LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Lina Merkevičienė
STAPHYLOCOCCUS
SPP. IR ESCHERICHIA
COLI
ATSPARUMO ANTIBIOTIKAMS
TYRIMAI LAUKINIŲ IR
NAMINIŲ PAUKŠČIŲ POPULIACIJOSE
Daktaro disertacija Žemės ūkio mokslai,
veterinarija (02A)
Disertacija rengta 2013–2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute.
Mokslinis vadovas
doc. dr. Modestas Ružauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos veterinarijos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkas
prof. habil. dr. Henrikas Žilinskas (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A).
Nariai:
dr. Aleksandr Novoslovskij (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A);
prof. dr. Antanas Sederevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A);
doc. dr. Antanas Šarkinas (Kauno technologijos universitetas, technolo-gijos mokslai, chemijos inžinerija – 05T);
prof. habil. dr. Michael Grashorn (Hohenheimo universitetas, Vokietija, žemės ūkio mokslai, zootechnika – 03A).
Disertacija bus ginama viešame veterinarijos mokslo krypties tarybos posė-dyje 2018 m. rugpjūčio 29 d. 14 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Dr. S. Jankausko auditorijoje.
Disertacijos gynimo vietos adresas: Tilžės g. 18, LT-47181, Kaunas, Lietuva.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES VETERINARY ACADEMY
Lina Merkevičienė
INVESTIGATIONS OF ANTIMICROBIAL
RESISTANCE AMONG STAPHYLOCOCCUS
SPP. AND ESCHERICHIA COLI IN
POPULATIONS OF WILD
AND DOMESTIC BIRDS
Doctoral Dissertation Agricultural Sciences,
Veterinary (02A)
Disertation has been prepared at the Institute of Microbiology and Virology, Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2013–2018.
Scientific supervisor:
Assoc. Prof. Dr. Modestas Ružauskas (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A).
Dissertation is defended at the Veterinary Research Council of Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences: Chairperson
Prof. Dr. Habil. Henrikas Žilinskas (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A).
Members:
Dr. Aleksandr Novoslovskij (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A);
Prof. Dr. Antanas Sederevičius (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A);
Assoc. Prof. Dr. Antanas Šarkinas (Kaunas University of Technology, Technological Sciences, Chemical Engineering – 05T);
Prof. Dr. Habil. Michael Grashorn (Hohenheim University, Germany, Agricultural Sciences, Zootechnics – 03A).
Dissertation will be defended at the open session of the Veterinary Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences on 29 th of August, 2018 at 2:00 p. m. in Dr. S. Jankauskas Auditorium of Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences.
5
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Bakterijų atsparumas skirtingų klasių antibiotikams ir epidemiologija ... 12
1.2. Stafilokokų genties bakterijų morfologija ir bendrosios savybės ... 18
1.3. Stafilokokų paplitimas paukštienoje ir kituose maisto produktuose ... 19
1.4. Stafilokokų paplitimas laukinių paukščių ir gyvūnų populiacijose ... 22
1.5. E. coli morfologija ir bendrosios jų savybės ... 24
1.6. E. coli paplitimas paukštienoje ir kituose maisto produktuose ... 24
1.7. E. coli paplitimas laukinių paukščių ir gyvūnų populiacijose ... 26
2. Tyrimų metodai ... 29
2.1. Tyrimų eiga, vieta ir tyrimo objektai ... 29
2.2. Medžiagos paėmimas (rinkimas) ir pristatymas į laboratoriją ... 32
2.3. Tiriamosios medžiagos įsėjimas į mitybines terpes bakterijoms išskirti ... 32
2.4. Išskirtų bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymas ... 33
2.4.1. Kokybinis jautrumo tyrimo metodas ... 33
2.4.2. Dauginio atsparumo bakterijų kiekybinis jautrumo tyrimas ... 35
2.5. Išskirtų dauginio atsparumo padermių identifikavimas biocheminiais testais .... 36
2.6. Išskirtų bakterijų padermių paruošimas molekuliniams tyrimams... 37
2.7. Antibiotikams atsparumą koduojančių genų nustatymas ... 37
2.8. Bakterijų identifikavimas sekoskaitos būdu... 41
2.9. Laukinių paukščių mikrobiotos metaganominiai tyrimai ... 42
2.9.1. Metagenominiai mikrobiotos profiliavimo tyrimai... 42
2.9.2. Genų, koduojančių atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, nustatymas sidabrinių kirų (Larus argentatus) mikrobiotoje ... 43
2.10. Tyrimų duomenų statistinis vertinimas ... 43
3. TYRIMO REZULTATAI ... 44
3.1. Stafilokokų genties bakterijos laukinių paukščių populiacijoje ... 44
3.1.1. Stafilokokų paplitimas laukinių paukščių populiacijoje ... 44
3.1.2. Laukinių paukščių stafilokokų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 45
3.1.3. Rūšinė stafilokokų įvairovė laukinių paukščių populiacijoje ... 50
3.1.4. Antibiotikams atsparumą koduojančių genų paplitimas tarp stafilokokų bakterijų, išskirtų iš laukinių paukščių ... 51
3.1.5. Stafilokokų rūšių, kokybinio ir kiekybinio atsparumo antimikrobinėms medžiagoms bei genetinių determinantų paplitimo tarp tam tikrų iš laukinių paukščių išskirtų Staphylococcus spp. padermių duomenys ... 54
3.1.6. Stafilokokų, išskirtų iš laukinių paukščių, rūšių identifikavimas sekoskaitos būdu ... 60
3.2. E. coli bakterijos laukinių paukščių populiacijoje ... 62
3.2.1. E. coli bakterijų paplitimas laukinių paukščių populiacijoje ... 62
3.2.2. E. coli atsparumas antimikrobinėms medžiagoms laukinių paukščių populiacijoje ... 62
6
3.2.3. Antibiotikams atsparumą koduojančių genų nustatymas tarp E. coli,
išskirtų iš laukinių paukščių ... 68
3.2.3. E. coli atsparumas kolistinui ir mcr-1 geno nustatymas, laukinių paukščių populiacijoje ... 71
3.3. Laukinių paukščių metagenominiai tyrimai ... 72
3.4. Stafilokokų genties bakterijos paukštienos produktuose ... 80
3.4.1. Stafilokokų paplitimas paukštienos produktuose ... 80
3.4.2. Stafilokokų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms paukštienos produktuose ... 81
3.4.3. Rūšinė stafilokokų įvairovė paukštienos produktuose ... 86
3.4.4. Antibiotikams atsparumą koduojančių genų paplitimas tarp stafilokokų bakterijų, išskirtų iš paukštienos produktų ... 87
3.4.5. Iš paukštienos produktų išskirtų stafilokokų rūšių, kokybinio ir kiekybinio atsparumo antimikrobinėms medžiagoms bei genetinių determinantų paplitimas tarp tam tikrų Staphylococcus spp. padermių duomenys ... 88
3.5. E. coli bakterijos paukštienos produktuose ... 94
3.5.1. E. coli paplitimas paukštienos produktuose ... 94
3.5.2. E. coli atsparumas antimikrobinėms medžiagoms paukštienos produktuose ... 95
3.5.3. Antibiotikams atsparumą koduojančių genų paplitimas tarp E. coli bakterijų, išskirtų iš paukštienos produktų ... 100
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS ... 104
4.1. Stafilokokų paplitimas laukinių paukščių populiacijoje ir jų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 104
4.2. E. coli paplitimas laukinių paukščių populiacijoje ir jų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 106
4.3. Laukinių paukščių mikrobiotos įvairovė... 108
4.4. Stafilokokų paplitimas paukštienos produktuose ir jų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 111
4.5. E. coli paplitimas paukštienos produktuose ir jų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 112
IŠVADOS ... 115
REKOMENDACIJOS ... 117
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 118
PASKELBTOS PUBLIKACIJOS DAKTARO DISERTACIJOS TEMA ... 135
SUMMARY ... 167
GYVENIMO APRAŠYMAS ... 220
CURRICULUM VITAE ... 221
7
SANTRUMPOS
AMP – ampicilinas C – chloramfenikolis CIP – ciprofloksacinas CLI – klindamicinasCLSI – Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas CN – gentamicinas
DNR – deoksiribonukleorūgštis E – eritromicinas
ECDC – Europos ligų prevencijos ir kontrolės centras
EMST – (angl. EFSA) Europos maisto saugos tarnyba EHEC – enterohemoraginė E. coli
EIEC – enteroinvazinė E. coli EPEC – enteropatogeninė E. coli ES – Europos Sąjunga
ESVAC – European Surveillance of Veterinary Antimicrobial Consumption
EAEC – enteroadhezinė E. coli ETEC – enterotoksigeninė E. coli
EUCAST – Europos antimikrobinio jautrumo tyrimų komitetas FOX – cefoksitinas
GAT – gatifloksacinas IMP – imipenemas LEVO – levofloksacinas
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
MASA – (angl. MRSA) meticilinui atsparus Staphylococcus aureus MSK – mažiausioji slopinamoji koncentracija
NCBI – Nacionalinis biotechnologijos informacijos centras
NVSTC – (angl. NHSN) Nacionalinis visuomenės sveikatos tyrimų centras. NGS – naujos kartos sekoskaita
nuc – termonukleazės genas OXA – oksacilinas
P – penicilinas
PGR – polimerazinė grandininė reakcija
PGSO – (angl. OIE) Pasaulio gyvūnų sveikatos organizacija PSO – Pasaulio sveikatos organizacija
PVBL – (angl. ESBL) plataus veikimo spektro beta laktamazės PVL – Pantono ir Valentino leukocidino toksinas
SXT – sulfonamido ir trimetoprimo derinys rRNR – ribosominė ribonukleorūgštis TE – tetraciklinas
VA – Veterinarijos akademija
VMVT – Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba VTD – vidutinė dienos (paros) gydomoji dozė
8
ĮVADAS
Bakterijų atsparumas antibiotikams yra gerai žinoma ir itin aktuali šiandieninės medicinos problema visame pasaulyje, tačiau skiriama per mažai dėmesio šios problemos daugialypiškumo suvokimui. Šis fenomenas susijęs ne tik su antibiotikų naudojimu gydymui, bet ir su sudėtingais per visą evoliuciją susidariusiais bakterijų apsaugos ir prisitaikymo mechanizmais. Bakterijų atsparumo antibiotikams plitimą gali lemti daug veiksnių, susijusių tiek su žmogaus veikla, tiek ir su natūraliais gamtos procesais.
