LAKTOBACILŲ PADERMIŲ ANTAGONISTINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAI

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARINĖS MAISTO SAUGOS PROGRAMA ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDRA

JOLANTA GIRDAUSKAITĖ

LAKTOBACILŲ PADERMIŲ ANTAGONISTINIŲ SAVYBIŲ

TYRIMAI

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: prof. dr. V. Oberauskas

2

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Laktobacilų padermių antagonistinių savybių tyrimai“.

1. Yra atliktas mano paties/pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

2013 m. gegužės 1 d. Jolanta Girdauskaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

2013 m. gegužės 1 d. Jolanta Girdauskaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

2013 m. gegužės 1 d. prof. dr. Vaidas Oberauskas

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

3

TURINYS

1.2 Pieno rūgšties bakterijos ... 15

1.2.1 Pieno rūgšties bakterijų nauda sveikatai – probiotikai... 17

1.2.2 Pieno rūgšties bakterijų panaudojimas pieno produktų gamyboje ... 20

1.2.2.1 Reikalavimai jogurto mikroorganizmų kultūroms ... 21

1.2.2.2 Reikalavimai probiotinėms mikroorganizmų kultūroms ... 22

1.3 Laktobacilos ... 23

1.3.1 Laktobacilų taksonomija ir filogenija ... 24

1.3.2 Probiotinių maisto produktų su laktobacilomis apžvalga ... 25

1.4 Antibakterinis pieno rūgšties bakterijų aktyvumas ... 26

1.4.1 Laktobacilų produkuojamos antibakterinės medžiagos ... 27

1.4.2 Bakteriocinai ... 29

1.4.2.1 Bakteriocinų klasifikacija ... 30

1.4.2.2 Bakteriocinų apžvalga ... 32

1.4.2.3 Bakteriocinų veikimo mechanizmas ... 35

1.4.2.4 Bakteriocinų stabilumas ... 36

1.5 Laktobacilų adhezinės savybės ... 36

1.6 Laktobacilų imunostimuliacinės savybės... 37

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 39

2.1 Tyrimų atlikimo laikas, vieta ir sąlygos ... 39

2.2 Laktobacilų išskyrimo metodika ... 40

2.3 Laktobacilų antagonistinių savybių nustatymo metodika ... 40

2.4 Laktobacilų atsparumo antibiotikams nustatymo metodika ... 42

2.5 Statistinė analizė ... 43

4

3.1 Laktobacilų antagonistinio aktyvumo rezultatai ... 44

3.2 Liofilizuotų 10 metų Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum antagonistinio aktyvumo palyginimo rezultatai ... 48

3.3 Laktobacilų jautrumo antibiotikams rezultatai ... 51

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 58

5. IŠVADOS ... 61

5

Laktobacilų padermių antagonistinių savybių tyrimai Jolanta Girdauskaitė

Magistro baigiamasis darbas

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. Veterinarijos akademija. Anatomijos ir fiziologijos katedra, Tilžės g. 18, LT - 47181, Kaunas, Lietuva, 2012-2013 metai.

Darbo vadovas: Prof. dr. V. Oberauskas

Darbą sudaro 72 lapai, penkios lentelės ir penkiolika paveikslų.

SANTRAUKA

Šio darbo tikslas – nustatyti skirtingų laktobacilų antagonistines savybes ir atsparumą antibiotikams.

Darbo tikslo įgyvendinimui iškelti sekantys uždaviniai:

1. Išgryninti jogurtuose esančias laktobacilas – Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus.

2. Ištirti laktobacilų Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum antagonistines savybes Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli ir Proteus mirabilis bakterijoms.

3. Ištirti laktobacilų Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum atsparumą antibiotikams. 4. Palyginti Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum antagonistines savybes prieš

liofilizaciją ir po liofilizacijos praėjus 10 metų.

Tirtos pienarūgščių mikroorganizmų Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum antagonistinis aktyvumas Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli ir Proteus mirabilis bakterijų atžvilgiu, bei atsparumas antibiotikams.

Atlikus tyrimus nustatyta, kad Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum kultūros pasižymi antagonistiniu

6

aktyvumu Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli ir Proteus mirabilis kultūrų atžvilgiu. Didžiausiu antagonistiniu aktyvumu pasižymi L. acidophilus kultūra, o mažiausiu L. bulgaricus. Lactobacillus acidophilus ir Lactobacillus plantarum pasižymi vidutiniu, o Lactobacillus bulgaricus mažu antagonistiniu aktyvumu visų tirtų kultūrų atžvilgiu. Lactobacillus rhamnosus pasižymi mažu antagonistiniu aktyvumu Salmonella enteritidis ir Enterococcus faecalis bakterijoms ir vidutiniu antagonistinu aktyvumu Staphylococcus aureus, Escherichia coli ir Proteus mirablis bakterijoms. Lactobacillus fermentum pasižymi vidutiniu antagonistiniu aktyvumu Salmonella enteritidis kultūros atžvilgiu, o Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Proteus mirablis bakterijoms nustatytas mažas antagonistinis aktyvumas. L. plantarum ir L. fermentum antagonistinis aktyvumas, lyginant iš karto po liofilizacijos ir išlaikius kultūras liofilizuotoje formoje 10 metų nepakito.

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum kultūros pasižymi atsparumu tirtų antibiotikų koncentracijoms – vankomicinui (VA30), gentamicinui (CN10), neomicinui (N30), eritromicinui (E15), oksitetraciklinui (T30), linkomicinui (MY2), kanamicinui (K30), ampicilinui (AM10), kolistinui (CT10), nitrofuranams (F300). Lactobacillus acidophilus kultūra atspari visų tirtų antibiotikų koncentracijoms.

Šios savybės yra svarbios atrenkant laktobacilų padermes probiotikų gamybai. Raktažodžiai: laktobacilos, antagonistinis aktyvumas, atsparumas antibiotikams.

7

Research of antagonistic characteristics in Lactobacillus strains Jolanta Girdauskaitė

The final Master‘s work

Lithuanian University of Health Sciences. Academy of Veterinary Science. Department of Anatomy and Physiology, Tilžės st. 18, LT - 47181, Kaunas, Lietuva, 2012-2013.

Work tutor: Prof. dr. V. Oberauskas

Work consists of 72 pages including 5 tables and 15 charts.

SUMMARY

The aim of this work is to identify antagonistic characteristics of different lactobacillus as well as notify the resistance to antibiotics.

In order for this work to succeed, the following tasks were adressed:

5. Purification the following lactobacillus in yogurts – Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus.

6. Examination the antagonistic characteristic of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum for bacteria Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli and Proteus mirabilis.

7. Examination of resistance to antibiotics of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum.

8. Comparison in antagonistic characteristics of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum before lyophilization and after 10 years of lyophilization.

The characteristics of the following lactic microorganisms have been examined: antagonistic activeness of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum in terms of resistance to antibiotics in Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli and Proteus mirabilis bacteria.

8

Performed examinations revealed that: Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum cultures can be distinguished by antagonistic activeness in terms of Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli and Proteus mirabilis cultures. The maximum antagonistic activeness was found in L. acidophillus culture and the minimum antagonistic activeness in L. bulgaricus. Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus plantarum were found to have the avarage antagonistic activeness though Lactobacillus bulgaricus had a minimum antagonistic activeness in terms of every single culture that was examined. Lactobacillus rhamnosus was determined to have little antagonistic activeness in terms of Salmonella enteritidis and Enterococcus faecalis and have an avarage antagonistic activeness for Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Proteus mirablis bacteria. Lactobacillus fermentum is determined by an avarage antagonistic activenessin terms of Salmonella enteritidis culture and Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Proteus mirablis bacteria were found to have little antagonistic activeness. L. plantarum and L. fermentum antagonistic activeness compared with after lyophilization state with maintained cultures in lyophilized form-10 of them have not changed.

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum cultures were distinguished of its resistance to antibiotics concentrations which were examined – vankomycin (VA30), gentamycin (CN10), neomycin (N30), erithromycin (E15), oxytetracycline (T30), lincomycin (MY2), kanamycin (K30), ampicillin (AM10), colistin (CT10), nitrofurantoin (F300). Lactobacillus acidophilus culture were distinguished of its resistance to antibiotics concentrations which were examined.

These characteristics are of great importance when selecting Lactobacillus strains for the production of probiotics.

9

SANTRUMPOS

B limfocitai– kraujo ląstelės, baltieji kraujo kūneliai C – anglis Ca – kalcis cm3– kubinis centimetras CO2 – anglies dioksidas Fe – geležis g – gramas H2O2 – vandenilio peroksidas IgA – Imunoglobulinas A K – kalis kDa – kilodaltonas

ksv – kolonijas sudarantys vienetai L (+), D (–) – izomero konfigūracija

log – atvirkštinė pagrindo kėlimo laipsniu funkcija M ląstelės – specializuotos epitelinės ląstelės MDP – muramildipeptidas

Mg – magnis mm – milimetras

MRS – De Man, Rogosa ir Sharpe mitybinė terpė

NADH – nikotinamido adenino dinukleotido hidrogenazė proc. – procentas

rRNA – ribosominė ribonukleino rūgštis subsp. – porūšis

10

ĮVADAS

Viena iš didžiausių problemų maisto pramonėje yra produktų užteršimas patogeniniais mikroorganizmais, kurie sukelia per maistą plintančias infekcijas. Per praėjusį dešimtmetį pasikartojantys diarėjos protrūkiai susiję su natūraliu sukėlėjų atsparumu, kas kelia didelį pavojų.

