems diagnostiniams tyrimams įvertinti, tačiau trūkumas yra, kad užima daug laiko (keletas dienų), dėl to klinikinei diagnozei įvertinti retai naudojama. Išmatų pasėlis yra vis dar reikalingas atlikti tipavimo tyrimus, epidemiologiniams tikslams ir jautrumo antibiotikams nustatymo bei sunkios ir / arba komplikuotos ligos atveju (su neigiamu toksino tyrimo rezultatu) [10].

Bakterinės kilmės infekcijoms nustatyti kuriami nauji, greitesni metodai, paremti ne kultūrų auginimu. Taigi C. difficile infekcijai nustatyti nauji ir greitesni yra imunofermentiniai ir molekuliniai tyrimai bei glutamato dehidrogenezės.

Praktikoje dažniausiai yra atliekamas imunofermentinis tyrimas (IFT) dėl C. difficile A ir B toksinų nustatymo. IFT metodas yra lengviau ir greičiau (per valandą) atliekamas, pakankamai specifiškas ir jautrus bei pigesnis už ląstelių citotoksišką tyrimą, o jų jautrumas yra nuo 75 proc. iki 95 proc., specifiškumas - nuo 83 proc. iki 98 proc., palyginus su ląstelių citotoksišku tyrimu [9].

ELISA, kaip IFT pagrįstas metodas, gali aptikti A toksiną arba abu toksinus. O jo jautrumas ir specifiškumas atitinkamai yra 50-90 proc. ir 70-95 proc. [9].

Imunochromatografinis testas yra paremtas IFT pagrindu. Skirtingai nei kitos imuninių tyrimų sistemos (ELISA ir greiti testai), leidžiantys tik aptikti TcdA ir TcdB kombinaciją su dviem atskiromis juostomis – raudona juosta po mėlyna kontroline juosta, kai mėginyje yra TcdA, ir kita raudona juosta virš kontrolinės juostos, kai mėginyje yra TcdB.

Glutamato dehidrogenezės testas (GDH) yra naudojamas, kaip pradinis atrankinis tyrimas, nes nustato patogeno buvimą išmatose, o ne toksino gamybą. GDH produkuoja toksigeninės ir netoksigeninės padermės. Esant teigiamam tyrimo rezultatui, antrame etape atliekamas patvirtinantis (IFT, ląstelių citotoksiškas ar molekulinis) tyrimas dėl C. difficile A ir/arba B toksinų nustatymo.

GDH testo jautrumas siekia nuo 96 proc. iki 100 proc., bei greitai atliekamas (<1 val.) ir palyginti nebrangus [23].

Nukleino rūgšties amplifikacijos tyrimai (NRAT) yra naujausi C. difficile nustatymo metodai. Šie tyrimai aptinka vieną ar daugiau genų, koduojančius toksinus, tai tcdA, tcdB, tcdC ir kiti genai, tokie kaip 16S, triozių fosfatų izomerazė (TPI) [9].

Molekulinių metodų bendras jautrumas yra 92 proc., palyginus su išmatų pasėliu ir 87 proc. lyginant su ląstelių citotoksišku tyrimu [22]. NRAT pranašumai yra greitas (rezultatai gali būti pateikti maždaug per valandą), jautrus ir specifiškas, bet ne visose mikrobiologijos laboratorijose gali būti įdiegtas.

8.3.2 C. difficile infekcijos klinikinė diagnostika

Tokie tyrimai, kaip rentgenografija, kompiuterinė tomografija (KT), radiologija ir endoskopija, kolonoskopija iš esmės buvo pakeisti, C. difficile nustatant laboratoriniais tyrimais. Klinikinė diagnostika yra brangūs, nepatogūs pacientui, santykinai nejautrūs, dažniausiai nėra specifiniai ir nereikalingi, atsižvelgiant į tai, kai nustatoma ar yra toksinų. Nepaisant to, šios procedūros dažnai daromos dėl kitų priežasčių. Klinikinė diagnostika gali būti naudinga, nustatant sunkesnes CDI formas. Endoskopinio žarnyno tyrimo metu įvertinama žarnyno sienelių būklė, tai pat, tai yra greičiausias būdas diagnozuoti pseudomembraninį kolitą sunkiais ligos atvejais, su neaiškia diagnoze arba klinikine būkle, reikalaujančia greitos diagnozės, kai negalimi greiti laboratorinės diagnostikos rezultatai arba yra atipinė ligos eiga, nesant viduriavimui. Apskritai endoskopija gali būti atliekama tais atvejais, kai įtariama kita diagnozė ir kuriai patvirtinti reikia apžiūrėti storosios žarnos gleivinę ir/arba paimti žarnyno gleivinės biopsiją. Atliekant tyrima sigmoidoskopu ar kolonoskopu - didelė perforacijos rizika. Saugiausia yra endoskopu, nors ši procedūra taip pat gali sukelti perforaciją žaibinio kolito atveju. Deja, šių tyrimų pagalba, aptinkamos pseudomembranos tik 51-55 proc. iš CDI atvejų [1].

Papildomi diagnotiniai tyrimai atliekami, įtariant CDI, yra rentgenografija ir kompiuterinė tomografija su peroraliniu ir intraveniniu kontrastavimu. Rentgenografinis pilvo ir dubens ištyrimas atliekamas pacientams, kuriems yra sunki ligos forma ir norint įvertinti ar nėra toksinės megakolono buvimo, žarnyno perforacijos ar kitos patologijos, reikalingos chirurginės intervencijos. Būdingos savybės (2 pav.) yra ženklus žarnos sienelės sustorėjimas, „nykščių antspaudai“, būdinga visiems kolitams.

2 pav. ,,Nykščio antspaudai” ir žarnos sienelės išsiplėtimas (https://www.med-ed.virginia.edu/courses/rad/gi/colon/infect02.html)

Kompiuterinė tomografija gali būt vertinga, nustatant pseudomembraninį kolitą arba žaibinį kolitą. Būdingos savybės (3 pav.) yra ženkliai sustorėjusi storosios žarnos sienelės, ,,akordeono ženklas" – kontrastas tarp sustorėjusių storosios žarnos raukšlių.