Antibiotikams atsparios bakterijos į žmogaus organizmą gali patekti per maisto grandinę, aplinką, kontaktą su gyvūnais. Patogeniškų bakterijų atsiradi-mas ir patekiatsiradi-mas į gyvūnų organizmą – aktuali veterinarijos problema [1–4]. Antibiotikai veterinarijoje naudojami gyvūnams gydyti, o kai kuriose šalyse ir profilaktikai. Antimikrobinės medžiagos, patekusios į gyvūno organizmą, žarnyne yra dažniausiai blogai absorbuojamos, tam tikras kiekis jų išsiskiria su gyvūnų išmatomis, šlapimu į aplinką. Dažnai žemės ūkyje gyvūnų išmatos naudojamos dirvai gerinti, o tai kelia susirūpinimą, nes antibiotikų likučiai daro žalą aplinkai [5]. Taip atsiranda galimybė antibiotikams patekti į lau-kinių gyvūnų organizmus, jiems maitinantis žemės ūkio kultūromis, geriant dirvos paviršiuje susikaupusį vandenį.
Vis daugiau bakterijų tampa atsparios ne tik daugiausia vartojamiems, bet apskritai visiems žinomiems antibiotikams. Tokios bakterijos yra meticili-nui atsparūs Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus pnaumoniae,
Klebsiella pneumoniae. Vis dar nėra aišku, kaip vienos padermės sugeba taip
prisitaikyti savo mechanizmais ir išlikti gyvybingos, taip mažindamos įprastų užkrečiamųjų ligų gydymo galimybes, todėl milijonai žmonių kasmet miršta nuo bakterijų sukeltų infekcijų [6].
Dauginis bakterijų atsparumas (angl. multi-resistance) antibiotikams dažnai laikomas viena didžiausių visuomenės sveikatos grėsmių tiek medici-noje, tiek veterinarijoje. Dauguma bakterijų, nustatomų aplinkoje, žmogaus organizme kaip natūralioji mikrobiota gali įgyti atsparumą antibiotikams, vėliau atsparumą jos gali perduoti visiškai negiminingoms ligas sukelian-čioms bakterijoms. Medicininos priežiūra gerėja, sukuriama tobulesnės maisto ir geriamojo vandens ruošimo technologijos, tačiau pastarąjį dešimt-metį sergamumas užkrečiamosiomis ligomis nemažėja. Šiuo metu infekci-nėms ligoms gydyti plačiausiai vartojami natūralūs arba pusiau sintetiniai antibiotikai, slopinantys baltymų sintezę (pvz., makrolidai, aminoglikozidai ir tetraciklinai), ribonukleorūgščių sintezę (pvz., rifampinai), jų sienelės susidarymą (pvz., penicilinai, cefalosporinai, glikopeptidai). Greta mikrobio-loginės kilmės antibakterinių junginių (antibiotikų), infekcijoms gydyti taip
9
pat vartojami sintetiniai antibakteriniai preparatai: fluorochinolonai, stabdan-tys bakterijų DNR replikaciją, oksazolidinonai, slopinanstabdan-tys baltymų sintezę, arba sulfonamidai, slopinantys folio rūgšties sintezę [7].
Gali būti įvairių atsparumo antimikrobinėms medžiagoms priežasčių: peršalimo ligoms gydyti skiriama plataus veikimo spektro antibiotikų, maisto pramonėje naudojami antibiotikai, žemės ūkyje gyvulių ligų profilaktikai ir augimui skatinti naudojami antibiotikai. Europos ligų profilaktikos ir kont-rolės centro (ECDC) duomenimis, 2016 m. bendras antimikrobinių vaistinių preparatų suvartojimas ligoninėse VTD/1000-čiui gyventojų per dieną skirtingose Europos šalyse svyravo 38,6 Graikijoje iki 11,4 Olandijoje, Lietu-voje buvo 19,5 VTD/1000-čiui gyventojų per dieną [8].
Europos vaistų agentūros (EMA) duomenimis, Lietuvoje vienam kilogramui ūkinio gyvūno biomasės tenka 39,4 mg antibiotikų, o Europos Sąjungos (ES) vidurkis – 144 mg. Daugiausia antiobiotikų vienam kilogra-mui ūkinio gyvūno biomasės tenka Ispanijoje, Italijoje, Olandijoje, Vokieti-joje. Lietuvoje pastaruosius kelerius metus veterinarijos ir žemės ūkio sektoriuose fiksuojamas antibiotikų sunaudojimo sumažėjimas, 2010 metais sunaudota 16,4 tonos, o 2015 m. – 13,1 tonos [9].
Pasaulio sveikatos organizacija skelbia, kad bakterijų atsparumas anti-biotikams – globali problema. Šios problemos mastai apima visas pasaulio šalis. Europa, Pietryčių Azija, Amerika – regionai, aktyviai dalyvaujantys įvairiose programose antibiotikų vartojimo kontrolei stiprinti [10].
Atsparių antibiotikams bakterijų plitimo keliai yra įvairūs: netinkamai vartojant antibiotikus, per maisto grandinę, laukinėje gamtoje per vandenį, gyvūnų išmatas, dirvožemį. Todėl vertinant visus įmanomus patekimo į žmogaus ir gyvūno organizmą kelius, svarbu įvertinti paukščių – kaip galimų atsparių antibiotikams bakterijų platintojų – vaidmenį. Svarbu nustatyti, kokios ir kokioms antimikrobinėms medžiagoms atsparios bakterijos yra paplitusios naminių ir laukinių paukščių populiacijose, siekiant geriau suprasti atsparių bakterijų epidemiologiją ir plitimą, nes naminiai paukščiai yra viena daugiausia auginamų gyvūninės produkcijos rūšių, o laukiniai paukščiai gali platinti tokias bakterijų padermes neribotais nuotoliais ir per trumpą laiką.
Darbo tikslas:
Ištirti Staphylococcus spp. ir Escherichia coli atsparumą antibiotikams laukinių ir naminių paukščių populiacijose bei įvertinti galimą jų dalyvavimą pernešant ir platinant atsparias antibiotikams bakterijas.
10 Uždaviniai:
1. Išskirti tarp laukinių ir naminių paukščių (jų produkcijoje) paplitu-sias indikatorines-zoonozines bakterijas (Escherichia coli ir
Staphy-lococcus spp.) ir nustatyti šių bakterijų jautrumą antibiotikams.