Antibiotikams atsparių bakterijų parinkimo problema ir vis didėjantis saugių maisto produktų su mažesniu cheminių priedų kiekiu poreikis sukėlė norą šias medžiagas pakeisti natūraliais maisto produktais, kurie nekenkia nei žmogui nei aplinkai. Šiuo metu maisto pramonės biotechnologija nukreipta į naudingų mikroorganizmų atranką ir jų produktų gamybą bei tobulinimą taip pat ir techninį jų pritaikymą gerinant maisto kokybę (Kapil, 2005).

Nepatogeninių mikroorganizmų ir jų metabolitų naudojimas maisto saugumui ir jo galiojimo laiko pailginimui apibrėžiamas kaip biokonservavimas (De Martinis et al, 2001). Antagonistinis pieno rūgšties bakterijų aktyvumas lemia jų saugų vartojimą fermentuotų maisto produktų gamyboje ir jų kaip biokonservantų naudojimą (Parada et al., 2007).

Šiuo metu antibiotikų naudojimas maiste ir pašaruose yra apribotas, o bakteriocinai yra įdomi biomolekulių grupė, turinti antimikrobinių savybių, todėl gali atstovauti kaip gera alternatyva maisto produktuose. Vis didėjantis susidomėjimas šiais junginiais paskatino naujų peptidų išskyrimą ir charakterizavimą (Deraz et al, 2005).

Daugiau kaip prieš šimtą metų gimusi idėja, jog žmogaus mityboje vartojamipienarūgščiai produktai, pirmiausia jogurtai, gali apsaugoti organizmą nuo senėjimo, priklausomikrobiologui I. I. Mečnikovui. Jo nuomone, žmogus gali gyventi ilgiau dėl antagonistiškaiaktyvių pienarūgščių mikroorganizmų, kurie eliminuoja iš žarnyno pūvimo mikroflorą ir neleidžiajos toksiškiems metabolitams patekti į kraują.

Amerikoje 1920–1922 metais terapiniais tikslais buvo pradėtos naudoti acidofilinės laktobacilos– probiotikų užuomazgos, tačiau labiau domėtis probiotikais pradėta tik daugiau kaip prieš tris dešimtmečius, kai dėl nesaikingo antibiotikų vartojimo pablogėjusi ekologinė padėtis sukėlė mikrobiocenozinius pažeidimus, paplito antibiotikams atsparios bakterijos (Šimkus, 2004).

Kyla klausimų, kaip dar galima kontroliuoti patogeninių bakterijų kiekį ir kaip užtikrinti gerą žarnyno mikroflorą. Dauguma žarnyno mikroorganizmų yra nepavojingi ir nesukelia ligų. Žarnyne nuolat vyksta įvairių rūšių mikroorganizmų konkurencija dėl vietos ir maistinių medžiagų, o nepavojingi mikroorganizmai ir patogeninės bakterijos pristabdo vieni kitų augimą ir dauginimasi.

11

Sutrikusi žarnyno mikrofloros būsena lemia patogeninių bakterijų persvaros atsiradimą. Patogeninių bakterijų kiekį žarnyne sumažina natūralūs probiotiniai preparatai.

Taigi probiotikų veikimo mechanizmo principas yra konkurencija dėl maisto medžiagų ir vietos virškinimo trakte. Epitelis pasidengia plonu naudingų bakterijų sluoksniu, kurios konkuruoja su patogeninėmis bakterijomis ir trukdo joms prisitvirtinti bei daugintis. Be to, probiotikai išlaisvina „imunines” ląsteles, kurios gali daugintis ir naikinti į žarnyną patenkančias patogenines bakterijas, absorbuodamos jų antigenus ir taip stiprindamos imuninę sistemą (Kepalienė ir kt., 2004).

Bakterijų rūšys, dažniausiai naudojamos kaip probiotikai, yra Lactobacillus ir Bifidobacterium. Dabar probiotikai beveik išskirtinai vartojami kaip fermentuoti pieno produktai, tokie kaip jogurtas ar šaldytos – džiovintos kultūros.

Lactobacillus gentyje yra daug rūšių, tačiau ne visos iš jų turi pakankamai naudingų savybių. Idealia probiotikų atmaina laikoma viena iš Lactobacillus rhamnosus padermių, išskirta bei nuodugniai ištirta mokslininkų Gorbach ir Goldin, kurių garbei pavadinta GG (Castagliuolo et al., 1999). Daugiau nei 30 Azijos, Europos, Lotynų Amerikos šalių Lactobacillus rhamnosus GG naudoja jogurtų, sūrių, sulčių ir kitų pieno produktų gamyboje. Antra laktobakterijų rūšis, tinkama probiotinių produktų gamybai, yra Lactobacillus acidophilus. Šios bakterijų atmainos yra išskirtos iš žmogaus organizmo, lengvai kolonizuoja žarnyną, adaptuojasi rūgščioje bei šarminėje terpėje. Jos lengvai prisitvirtina prie žarnyno gleivinės, ten dauginasi ir sumažina jų pralaidumą bei uždegiminių reakcijų intensyvumą (Castagliuolo et al., 1999).

Laktobacilos reikiamais kiekiais patekusios į organizmą stabdo žarnyne pavojingų bakterijų, tokių, kaip streptokokų, žarnyno lazdelės atskirų padermių, salmonelių, stafilokokų, pseudomonų, protėjų ir šigelų (dizenterijos sukėlėjų) veiklą, išskirdamos jas naikinančias medžiagas acidofoliną ir acidoliną. Be to, jos stipriai prilimpa prie žarnų sienelių, atimdamos gyvybinę erdvę ir maisto medžiagas iš jau minėtų ligas sukeliančių (patogeninių) bakterijų. Gyvam organizmui pavojingų bakterijų augimo slopinimas dar yra naudingas ir tuo, kad blogosios bakterijos žarnyne padeda susiformuoti nitrozaminams, kurios turi įtakos vėžio atsiradimui (Roberfroid, 1998).

Darbo tikslas buvo nustatyti skirtingų laktobacilų antagonistines savybes ir atsparumą antibiotikams.

Darbo tikslo įgyvendinimui iškelti sekantys uždaviniai:

1. Išgryninti jogurtuose esančias laktobacilas – Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus.

12

2. Ištirti laktobacilų Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum antagonistines savybes Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli ir Proteus mirabilis bakterijoms.

3. Ištirti laktobacilų Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum atsparumą antibiotikams. 4. Palyginti Lactobacillus plantarum ir Lactobacillus fermentum antagonistines savybes prieš

13

1. LITERATŪROS APŽVALGA

Jogurtas – daugelyje pasaulio šalių populiarus produktas. Balkanų ir Viduržemio jūros regiono šalyse žinomas nuo Antikos laikų. Palyginti neseniai apie jį išgirdome ir pamėgome kaip puikų maistingą desertą, tačiau yra tautų, kurios jogurtą vartoja nuo senovės ir net neįsivaizduoja maisto gaminimo be šio pieno produkto. Tūkstančius metų gyvulių augintojų tautos, gyvenančios nederlingose žemėse, vartojo pieną, kaip lengviausiai prieinamą vertingų baltymų ir kitų maistingųjų medžiagų šaltinį, tačiau pienas yra greitai gendantis produktas, todėl Artimųjų Rytų ir Balkanų kraštuose šeimininkės kone kasdien ką tik pamelžtą karvių, avių, buivolų ir ožkų pieną supildavo į molinius indus ir raugindavo, o iš jo ruošdavo įvairiausius valgius. Tik pačioje XIX a. pabaigoje mokslininkai atkreipė dėmesį, kad kalnų gyventojai, valgantys daug jogurto, iki senatvės išlieka sveiki ir darbingi. Tuomet ir imta domėtis gydomosiomis jogurto savybėmis. Mokslininkai tyrė, kas sukelia jogurtui būdingą pieno fermentaciją, kol nustatė, kad pieną suraugina bakterija, kurią pavadino Lactobacillus bulgaricus. Todėl neretai jogurtas vadinamas bulgariškuoju pienu (Masteikienė, 2006).

Įvairiose šalyse gaminamas jogurtas skiriasi ne tik pavadinimu, bet ir skoniu, konsistencija, bei aromatu. Pasaulinė jogurto gamyba nuolat didėja. Per pastarąjį dešimtmetį šio produkto suvartojimas kai kuriose Europos šalyse (Olandijoje, Belgijoje, Vokietijoje) išaugo daugiau kaip 50 proc. Jogurto populiarumą lemia daug veiksnių: didelis patraukliai įpakuotų produktų asortimentas, ilgesnis nei šviežio geriamojo pieno išsilaikymas, vartotojų išprusimas ir gebėjimas pasirinkti vertingesnius produktus.