3 pav. Trijų pacientų pilvo kompiuterinė tomografija, kuriems diagnozuojamas žaibinis kolitas.

[12]

Kompiuterinė tomografija gali palengvinti CDI diagnozę, tačiau ši metodika nėra nei jautri, nei specifiška, dėl to CDI diagnozė turėtų būti pagrįsta klinikinių ir laboratorinių tyrimų deriniu [1]. Biopsija nėra atliekama, norint nustayti CDI.

8.4 C. difficile infekcijos gydymas

Pastaruoju laikotarpiu didžiausia gydymo problema esant CDI yra: 1) brangus gydymas; 2) atsparumas antibakteriniams vaistams. Todėl, siekiant išspręsti šias problemas, reikia taikyti naujus metodus.

CDI dažniausiai yra gydoma metronidazoliu (MTZ) ir/arba vankomicinu (VAN). MTZ yra naudojamas kaip pirminis vaistas, gydant lengvajį ir vidutinio sunkumo CDI atvejį. C. difficile padermių atsparių metronidazoliui yra mažas skaičius, tačiau keliuose tyrimuose buvo pabrėžta MTZ gydymo nepakankamumas [5]. Vankomicinas tai pat yra naudojamas kaip pirminis vaistas tik gydant vidutinio sunkumo ir sunkų CDI atvejį. Norint pagerinti rekomenduojamo, pagal Surawiczn ir kt. Gastroenterologus 2013 m., gydymo kokybę, C. difficile infekcija buvo sugrupuota pagal ligos sunkumą (1 lentelė)

1 lentelė Rekomenduojamo gydymo su MTZ ir VAN santrauka pagal ligos sunkumą. Pagal Surawiczn ir kt. 2013 m. [5]

Sunkumas Gydymas Paaiškinimas

Nuo lengvo iki vidutinio sunkumo CDI atvejo

MTZ 500 mg 3 k./d. 10dienų Jei nėra pagerėjimo per 5-7 dienas, pakeiskite prie VAN 4x125 mg

Sunkus CDI atvejis VAN 125 mg 4 k./d. 10 dienų Nuo sunkaus iki komplikuoto

CDI atvejo

VAN 500 mg 4k./d. ir intaveninis MTZ 500 mg 3k./d. ir (į tiesiąją žarną VAN su 500 ml 0,9% Nalco) 2 – 4 k./d.

Siūlomas chirurginis konsiliumas

MTZ IR VAN pastaraisiai metais buvo susiję su padidėjusiu gydymo nesėkmių ir infekcijos pasikartojimo dažniu [5]. Todėl pastaraisiais metais buvo pasiūlyta kitų CDI gydymo galimybių. Tai būtų gydymas rifampicinu (RIF), fidaksomicinu (FDX) ir kitais antibiotikais, tokiais kaip tetraciklinu (TET) ir chloramfenikolis (CHL). Iš naujausių tyrimų, kuriuos atliko Huang JS ir kt 2013 m., nustatė, kad C. difficile demonstruoja vis didėjantį klinikinių izoliatų atsparumą rifampicinui, o atsparumas gali atsirasti net gydymo metu [5]. FDX yra naujas, siauro spektro antibiotikas, naudojamas CDI gydymui, pacientams su aukštos rizikos pasikartojimu (recidyvams).

Publikuotuose tyrimose apie C. difficile atsparumą TET, kuriuos atliko Norman KN ir kt. 2014 m. bei Dong D, Zhang L ir kt. 2013 m., rodo skirtingus rezultatus pagal šalis, kuriose vyko tyrimai. Atsparumas TET yra nuo 2,4 iki 41,67 proc. [29, 30].

Pastebėta, kad CDI pasikartojimas po pirmo karto susirgimo yra 10-20 proc. per 8 savaites, o kiekvienu kitu atveju padidėja iki 40-65 proc.[5]. Jei ligoniams skirti antibiotikai buna neveiksmingi arba dėl CD infekcijos pasikartojimo rekomenduojama ir atliekamas žarnyno mikrobiotos

transplantavimas.

Žarnyno mikrobiotos transplantavimas (mikrobiominis pernešimas arba išmatų mikrobiota persodinimas) yra procedūra, kai iš sveiko žmogaus mikroflora pernešama į kito asmens plonąją žarną kolonoskopija, endoskopija, sigmoidoskopija, o kartais net ir klizma. Kadangi C. difficile yra laikoma oportunistine bakterija, sukeliančią ligą disbiozės sąlygomis, sveikos žarnos mikrofloros atkūrimas leidžia įprastai atsirasti konkurencijai mikrofloros [8]. Šiai procedūrai nebūtinas imunologinis donoro ir recipiento suderinamumas, po procedūros nereikalinga imunosupresija. Donorais dažniausiai

pasirenkami jauni, sveiki asmenys, gali būti šeimos nariai, draugai ir kiti giminystėmis ar draugystėmis nesusiję asmenys. Svarbiausia donorą nuodugniai ištirti atliekant serologinį ir išmatų tyrimą dėl

užkrečiamų ligų (hepatitų A, B ir C, ŽIV, sifilio) bei kad jo išmatose nebūtų parazitų ar ligas galinčių sukelti bakterijų. [8, 31]. Žarnyno mikrobiotos transplantacijos efektyvumas, gydant antibiotikams atsparią Clostridium difficile infekciją, siekia 90 proc. [8].

9. TYRIMO METODIKA

9.1 Tyrimo atlikimo vieta

Mokslinis tiriamasis darbas buvo atliekamas 2017-2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje.

9.2 Tyrimo metodika

Siekiant įvertinti C. difficile dinamiką penkerių metų laikotarpiu (2013 – 2017 m. ), buvo atlikta retrospektyvinė pacientų mikrobiologinių tyrimo rezultatų duomenų analizė. Į tyrimą buvo įtraukti visi pacientai, kurie tiriamuoju laikotarpiu buvo tirti dėl C. difficile toksino.