2. Įvertinti naminių ir laukinių paukščių rūšių mikrobiotos atsparumo antibiotikams ypatumus.
3. Nustatyti genetinius determinantus, koduojančius paukščių bakterijų atsparumą antibiotikams ir juos palyginti su bakterijų, žmonių organizmuose ir naminių gyvūnų populiacijose žinomais genetiniais determinantais.
4. Įvertinti paukščių kaip galimo atsparių antibiotikams bakterijų pla-tintojų vaidmenį.
Darbo naujumas ir praktinė reikšmė
Tyrimų metu (2013–2017 metais) išskirtos ir įvertintos antibiotikams atsparios stafilokokų ir ešerichijų padermės iš naminių vištų (Gallus gallus
domesticus), įvertinta galimybė tokioms padermėms plisti per maisto
gran-dinę.
Pasaulyje nėra daug tyrimų, kurių metu nustatytos į laukinių paukščių organizmus patekusios atsparios antibiotikams bakterijos. Todėl svarbu įvertinti sėslių ir migruojančių laukinių paukščių vaidmenį Lietuvoje, turint ir pernešant antibiotikams atsparias stafilokokų ir ešerichijų padermes.
Pirmą kartą pasaulyje iš laukinio gyvūno – sidabrinio kiro (Larus
argentatus) – išskirtose E. coli buvo nustatytas mcr-1 genas, esantis
plazmi-dėje ir koduojantis atsparumą kolistinui. Pirmą kartą Lietuvoje ištirta tiek daug laukinių paukščių rūšių, įvertintas jų, kaip atsparių antibiotikams bakte-rijų platintojų, vaidmuo.
Pirmą kartą Lietuvoje tiriant laukinių paukščių populiacijų bakterijų jautrumą antibiotikams buvo nustatyti meticilinui atsparūs Staphylococcus
aureaus (MRSA) ir kiti meticilinui atsparūs stafilokokai bei plataus veikimo
spektro beta laktamazes gaminančios (ESBL) E. coli.
Mūsų duomenimis, pirmą kartą pasaulyje buvo atlikti metagenominiai tyrimai ir įvertinta sidabrinių kirų (Larus argentatus) mirobiotos įvairovė.
Vykdant tyrimus naujausiais molekulinės biologijos metodais tirta laukinių ir naminių paukščių mikrobiota, nustatytas atsparių antibiotikams bakterijų paplitimas paukščių organizmuose. Tokiu būdu buvo gauta aktualių ir naujų duomenų mokslui ir visuomenei.
11 Darbo aprobacija
Pagrindiniai disertacijos rezultatai paskelbti keturiuose straipsniuose, referuojamose duomenų bazėje „Clarivate Analytics Web of Science“ ir turinčiuose cituojamumo rodiklį. Duomenys skelbti mokslo populiarinimo leidiniuose. Tyrimų rezultatai pristatyti dvylikoje tarptautinių ir keturiose nacionalinėse mokslinėse konferencijose.
Darbo apimtis
Darbą sudaro įvadas, literatūros apžvalga, tyrimų metodai ir metodų aprašymas, rezultatai, rezultatų aptarimas, išvados, rekomendacijos, paskelb-tos publikacijos daktaro disertacijos tema, kipaskelb-tos paskelbpaskelb-tos publikacijos, daly-vavimas konferencijose, padėka, gyvenimo aprašymas, darbe vartoti literatū-ros šaltiniai (256 šaltiniai), disertacijos santrauka (angl. summary) anglų kalba. Darbo apimtis 222 puslapiai, tyrimų rezultatai pateikti 50 lentelių, 27 paveiksluose.
12
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bakterijų atsparumas skirtingų klasiųantibiotikams ir epidemiologija
Antibiotikai – tai medžiagos, vartojamos ligoms gydyti. Šios medžiagos slopina mikroorganizmų dauginimąsi. Antibiotikų atradimas yra vienas svarbiausių medicinos istorijos įvykių. Šie įvykiai neatsiejami nuo Pauliaus Erlicho (Paul Ehrlich) humoralinio imuniteto teorijos. Būtent šio mokslininko paskelbti darbai davė pradžią antibiotikus skirti užkrečiamosioms ligoms gydyti. Didelis indėlis mikrobiologo Aleksandro Flemingo (Alexsander Fleming), kuris atrado, kad pelėsis Penicillium notatum gamina medžiagas, žudančias pūliavimą sukeliančias bakterijas, ir jas pavadino pagal gamintoją (angl. producer) penicilinu [11–13].
Pramoninės mikrobiologijos tempai didėjo XX amžiuje, buvo greitai ieškoma naujų antibiotikų ir tobulinami jų gamybos būdai. Reikšmingi mikrobiologijos ir epidemiologijos įvykiai ir datos pateikti 1.1.1 pav. [14].
13
1.1.1 pav. Reikšmingi mikrobiologijos ir
epidemiologijos įvykiai ir datos [14]
PDR (angl. pan drug-resistant) – visiškai atsparus vaistui; R (angl. resistant) – atsparus; XDR (angl. extensively drug-resistant) – plačiai atsparus vaistams.
Iš pateiktos trumpos antibiotikų istorijos matyti, kad atsparios bakterijos atsirado ne tada, kai buvo pradėti naudoti pirmieji antibiotikai. Jos aplinkoje buvo jau daug metų. Edita Siužedelienė teigia, kad tokios bakterijos
egzistuo-14
ja biosferoje milijonus metų – kaip ir genų, lemiančių atsparumą patiems nau-jausiems sintetiniams antibiotikams, prototipai jų genomuose. Todėl atspa-rumo antibiotikams atsiradimo ir išsilaikymo šaltinių reikėtų nuodugniai paieškoti ir įvairiose gamtinėse nišose – gamtos „cheminėse laboratorijose“. Jose vienų organizmų gaminami antibiotikai ar kitos biologiškai aktyvios medžiagos galėtų skatinti atsparumą šalia jų egzistuojančioms rūšims, iš kurių atsparumą lemiantys genai galėtų toliau plisti. Tai mažai ištyrinėta sritis, dabar susilaukianti labai atidaus tyrėjų dėmesio [15].
Šiuo metu pasaulio medicinoje naudojama per 4000 junginių, turinčių antimikrobinių savybių. Antibiotikais gydomos infekcijos, skatinamas gyvūnų augimas. Infekcinėms ligoms gydyti plačiausiai vartojami natūralūs arba pu-siau sintetiniai antibiotikai. Vieni antibiotikai slopina bakterijų augimą, kiti – slopina baltymų sintezę (pvz., makrolidai, aminoglikozidai ir tetraciklinai), ribonukleorūgščių sintezę (pvz., rifampinai), DNR replikaciją (pvz., chinolo-nai) bakterijose, jų sienelės susidarymą (pvz., penicilinai, cefalosporinai, glikopeptidai). Greta mikrobiologinės kilmės antibakterinių junginių (anti-biotikų), infekcijoms gydyti taip pat vartojami sintetiniai antibakteriniai prie-paratai: fluorochinolonai, stabdantys bakterijų DNR replikaciją, oksazolidi-nonai, slopinantys baltymų sintezę, arba sulfonamidai, slopinantys folio rūgš-ties sintezę. Antibiotikų veiksmingumą lemią jų klasė ir koncentracija [7, 16].
Pastaraisiais metais padidėjęs antibakterinių ir priešgrybelinių preparatų vartojimas sukėlė padidėjusį bakterijų atsparumą šiems vaistams. Todėl šiuo metu atliekama nemažai tyrimų, susijusių su klinikinio atsparumo padariniais [17]. Medicinoje naudojama tikrai nemažai veiksmingų antibiotikų, tačiau visada buvo ir yra mikroorganizmų, atsparių antibiotikams. Antibiotikų veikimo mechanizmas – slopina ar visai pašalina tam tikrą mikroorganizmų metabolizmo proceso grandį kaip antibiotiko poveikio taikinį: antibiotikas jungia (inaktyvina) tam tikrą fermentą arba mikroorganizmo gyvybingumui būtiną molekulinę struktūrą. Jis, pasiekęs tam tikrą koncentraciją, nekenks-mingą eukariotinėms šeimininko ląstelėms, nutraukia mikroorganizmo gyvy-bingumą [13].
Bakterijos, kurios įgyja atsparumą antibiotikams, kelia dideles grėsmes medicinoje ir veterinarijoje. Nauji atsparumo mechanizmai aiškinami genų transmija: atsparumą gali lemti genai, kurie gali būti perduodami tarp pačių bakterijų [18].