Tradiciškai jogurto gamybai yra naudojama termofilinių pienarūgščių kokų (Streptococcus thermophilus) ir bulgarų lazdelių (Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus) raugas. Daugeliu atvejų lazdelių ir streptokokų santykis jogurte yra 1:1 ar 1:2, tačiau ir kiti santykiai (nuo 1:3 iki 1:6 ar net 1:10) laikomi optimaliais. Rauginimas vyksta 40-43oC temperatūroje, įpylus 1-5 proc. raugo (106-107 ląstelių/cm3

) ar 0,02 proc. sausojo koncentrato. Rauginimas trunka 2,5-5 valandas. Po rauginimo (75-85oT) jogurtas atšaldomas iki 6-8oC temperatūros. Rūgimo pradžioje intensyviau auga pienarūgščiai streptokokai, kurie pradeda glikolizę.Tuo tarpu lazdelės vystosi lėčiau ir mikroskopiniame preparate aptinkamos po kelių rūgimo valandų.Vėliau lazdelės pradeda greitai daugintis, skatinamos streptokokų veiklos produktų (formiato, piruvato, anglies dioksido), aktyvėja glikolizė ir aromatinių medžiagų

14

gamyba (pieno rūgšties, acetaldehido, anglies dioksido, baltymų skilimo produktų). Bulgarinių lazdelių išskiriamos aminorūgštys (histidinas, valinas) skatina streptokokų augimą (Masteikienė, 2006).

Jogurto skoniui ir konsistencijai didelę įtaką daro raugo bakterijų savybės ir jų tarpusavio santykis.Jei rauge vyrauja streptokokai, jogurtas buna mažiau rūgštus, jei bulgarinės lazdelės – rūgštesnis. Reikšmės turi ir rauginimo temperatūra. Rauginant 40o_{C temperatūroje yra aktyvesni}

streptokokai (jų optimali augimo temperatūra– 39oC), o 43oC temperatūroje – bulgarinės lazdelės (jų optimali augimo temperatūra – 45oC). Nuo šių bakterijų santykio, glikolitinio ir proteolitinio aktyvumo taip pat priklauso ir aromatinių medžiagų bei antibiotikų susidarymas.

Jogurto rauginimo trukmė turi būti tokia, kad proceso pabaigoje būtų susidariusi gera sutrauka, susiformavęs pakankamas jogurto aromatas, tačiau nekiltų perrūgimo ir išrūgų atsiskyrimo pavojus. Rauginimo pabaigą geriausia nustatyti pagal pH vertę. Rauginimą geriausia nutraukti pasiekus kazeino izoelektrinį tašką, kai pH 4,7-4,6. Raugo bakterijų rūgimo pabaigoje padaugėja iki 108 ląstelių/cm3

jogurto.Vertingos raugo bakterijos lieka gyvybingos, jei po surauginimo jogurtai yra nepasterizuojami.

Jogurto gamybai naudojami ir pieno ar išrūgų milteliai, sutirštinatas pienas, sutirštintos išrūgos, išrūgų baltymai, pasterizuota grietinėlė, baltymų koncentratai. Priklausomai nuo receptūros, į jogurtą gali būti dedama įvairių aromatinių ir skoninių priedų: vaisių, uogų, daržovių, grūdų produktų, medaus, šokolado, kakavos, kavos, riešutų, prieskonių.

Lietuvoje jogurtas gaminamas įvairaus riebumo, natūralus ir su priedais: cukrumi, vaisiais, uogomis, šokoladu, karamele, riešutais, vitaminais.

Iš to paties pieno galima pagaminti įvairių rūšių jogurtą. Jogurtai gali būti: skysti ir tiršti, natūralūs ir su priedais, riebūs ir liesi, termiškai apdoroti ir neapdoroti termiškai. Pagal techninius reikalavimus jogurtas gali būti:

 liesas;

 termiškai apdorotas liesas;  liesas su priedais;

 termiškai apdorotas liesas su priedais;  2,5 proc. riebumo;

 termiškai apdorotas 2,5 proc. riebumo;  2,5 proc. riebumo su priedais;

 termiškai apdorotas 2,5 proc. riebumo su priedais;  2,5 proc. riebumo su priedais geriamasis;

15

 termiškai apdorotas 2,5 proc. riebumo su priedais geriamasis;  termiškai apdorotas 7 proc. riebuno su priedais.

Skysti jogurtai yra gaminami iš nesutirštinto pieno, o tiršti iš pieno, kuris, prieš dedant bakterijų, sutirštinamas pieno milteliais bei krakmolu. Tokie jogurtai būna kremo tirštumo, paprastai maistingesni už skystus, nes juose yra daugiau baltymų. Natūralūs jogurtai yra gaminami iš gryno pieno. Jie būna rūgštoki bei gaivaus skonio. Jogurtuose su priedais yra daugiau cukraus, jie kaloringesni.

Pagal tai, kokiais mikroorganizmais buvo rauginami, jogurtai skirstomi į gyvuosius ir desertinius, tradicinius ir naujos kartos jogurtus. Be tradicinių rūšių jogurto, gaminamas biologiškai vertingesnis jogurtas, su probiotinėmis mikroorganizmų kultūromis. Dažniausiai, be tradicinių kultūrų, kaip probiotinės kultūros naudojamos acidofilinės lazdelės ir bifidobakterijos. Ant tokio jogurto indelio dažniausiai būna užrašas: „biojogurtas‟ arba „jogurtas su gyvosiomis bakterijomis‟. Desertiniai jogurtai paprastai po fermentacijos būna pasterizuojami ir sterilizuojami, todėl juose esančios bakterijos žūva. Termiškai apdorotus jogurtus galima laikyti šaldytuve keletą mėnesių, tačiau jie nėra tokie vertingi kaip gyvieji. Gyvieji jogurtai daug vertingesni, nes jie rauginami gyvosiomis bakterijomis ir neapdorojami termiškai. Tokie produktai, kurie turi daug gyvybingų pienarūgščių, probiotinių bakterijų, teigiamai veikia žarnyno mikrobiotą, atkuria pažeistą mikroorganizmų balansą, stabdo puvimo ir patogeninių bakterijų žarnyne dauginimąsi (Masteikienė, 2006).

1.2 Pieno rūgšties bakterijos

Žmogaus ir gyvūnų virškinimo trakte yra labai daug skirtingų mikroorganizmų, kurių dauguma priklauso griežtai fakultatyviniams anaerobams. Viena svarbiausių jossudėtinių dalių yra pieno rūgšties bakterijos, kurios vyrauja visame virškinimo trakto plote: nuo burnos ertmės iki tiesiosios žarnos. Daug darbų nagrinėja jų biologines savybes, taip pat plačiai tiriama ir jų biocheminė veikla. Toks didelis mokslininkų skiriamas dėmesys šiai mikroorganizmų grupei aiškinamas tuo, kad pieno rūgšties bakterijos labai svarbios įvairiose gyvenimo srityse. Praktinis pieno rūgšties bakterijų pritaikymas žinomas nuo senų laikų. Pieno rūgšties produktus nudegimams ir žaizdoms gydyti bei skrandžio – žarnyno ligų gydymui ir profilaktikai nuo seno vartoja daugelis tautų (Jankauskienė, 1996).

Pienarūgštės bakterijos yra gram-teigiamos, nuo kokų iki lazdelių formos, anaerobinės, bet toleruojančios deguonį, iš angliavandenių gaminančios energiją ir pieno rūgštį bakterijos. Jos nesudaro sporų, pasižymi neigiama katalazės reakcija, gamina pieno rūgštį ir sukelia rūgimą (Parada et al., 2007; Line et al., 2008).

16

Pieno rūgšties bakterijoms priklauso nemažai bakterijų rūšių, kurios priskiriamos Firmicutes tipui. Jų sistematika nėra baigta, nes sunkumų atsiranda, auginant skirtingas jau žinomas padermes ant skirtingų terpių ir skirtingomis sąlygomis, keičiasi daugelis jų savybių (Line et al., 2008).

Pagrindinės pieno rūgšties bakterijų gentys yra šios: Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus,Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus ir Weissella (Parada et al., 2007). Kitos gentys: Aerococcus, Microbacterium, Propionibacterium ir Bifidobacterium (Carr et al, 2002).

Pagrindinė savybė, kuria remiantis pieno rūgšties bakterijos yra jungiamos į atskirą mikroorganizmų grupę, yra jų gebėjimas kaip pagrindinį fermentacijos produktą gaminti pieno

rūgštį. Pieno rūgštį produkuoja visos gram-teigiamos bakterijos, išskyrus kelis Actinobacteria tipo atstovus: Microbacterium, Aerococcus, Propionibacterium, Bifidobacterium (Beasley, 2004). Pieno rūgštį gaminančios bakterijos apima tokias rūšis, kaip Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. rhamnosus, L. delbrueckii bulgaricus, L. fermentum, L. reuteri, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis cremoris, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. adolecentis, B. longum, B. breve, Enterococcus feacalis, Enterococcus feacium, Streptococcus cricetus, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus ir kitas (Parada et al., 2007; Line et al., 2008).

Priklausomai nuo organizmo skiriasi metaboliniai keliai. Kai gliukozė yra pagrindinis anglies (C) šaltinis, heterofermentinės bakterijos (Leuconostoc ir Weissella) transformuoja gliukozės molekulę į etanolį, laktatą, anglies dioksidą ir pagamina iki 50 proc. pieno rūgšties, tuo tarpu homofermentinės bakterijos (Lactobacillus, Streptococcus) pagamina du laktatus iš vienos gliukozės molekulės (iki 90 proc. pieno rūgšties) (Parada et al., 2007).