9.2.1 Mėginių paruošimas ir C. difficile identifikavimas

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje C. difficile toksino A ir toksino B aptikimui išmatose, atliekamas vieno veiksmo imunochromatografinis testas – SIMPLE 2A – Bdiff/ STICK 2A – Bdiff. OPERON 2A-Bdiff chromatografinis imuninis tyrimas siūlo C. difficile toksino A (TcdA) ir toksino B (TcdB) kokybinio

aptikimo procedūrą dviejose skirtingose juostose. Teigiama bet kurio toksino juosta yra esamos C. difficile infekcijos (CDI) požymis, į kurį gydytojas turėtų atsižvelgti.

Pagal gamintojo rekomendacijas mėginių paruošimo protokolas: Šis testas yra skirtas skystų ar pusiau skystų žmogaus išmatų mėginių analizei. Kietus mėginius galima analizuoti, bet tai neįprasta, atsižvelgiant į tai, kad pagrindinis C.difficile infekcijos simptomas yra viduriavimas. Primygtinai rekomenduojma naudoti šviežius, neapdorotus mėginius; Jeigu juos reikia kiek palaikyti, laikoma šaldytuve (+2-8 °C) 1-2 dienas. Jeigu reikia laikyti ilgiau, užšaldoma -20°C temperatūroje, atsižvelgdami į tai, kad po šaldymo kai kurie mėginiai taps neigiami; Prieš pradedant analizuoti šaldytus mėginius, įsitikinama, kad jie pilnai atitirpo ir pasiekė kambario temperatūrą; Reikia vengti išmatų

mėginių šaldymo-atitirpimo ciklų, nes gali nukentėti toksinų vientisumas.

Išmatų mėginių paruošimo protokolas su Simple ir Stick formatais yra toks pats: 1. Jeigu išmatos skystos ar pusiau skystos, įlašinama 75 µl mėginio į pažymėtą 1,5 ml mikromėgintuvėlį. Jeigu naudojamas vienkartinės negraduotas pipetės (geltonas), įeinančias į rinkinį, paimama 3 mėgintuvėlio lašai. Jeigu išmatos kietos, paimama maždaug 75 mg (nedidelį maždaug 3 mm diametro rutuliuką) su mediniu aplikatoriumi ir įlašinama į pažymėtą 1,5 ml mikromėgintuvėlį. Svarbu: homogenizuojame mėginį ir paimame mėginio dalį mažiausiai iš trijų skirtingų vietų, kad išgautumėme iš mėginio kiek galima daugiau informacijos. 2. Įlašinama 1 ml mėginių skiediklio į ankstesnį 1,5 ml mikromėgintuvėlį su mėginiu (arba atitinkamą kiekį, kad išlaikytumėme 75 µl (ar 75 mg) mėginio kiekį 1 ml mėginių skiedimo buferio). 3. Kruopščiai sūkuriuojame mikromėgintuvėlį 30 sekundžių, kad užtikrintumėme pilną pakartotinę mėginio suspenciją buferyje. 5. 5 minutes centrifuguojame 1,5 ml mikromėgintuvėlius 700xg (maždaug 3000 apsukų/min.) nedidelėje centrifugoje, pritaikytoje tokio tipo mikromėgintuvėliams, kad nusėstų kietos dalelės. Jeigu nėra tinkamos centrifugos, 3-5 minutes reikia palaukti, kad kietos dalelės nusėstų į mėgintuvėlio dugną. Bet kokiu atveju optimalus testo veikimas išgaunamas turint skaidrų ištraukto mėginio tirpalą po centrifugavimo.

SIMPLE 2A – Bdiff procedūra: Po centrifugavimo paimama mėginio supernatantą su nauja vienkartine pipete ir įlašinama 4 lašus (ar 100 µl) į reakcijos įtaiso mėginio vietą (apvalų langelį pažymėtą rodykle; Lygiai 15 minučių palaukiama, perskaitomi ir interpretuojami rezultatai.

STICK 2A – Bdiff procedūra: Po centrifugavimo: 1) jei naudojamas į rinkinį įeinantis mėgintuvėlis paimama 265 µl (ketvirta žyma ant graduotos vienkartinės pipetės) mėginio supernatantą ir nusodinama mėgintuvėlyje; 2) jei naudojama 96 šulinėlių plokščiadugnę mikroplokštelę paimama maždaug 150 µl (trečia žyma ant graduotos vienkartinės pipetės) mėginio supernatanto šulinėliui; Įkišama juostelė į mėgintuvėlį (ant pastatyto laikiklio) arba į mikroplokštelės šulinėlį taip, kad rodyklės būtų nukreptos žemyn; Lygiai 15 minučių palaukiama, perskaitomi ir interpretuojami rezultatai.

9.2.2 Rezultatų pateikimas ir interpretavimas

Galima skirti tris skirtingas spalvotas juostas: Mėlyna juosta: tai kontrolinė juosta, rodanti, kad testas tiksliai veikia, viršutinė raudoja juosta: TcdB teigiamas mėginys ir apatinė raudoja juosta: TcdA teigiamas mėginys (4 pav.). Kontrolinė mėlyna juosta turi būti rodoma visada. Bet kokia papildoma raudona juosta, rodo, kad mėginyje yra C. diffcile, kurios išskiria į analizuojamą mėginį toksiną A ir/ar toksiną B.

4 pav. Galimų rezultatų pavyzdžiai

http://operon.es/wp-content/uploads/pdf/FIC-ENF-INF-GDH.2AB.pdf

Galimų rezultatų pavyzdžiai, kuriuose galima gauti su 2A-Bdiff testu (4 pav.):

1 juostelė: neigiamas rezultatas: mėginyje nėra C. difficile arba yra padermė, neišsirianti TcdA/TcdB. Reakcijos įtaiso viduriniame plotelyje pasirodo viena mėlyna linija (dirbant SIMPLE formatu, sulyginus su raide “C” ant kasetės). Ši juosta yra kontrolinė juosta ir turi visada atsirasti, nes tai rodo, kad chromotografija vyksta normaliai.