Kasmet pasaulyje dėl atsparių antibiotikams bakterijų sukeltų infekcijų miršta 700 000 žmonių, Europoje – 25 000. Manoma, kad 2050 metais tokios infekcijos pražudys dešimtis milijonų žmonių 1.1.2 pav. [19].
15
1.1.2 pav. Prognozinė 2050 metais pasaulyje infekcijų
sukeltų mirčių statistika [19]
Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) teigia, kad žmonės turėtų atsakin-gai vartoti antibiotikus, nes susidariusi atsaparumo antibiotikams situacija kelia didelį susirūpinimą. Nesvarbu, kad mokslininkai sukuria naujus vaistus, bet bakterijos labai greitai įgyja atsparumą ir naujiems antibiotikams. Jeigu nebus imtasi griežtų atsakingo antibiotikų vartojimo priemonių, pasaulis sugrįš į laikotarpį, kai antibiotikai nebuvo atrasti, ir nuo mažiausių sužalojimų žmonės mirs [20].
Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, šiuo metu į pavojingiausių bakterijų sąrašą įtrauktos šios rūšys: Acinetobacter baumannii, Enterobacter
aerogenes / cloacae, Enterococcus faecalis / faecium, Escherichia coli
(E. coli), Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella
Typhi / Paratyphi, Staphylococcus aureus ir Streptococcus pneumoniae [21].
Šis sąrašas sudarytas pagal šiuos kriterijus: kritinio, didelio, vidutinio lyg-menų pavojai [22].
Žmonėms ir gyvūnams gydyti naudojami antibiotikai yra skirstomi į kritiškai svarbius, labai svarbius ir svarbius. 2016 metais Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) paskelbė, kad didžiausias dėmesys turi būti skiriamas ir bakterijų atsparumo situacija stebima šių antibiotikų: ciprofloksacino (fluoro-chinolonų), cefotaksimo ir ceftazidimo (trečiosios kartos cefalosporinų),
16
meropenemo (karbapenemų), kolistino (polimiksino E) ir azitromicino (makrolidų) [23]. Kritiškai svarbūs antibiotikai, kurie vartojami medicinoje ir naudojami veterinarijoje, pateikti 1.1.1 lentelėje [24, 25].
1.1.1 lentelė. Kritiškai svarbių antibiotikų sąrašas
Žmonėms kritiškai svarbūs antibiotikai
(pagal PSO) Gyvūnams kritiškai svarbūs antibiotikai (pagal PGSO (OIE))
3 ir 4 kartų cefalosporinai Aminoglikozidai
Fluorochinolonai Cefalosporinai Aminoglikozidai Makrolidai Makrolidai Penicilinai Karbapenemai Chinolonai Glikopeptidai Fenikoliai Glicilciklinai Sulfonamidai Oksazolidinonai Tetraciklinai Penicilinai Spektinomicinas Polimiksinai Antituberkulioziniai vaistai
Atsparumas antibiotikams yra viena pagrindinių visuomenės sveikatos problemų visame pasaulyje, todėl reikia imtis tarptautinių priemonių šiai problemai spręsti. Hermanʼas Goossensʼas ir kt. pateikė nemažai duomenų apie žmogaus patogeniškų bakterijų paplitimą. Šie duomenys rodo, kad atsparumas skirtingoms antibiotikų grupėms Europoje yra labai skirtingas dėl geografinių skirtumų [26, 27].
Visame pasaulyje ligoninėse yra susidariusi labai skirtinga atsparumo antibiotikams situacija. Pastaruosius keletą metų gydymo įstaigose stebimas gramneigiamųjų bakterijų atsparumas karbapenemams. Todėl tokiems ligo-niams gydyti yra skiriamas kritiniais atvejais vartojamas antibiotikas – kolis-tinas. Iki pat 2015-ųjų vaistas kolistinas buvo laikomas antibiotiku, kuriam bakterijos nesugeba įgyti atsparumo. Tačiau pernai baigiantis metams grupė Kinijos mokslininkų paskelbė aptikę kelių rūšių enterobakterijų, kurių atspa-rumą kolistinui lemia genas, pavadintas mcr-1, esantis vadinamojoje plazmi-dėje – DNR molekulėje. Nustatyta, kad DNR molekulės iš vienų gali būti perduodamos kitoms bakterijoms. Po Kinijos mokslininkų atradimo viso pasaulio šalių mikrobiologai ėmėsi mcr-1 geno ieškoti kolistinui atspariose bakterijose. Per pirmuosius 2016 m. mėnesius žmonių, naminių, laukinių gyvūnų ir iš maisto išskirtose bakterijose jų aptiko Danijos, Vokietijos, Pran-cūzijos, Italijos, Amerikos ir Jungtinės karalystės šalių tyrėjai [28–30].
17
Kinijos mokslininkai įvairiuose šaltiniuose toliau savo šalyje tyrinėjo dauginio atsparumo gramneigiamąsias bakterijas ir jų atsparumą kolistinui lemiančius mcr genus. 2016 metais atlikus mcr-1 geno paieškas ir nustačius šiuos genus skirtinguose gyvūnuose, buvo pradėta ieškoti ir kitų genų, lemiančių atsparumą kolistinui: mcr-2 ir mcr-3. Jileiʼas Zhangasʼas kartu su bendraautoriais atliko tyrimus ir nustatė: mcr-1 genas iš paukščių išskirtose enterobakterijose buvo nustatytas kiaulėse – 79,2 proc., žąsyse – 71,7 proc., viščiukuose – 31,8 proc., antyse – 34,6 proc., balandžiuose – 13,1 proc. visų tirtų mėginių. mcr-2 genas buvo paplitęs kiaulėse – 56,3 proc., viščiukuose – 5,5 proc., žąsyse – 5,5 proc., antyse – 2,3 proc., balandžiuose šio geno nenustatyta. Iš tų pačių šaltinių išskirtų padermių buvo ieškoma mcr-3 geno, kiaulėse jis buvo aptiktas 18,7 proc. visų tirtųjų atvejų, antyse – 18,8 proc., žąsyse – 11,9 proc., viščiukuose ir balandžiuose po 5 proc. atvejų. Iš visų tirtų mėginių 177 kiaulių ir trys viščiukų izoliatai turėjo visus tris šiuos genus. Atlikti tyrimai atskleidė, kad Kinijoje kiaulių ir naminių paukščių populiacijose gramneigiamosios bakterijos turi kolis-tinui atsparumą koduojančius genus, todėl labai svarbu imtis visų įmanomų profilaktikos priemonių, kad šios bakterijos toliau nebūtų perduodamos kitiems gyvūnams, ypač per maisto grandinę žmogui [31].
Jungtinėse Amerikos Valstijose Nacionalinis sveikatos priežiūros tinklas (NHSN) 2009–2010 metais atliko bakterijų atsparumo antibiotikams stebėse-ną. NHSN, pranešė, kad ligoninėse buvo pastebėtas nedidelis MRSA infek-cijų sukeltų atvejų sumažėjimas, bet nustatyta nemažai gramneigiamųjų bakterijų, pvz., E. coli, K. pneumonia, P. aeruginosa, A. baumanni,
Entero-bacter spp. atvejų, atsparių daugeliui antibiotikų. Atsparumas
karbapene-mams buvo nustatytas šešioms padermėms Escherichia coli, Enterobacter
cloacae, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca ir Acinetobacter baumannii, kurios dažniausiai buvo atsparios šiems
antibio-tikams. Acinetobacter baumannii padermių atsparumas siekė 60 proc. [32]. Bakterijų atsparumas antibiotikams tapo pagrindine visuomenės svei-katos problema Indijoje. Šios šalies ligoninėse atlikti mikrobiologiniai tyri-mai parodė labai sudėtingą ir sunkiai valdomą atsparumo antibiotikams padėtį. Antibiotikams atsparių bakterijų sukeltų infekcijų skaičius greitai didėja. Įvairiuose Indijos regionuose tirtų ligoninių tyrimų ataskaitos rodo, kad praplėsto veikimo spektro beta laktamazes gaminančių bakterijų (ESBL) paplitimas svyruoja 19–60 proc., karbapenemams atsparumas siekia 5,3– 59 proc. [33]. Mumbajuje (Vakarų Indija) 18,5 proc. tirtų enterobakterijų izo-liatų yra atsparūs karpanemams, turi karbapenemams atsparumą koduojan-čius genus [34]. Kalkutos onkologijos ligoninėje buvo nustatytos 24
18
lemiančios tokius neigiamus rodiklius Indijoje, – prastos socialinės ir ekono-minės gyvenimo sąlygos [35].