Pieno rūgšties bakterijos pirmą kartą buvo išskirtos iš pieno ir nuo tada buvo rastos daugybėje fermentuotų maisto produktų: pieno produktuose, mėsoje, daržovėse, gėrimuose, duonoje. Jų randama ir natūraliai fermentuotame maiste, taip pat gausu aplinkoje: vandenyje, mėšle, nuotekose, gyvūnuose bei žmonėse. Pieno rūgšties bakterijos, vystantis mokslui, nagrinėjamos vis nuodugniau. Jos yra vienas iš genų inžinerijos objektų. Tiriama jų ląstelių morfologija, laktobacilų teicho rūgštys, kurios su peptidogliukanais turi poveikį organizmo imuninei sistemai. Jos stabdo patogeninių mikroorganizmų, sukeliančių ligas ir gadinančių maisto produktus vystymąsi, taip gerindamos maisto produktų kokybę ir ilgindamos jų vartojimo terminą (Parada et al., 2007).

Keletas padermių yra burnos mikrofloros dalis ir gali būti dantų karieso atsiradimo priežastimi. Pieno rūgšties bakterijos taip pat gali sugadinti maisto produktus (duona, žuvis, mėsa, gėrimai), ar gali

17

būti naudojamos kaip skoninės ir tekstūrinės medžiagos bei konservantai. Dalis pieno rūgšties bakterijų (Lactobacillus lactis ir Streptococcus thermophilus) inhibuoja maisto produktų gedimą ir patogenines bakterijas bei ilgiau išsaugo žalių maisto produktų kokybę. Konservavimo savybėmis pasižyminčių pieno rūgšties bakterijų metabolitų naudojimas pakuojant maisto produktus pastaruoju metu plačiai aptariamas. Pieno rūgšties bakterijos taip pat labai svarbios apdorojant gyvūnų pašarus. Antimikrobinis poveikis labiausiai priklauso nuo pieno ir organinių rūgščių produkcijos, kuri sukelia vidinės terpės pH sumažėjimą. Žemas pH bei rūgštys padidina lipidų tirpumą ir difuziją per ląstelių membraną į citoplazmą. Jos taip pat produkuoja vandenilio peroksidą, diacetilą, acetaldehidą, polisacharidus ir bakteriocinus, iš kurių dalis gali veikti antimikrobiškai (Moreno et al, 2006).

Pieno rūgšties bakterijos pagal lokalizaciją skirstomos į sienelės ir turinio, o pagal prisitvirtinimą – į normaliąją ir tranzitinę mikroflorą. Sienelės mikroflora yra išsidėsčiusi šalia epitelinių gleivinės ląstelių arba yra glaudžiai asocijuota tiesiogiai su gleivinės epitelinėmis ląstelėmis. Ji daugiausiai formuojasi iš mikroorganizmų, įeinančių į sienelės sudėtį ir patenkančių į organus iš išorinės terpės arba kitų organų. Sienelės mikroflorą daugiausiai sudaro normalioji mikroflora, kurios viena svarbiausių dalių yra Lactobacillus, o turinyje yra ir normaliosios ir tranzitinės mikrofloros. Ši sienelės mikrofloros dalis yra svarbi, nes lemia organizmo apsaugines funkcijas (formuoja ekologinį barjerą, kuris ir yra vienas iš rezisentiškumo faktorių (Beasly, 2004).

Dalis pieno rūgšties bakterijų gamina antagonistines medžiagas – bakteriocinus, kurie net ir mažais kiekiais yra labai aktyvūs prieš patogenus (Moreno et al, 2006).

Sveiko žmogaus laktoflorą sudaro įvairių rūšių homo ir heterofermentinės laktobacilos, tačiau dažniausiai sutinkamos šešios rūšys: L. acidophillus, L. fermentum, L. casei, L. plantarum, L.brevis ir L. salivarius (Jankauskienė, 1996).

1.2.1 Pieno rūgšties bakterijų nauda sveikatai – probiotikai

Probiotikai, pagal Pasaulio sveikatos organizacijos 2001 metų apibrėžimą, – tai gyvi mikroorganizmai ar jų komponentai, kurie vartojami tinkamais kiekiais, yra naudingi žmogaus sveikatai. Tai mikrobinis maisto papildas, kurio pagrindinė paskirtis yra atkurti natūraliosios žarnyno mikrofloros pusiausvyrą ir pagerinti žmogaus sveikatos būklę (Knašienė, Rimaitis, 2009). Probiotikų preparatai gaminami iš mikroorganizmų – žmogaus mikrobiotos rūšių arba jų genetiškai modifikuotų variantų. Dažniausiai tai laktobakterijos ir bifidobakterijos. Šios bakterijos yra nepatogeniškos ir netoksiškos, tai pagrindiniai žarnyno ir makšties simbiontai. Jų, kaip maisto papildų, dedama į varškę,

18

jogurtus, kefyrą arba jie vartojami liofilizuotų miltelių (kapsulių, mikrokapsulių), tablečių ir skystųjų suspensijų forma (Aukštakalnienė, Radžiūnas, 2006).

Manoma, kad probiotikai atlieka daug žmogaus organizmui naudingų funkcijų. Jie vartojami įvairių ligų profilaktikai bei gydymui. Jie saugo nuo bakterijų bei virusų sukeliamo viduriavimo, nes yra infekcijų sukėlėjų antagonistai (http://www.bifoval.lt/press.php.Prieiga per internetą 2012 m. lapkričio 3 d.). Be to, probiotikai stiprina imuninę sistemą, aktyvindami antikūnų gamybą ir imuninį atsaką ląstelių lygmeniu, slopina alergines organizmo reakcijas į maistą, mažindami žarnų pralaidumą alergenams, bei juos skaidydami. Probiotikai gerina maisto virškinimą bei jo pasisavinimą į organizmą, skaido laktozę, mažina pilvo pūtimą. Yra duomenų, kad jie skaido kancerogenines medžiagas, saugodami organizmą nuo vėžio (Knašienė, Rimaitis, 2009).

Probiotikai rekomenduojami:

 Esant viduriavimui, sukeltam antibiotikų;  Esant infekcinės kilmės viduriavimui;

 Pasireiškus Clostridium difficile sukeltam viduriavimui;  Esant Helicobacterpylori sukeltai infekcijai;

 Esant žarnyno uždegimo ligoms;  Sergant dirgliosios žarnos sindromu;

 Pasireiškus spindulinės terapijos sukeltam viduriavimui;  Esant alergijai maistui, atopiniam dermatitui;

 Esant laktozės netoleravimui;

 Esant keliautojų viduriavimui (Fedorak, Madsen, 2004).

Pirmi probiotikai su laktobacilomis ir bifidobakterijomis pasirodė praėjusio šimtmečio trečiajame dešimtmetyje (Knašienė, Rimaitis, 2009).

1676 m. Anthony von Leeuwenhoek pirmasis pradėjo domėtis probiotikais. Apie 1850 m. Louis Pasteur identifikavo pirmąją probiotinę bakteriją – Lactobacillus. 1899 metais Dr.Henri Tissier atrado Bifidobacteria, jis pirmasis pabandė naudoti bakterijas žarnyno ligoms gydyti. Gydančiais laikoma tik keletas laktobacilų, laktokokų ir bifidobakterijų padermių, be to, per mažai žinoma apie žarnyno mikrobiotos mechanizmus. Pieno rūgšties bakterijos sudaro būtiną sveikos virškinimo trakto mikroekologijos dalį ir yra glaudžiai susijusios su šeimininko metabolizmu. Šios bakterijos fermentuoja įvairius substratus, tokius kaip laktozę, įvairius aminus į trumpos grandinės sočiąsias riebalų ir kitas organines rūgštis bei dujas. Taip pat sintetina vitaminus, fermentus, antioksidantus, bakteriocinus. Dėl

19

šių savybių pieno rūgšties bakterijos sudaro svarbų mechanizmą, kuris metabolizuoja bei detoksikuoja į organizmą patekusias svetimas medžiagas (Pavilonis ir kt., 2005).

Yra publikacijų apie probiotikų veiksmingumą Helicobacter pylori sukeltų infekcijų gydymui ir prevencijai. Helicobacter pylori bakterija sukelia B tipo gastritą ir peptines opas ir yra rizikos veiksnys skrandžio vėžiui atsirasti. Tyrimuose in vitro ir su gyvūnais nustatyta, kad pieno rūgšties bakterijos slopina Helicobacter pylori augimą ir jos ureazinį aktyvumą, kurio jai reikia išgyventi rūgščioje skrandžio terpėje. Taip pat yra tyrimų, kuriais nustatyta, kad probiotikai žmogaus organizme ne tik slopina Helicobacter pylori infekciją, bet ir mažina recidyvų riziką (Pavilonis ir kt., 2005).

Atlikta nemažai tyrimų probiotikų efektyvumo, gydant įvairias žarnyno infekcijas, tokias kaip diarėja, tema. Duomenys rodo, kad probiotikai geba slopinti žarnyno infekcijų sukėlėjų dauginimasi bei jų adheziją.

Eksperimentuose su gyvūnais nustatyta, kad Lactobacillus rhamnosus GR-1, Lactobacillus fermentum RC-14 ir Lactobacillus rhamnosus GG didina sekrecinio IgA prieš salmoneles gamybą, aktyvina fagocitus ir mažina kepenų bei kitų organų kolonizavimą (Mėgelaitis, 2005).