2-4 juostelės: teigiami rezultatai:

2 jusotelė. TcdA aptikimas: pasirodo mėlyna juosta (kontrolė) ir po pat kontroline juosta - raudona juosta (dirbant SIMPLE formatu, sulyginus su žyma “T1” ant kasetės).

3 juostelė. TcdB aptikimas: pasirodo mėlyna juosta (kontrolė) ir po pat kontrolinė juosta – raudona juosta (dirbant SIMPLE formatu, sulyginus su žyma “T2” ant kasetės).

4 juostelė. TcdA ir TcdB aptikimas: pasirodo mėlyna juosta (kontrolė) ir dvi raudonos juostos (viena virš – TcdB ir kita po –TcdA kontrolinė juosta)

5 juostelė. Klaidingai teigiami arba klaidinai neigiami rezultatai: nepasirodanti mėlyna kontrolės juosta arba smarkiai pasikeitusi šios juostos mėlyna spalva (labai tamsiai mėlyna ar violetinė spalva), taip pat nebūdingos spalvos teigiamose juostose (skiriasi nuo raudonos). Apskirtai bet kokia spalvų kombinacija, besiskirianti nuo išvardintų su 1-4 juostelėmis, rodo testo veikimo anomaliją. Galimos tokios priežastys: Kai kurie reagentai buvo pažeisti arba baigėsi testo galiojimo laikas, mėginys

buvo paruoštas ne pagal naudojimo instrukcijas, mėginyje yra daug kraujo.

Bet kokia po 15 minučių atsirandanti testo linija dėl mėginio pobūdžio neturi diagnostinės vertės.

9.3 Statistinė duomenų analizė

Statistinė analizė atlikta SPSS (angl. Statistical Package for the Social Sciences) duomenų paketu (versija 22.0) ir Microsoft Excel programa.

10. REZULTATAI

10.1 Clostridium difficile infekcijos atvejai ir lemiantys veiksniai Belgijoje, Šiaurės

Italijoje ir Jungtinės Amerikos Valstijose

Nuo 2008 metų iki 2015 metų. C. Valencia ir kt. atliko tyrimus Belgijoje, kur analizavo CDI atvejų skačių 10000 pacientų per metus. Dažniausias CDI sergamumas buvo 2008 ir 2015 metais, tačiau iš publikuoto tyrimo pastebima, kad nuo 2008 iki 2015 metų išlieka stabiliai didelis CDI atvejų skaičius Belgijoje (2 lentelė).

2 lentelė. Clostridium difficile infekcijos atvejų dažnis Belgijoje 2008 – 2015 metais. [3]

Metai 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015

CDI dažnis 1,57 1,45 1,25 1,19 1,20 1,30 1,22 1,61

2015 m. daugiausia sergančių CDI pacientų buvo, kurių amžius 80 ir daugiau (n = 1291). Atvejų pasiskirstymas pagal amžių nuo 2008 m. iki 2015 m. mažai kuo skirėsi ir išliko toks pat, kaip nurodyta 3 lentelėje 2015 m. [3].

3 lentelė. Pacientų pasiskirstymas pagal amžių 2015 m. Belgijoje [3]

Amžiaus grupės Pasiskirstymas Pasiskirstymas proc.

0-2 39 1

3-64 720 26

65-79 749 27

80 ir daugiau 1291 46

20 proc. CDI atvejų nebuvo registruojami, kuriame ligoninės skyriuje pacientas gulėjo [3]. Tačiau pagal atliktus tyrimus 2015 metais daugiausia pacientų gulėjo terapiniame skyriuje (90 proc.), kuriems buvo nustatyta Clostridium difficile toksinai (4 lentelė). 60 proc. CDI atvejų, diagnozuota geriatrijos, intensyvios terapijos (ITS), onkohematologijos ir gastroenterologijos skyriuose [3]

4 lentelė. CDI atvejai pagal ligoninės skyrius [3]

Skyrius Pasiskirstymas Pasiskirstymas proc.

Terapinis 1289 90,4

ITS 128 9.0

Kiti skyriai 9 0,6

Nuo 2010 m. sausio mėn. iki 2015 m. gruodžio mėn. Šiaurės Italijoje Greta Roncarati ir kt. atliko tyrimus, kur analizavo CDI atvejų skačių 10000 pacientų per metus. Pacientams, kuriems buvo nustatyti Clostridium difficile infekcija, per pastaruosius metus skaičius siekė nuo 3,8/ 10000 pacientų per metus 2010 m. ir 2011 m. bei 2015 m. (mažiausia vertė) iki 4,0/ 10000 pacientų per metus (didžiausia vertė tyrimo laikotarpiu) (5 lentelė).

5 lentelė. Clostridium difficile infekcijos dažnis Šiaurės Italijoje 2010 – 2015 metais [2]

Metai CDI dažnis

2010 3,8 2011 3,8 2012 4,0 2013 3,5 2014 3,0 2015 3,8

6 lentelėje parodytas bendras CDI atvejų pasiskirstymas ligoninės skyriuose tyrimo laikotarpiu. Pastebime, daugiausia pacientų gulėjo terapiniame skyriuje (94 proc.), kuriems buvo nustatyta Clostridium difficile toksinai, o mažiausia vaikų skyriuje (0,1 proc.).

6 lentelė. CDI atvejai pagal ligoninės skyrius 2010 – 2015 metais [2]

Skyriai Pasiskirstymas Pasiskirstymas proc.

Terapinis 885 94

Chirurginis 39 4,1

ITS 17 1,8

Vaikų 1 0,1

Šiaurės Italijoje atlikus retrospektyvinį tyrimą (n = 101) dėl CDI išsivystymą lemiančių priežasčių, buvo nustatyta: 1) antibiotikų vartojimas 76,2 proc. (n = 77) ir skrandžio sulčių sekreciją

slopinantys vaistai (H2 blokatorių ir PSI) 12,9 proc. (n = 13) ir 77,2% (n = 78) (7 lentelė); 2) beveik visi pacientai iš 101 buvo vyresni nei 65 metų (96 proc.) (8 lentelė), o jų vidutinis amžius 82 metai. Sergančiųjų CDI 63 moterys (62 proc.) ir 38 vyrai (38 proc.) (5 pav.)