Europoje pastarąjį dešimtmetį bakterijų atsparumui antibiotikams skiriamas gana didelis dėmesys. Vertinant 30 Europos šalių pateiktus ataskaitos duomenis, gramneigiamųjų bakterijų atsparumas antibiotikams išlieka gana didelis [36]. Europoje daugelio mikrobiologijos laboratorijų pateiktose ataskaitose pastebimas padidėjęs bakterijų atsparumas kelioms antibiotikų grupėms: fluorochinolonams, trečiosios kartos cefalosporinams ir aminoglikozidams. 2012–2015 m. iš Europos ligoninių gautų ataskaitos duo-menų pastebimas padidėjęs K. pneumoniae ir E. coli atsparumas trečiosios kartos cefalosporinams. Didžiausias atsparumo lygis, apie kurį pranešta, yra karbapenemams – Acinetobacter baumannii atsparumas kai kuriose Pietų ir Pietryčių Europos dalyse ir Baltijos šalyse siekia daugiau kaip 80 proc. To-kiems rezultatams įtakos turi molekuliniai bakterijų mechanizmai, todėl klinikinėje praktikoje mažėja gydymo alternatyvų [37].
Bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms keliamos grėsmės aktualios ir Lietuvai. Lietuvoje nuolat atliekami bakterijų atsparumo anti-mikrobinėms medžiagoms tyrimai. Atsparumas antibiotikams yra natūralus reiškinys, kurį sukelia bakterijų genų mutacijos. Kai kurios atsparios bakteri-jos, susijusios su maisto vartojimu, gali būti perduodamos iš gyvūnų žmo-nėms per maistą. Gyvūnai gali užsikrėsti bakterijomis, kurios atsparios žmonių infekcijoms gydyti vartojamiems antibiotikams [36]. Palyginus Pietų ir Rytų Europos regionus su Šiaurės ir Vakarų Europa, pastaruosiuose bakterijų atsparumas antibiotikams buvo mažesnis. Šiaurės Europos šalyse atsparumo antibiotikams rodikliai yra gana maži, tačiau Pietų ir Centrinėje Europoje šie rodikliai kelia didelį susirūpinimą. Antibiotikų suvartojimo kiekiai vis dažniau įvardijami kaip pagrindinė bakterijų atsparumo antibiotikams prie-žastis. Todėl visose srityse – medicinoje, veterinarijoje, žemės ūkyje, maisto pramonėje – turi būti vykdoma antibiotikų stebėjimo kontrolė [38]. Europos šalyse vykdomos įvairios iniciatyvos, kaip sumažinti bakterijų atsparumą antibiotikams. Jos apima sudėtines priemones, kurių pagrindinis tikslas – visuomenei ir sveikatos priežiūros specialistams suteikti žinių apie tinkamą antibiotikų vartojimą bei bakterijų atsparumo antibiotikams priežastis ir keliamas grėsmes, kylančias dėl netinkamo antibiotikų vartojimo [39].
1.2. Stafilokokų genties bakterijų morfologija ir bendrosios savybės Stafilokokai – tai gramteigiamosios, apvalios formos, apie 0,6–1 μm ilgio bakterijos. Šios bakterijos nėra judrios, nesudaro sporų. Stafilokokai sintetina katalazę, fermentuoja daug angliavandenių ir sudaro pieno rūgštį, jiems
19
būdingas skirtingas protoeolizinis aktyvumas. Prie stafilokokų genties priski-riamos 42 rūšys ir 24 porūšiai. Šios genties bakterijos yra vertinamos pagal fenotipines ir genotipines savybes. Dažniausiai šios bakterijos klasifikuo-jamos į dvi grupes, ar šios genties bakterijos sintetina fermentą koaguliazę, ar ne. Stafilokokai – tai bakterijos, kurių virulentiškumas pasireiškia daugybe įvairių infekcijų žmonių ir gyvūnų organizmuose [40, 41]. Stafilokokai žmo-gaus ir gyvūnų organizme gyvena kaip komensalai, tačiau susilpnėjus imuni-nei šeimininko sistemai, jos gali tampti patogeniškos. Staphyloccus epidermis ir Staphylococcus saprophyticus – koaguliazės neigiamieji stafilokokai, tai rūšys, sukeliančios žmonėms šlapimo takų ir kvėpavimo infekcijas.
Staphy-lococcus aureus, StaphyStaphy-lococcus intermedius, StaphyStaphy-lococcus pseudinter-medius yra koaguliazės teigiamosios padermės, šios padermės – aktualūs
patogenai medicinoje ir veterinarijoje [42]. Trisdešimt procentų žmonių po-puliacijos savo organizmuose turi Staphylococcus aureus bakterijų [43]. Vi-same pasaulyje šios bakterijų rūšies sukeltos infekcijos labiausiai yra apra-šytos ir ištirtos daugelio šalių mokslininkų. Mokslininkai susiduria su proble-momis, kaip suvaldyti tam tikruose regionuose šių bakterijų plitimą gydymo įstaigose [44].
Stafilokokai išskiria ir sintetina egzotoksinus. Kiekviena S. aureus pa-dermė gali sintetinti keletą pirogeninių egzotoksinų ir taip sukelia imuninio atsako reakcijas. Stafilokokų enterotoksinai yra skirtingų stafilokokų rūšių išskiriami toksinai. Šie bakterijų baltymai yra patogeniški ir susiję su tam tikromis žmonių ligomis. Dažniausiai šiuos toksinus išskiria S .aureus, nors ir kitos šios genties bakterijos juos išskiria [45]. Enterotoksinai neutralizuoja virškinimo fermentus, yra termostabilūs. Toksinai skirstomi į keletą tipų, dauguma susiję su maisto produktų sukeltais apsinuodijimais [46]. Pastarąjį dešimtmetį greitai tobulėjantys tyrimo metodai ir technologijos mokslinin-kams leido išanalizuoti stafilokokų genomus ir duomenų bazėse sukaupti duomenis. Juos vartojant galime palyginti tam tikras rūšis, išskirtas iš skirtingų regionų įvairių šaltinių ir taip vykdyti jų stebėseną [47].
1.3. Stafilokokų paplitimas paukštienoje ir kituose maisto produktuose
Stafilokokų genties bakterijos paplitusios visur: ore, aplinkoje, vande-nyje, žmonių organizmuose, naminių paukščių, gyvūnų populiacijose. Šios bakterijos sukelia nemažai infekcijų: Amerikoje 2005 metais iš nustatytų 94 360 meticilinui atsparių Staphylococcus aureus (MRSA) sukeltų infekci-jos atvejų 18 650 pasibaigė mirtimi [48]. Tokiu būdu per gyvūnus atsiranda
20
galimybė atsparioms antibiotikams bakterijoms skerdimo metu patekti į par-duodamus gaminius ir per maisto grandinę – į žmogaus organizmą [49, 50]. 1884 metais Mičigane pirmą kartą aprašyti stafilokokų sukelti apsinuodijimo atvejai, kai žmonės vartojo stafilokokais užterštus sūrio produktus. Po dešim-ties metų buvo atlikti galvijų mėsos tyrimai. Taip pat buvo išskirta stafiloko-kų, kurie sukėlė nemažai apsinuodijimų [51, 52]. Daugelio mokslininkų nuomone, stafilokokų paplitimas maisto gaminiuose – viena dažniausių apsi-nuodijimų infekcijų priežasčių [53]. Paukštiena, kaip ir visi kiti mėsos pro-duktai, dažnai yra užteršta bakterijomis, kurios į mėsa patenka tiek endoge-niniu, tiek egzogeniniu būdais. Į mėsą patogeniškų mikroorganizmų gali patekti tiek iš sergančių paukščių, tiek iš aplinkos [54]. Stafilokokai – vieni iš plačiausiai paplitusių mikroorganizmų. Staphylococcus aureus yra gerai žinomas žmonių ir gyvūnų patogenas. Šių bakterijų atsparumas meticilinui kelia grėsmę žmonių sveikatai [55].