Yra keletas mechanizmų, kurie neleidžia žalingoms bakterijoms prisitvirtinti prie žarnyno epitelio. Tai antimikrobinių agentų – bakteriocinų ir organinių rūgščių gamyba ir sekrecija, konkurencija dėl adhezijos vietų, sterilios kliūtys ir barjerai, konkuruojant su patogenais ir juos eliminuojant. Pieno rūgšties bakterijų apsauginę funkciją lemia jų kolonizavimosi galimybės ir šiuo atveju labai svarbus adhezijos mechanizmas, kuris dalyvauja sienelės mikrofloros formavime ir palaikyme. Ši pieno rūgšties bakterijų funkcija ir nulemia jų gebėjimą įeiti į sienelės mikroflorą ir tapti ekologinio barjero dalimi, apsaugančio makroorganizmo ląsteles nuo patogeninių mikrobų prisitvirtinimo prie gleivinės. Stipriausiomis adhezinėmis savybėmis pasižymi šios rūšys: L. salivarius, L. casei ir L. plantarum. L. acidophilus, L. fermentum ir L. brevis paprastai pasižymi silpnomis adhezinėmis savybėmis arba visai praradę šią savybę. Be to, padermės, pasižyminčios geromis adhezinėmis savybėmis, pasižymi žymiai didesniu antagonistiniu aktyvumu. Antagonistinis pienarūgščių lazdelių aktyvumas nuo seno domina mokslininkus, nes laktobacilose antagonistinis aktyvumas gerai pasireiškia in vitro (Bengmark, 1998).

Daugelis mokslininkų mano, kad laktobacilų inhibitorinės savybės pirmiausia yra susijusios su jų produkuojama pieno rūgštimi ir tik po to su antibiotinėmis medžiagomis. Nustatyti laktobacilų bakteriocinai – lektocinai, kurie yra susiję su jų kolonizavimosi galimybėmis.

20

Taigi, teigiamas probiotikų poveikis į organizmą pasireiškia dviem būdais: vietiškai, normalizuojant virškinimo trakto mikroflorą, ir taip pat – sistemiškai, gerinant viso organizmo sveikatą (Ortwin, 2005).

Įvardijamos šios teigiamos probiotikų poveikio savybės organizmui:  dėl probiotikų susidaro baktericidas ir vandenilio peroksidas;

 probiotikai produkuoja antibiotikus, tokius kaip laktalinas, acidofilinas, nizinas;

 probiotiniai organizmai išstumia patogeninius mikroorganizmus, varžydamiesi dėl vietos ir maisto medžiagų, taip pat stiprina imuninę sistemą ;

 organizmo apsauganuo žarnyno infekcijų (Rolfe, 2000);  mažina diarėją, sukeltą antibiotikų;

 padeda, esant vidurių užkietėjimui;

 kai kurie probiotiniai mikroorganizmai geba inaktyvuoti kancerogeninę betagliukoronidazę ir nitroreduktazę (Guarner et al., 2003);

 pieno, acto, propiono, riebalų rūgščių gamyba, kuri sąlygoja pH sumažėjimą žarnų turinyje;

 toksiškų aminų bei amoniako susidarymo stabdymas;  virškinimo, vitaminų ir mineralų absorbcijos gerinimas;  daro teigiamą įtaką organizmo mikroflorai;

 laktozės virškinimo ir žarnų peristaltikos gerinimas;  kepenų ir inkstų katabolitinių produktų detoksikacija;

 pasižymi anticholesteroliniu, antikancerogeniniu, antimutageniniu, antialerginiu poveikiu;  dar nenustatytų augimą skatinančių faktorių gamyba (Ortwin, 2005).

1.2.2 Pieno rūgšties bakterijų panaudojimas pieno produktų gamyboje

Pastaraisiais metais vis daugiau dėmesio skiriama funkcionaliesiems pieno produktams gaminti. Tokiais produktais vadinami rauginti pieno produktai, kurių gamybai kartu su pieno rūgšties bakterijomis naudojamos probiotinės kultūros, tokios kaip Bifidobacterium ar Lactobacillus acidophilus (Kulikauskienė, Margelytė, 2000).

Kaip probiotinis priedas parenkama mikroorganizmų kultūra turi atstovauti normaliąjai mikroflorai, maiste prieš vartojimą būti gyva ir aktyvi, tokia išlikti praeidama virškinamąja trakto dalimi, gebėti daugintis žarnyne ir teigiamai jį veikti. Vienas iš pagrindinių probiotikų naudojimo

21

maisto produktų gamyboje trūkumų yra tas, kad parenkamos tik specialios probiotinių bakterijų kultūrų padermės, kurios įveikia antibakterines kliūtis, bet ne tos, kurių reikia šeimininko organizmui. Pieno pramonėje kaip probiotikai šiuo metu dažniausiai naudojamos šių mikroorganizmų kultūros: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus rhamnosus (Kačerauskis ir kt., 2003).

Probiotinės bakterijos pieno produktų gamybai parenkamos atsižvelgiant į jų fiziologinio poveikio savybes, aktyvumą ir technologinius požymius. Atrinktos kultūros turi aktyviai auginti biomasę, kuri reikalinga terapiniam efektui pasiekti. Bakterijų padermės turi būti atsparios bakteriofagui, šarminei terpės reakcijai, tulžiai ir fenolui. Atsparumas lizocimui, skrandžio rūgštims taip pat svarbus. Didelės reikšmės turi ir adhezinės savybės (kaip netiesioginis galimybės apsigyventi organizme rodiklis), tačiau pats svarbiausias ir pagrindinis požymis yra kultūrų atsparumas antibiotikams ir sąlygiškai patogeniniams bei patogeniniams mikroorganizmams (antagonistinis aktyvumas) (Kačerauskis ir kt., 2001).

Būtina atsižvelgti ir į suderinamumą su tradicinėmis simbiotinėmis kultūromis, veiklos stimuliavimą, glikolizės proceso pobūdį, proteolitinį aktyvumą, įtaką būsimo produkto klampiui. Taip pat pageidautina įvertinti ir dietinius reikalavimus, tarp jų ir mažą D (-) – pieno rūgšties izomero kiekį produkte (Garmienė ir kt., 2005).

Priklausomai nuo gaminamo produkto rūšies, parenkant probiotines kultūras, atsižvelgiama į šias padermių savybes:

 skystų raugintų produktų (rūgpienio, jogurto, įvairių gėrimų) gamybai būtinanaudoti tokias mikroorganizmų padermes, kurios formuoja gerai drėgmę sulaikančią sutrauką.

 baltyminių produktų (sūrių, varškės) gamybai reikalingos padermės, kurios pasižymi geromis sinergetinėmis savybėmis.

 raugintiems gėrimams geriausiai tinka padermės, kurios suteikia produktui ryškų skonį bei specifinį aromatą. Sūrių ir varškės gamyboje aštrus sutraukos skonis ir aromatas yra nepageidaujami, nes blogina produkto kokybę (Sekmokienė ir kt., 2005).

1.2.2.1 Reikalavimai jogurto mikroorganizmų kultūroms Mikroorganizmų kultūros, naudojamos jogurto gamybai turi turėti tokias savybes:  Suteikti tinkamą konsistenciją, klampumą, gerinti skonį;

 Lengvai išlaikyti kultūros stabilumą ir balansą;  Nesukelti sinerezės;

22

 Toleruoti cukrų;

 Nedaryti jokio poveikio medžiagų apykaitos proceso metu dėl penicilino ir kitų antibiotikų;  Turi išlikti aktyvūs dalyvaujant bakteriofagams;

 Turi būti atsparūs antibiotikams (Danielsen ,Wind, 2003);  Greito rūgštinimo gebėjimas (Haddadin et al., 2004);

 Turi išlikti aktyvūs iki nustatytos galiojimo pabaigos (Adolfsson et al., 2004);  Turi būti atsparūs rūgštims ir tulžiai (Liong, Shah, 2006);

 Turi išlikti gyvi visame žmogaus virškinamajame trakte (Mater et al., 2005);  Išlaikyti gerą produkto skonį po jo pagaminimo;

 Turi išlikti gyvybingi produkto gamybos pabaigoje (Dilmi-Bouras, 2006);  Turi gebėti gaminti mažiau rūgšties šaldymo metu (Ongol et. al., 2007).

1.2.2.2Reikalavimai probiotinėms mikroorganizmų kultūroms Probiotinės kultūros turi turėti tokias savybes:

 Daryti teigiamą poveikį sveikatai (didinti organizmo atsparumą ligoms);  Išgyventi skrandžio bei žarnyne esančiomis sąlygomis ir būti aktyvios;  Nesukelti imuninio atsako probiotinių mikroorganizmų kamienams;

 Nesukelti toksinio, patogeninio, alerginio, mutageninio, kancerogeninio poveikio pačių probiotiniams kamienams, jų fermentacijos produktams ir ląstelių komponentams po bakterijų sumažėjimo;

 Turi būti genetiškai stabilūs, neperkelti plazmidžių;  Lengva ir pakartotina gamyba;

 Gyvybingumas gamybos ir laikymo metu;

 Atsparumas virškinimo fermentams, pavyzdžiui lizocimui;

 Atsparumas toksiškiems metabolitams, tokiems kaip fenolis, pasigaminęs virškinimo metu;  Atsparumas antibiotikams ir virusams;

 Gebėjimas augti piene ir jį rūgštinti;

 Atsparumas pieno rūgštingumui, užtikrinant probiotinių mikroorganizmų gyvybingumą gamybos metu;

 Atsparumas skrandžio sultims ir tulžies druskoms;  Gebėjimas pereiti virškinamajį traktą;

23

 Gebėjimas sunaudoti endogenines ir egzogenines maistines medžiagas;  Gentys turi būti žmogaus kilmės;

 Atsparumas deguoniui;

 Gebėjimas gaminti antimikrobines medžiagas;

 Turi būti saugios su įrodytu veiksmingumu (Kailasapathy, Smakras, 2000);

 Gebėjimas pasiekti distalinį virškinamojo trakto galą gyvybingoje formoje ir būti išskirtoms iš fekalijų (Elli et. al., 2006).