7 lentelė CDI atvejų pasiskirstymas pagal rizikos faktorius [2]

Vaistai Pasiskirstymas (n = 101) Pasiskirstymas proc.

Antibiotikai 77 76,2

H2 blokatorius 13 12,9

PSI 78 77,2

8 lentelė. CDI pacientų pasiskirstymas pagal amžių [2]

Amžiaus grupė Pasiskirstymas (n = 101) Pasiskirstymas proc.

> 65 metai 97 96%

5 pav. CDI pacientų pasiskirstymas pagal lytį [2]

Pagal Sveikatos priežiūros infekcijos draugijos duomenis (ang. HAIC), dešimtyje Jungtinės Amerikos Valstijose, iš jų 35 –iose apygardose, CDI atvejų skaičius paskutinį dešimtmetį sparčiai augo. Pastaraisiais metais nuo 2012 iki 2015 metų Clostridium difficile infekcijos susirgimų dažnis 10000 pacientų per metus, šiose šalyse išliko stabiliai aukštas (9 lentelė).

38 proc. (n = 38) 62 proc

(n = 63)

9 lentelė. Clostridium difficile infekcijos atvejų dažniai JAV (dešimtyje valstyjų 35 –iose apygardose) 2012 – 2015 metais [7]

Metai Pasiskirstymas

2012 14,5

2013 14,1

2014 14,1

2015 14,8

Nuo 2012 iki 2015 metų daugiausia sergančių CDI buvo, kurių amžius ≥ 65 metai, o mažiausia, kurių amžius nuo 1 iki 17 metų (10 lentelė).

10 lentelė. CDI atvejų dažnis pagal amžiaus grupę [7]

Amžiaus grupės 2012 m. 2013 m. 2014 m. 2015 m.

1- 17 2,3 2,6 3,0 3,1

18 – 44 5,4 5,6 5,9 6,7

45 - 64 15,3 15,1 15,6 16,5

≥ 65 66,4 60,0 56,2 55,9

Jungtinės Amerikos Valstijose nuo 2012 – 2015 metų, CDI dažniau sirgo moterys nei vyrai (11 lentelė).

11 lentelė. CDI atvejų dažnis pagal lytį

Metai Moterys Vyrai

2012 16,8 12,1

2013 16,4 11,8

2014 16,3 11,8

10.2 Clostridium difficile toksino nustatymo dažnis Lietuvoje 2013 – 2017 metais

Atlikus retrospektyvinį tyrimą Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų

laboratorinės medicinos klinikoj buvo nustatyta, kad 2013 metais 427 pacientams buvo atliktas C. difficile toksino nutatymo tyrimas, iš jų buvo rasta 7 pacientams (1,6 proc.) (7 pav.).

7 pav. 2013 m. CD toksino nustatymo analizė

2014 metais 550 pacientams ir 2015 metais 931 pacientams buvo atliktas C. difficile toksino nutatymo tyrimas, iš jų buvo rasta atitinkamai 35 pacientams (6,4 proc.) (8 pav.) ir 122 pacientams (13,1 proc.) (9 pav.).

8 pav. 2014 m. CD toksino nustatymo analizė

427 7 Tirta Rasta Tirta Rasta 550 35 Tirta Rasta Tirta Rasta

9 pav. 2015 m. CD toksino nustatymo analizė

Bei 2016 metais 1244 pacientams ir 2017 metais 1163 pacientams buvo atliktas C. difficile toksino nutatymo tyrimas, iš jų buvo rasta atitinkamai 160 (12,8 proc.) (10 pav.) ir 137 pacientams (11,8 proc.) (11 pav.)

10 pav 2016 m. CD toksino nustatymo analizė

931 122 Tirta Rasta Tirta Rasta 1244 160 Tirta Rasta Tirta Rasta

11 pav. 2017 m CD toksino nustatymo analizė

Atlikus retrospektyvinį tyrimą Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų laboratorinės medicinos klinikoj, nuo 2013 iki 2017 metų 461 pacientams buvo nustatytas Clostridium difficile A ir/arba B toksinai. Nustatyta, kad sergančių CDI skaičius nuo 2013 m. (1%) iki 2017 m. (30 proc.) sparčiai auga. Nors 2017 metais susirgusių pacientų skaičius sumažėjo, palyginus su 2016 m. (35 proc.), tačiau išliko stabiliai aukštas CDI atvejų skaičius (12 pav.).

12 pav. Clostridium difficile toksino nustatymo dažnis 2013 – 2017 metais.

Nuo 2013 iki 2017 metų sirgusiųjų CDI sudarė 241 moterys (52 proc.) ir 220 vyrų (48 proc.) (13 pav.) 1163 137 Tirta Rasta Tirta Rasta 1 proc. (n = 7) 8 proc. (n = 35) 26 proc. (n = 122) 35 proc. (n = 160) 30 proc. (n = 137) 2013 m. 2014 m. 2015 m. 2016 m. 2017 m.

13 pav. Pacientų pasiskirstymas pagal lytį

10.2.1 C. difficile galimų pokyčių pagrindinės priežastys 2017 metais

Atlikus tyrimą nustatėme, kad 2017 m. sergančių CDI pacientų, statistiškai reikšmingai (p < 0,05) daugiau buvo nustatytas Clostridium difficile A ir/arba B toksinas, kurių amžius ≥65 metai

(66 proc.), o mažiausiai – vaikams iki 18 metų (3 proc.) (14 pav.). Jauniausiam pacientui buvo 2017 metais gimęs kūdikis., vyriausiam – 97 metų.