Staphylococcus aureus išskiriami enterotoksinai sukelia stafilokokinę
maisto intoksikaciją. Tai dažniausia per maistą sukelta infekcija pasaulyje. Žmogaus organizme apsinuodijimą sukelia temperatūrai ir proteazėms atspa-rūs maiste susikaupę enterotoksinai [56, 57]. Kitos šios genties rūšys, kurios taip pat svarbios, yra S. hyicus, S. sciuri, S. xylosus ir S. cohnii. Atlikti tyrimai parodė, kad šios padermės turi genų, koduojančių atsparumą tam tikriems antibiotikams [58, 59]. Stafilokokų genties bakterijos žmogaus ir gyvūnų, paukščių organizme nustatomos kaip normalioji mikrobiota. Dažniausiai jų randama ant odos ir nosiaryklėje. Šios bakterijos gali išgyventi ir kauptis paukščių organizme ir po fiziologinių, mechaninių procesų [60, 61]. Šios genties bakterijos – vienos vyraujančių paukštienos skerdienoje [62]. Didelė tikimybė žmogui, vartojančiam paukštienos gaminius užsikrėsti skirtingomis stafilokokų rūšimis, atspariomis antibiotikams. Stafilokoko kamienas, pava-dintas ST3980, yra atsparus visiems šiuo metu žinomiems ir medicinoje vartojamiems antibiotikams. Europoje yra nemažai gyvulių, užsikrėtusių šia paderme. Olandijoje nustatyta, kad broilerių pulkuose MRSA paplitimas siekė 35 proc. visų tirtų mėginių, iš jų didžioji dalis priklausė sekos tipui ST3980. Šis tipas susijęs su iš gyvūnų išskirtomis MRSA padermėmis. ST3980 atsiradimas susijęs su besaikiu antibiotikų naudojimu auginant galvi-jus (daugiausia – kiaules) Europos fermose. Iš pradžių ištyrus skerdyklų broilerius, 8 proc. broilerių organizmuose buvo paptitęs MRSA (iš visų tirtų mėginių), tačiau dienos laikotarpiu padidėjo iki 35 proc. Ištyrus skerdyklų darbuotojus nustatyta 1,9 proc. MRSA turėtojų, o tarp kitų fermos darbuotojų MRSA paplitimas siekė 0,1 proc. [63].
Visame pasaulyje didelis dėmesys skiriamas maistui naudojamų gyvūnų stebėjimui, nes gyvūnai platina patogeniškas bakterijas, kurios atsparios kri-tiškai svarbiems antibiotikams. Per maisto grandinę, vandenį, dirvožemį šios
21
padermės gali patekti į žmogaus organizmą. Veiksniai, lemiantys antibioti-kams atsparių bakterijų atsiradimą, pavaizduoti 1.3.1 pav. [64].
1.3.1 pav. Veiksniai, lemiantys antibiotikams
atsparių bakterijų atsiradimą ir plitimą [64]
Mikroorganizmų sukeliami apsinuodijai maistu skirstomi į dvi grupes: toksikoinfekcinės ligos – tai užkrečiamosios ligos: maisto produktai yra tik patogeniškų mikroorganizmų pernešikliai nuo sergančio (ar bakterijų turėtojo) organizmo sveikam (maisto sukeltos infekcinės ligos). Šie sukėlėjai maisto produktuose nesidaugina, tačiau ilgai išsilaiko ir nepalankiomis sąly-gomis ir gali būti virulentiški. Kita grupė – mikroorganizmų intoksikacijos, šias ligas sukelia mikroorganizmų toksinai. Staphylococcus aureus – viena dažniausių maisto infekcijas sukeliančių bakterijų, šioms bakterijoms tam tikri maisto produktai – tai puiki terpė išlikti virulentiškiems. Mėsa, daržovės, kiaušiniai, pienas, pyragaičių kremai, įvairūs padažai, naudojami maistui ruošti, – tai produktai, iš kurių buvo išskirtos antibiotikams atsparios
22
Naminiai paukščiai turi įvairių stafilokokų rūšių, o šių bakterijų sukeltos infekcijos yra dažnos paukštynuose. Sergančių paukščių infekcijų sukelėjai –
Staphyloccocccus aureus, Staphylococcus hyicus – padermės. Paukščių Sta-phylococcus aureus – dažniausia pėdų, kojų infekcijų, sepsio priežastis [67].
Stafilokokai paukščiams gali sukelti patologinius procesus įvairiose vietose: kauluose, sąnariuose, odoje. Viena dažnesnių ligų – osteomielitas. Jautriausi yra jauni paukščiai. Svarbu diagnozuoti ligos sukėlėją ir tinkamai paskirti gydymą. Atsiradus ūminėms paukščių stafilokokinėms infekcijoms, paukšty-nai patiria didelius ekonominius nuostolius. Penicilinas, eritromicinas ir tetra-ciklinas – tai antibiotikai, naudojami naminių paukščių stafilokokinėms in-fekcijos gydyti. Įvairiose šalyse atliekama daug tyrimų, kuriuose aprašyti MRSA atvejai paukštienos gaminiuose. Vis dažniau išskiriamos šios pader-mės iš gyvūnų, todėl didelė tikimybė tokioms bakterijoms plisti per maisto grandinę. Paukštynuose svarbu nuolatos stebėti paukščius. Netinkamai lai-kant ir prižiūrint paukščius didėja tikimybė plisti infekcijoms. Staphylococcus
aureus bakterijos per maisto grandinę gali patekti į žmonių organizmus, todėl
įsigytus paukštienos gaminius reikią tinkamai termiškai apdoroti [68–70]. 1.4. Stafilokokų paplitimas laukinių paukščių
ir gyvūnų populiacijose
Laukinių paukščių, kaip galimų patogeniškų bakterijų pernešėjų, vaid-meniu susidomėjo nemažai įvairių pasaulio mokslininkų. Ištyrus ir nustačius, kad laukiniai paukščiai gali būti atsparių antibiotikams bakterijų rezervuaras, galima bandyti užkirsti kelią tokioms bakterijoms plisti daugelyje šalių [71]. Didžiuosiuose miestuose ar arti jų yra įvairių laukinių paukščių populiacijų. Laukinių paukščių populiacijos greitai didėja, nes juos lesina žmonės ir patys paukščiai lengvai gali lesti antropogenines liekanas sąvartynuose, atviruose šiukšlių konteineriuose. Taip didėja tikimybė su paukščių išmatomis į aplinką patekti įvairioms patogeniškoms bakterijoms, pvz., E. coli, Salmonella
ente-rica, Staphylococcus aureus, Campylobacter spp. [72–76].
Stafilokokų bakterijos išskiriamos ne tik iš žmonių, naminių paukščių, bet ir laukinių gyvūnų. Laukiniai paukščiai taip pat yra šių bakterijų rezer-vuaras. Jų vaidmuo, kaip galimų tokių bakterijų platintojų, – daugeliui moks-lininkų aktualus tyrimų uždavinys. Šiuo metu atliekama nemažai tyrimų, sie-kiančių išsiaiškinti, kaip tokios bakterijos yra paplitusios laukinėje gamtoje. Iš laukinių paukščių išskirtos bakterijos gali būti pavojingos ir yra pavojingos žmonėms, todėl šiuo metu skiriamas didelis dėmesys laukinei gamtai ištirti [77, 78].
23
Laukinių paukščių stafilokokai buvo išskirti iš įvairių paukščių rūšių: baltųjų gandrų, vandens paukščių, grifų, kirų. Molekuliniai tyrimai patvirtino, kad iš laukinių gyvūnų išskirtos stafilokokų rūšys buvo tokios pačios kaip ir iš žmonių [78–81].
Portugalijoje 2014 metais atlikti tyrimai parodė, kad plėšrieji paukščiai yra atsparių antibiotikams S. aureaus ir koguliazei neigiamųjų stafilokokų turėtojai. Šių paukščių sąlytis su kitais laukiniais gyvūnais didina riziką tokioms bakterijoms patekti į jų organizmus, taip pat – ir į žmogaus. Kai genų, koduojančių atsparumą antibiotikams, atsiranda tarp laukinių paukščių bak-terijų, tokių bakterijų pernešimas gali būti tarpžemyninis ir sukelti nemažai problemų [79]. Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms yra vis didesnė visuomenės sveikatos, pramonės ir aplinkos apsaugos problema visa-me pasaulyje [82]. Jungtinėse Avisa-merikos Valstijose tiriant laukinius gyvūnus, kiškinių šeimos atstovams (du mėginiai) ir laukinių paukščių tilvikinių šei-mos vienai padermei, nustatyti meticilinui atsparūs Staphylococcus aureus. Iš kiškinių šeimos išskirti izoliatai buvo atsparūs tetraciklinui, eritromicinui, iš tilvikinių paukščių išskirta padermė buvo atspari eritromicinui, klindami-cinui, levofloksacinui. Visiems trims izoliatams nustatytas Pantono ir Valen-tino leukocidino (PVL) toksinas. Mokslininkai teigia, kad nors buvo tirta tik 114 laukinių gyvūnų, iš kurių 2,6 proc. buvo teigiamieji MRSA izoliatai, šie tyrimai rodo laukinių gyvūnų svarbą platinant tokias atsparias padermes ir būtina atlikti išsamesnius laukinių gyvūnų tyrimus [83].