1.3. Laktobacilos

Laktobacilos yra viena stambiausių pieno rūgšties bakterijų grupės padermė. Šios bakterijos laktozę ir kitus cukrus paverčia į pieno rūgštį ir yra labai atsparios virškinimo trakto aplinkai – skrandžio ir tulžies rūgštims (Parada et. al., 2007).

Lactobacillus tai – 1,0-10 x 0,5-1,2 m dydžio lazdelinės bakterijos. Jų forma – nuo ištemptos lazdelės iki kokobacilos. Šioms bakterijoms būdinga jungtis į trumpas grandinėles, ypač vėlesnėje logaritminės fazės augimo stadijoje. Dauguma laktobacilų yra nejudrios, neformuoja sporų. Tai Gr+ fakultatyvūs anaerobai (kai kurie mikroaerofilai), tačiau padidėjus terpės pH, senos kultūros, tampa Gr–. Laktobacilos yra neigiamos katalazei ir citochromoksidazei. Laktobacilos geriau ir greičiau auga aplinkoje esant 5-10 proc. CO2 koncentracijai ir tam tikroms maisto medžiagoms – aminorūgštims,

peptidams, riebalinėms rūgštims, vitaminams, angliavandeniams, nukleininių rūgščių priedams. Optimali augimo temperatūra – 30-40o_{C, tačiau auga esant temperatūrai nuo +5 iki +53}o

C. Optimali pH koncentracija yra 5,5-5,8 (Giraffa et al., 2010).

Laktobacilų genčiai priklauso148 rūšys. Pagal susidariusius fermentacijos produktus laktobacilos skirstomos į griežtas homofermentines (L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius), griežtas heterofermentines (L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, L. reuteri) ir fakultatyvines heterofermentines (L. casei L. curvatus, L. plantarum, L. sakei).

Homofermentinės laktobacilos skaldo gliukozę, maltozę, fruktozę, galaktozę, sorbitą. Fermentacijos eigoje susidaro apie 85 proc. pieno rūgšties. Heterofermentinės laktobacilos skaldo gliukozę, ramnozę, ksilozę, arabinozę. Tada susidaro mažesnis kiekis pieno rūgšties (50 proc.). Fakultatyvinės heterofermentinės laktobacilos skaldo pentozes (arabinozę, ksilozę ir kt.) ir heksozes (gliukozę, fruktozę, maltozę ir kt.), susidaro pieno rūgštis, o kai trūksta gliukozės, skaldo ją iki acto rūgšties ir spirito. Jos užima tarpinę padėtį (Kleerebezem, 2010).

24

Laktobacilos randamos įvairiose ekologinėse nišose, tokiose kaip vanduo, dirva, mėšlas, silosas, žalias pienas, gyvūnų bei žmonių virškinimo traktas, burnos ertmė, makštis. Jos taip pat aptinkamos maisto produktuose (sultys, vynas, alus, grūdų ir mėsos produktai, vaisiai) (Leroy, De Vuyst, 2004).

1.3.1 Laktobacilų taksonomija ir filogenija

Laktobacilų ekologinį ivairiapusiškumą lemia dideli fenotipiniai ir genotipiniai pokyčiai rūšies viduje. Santykinė 16S/23S rRNA geno sekos analizė, parodė filogenetinius santykius tarp laktobacilų. Prdžioje buvo išskirtos trys filogenetinės grupės: Lactobacillus casei –Pediococcus, Lactobacillus delbrueckii ir Leuconostoc. Vėliau Lactobacillus delbrueckii grupė buvo pavadinta Lactobacillus acidophilus grupe, o Lactobacillus casei –Pediococcus grupė buvo suskirstyta į L. casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri ir Lactobacillus salivarius grupes. Dabar laktobacilų filogenetinė struktūra dar apima Lactobacillus perolens, Pediococcus ir Lactobacillus vitulinu–secatenaformis grupes (Pot, Tsakalidou, 2009).

L. acidophilus grupė yra beveik išimtinai obligatinė homofermetinė laktobacilų grupė. Be L. acidophilus yra daug kitų pramoninių rūšių, tokių kaip Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus crispatus, L. delbrueckii su porūšiu delbrueckii, lactis, bulgaricus ir indicus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus ir Lactobacillus gasseri. L. helveticus ir L.delbrueckii rūšys yra žinomos kaip starterinės kultūros pieno ir daržovių fermentacijoje, o keli L. acidophilus kamienai, kaip ilgai buvo žinoma, vaidino pagrindinį vaidmenį žmogaus sveikatos ir mitybos gerinime, darydami teigiamą įtaką žarnyno mikrobiotai (Pot, 2008).

L. casei grupei priklauso žinomiausia rūšis Lactobacillus rhamnosus taip pat Lactobacillus paracasei, L. casei ir Lactobacillus zeae. Šis porūšis praeityje buvo pateiktas plačiai taksonominei peržiūrai, kurios metu L. paracasei rūšies pavadinimas buvo laikinai pripažintas netinkamu. Šiuo metu ši rūšis vis dar laikoma atskira rūšimi gentyje (Dellaglio et al., 2002; Desai et al., 2006; De Vos et al., 2005; Pot, 2008).

L. paracasei ir L. casei yra labiausiai paplitę per maistą plintančių ligų izoliatai L. casei grupėje, ypatingai sūryje. Šios rūšys taip pat randamos silose ir yra nuolatiniai žmogaus bei gyvūnų virškinamojo trakto gyventojai (Pot, Tsakalidou, 2009).

L. plantarum grupė apima L. plantarum subsp. plantarum, L. plantarum subsp. argentoratensis, Lactobacillus paraplantarum ir Lactobacillus pentosus. Ši rūšis randama daugelyje maisto produktų (pienas, mėsa, daržovės). L. plantarum paprastai randama žmogaus virškinimo trakte, kas įrodo, jog ši rūšis išgyvena nepalankias sąlygas ir kolonizuoja skrandį. L. plantarum yra pripažintas maisto

25

mikroorganizmas. Jis turi ilgą tyrimų istoriją dėl saugaus naudojimo fermentuotuose maisto produktuose (de Vries et al., 2006).

L. reuteri grupei priklauso mažiausiai šešios rūšys, išskirtos iš raugo. Būtina pažymėti, kad ši rūšis gali būti dominuojanti rauge šalia kitų kultūrų (Del Bello et. al., 2005). L. fermentum – viena geriausiai žinomų šios grupės rūšių. Ji buvo išskirta pieno ir daržovių fermentacijos metu (Pot, 2008; Pot, Tsakalidou, 2009).

L. buchneri yra didelė heterogeninė grupė, daugiausiai susijusiu su maisto fermentacija. Šiai grupei priklauso rūšys išskirtos daržovių fermentacijos metu (L. buchneri, Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii), raugo (Lactobacillus sanfranciscensis) ir kefyro grūdelių (Lactobacillus kefiri ir Lactobacillus parakefiri).

L. salivarius tai labai heterogeninė grupė. L. salivarius rūšis tai homofermentinė laktobacila, išskirta iš žmogaus burnos. Lactobacillus algidus buvo išskirta iš vakuume supakuotos jautienos, kuri buvo aptikta kaip dominuojančios psichrofilinės mikrofloros dalis. Lactobacillus agilis aptikta kaip pagrindinė karvelio gūžio floros sudėtinė dalis (Pot, 2008; Pot, Tsakalidou, 2009).

1.3.2 Probiotinių maisto produktų su laktobacilomis apžvalga

Tarp probiotinių maisto produktų labiausiai yra paplitę pieno produktai. Dažniausiai naudojamiems probiotiniams mikoorganizmams priklauso L. acidophilus, L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. (para)casei, L. reuteri, L. plantarum, L. rhamnosus, L. fermentum (1 lentelė ) (Tamime et al., 2005).

Platų probiotinių pieno produktų pasirinkimą galima rasti įvairiose rinkose; tipiški pavyzdžiai pasterizuotas pienas, ledai, fermentuotas pienas, sūris, pieno milteliai kūdikiams. Jogurtas yra klasikinis probiotinio pieno produkto pavyzdys. Jogurto su probiotiniais mikoorganizmais gamybos stadijos yra beveik tokios kaip paprasto jogurto, tik fermentacijos laikas yra šiek tiek ilgesnis (Tamime et al., 2005).

Nors buvo įrodyta, kad pieno produktai yra geriausia terpė probiotiniams mikroorganizmams, yra vis daugiau tyrimų, kurie rodo, kad probiotinių maisto produktų gamybai gali būti naudojamas ne tik pienas. Buvo ištirta keletas žaliavų (javai, vaisiai, daržovės), norint nustatyti, ar jos yra tinkamos probiotinių maisto produktų gamybai (Espinoza , Navarro, 2010). Šiuo metu intensyviausiai naudojami probiotiniai mikroorganizmai priklauso Lactobacillus genčiai, tačiau keletas kamienų yra netinkami probiotikų gamybai (1 lentelė) (Parada, et. al., 2007). Genų inžinerija vaidins svarbų vaidmenį, ieškant

26

ir tyrinėjant naujus bakterijų kamienus ir genų sekas ir taip didins supratimą apie probiotikų mechanizmą ir funkcionavimą (Reid, 2008).