14 pav. Pacientų pasiskirstymas pagal amžių 2017 metais. 52 proc. (n = 241) 48 proc. (n = 220) Moterys Vyrai 3 proc. (n = 5) 31 proc. (n = 42) 66 proc. (n = 90) iki 18 m. 19 - 64 m. > 65

Atlikus tyrimą buvo nustatyta, kad 2017 metais CDI išsivystymui, statistiškai reikšmingai daugiausia įtakos turėjo pacientams, kurie gydėsi terapiniame skyriuje (82 proc.) nei intensyvios terapijos (ITS) (4 proc.) ir vaikų skyriuose (4 proc.) (p < 0,05) (15 pav.)

15 pav. Pacientų pasiskirstymas pagal tai kuriame ligoninės skyriuje gydėsi, nustatčius Clostridium difficile A ir/arba B toksinus 2017 metais

Išanalizavus mūsų rezultatus, pacientams, kuriems buvo nustayta Clostridium difficile A ir/arba B toksinai, iki susirgimo vartojo antibiotikus 44 pacientai (32 proc.), o nevartojo 93 pacientai (68 proc.) (16 pav.).

16 pav. Galimai pagrindinis rizikos veiksnys – antibakterinis preparatas, susiję su CDI vystymu 2017 metais

Dažniausiai tiriamųjų grupėje buvo nustatyti antibiotikai cefuroksimas, ciprofloksacinas, meropenemas, metronidazolis ir vankomicinas (atitinkamai 34,6 proc., 11,5 proc., 7,7 proc., 7,7 proc. ir

82 proc (n = 113). 10 proc. ( n = 14) 4 proc. (n = 5) 4 proc. (n = 5) Terapinis Chirurginis ITS Vaikų Negavo 68 proc. (n = 93) Gavo 32 proc. (n = 44)

7,7 proc.) (12 lentelė). Bent vieną antibiotiką vartojo 36 pacientai (81,8 proc.), du antibiotikus 6 pacientai (13,6 proc.), tris – 2 pacientai (4,6 proc.).

12 lentelė. Sirgusiųjų CDI skirstinys pagal vartotą antibakterinį preparatą 2017 metais

Vartotas antibiotikas Pasiskirstymas Pasiskirstymas proc.

Meropenemas 4 7,7 Cefuroksimas 18 34,6 Metronidazolis 4 7,7 Piperac./tazobakt. 3 5,8 Ciprofloksacinas 6 11,5 Ampicilinas 3 5,8 Ceftazidimas 3 5,8 Cefazolinas 1 1,9 Gentamicinas 1 1,9 Vankomicinas 4 7,7 Nitrofurantoinas 2 3,8 Klindamicinas 1 1,9 Klaritromicinas 1 1,9 Sultamicilinas 1 1,9

Atlikus tyrmą, 2017 metais CDI išsivystimui labiausiai įtakos turėjo antibiotikų vartojimas ITS skyriuje lyginant su chirurginiame skyriuje gydomais pacientais (atitinkamai 80 proc. (n = 4) pacientų ir 14,3 proc. (n = 2) pacientų) (17 pav.).

17 pav. Sirgusiųjų CDI paskirstymas pagal antibiotikų vartojimą ligoninės skyriuose gydomus pacientus 2017 metais 31.90% 14.30% 80% 40% Terapinis Chirurginis ITS Vaikų Gavo

11. REZULTATŲ APTARIMAS

Šiame tyrime buvo analizuojami 4315 pacientai iš kurių 461 pacientams buvo rastas Clostridium difficile A ir/arba B toksinas, sukėlęs CDI 2013 – 2017 metais, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninėje Kauno klinikose. Atlikus retrospektyvinį tyrimą, Clostridium difficile toksino dinamika paskutinius penkis metus sparčiai augo. O pastaraisiais metais Clostridium difficile infekcijos susirgimų skaičius LSMU KK išliko stabiliai aukštas. Remiantis mūsų atliktas tyrimai tiriamųjų grupę sirgusiųjų CDI imtį sudarė 241 moterys (52 proc.) ir 220 vyrai (48 proc.). Palyginus pacientų pasiskirstymą pagal lytį, buvo nustatyta, kad moterų serga nežymiai daugiau nei vyrų, šie rezultatai panašūs į Warren N Fawley ir kt. 2016 m. publikuotame tyrime skelbiamus rezultatus. Tai pat mūsų tyrime buvo analizuojamos galimos priežastys, sukėlusios CDI atvejų padidėjimą. Šiam tyrimui buvo pasirinktas 2017 metų laikotarpis. Taigi pagrindinės priežastys galimai sukėlusios CDI pokyčius sutapo su Daniel Freedberg, MD, MS ir kt. 2016 m. publikuotame tyrime pateiktomis priežastimis. Tai būtų amžius, antibiotikų vartojimas ir hospitalizacija. Ko pasekoje, atlikus tyrimus, nustatėme: 1) Kad dažniausiai CDI serga vyreni nei ≥ 65 metų žmonės; 2) Daugiausia sergančių CDI pacientų gulėjo terapiniame skyriuje (82,5 proc.) iš jų daugiau nei pusę bendrai (52,3 proc.) - Nefrologijos ir Gastroenterologijos skyriuose. Tai galėjo turėti įtakos CDI išsivystimui: a) hospitalizacija, tai yra galimas tiesioginis ir netiesioginis kontaktas su sergančiuoju ar nešiotoju; b) inkstų nepakankamumas; c) skrandžio sulčių sekreciją slopinantys vaistai. ( H2 blokatorių ir PSI) d) antibiotikai; 3) Pirmą kartą, 1998 metais buvo atliktas tyrimas ir nustatyta jog CDI rizika padidėja 6 kartus nei asmenims, kuriems nebuvo skirtas antimikrobinis gydymas [27]. Taigi mūsų tyrime nustatyta, kad 32 proc. pacientų, kurie sirgo CDI, prieš tai vartojo antimikrobinį preparatą. Reikia pastebėti, mūsų tyrimo rezultatai dėl antibiotikų ir kitų vaistų vartojimo nėra pakankamai tikslūs, dėl informacijos pateikimo trūkumo. O C. difficile toksinas dažniausiai buvo nustatytas pacientams, kurių gydymui buvo skirta cefuroksimo ir ciprofloksacino, kaip ir Aubrey Balch ir kt. 2017 m. publikuotame tyrime. Nors C. difficile toksinas dažniausiai buvo nustatytas terapiniame skyriuje (82 proc.) atitinkamai vartojo antibiotikus 31,9% pacientų, tačiau buvo dažniausias antibiotikų vartojimas buvo ITS (intensyvios terapijos skyriuje) gydomų pacientų tarpe. Panašiai nustatė ir Daniel E. Freedberg, MD, MS ir kt. 2016 m. publikuotame tyrime, kur daugiausia pacientų vartojusių antibiotikus gydėsi ITS.