Sepsinė stafilokokozė dažnai nustatoma paukščiams, jautrūs yra jauni, ir seni paukščiai; juos ištinka mirtis. Stafilokokozės – užkrečiamoji paukščių ir gyvulių liga, kurią sukelia stafilokokų bakterijos, gali pažeisti kepenis, plau-čius ir kitus organus. Nustaplau-čius šią infekciją laukiniams paukščiams, šios bakterijos buvo išskirtos iš baltagalvio jūrinio erelio, raudonkojų sakalų, raudonuodegių suopių, didžiųjų ančių, gulbių nebylių, žiedasnapių kirų [84].
Paukščiai – tie gyvūnai, gebantys keliauti didelius nuotolius. Paukščių migracijos keliai priklauso nuo paukščių rūšies, gyvenimo būdo. Paukščiai yra vieni iš potencialių gyvūnų, platinančių antibiotikams atsparius mikroor-ganizmus tarp šalių ir žemynų. Taigi paukščiai migruodami kartu platina bak-terijas, virusus, parazitinius pirmuonis, tai prilyginama žmogaus galimybėms kaliauti po pasaulį. Tokiu būdu atsiranda galimybė bakterijoms išplisti regio-nuose, kuriuose jų nebuvo [85].
24
1.5. E. coli morfologija ir bendrosios jų savybės
Escherichia coli – tai šiltakraujų ir šaltakraujų gyvūnų žarnyno
bakte-rijos. Šios bakterijos į aplinką patenka kartu su gyvūnų išmatomis. Tokiu bū-du šios bakterijos, patekusios į aplinką, yra vienas iš vandens ar dirvos už-terštumo požymių, sanitarinis rodiklis [86]. Tai gramneigiamosios, polimor-fiškos, mažos, 2–3 µm ilgio ir 0,4–0,6 µm storio apvaliais galais lazdelės, jos nesudaro sporų. E. coli – fakultatyvusis anaerobas. Dauguma E. coli pader-mių iki rūgščių ir dujų skaido laktozę ir gliukozę, manitolį, sacharozę. Suskaidžius triptofaną, susidaro indolas. Dauguma turi piles, jomis tvirtinasi prie šeimininko žarnų epitelio. Tai svarbus patogeniškumo veiksnys. Pilės yra klasifikuojamos, remiantis šeimininko ląstelių rūšimi ir savitaisiais jų recep-toriais, su kuriais E. coli jungiasi. Endotoksinas yra ląstelės sienelės lipopoli-sacharidas, turintis enterotropinį ir pirogeninį veikimą. Pagrindinės E. coli patogeniškos grupės: enterotoksigeninės (ETEC), enterohemoraginės (EHEC), enteroadhezinės (EAEC), enteropatogeninės (EPEC), enteroinvazinės (EIEC), visos jos sukelia pavojingas infekcijas [87, 88].
1.6. E. coli paplitimas paukštienoje ir kituose maisto produktuose
Escherichia coli bakterijos yra žmonių ir gyvūnų storosios žarnos
mikrobiota, tačiau medicinos praktikoje būna ir labai agresyvių šių bakterijų formų. Šios padermės gali sukelti tam tikrus virškinamojo kanalo pakyčius [89, 90]. E. coli padermių sukeltos uždegiminės infekcijos paplitusios visame pasaulyje. Tačiau šalyse, kuriose sanitarinės sąlygos prastos, šių bakterijų sukeliamos infekcijos yra ypač aktuali problema ir vykdyti jų kontrolę labai sudėtinga [91]. Daugelio šalių praktika rodo, kad netinkamai gydyti paskirti antibiotikai, žmonių piktnaudžiavimas jais didina tikimybę bakterijoms tapti atspariomis antimikrobinėms medžiagoms [92]. E. coli įgytas atsparumas antimikrobinėms medžiagoms mažina gydymo veiksmingumą. Enterobak-terijos, ypač E. coli, pastaruoju metu dažnai atsparios trečiosios kartos cefa-losporinams. Escherichia coli ir Klebsiella pneumoniae yra vienos iš dau-giausia paplitusių bakterijų. Šių bakterijų atsparumas antibiotikams pasaulyje greitai didėja, taip pat ir karbapenemams, kurie yra viena iš paskutiniųjų priemonių šių bakterijų sukeltoms infekcijoms gydyti [93].
Airijoje buvo atliktas tyrimas, kurio metu įvertintas iš žalios mėsos išskirtų E. coli atsparumas trims kritiškai svarbioms žmonėms gydyti vartoja-moms antimikrobinėms medžiagoms (fluorochinolonams, cefalosporinams ir karbapenemams). Atlikti tyrimai parodė, kad mažmeninės prekybos vietose
25
įsigyta mėsa buvo užteršta E. coli bakterijomis, atspariomis tirtiems antibio-tikams [94]. Žmonėms vartojant gyvūninės kilmės maistą ar maisto produk-tus, kuris užterštas Escherichia coli bakterijomis, ir šioms būdingas atsparu-mas antimikrobinėms medžiagoms kelia didelį pavojų visuomenės sveikatai [95].
Jungtinėse Amerikos Valstijose 2000–2008 metais buvo atliekami svei-katos apsaugos institucijų tyrimai. Jų metu tiriamoji medžiaga (E. coli bakte-rijoms nustatyti) buvo renkama mažmeninėse prekybos vietose: įsigyjama paukštienos, kiaulienos, jautienos gaminių. Laboratorijose buvo išskirtos šių gaminių E. coli padermės ir nustatomas jų jautrumas antimikrobinėms me-džiagoms. Vykdant šią stebėseną ir skelbiant rezultatus visuomenei, nustatyti akivaizdūs pokyčiai: tyrimo pradžioje bakterijų atsparumas skirtingiems an-tibiotikams daugumos buvo didesnis, o tyrimo pabaigoje – mažesnis. Atspa-rumo tendencijų mažėjimas nustatytas: kanamicinui (16,1 proc. – 10,2 proc.), streptomicinui (77,5 proc. – 54,6 proc.), trimethoprimui / sulfametoksazoliui (17,2 proc. –9,1 proc.) ir tetraciklinui (68,4 proc. – 47,4 proc.). Atsparumas cefoksitinui padidėjo nuo 7,4 proc. iki 15 proc., o atsparumas ceftriaksonui padidėjo nuo 6,3 proc. iki 13,5 proc. Per šį laikotarpį atsparumas ciprofloksa-cinui buvo mažas (< 1 proc.). Todėl, norint valdyti situaciją, visuomenę bū-tina supažindinti su tyrimų išvadomis [96].
Labai svarbu nuolatos tikrinti vandens kokybę. Nuotekų vandeniu lais-tant daržoves, didėja tikimybė šioms būti užterštoms patogeniškomis bakte-rijomis. Į gyvūnų organizmus tokios bakterijos gali patekti taip pat per užterš-tą vandenį. Tuomet žmogus, turėdamas kontakužterš-tą su gyvūnais, gyvulių mėsa ar žemės ūkio kultūromis, rizikuoja užsikrėsti patogeniškomis bakterijomis [97, 98].