1 lentelė. Dažniausiai probiotiniuose preparatuose naudojamos laktobacilų rūšys (ypač pieno produktuose) (Tamime et al., 2005)

Rūšis Svarbiausi komerciniai kamienai, naudingi

žmogaus sveikatai

Lactobacillus acidophilus LA1; LA5

Lactobacillus johnsonii La1; NCFM; DDS-1; SBT-2062 Lactobacillus (para)casei F19; CRL 431; Immunitass; Shirota Lactobacillus rhamnosus GG; LB21; 271; GR-1;

VTT E-97800 Lactobacillus plantarum 299v; Lp01 Lactobacillus delbrueckii subsp.

Bulgaricus

Lb12

Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis Lla Lactobacillus cellobiosus Lactobacillus curvatus Lactobacillus fermentum RC-14 Lactobacillus reuteri MM2 Lactobacillus brevis

Lactobacillus salivarius UCC118

Lactobacillus helveticus B02

Lactobacillus amylovorus Lactobacillus crispatus Lactobacillus gallinarum

Lactobacillus gasseri LG21

1.4 Antibakterinis pieno rūgšties bakterijų aktyvumas

Susidomėjimas pieno rūgšties bakterijomis auga, tiriamas jų gebėjimas būti natūraliais konservantais maisto pramonėje. Pienarūgščių bakterijų medžiagų apykaitos metu išskiriamos

27

antimikrobinį aktyvumą turinčios medžiagos – organinės rūgštys (pieno r., acto r. ir pan.), vandenilio peroksidas, antimikrobiniai fermentai, bakteriocinai, reuterinai ir kt. (Albano et. al., 2007).

Dauguma pieno rūgšties bakterijų yra aktyvios prieš Gram + bakterijas. Bakterijų išskiriami bakteriocinai yra aktyvesni prieš bakterijas, kurios yra genetiškai artimesnės bakteriociną išskyrusiai padermei (Line et. al., 2008). Daugelyje straipsnių teigiama, kad bakteriocinai gali būti aktyvūs ir prieš Gram+, ir prieš Gram– bakterijas (Todorov et. al., 2005; Oscariz, Pisabarro, 2001; Oh et. al., 2000, Maldonado et. al., 2004).

Tyrimai rodo, kad L. delbrueckii subsp.bulgaricus inhibitorinis aktyvumas yra didesnis nei S. thermophilus kultūros. Jogurtų mikroorganizmai pasižymi antagonistiniu aktyvumu Yersenia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis ir Listeria monocytogenes kultūrų atžvilgiu (Noremark et al., 2002; Sarkar, Misra, 2001; Pazakova et al., 2001).

Maity, Misra (2001) nustatė antagonistinį jogurtų kultūrų aktyvumą E. coli (7,5 prieš 10,0), S. aureus (8,0 prieš 10,5) ir Shigella dysenteriae (8,0 prieš 11,0) kultūrų atžvilgiu. Buvo nustatyta, kad jogurtas su L. casei ir L. acidophilus kultūromis buvo antagonistiškai aktyvesnis S. aureus ir L. monocytogenes kultūrų atžvilgiu negu paprastas jogurtas (Salvatierra et al., 2004; Barrantes et al., 2004). Terapinės jogurto savybės, skiriant vaikams sergantiems diarėja, gali būti padidintos įtraukiant L. casei ir B. bifidum bakterijas.

Reikšmingas patogenų sumažėjimas buvo nustatytas (1,01prieš 1,99 log10 ksv/g fekalijose) šeriant

laboratorines peles jogurtu su B. bifidum bakterijom, negu šeriant jogurtu be šių bakterijų (Christopher et al.,2006).

Neseniai dvigubas atsitiktinių imčių tyrimas placebo parodė, kad keturias savaites vartojant 100 g komercinio jogurto su L. rhamnosus GG bakterijom iš organizmo buvo pašalintas vankomicinui atsparus enterokokas (Manley et al., 2007). Norint padidinti antibakterinį jogurto aktyvumą, buvo pasiūlyta į sudėtį įtraukti šiuos mikroorganizmus: Bifidobacterium sp., L. acidophilus, B. bifidum ir P. freudenreichii subsp shermanii, Propionibacterium acidipropionici, L. acidophilus, B. bifidum, Lactobacillus reuterii ir L. rhamnosus, B. bifidum ir L. acidophilus (Kasimoglu, Akgun, 2004; Warmi Ska-Radyko et al., 2003; Sadek et al., 2000; El-Rahman, 2000).

1.4.1 Laktobacilų produkuojamos antibakterinės medžiagos

Pieno rūgšties bakterijų antagonistinis aktyvumas puvimo, patogeninei ir sąlygiškai patogeninei mikroflorai yra susijęs su jų gebėjimu sintezuoti daugybę antibiotinių medžiagų (laktocidai,

28

lantibiotikai, daug neidentifikuotų junginių su antibakteriniu veikimu), vandenilio peroksidą, lizocimą, interferoną, interleukiną (Сидоров и др., 2000).

Kai kurios laktobacilų padermės, ypač Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, daugiau vandenilio peroksido (H2O2) gamina, kai terpėje yra mažesnė gliukozės koncentracija. Nustatyta, kad vandenilio

peroksido susidarymas yra susijęs su NADH oksidazės veikla (Jaroni, Brashears, 2000).

Laktobacillus acidophilus ir L. plantarum geba pernešti Fe2+ iš terpės į ląsteles, kur geležis iš dalies oksiduojasi iki Fe3+, susidarant vandenilio peroksidui. L. delbrueckii subsp. bulgaricus išskiria vandenilio peroksidą, esant deguoniui arba gliukozei, o L. acidophilus – nesant gliukozės. Daroma išvada, kad laktobacilos neleidžia patogeniniams mikroorganizmams įsisavinti Fe2+

(Saikauskienė, 2002).

Be antibiotinių medžiagų laktobacilos sintetina ir biologiškai aktyvias medžiagas – fermentus, vitaminus, amino rūgštis (Сидоров и др., 2000). L.fermentum gaminamas lizocimas pagerina laktobacilų adhezines savybes, pasižymi imunomoduliuojančiomis, antianeminėmis, regeneraciją stimuliuojančiomis savybėmis bei paryškina kitas biologines savybes. L.plantarum viena arba kartu su kitomis probiotinėmis padermėmis rodo stiprų gebėjimą eliminuoti sąlygiškai patogeninius mikroorganizmus in vitro ir in vivo sąlygomis.

Antagonistiniu aktyvumu Lactobacillus genties bakterijos pasižymi ir gamindamos rūgštis. Manoma, kad organinių rūgščių gamyba yra pagrindinis faktorius, reguliuojantis žarnyno mikroorganizmų aktyvumą. Dažniausiai gaminama pieno rūgštis, kuri slopina rūgštims jautrių patogeninių ir puvimo mikroorganizmų vystymąsi. Homofermentinės laktobacilos pagamina daugiau kaip 85 proc. pieno rūgšties, kuri palaiko rūgščią terpės reakciją virškinimo trakte, o daugelis enteropatogeninių mikroorganizmų auga neutralioje arba lengvai šarminėje terpėje, todėl rūgštinė aplinka, jiems yra nepalanki (Oberauskas, 2004).

Pieno rūgšties sudėtyje yra vienas asimetrinis anglies atomas, todėl yra du optiniai izomerai – L (+) ir D (+). Pastaruoju metu maisto, medicinos, farmacijos, kosmetikos, maisto produktų ekologinio įpakavimo srityje pirmenybė teikiama L (+) izomerui ir gaminiams iš jo, todėl ieškoma producentų ir metodų šimtaprocentinei šio izomero gamybai (Saikauskienė, 2002).

Pieno rūgšties baktericidinis poveikis žymiai stipresnis už acto ir citrinų rūgšties, o L (+) izomero stipresnis už D (-) izomero. Pieno rūgštis geriau prasiskverbia į audinius, gydo kai kurias virškinimo trakto ligas. Gamtoje retai randama kuri nors viena rūgštis, dažnai naudojamas pieno ir acto rūgščių mišinys, kuris mikroorganizmų atžvilgiu veikia sinergetiškai. Yra žinoma, kad kai kurios laktobacilos gamina L (+) izomerą (Lactobacillus casei sbsp. sasei), kitos tik D (-) izomerą, o kai kurios abu

29

(Lactobacillus brevis, L. helveticus). Taigi antibakterinis laktobacilų aktyvumas susijęs su pagaminta pieno rūgštimi (Saikauskienė, 2002).

Tiriant laktobacilų sienelės struktūrą, buvo bandoma išskirti medžiagas, kurios stimuliuoja imuninę sistemą. Buvo nustatytos molekulės, iškilusios virš ląstelės paviršiaus, kurios buvo įvardintos kaip lektinai ir teichoinės rūgštys. Šios molekulės dalyvauja bakterijoms prisitvirtinant prie žarnų epitelio, o prisijungimas prie intraepitelinių limfocitų membranose esančių glikoproteinų gali turėti imunostimuliacinį poveikį (Stakauskas, 2001).