Mūsų tyrime remiantis literatūros duomenimis Belgijoje, Šiaurės Italijoje ir Jungtinės Amerikos Valstijose (JAV) buvo analizuojama Clostridium difficile infekcijos atvejų skaičiai keletos metų eigoje. Iš publikuotų tyrimų pastebime, kad pastaraisiais metais Clostridium difficile infekcijos susirgimų skaičius šiose šalyse nesumažėjo, o išliko stabiliai aukštas. O daugiausia sergančių CDI buvo nustatyta Jungtinės Amerikos Valstijose, kai didžiausia vertė tyrimo laikotarpiu buvo 14,8/10000

pacientų per metus lyginant su Belgija ir Šiaurės Italija atitinkamai 1,61/10000 ir 4,0/10000 pacientų per metus. Tai pat remiantis literatūros duomenimis, pastebime, jog daugiausia sergančių CDI yra kurių amžius ≥65 metai, o mažiausia vaikai iki 18 metų, kaip ir mūsų atliktame tyrime Kauno klinikose. Lietuvoje (LSMU KK), Belgijoje ir Šiaurės Italijoje daugiausia CDI išsivystimui turėjo pacientams, kurie gydėsi terapiniame skyriuje, o tai įtakoti tai pat, kai pastarąjį kartą minėjau, galėjo hospitalizacija, gretutinės ligos, skrandžio sulčių sekreciją slopinantys vaistai (H2 blokatorių ir PSI) (Šiaurės Italijoje atitinkamai 13 proc. ir 78 proc.) bei antibiotikai. Nors LSMU duomenys ne visai tikslūs dėl informacijos pateikimo trūkumo, tačiau antibiotikai labai prisideda prie CDI išsivystymo ypač Šiaurės Italijoje (76,2 proc.). O Šiaurės Italijoje ir JAV daugiausia sergančiųjų CDI sudarė moterys.

12. IŠVADOS

1. Remiantis literatūros duomenimis Clostridium difficile infekcijos dinamika paskutinį dešimtmetį sparčiai augo. Pastaraisiais metais Clostridium difficile infekcijos susirgimų skaičius šiose šalyse išliko stabiliai aukštas.

2. Nors didžiausias nustatytas antibiotikų vartojimas buvo Kauno klinikų Intensyvios terapijos skyriaus gydomų pacientų tarpe, tačiau C. difficile toksinas dažniausiai buvo nustatytas terapiniame skyriuje (dažniausiai Nefrologijos ir Gastroenterologijos skyriuose) gydytiems pacientams.

3. Kauno klinikose C. difficile toksinas dažniausiai buvo nustatytas pacientams, kurių gydymui buvo skirta cefuroksimo ir ciprofloksacino.

13. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Cohen SH, Gerding DN, Johnson S, Kelly CP, Loo VG, McDonald LC ir kt. Clinical Practice Guidelines for Clostridium difficile infection in Adults: 2010 Update by the Society of Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA). Infect Control Hosp Epidemiol.2010; 31(5):431-55.

2. Greta Roncarati, Laura Dallolio, Erica Leoni, Manuela Panico, Angela Zanni and Patrizia Farruggia. Surveillance of Clostridium difficile Infections: Results from a Six-Year Retrospective Study in Nine Hospitals of a North Italian Local Health Authority. Int J Environ Res Public Health. 2017 Jan; 14(1): 61.

3. C. Valencia, M.L. Lambert. Epidemiology of Clostridium difficile infection in Belgium. OD Public Health and Surveillance July 2016; 2506-9187.

4. Matteo Bassetti, Giovanni Villa, Davide Pecori, Alessandra Arzese, Mark Wilcox. Epidemiology, Diagnosis and Treatment of Clostridium Difficile Infection. Expert Rev Anti Infect Ther. 2012;10(12):1405-23.

5. Khalid M. Aljarallah. Conventional and alternative treatment approaches for Clostridium difficile infection. Int J Health Sci (Qassim). 2017; 11(1): 1–10.

6. Latisha Heinlen, Jimmy D. Ballard. Clostridium difficile Infection. Am J Med Sci. 2010 Sep; 340(3): 247–52.

7. Healthcare-Associated Infections Community Interface (HAIC). 2012 – 2015 Annual Report for the Emerging Infections Program for Clostridium difficile Infection. Prieiga internete:

https://www.cdc.gov/hai/eip/clostridium-difficile.html

8. Liubakka A, Vaughn BP. Clostridium difficile Infection and Fecal Microbiota Transplant. AACN advanced critical care. 2016; 27(3):324-37

9. Mehdi Goudarzi, Sima Sadat Seyedjavadi, Hossein Goudarzi, Elnaz Mehdizadeh Aghdam and Saeed Nazeri. Clostridium difficile Infection: Epidemiology, Pathogenesis, Risk Factors, and Therapeutic Options. Scientifica Volume 2014 (2014), Article ID 916826, 9 pages. Prieiga internete: https://www.hindawi.com/journals/scientifica/2014/916826/.

10. Catherine Eckert, Gabrielle Jones, Frédéric Barbut. Diagnosis of Clostridium Difficile Infection. Future Microbiol. 2013;8(12):1587-98.

11. Kelly CP, Kyne L. The host Immune response to Clostridium difficile. J Med Microbiol. 2011; 60(Pt 8):1070-9.

12. Ramsey M. Dallal, Brian G. Harbrecht, Arthur J. Boujoukas, Carl A. Sirio, Linda M. Farkas, Kenneth K. Lee ir kt. Fulminant Clostridium difficile: An Underappreciated and Increasing Cause of Death

and Complications. Ann Surg. 2002 Mar; 235(3): 363–72.

13. Daniel E Freedberg MD, MS; Hojjat Salmasian, MD, PhD; Bevin Cohen, MPH; Julian A. Abrams, MD, MS; Elaine L. Larson, RN, PhD. Receipt of Antibiotics in Hospitalized Patients and Risk for Clostridium difficile Infection in Subsequent Patients Who Occupy the Same Bed. JAMA Intern Med. 2016;176(12):1801-08

14. Rory N. Pruitt, D. Borden Lacy. Toward a structural understanding of Clostridium difficile toxins A and B. Front Cell Infect Microbiol. 2012; 2:28.

15. Reveles KR, Lawson KA, Mortensen EM, Pugh MJV, Koeller JM1, Argamany JR, ir kt. National epidemiology of initial and recurrent Clostridium difficile infection in the Veterans Health Administration from 2003 to 2014. PLoS One. 2017 Dec 7;12(12):e0189227.

16. Daryl D. DePestel, David M. Aronoff. Epidemiology of Clostridium difficile Infection. J Pharm Pract. 2013 Oct; 26(5): 464–75.

17. A. Le Monnier, J-R Zahar, F. Barbut. Update on Clostridium difficile infections. Med Mal Infect. 2014 Aug; 44(8): 354–65.

18. Daniel E. Voth, Jimmy D. Ballard. Clostridium difficile Toxins: Mechanism of Action and Role in Disease. Clin Microbiol Rev. 2005 Apr; 18(2): 247–63.

19. Lanis JM, Heinlen LD, James JA, Ballard JD. Clostridium difficile 027/BI/NAP1 encodes a hypertoxic and antigenically variable form of TcdB. PLoS Pathog. 2013;9(8):e1003523

20. Chang Ho Yeom, Min Mi Cho, Seong Kyu Baek, Ok Suk Bae. Risk Factors for the Development of Clostridium difficile-associated Colitis after Colorectal Cancer Surgery. J Korean Soc Coloproctology. 2010 Oct; 26(5): 329–33.

21. Velazquez-Gomez I, Rocha-Rodriguez R, Toro DH, Gutierrez-Nunez JJ, Gonzalez G, Saavedra S. A Severity Score for Clostridium difficile infection. Infect Dis Clin Pract. 2008; 16(6):376-8

22. Adrián Martínez-Meléndez, Adrián Camacho-Ortiz, Rayo Morfin-Otero, Héctor Jesús Maldonado-Garza, Licet Villarreal-Treviño, Elvira Garza-González. Current knowledge on the laboratory diagnosis of Clostridium difficile infection. World J Gastroenterol. 2017 Mar 7; 23(9): 1552–67. 23. John G. Bartlett, Dale N. Gerding; Clinical Recognition and Diagnosis of Clostridium difficile

Infection. Clinical Infectious Diseases, Volume 46, Issue Supplement_1, 15 January 2008, Pages S12–S18. Prieiga internete: https://doi.org/10.1086/521863

24. Tomefa E Asempa and David P Nicolau. Clostridium difficile infection in the elderly: an update on management. Clin Interv Aging. 2017; 12: 1799–809.

25. Evans CT, Safdar N. Current Trends in the Epidemiology and Outcomes of Clostridium difficile Infection. Clin Infect Dis. 2015 May 15;60 Suppl 2:S66-71.

26. Christoph Lübbert, Lisa Zimmermann, Julia Borchert, Bernd Hörner, Reinier Mutters, Arne C. Rodloff. Epidemiology and Recurrence Rates of Clostridium difficile Infections in Germany: A

Secondary Data Analysis. Infect Dis Ther. 2016 Dec; 5(4): 545–54.

27. Eze P, Balsells E, Kyaw MH, Nair H. Risk factors for Clostridium difficile infections – an overview of the evidence base and challenges in data synthesis. Journal of Global Health. 2017;7(1):010417. 28. Balch A, Wendelboe AM, Vesely SK, Bratzler DW. Antibiotic prophylaxis for surgical site infections

as a risk factor for infection with Clostridium difficile. 2017; PLoS ONE 12(6): e0179117.

29. Dong D, Zhang L, Chen X, Jiang C, Yu B, Wang X, et al. Antimicrobial susceptibility and resistance mechanisms of clinical Clostridium difficile from a Chinese tertiary hospital. Int J Antimicrob Agents. 2013; 41:80–4.

30. Norman KN, Scott HM, Harvey RB, Norby B, Hume ME. Comparison of antimicrobial susceptibility among Clostridium difficile isolated from an integrated human and swine population in Texas. Foodborne Pathog Dis. 2014; 11:257–64.

31. Christina M. Surawicz MD, Lawrence J. Brandt, MD, David G. Binion, MD, Ashwin N. Ananthakrishnan, MD, MPH, Scott R. Curry, MD, Peter H. Gilligan, PhD ir kt. Guidelines for Diagnosis, Treatment, and Prevention of Clostridium difficile Infections. Am J Gastroenterol 2013; 108:478–98;

Filename: Magistrinis darbas.docx

Folder: /Users/Loreta/Library/Containers/com.microsoft.Word/Data/Documents

Template: /Users/Loreta/Library/Group Containers/UBF8T346G9.Office/User

Content.localized/Templates.localized/Normal.dotm Title:

Subject:

Author: Microsoft Office User

Keywords: Comments:

Creation Date: 30/05/2018 19:39

Change Number: 5

Last Saved On: 30/05/2018 21:22

Last Saved By: Microsoft Office User

Total Editing Time: 31 Minutes

Last Printed On: 30/05/2018 21:49

As of Last Complete Printing Number of Pages: 41

Number of Words: 9 450 (approx.)