1.4.2 Bakteriocinai

Pastaruoju metu bakterijų atsparumas antibiotikams tapo didžiule problema dėl gausaus klasikinių antibiotikų vartojimo žmonių ir gyvūnų gydyme. To pasekoje atsirado ir paplito antibiotikams atsparūs bakterijų kamienai, kas lėmė problemas apribojant antibiotikų, kaip augimo stimuliatorių vartojimą. Taigi tyrimai, ieškant naujų antimikrobinių medžiagų, įgauna vis didesnę svarbą medicinoje (Kumar, Schweiser, 2005; Fisher et al, 2005). Reikia rasti bakterinį peptidą, kuris kaip antibakterinė medžiagapakeistų antibiotikus. Viena iš tokių medžiagų bakteriocinai, kurių antagonistininis aktyvumas nustatytas nanomolinėse koncentracijose ir yra nenuodingi. Bakteriocinai yra baltymai arba kompleksiniai baltymai, biologiškai aktyvūs, pasižymintys antimikrobiniu poveikiu prieš giminingas producentui bakterijų rūšis. Juos gamina bakterijos ir oficialiai jie nėra vadinami antibiotikais. Bakteriocinai skiriasi nuo antibiotikų, nes yra baltyminės kilmės, ir skrandyje gali būti greitai suvirškinti proteazių. Jų sintezė vyksta ribosomose, kas didina galimybes gerinti jų savybes, kad padidinti jų aktyvumą ir veikimo spektrą (Saavedra et al.,2004). Antibiotikai paprastai laikomi antriniais metabolitais, veikiančiais mažomis koncentracijomis, pašalindami šalutinių medžiagų apykaitos produktų, tokių kaip amoniakas, organinės rūgštys ir vandenilio peroksidas, sukeltą slopinimą. Tikėtina, kad dauguma, jei ne visos bakterijos, gali gaminti įvairias heterogenines molekules jų vystymosi metu in vitro (tikėtina ir natūralioje jų gyvavimo aplinkoje), kas gali turėti slopinamą poveikį ir joms pačioms ir kitoms bakterijoms. Bakteriocinų gamyba maisto ir pašarų gamintojams gali būti laikoma dideliu privalumu, nes šie peptidai gali nužudyti arba sustabdyti daugelio patogeninių bakterijų augimą, kurios konkuruoja dėl tos pačios ekologinės nišos ir maisto medžiagų su kitomis bakterijomis. Tai patvirtina faktas, kad daugelis bakteriocinų turi siauras šeimininkų ribas ir dėl to tikėtina, kad jie bus labiausiai veiksmingi prieš giminingas bakterijas, turinčias tuos pačius mitybinius poreikius toms pačioms ribotoms maisto atsargoms (Deegan et al, 2006).

30

Atsižvelgiant į bakteriocinų antimikrobinį spektrą, molekulinį svorį, stabilumą, fizikochemines savybes ir veikimo būdą, jie sudaro nevienalytę (heterogeninę) grupę. Yra klasikinis bakteriocinų tipas, kurio veikimo spektras yra tik prieš homologines rūšis. Antroji rūšis mažiau paplitusi, kuri veikia prieš daugelį Gram + bakterijų. Vienas iš antros grupės bakteriocinų yra nizinas, kurį gamina Lactococcus lactis subsp. lactis rūšis. Kitas yra pediocinas, kurį gamina Pedicoccus pentosaceus (Parada et al, 2007). Nizinas yra aktyvus ir prieš Gram– bakterijas, bet tik didelėmis dozėmis. Taigi bakteriocinai ne dažnai yra aktyvūs prieš Gram– bakterijas. Išorinė šių bakterijų membrana veikia kaip ląstelės pralaidumo barjeras, todėl tokios medžiagos kaip antibiotikai, valymo priemonės, dažai nepraeina pro ląstelės membraną, nes yra sulaikomi. Tačiau jau buvo atlikta keletas tyrimų, kurie parodė, kad bakteriocinai aktyvūs ir prieš šios grupės bakterijas. Pavyzdžiui plantaricinas 35, kurį gamina L. plantarum, yra aktyvus prieš Aeromonas hydrophila, bakteriocinas ST151BR, kurį gamina Lactobacillus pentosus ST151BR ir Lactobacillus paracasei subsp. paracasei gaminamas bakteriocinas aktyvus prieš Escherichia coli, termofilinas, gaminamas Streptococcus thermophilus aktyvus prieš E. coli, Yersinia pseudotuberculosis ir Yersinia enterocolitica tarp Gram– rūšių ir prieš keletą Bacillus rūšių, Listeria monocytogenes ir Salmonella typhimurium tarp Gram + (Messi et al., 2001; Torodov, Dicks, 2004; Caridi, 2002).

Bakteriocinai ST28MS ir ST26MS, gaminami Lactobacillus plantarum, išskirti iš pelių, stabdo Escherichia coli ir Acinetobacter baumanii augimą kaip ir kelių Gram + bakterijų (Torodov, Dicks, 2005). Lade (2006) išskyrė dvi Lactobacillus rūšis (L. plantarum ir L.lactis) iš augalinių atliekų, kurios gamino bakteriociną, stabdantį E. coli augimą.

1.4.2.1 Bakteriocinų klasifikacija

Yra daug bakteriocinų, kuriuos gamina įvairios pieno rūgšties bakterijos (1 lentelė) (Parada et al., 2007). Jie gali būti klasifikuojami pagal jų biochemines ir genetines savybes (González-Martínez et al., 2003).

I klasė lantibiotikai: maži (< 5 kDa), karščiui atsparūs peptidai, veikiantys membranos struktūrą. Jie formuoja aminorūgštis lantioniną ir metillantioniną. Tai vyksta dviem etapais: pirmiausia genų užkoduotas searinas ir treoninas yra paveikiami per enzimų dehidraciją. Lantobiotikai buvo suskirstyti į du pogrupius, atsižvelgiant į jų struktūrą ir elementą, lemiantį jų aktyvumą.

Ia – pailginti, lankstūs, sraigto formos, amfipatiniai, katijoniniai peptidai. Jų veikimas priklauso nuo sukuriamo elektrinio lauko tarp lastelių membranos taikinių ir bakteriocino. Dėl nenustatytos

31

sąveikos su ląstelėmis taikiniais sudaro poras, taip sukurdami įtampą ląstelių membranose. Tipinis šio pogrupio atstovas yra nizinas.

Ib – jiems būdinga nelanksti struktūra, susideda iš anijoninių arba rutuliškos formos neutralių peptidų. Jie veikia, interferuodami su esminėm jautrių bakterijų fermentinėm reakcijom (Deegan et al., 2006; Maragkoudakis et al., 2009; Oscariz, Pisabarro, 2001).

II klasė – nelantibiotikai: jie yra kintamos molekulinės masės, tačiau paprastai maži – <10 kDa. Jie atsparūs karščiui, sudaryti iš nemodifikuotų aminorūgščių. Ši grupė skirstoma į tris pogrupius:

Pogrupis II a: šie peptidai yra aktyvūs prieš Listeria. Pagrindiniai atstovai pediocinas PA-1 ir sakacinas P. Taip pat priklauso sakacinas A, mesentericinas Y 105, karnobakteriocinas B2. Šie komponentai yra baktericidiniai, nes jie suardo citoplazmos membranos vientisumą, sukelia joninį disbalancą ir organinio fosfato pralaidumą, taip sukeldami ląstelės žūtį.

Pogrupis II b: šie bakteriocinai susideda iš dviejų atskirų peptidų, kurie formuoja kompleksus. Šie peptidai mažai aktyvūs arba išvis neaktyvūs ir nėra sekos panašumų tarp papildomų peptidų.

Du peptidai gali veikti ir po vieną, tačiau jų kompleksas veikia sinergetiškai. Šio pogrupio atstovai laktocinas G, plantaricinas EF ir JK.

Pogrupis II c: tai maži karščiui atsparūs peptidai, kurie transportuojami pagrindinių peptidų. Atstovai: divergicinas A ir acidocinas B. Šiai grupei priklauso 2 bakteriocinų tipai: antibiotikai su 1 ar 2 cisteino radikalais (tiolbiotikai ir cystibiotikai) ir antibiotikai be cisteino (laktokocinas A ir acidocinas B) (Cintas et al., 2001; Oscariz, 2001).

III klasė – tai dideli karščiui neatsparūs peptidai, kurių molekulinė masė didesnė nei 30 kDa. Šiai klasei priklauso helveticinas J, sintetinamas L. helveticus 481 ir heveticinas V, acidofilicinas A, laktacinas A ir lakticinas B, sintetinamas L. acidophilus. Lactobacillus genčiai priklauso daugelis šios klasės atstovų (Gottlieb et al., 2008).

Dauguma mažos molekulinės masės bakteriocinų yra katijoniniai prie pH 7 ir tai yra bruožas, vienijantis tiek lantibiotikus tiek nelantibiotikus (Cintas et al., 2001).

2 lentelė. Pieno rūgštiers bakterijų produkuojami bakteriocinai ir jų charakteristika (Parada et al., 2007)

Bakterijų rūšys Bakteriocinai Veikiamos rūšys Charakteristika

Lactococcus lactis subsp. lactis Nizinas Gram+ bakterijos I lantabiotikų klasė, 3,5 kDa, 34 aminorūgštys, naudojamas komerciškai Lakticinas 3147 Clostridium sp Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Streptococcus dysgalactiae Enterococcus faecalis I dvikomponenčių lantibiotikų klasė, 4,2 kDa, atsparus karščiui, aktyvus esant rūgštims ir prie neutralaus pH