2015 metais Europos maisto saugos tarnyba (EFSA) ir Europos ligų pro-filaktikos ir kontrolės centras (ECDC) visuomenei pateikė tyrimų ataskaitas, kuriose pateikiamas bakterijų iš kiaulių ir galvijų išskirtų mėginių atsparumo antimikrobinėms medžiagoms vertinimas. Gauti rezultatai parodė, kad atsparumas karbapenemų grupės antibiotikams pirmą kartą buvo nustatytas vykdant visos Europos Sąjungos (ES) metinę gyvūnų ir maisto stebėsenos programą. Karbapenemų grupės antibiotikai dažniausia vartojami kaip pasku-tinė gydymo priemonė pacientams, užsikrėtusiems visiems kitiems turimiems antibiotikams atspariomis dauginio atsparumo bakterijomis. Labai maži
E. coli bakterijų atsparumo lygmenys buvo nustatyti kiaulių organizme ir jų
mėsoje. Kita svarbi išvada – plataus veikimo spektro beta laktamazes (ESBL) gaminančios E. coli nustatytos jautienoje, kiaulienoje, kiaulių ir veršelių organizme. ESBL fermentus gaminančioms bakterijoms būdingas dauginis atsparumas beta laktaminiams antibiotikams, į kuriuos įeina penicilino dari-niai ir cefalosporinai. ESBL gaminančių E. coli paplitimas įvairiose Europos
26
šalyse buvo skirtingas – pradedant mažu paplitimu ir baigiant labai dideliu. Naujausioje išvadoje teigiama – labai mažo lygmens Salmonella ir E. coli atsparumas kolistinui buvo nustatytas kiaulių ir galvijų organizme. Kolistinas gali būti naudojamas kai kuriose šalyse gyvūnų, ypač kiaulių infekcijų kontrolei. Kai kuriomis aplinkybėmis jis gali būti naudojamas kaip paskutinė priemonė žmonėms gydyti [99, 100].
1.7. E. coli paplitimas laukinių paukščių ir gyvūnų populiacijose
E. coli, kartu su kitomis bakterijomis, sudaro normaliąją mikrobiotą
žmo-gaus organizme. Kartais šios rūšies bakterijos žmožmo-gaus organizme tampa pa-vojingos ir sukelia šlapimo takų, virškinamojo kanalo ir kraujo infekcijas. Nagrinėjant bakterijų atsparumą antibiotikams, laukinėje gamtoje ešerichi-jos – vienos dažniausiai išskiriamų bakterijų. Jų atsparumas trečiosios kartos cefolosporinams, karbapenemams pastaraisiais metais greitai didėjo [101]. Laukiniai gyvūnai neturi tiesioginio kontakto su antibiotikais. Pastaraisiais metais atlikti tyrimai parodė, kad laukiniai gyvūnai tai pat turi tokių atsparių antibiotikams bakterijų. Kaip tokios bakterijos patenka į laukinių gyvūnų organizmą, ne visada galima paaiškinti, – tai priklauso nuo gyvūno rūšies, gyvenimo būdo [102, 103].
1975 metais pirmą kartą iš laukinių paukščių buvo išskirtą E. coli pader-mė. Ši padermė buvo išskirta iš balandžių tiriamosios medžiagos ir buvo atspari daugeliui tirtų antibiotikų, vienas iš jų – chloramfenikolis [103]. Vėliau buvo atlikta daugiau tyrimų, kurie patvirtino atsparių antibiotikams
E. coli paplitimą ančių ir žąsų [104, 105], kormoranų [106, 107], plėšriujų
paukščių [108, 109], gulbių [106], balandžių [110], žvirblinių paukščių populiacijose [111]. Laukinių paukščių populiacijose plataus veikimo spektro beta laktamazes gaminančios (ESBL) E. coli pirmą kartą nustatyta buvo 2006 metais [112]. Po šio įvykio nemažai Europos ataskaitų patvirtino, kad lauki-niai paukščiai perneša šias padermes [113, 114]. Šios bakterijos iš laukinių paukščių buvo išskirtos daugelyje žemynų, išskyrus Australiją ir Antarktidą. Atsparių antibiotikams bakterijų paplitimui laukinių paukščių populiacijoje įtakos turi geografinė vietovės padėtis, gyventojų tankis, to regiono žemės ūkio veiksniai [115].
Jungtinėse Amerikos Valstijose buvo nustatyta, kad kirai platina atspa-rias antibiotikams E. coli padermes, kurių kamienai buvo tokie patys kaip ir
E. coli, išskirtų iš sąvartynų, nuotekų sistemų tiriamosios medžiagos [116].
Čilėje ištyrus kirinių šeimos laukinius paukščius buvo išskirta du kartus daugiau ESBL gaminančių E. coli padermių, palyginti su tyrimais, atliktais
27
su žmonėmis [117]. Manoma, kad laukinių paukščių populiacijoje atsparių antibiotikams bakterijų paplitimui įtakos turi žmogaus veikla. Paukščių migracijos laikotarpiu išauga tikimybė antibiotikams atsparioms bakterijos pasklisti kituose regionuose tarp žmonių ir tarp laukinių paukščių [118–121]. Bangladeše, tiriant laukinius paukščius, nustatytos E. coli padermės, gaminančios CTX-M15 beta laktamazes. Atlikti tyrimai parodė, kad laukiniai paukščiai svarbūs pernešant atsparias antibiotikams bakterijas aplinkoje ir taip pat prisideda prie CTX-M beta laktamazes koduojančių blaCTX-M genų plitimo. Beta laktamazes gaminančių E. coli padermėms atsirasti Bangladeše įtakos turi žmonių populiacijos didelis skaičius, antisanitarinės gyvenimo sąlygos ir pagrindinė priežastis neribotas antibiotikų vartojimas medicinoje ir naudojimas veterinarijoje, akvakultūroms. Paskelbus atliktų tyrimų išvadas, buvo numatyta imtis visų saugos priemonių – stebėti situaciją ligoninėse, atlikti daugiau naminių ir laukinių gyvūnų tyrimų [122].
Laukiniams paukščiams tikimybė turėti kontaktą su antibiotikais yra labai maža. Šiuo metu didžiuosiuose miestuose stebima urbanistinės raidos plėtra. Taip mažėja laukinių paukščių buveinių teritorijos, todėl tikimybė laukiniams paukščiams susidurti su antibiotikais per užterštą aplinką didėja. Europoje altikti tyrimai parodė, kad laukiniai žinduoliai ir paukščiai yra atsparių antibiotikams bakterijų šaltiniai. Su gyvūnų išmatomis į aplinką pa-tenka patogeniškų bakterijų, kurios yra pavojingos žmogui ir kitiems gyvū-nams [113, 123–125].
Kanadoje, tiriant smulkiųjų laukinių gyvūnų išmatas, atsparių antibioti-kams E. coli bakterijų nustatyta nemažai. Tyrimo metu buvo atsižvelgiama į vietovę, kurioje šie gyvūnai gyvena. Manoma, tokiems rezultatams įtakos turi tai, kad šie smulkieji laukiniai gyvūnai gyvena arti ūkių, sąvartynų, gyvena-mųjų namų. Dažniausiai išskirtos atsparios E. coli padermės buvo iš laukinių graužikų išmatų [126–129].
Australijoje iš 77 tirtų laukinių žinduolių rūšių E. coli išskirta buvo 449 atvejų. Šie rezultatai parodė, kad tarp laukinių gyvūnų bakterijos, atsparios antimikrobinėms medžiagoms, geografijos ir biologijos (tarp gyvūnų rūšių) požiūriu paplitusios gana plačiai [130].
Centrinėje Europos dalyje šernai yra potencialiausi atsparių antibioti-kams E. coli platintojai. Šie gyvūnai dažnai maitinasi antropogeninėmis atliekomis ir taip atsiranda galimybė tokioms bakterijoms patekti į gyvūnų organizmus [131–133].
Mokslininkai teigia, kad ne tik laisvėje gyvenantys laukiniai gyvūnai, bet ir laikomi zoologijos sode gali būti enterohemoraginių, enteropatogeninių
28
bakterijų paplitimas tarp laukinių gyvūnų, taip didėja tikimybė šiems gyvū-nams nugaišti nuo diarėjos. Todėl lankytojams ir zoologijos sodo darbuoto-jams kyla pavojus susidurti su šiomis bakterijomis [134].
Atsparių antibiotikams bakterijų paplitimas laukinėje gamtoje dažniau-siai aiškinamas kaip žmogaus veiklos padarinys (antropogeninės atliekos, žemės ūkio nuotekų patekimas į gruntinius vandenis). Afrikoje atliktas tyri-mas, kuriuo buvo siekiama išsiaiškinti, kokiu dažnumu laukiniams gyvūnams nustatomos antibiotikams atsparios E. coli padermės ir jos buvo palygintos su aplinkinių kaimų gyventojų išskirtomis E. coli padermėmis. 2011 metais Botsvanoje buvo surinkti 150 išmatų mėginių iš 18 skirtingų laukinių gyvūnų rūšių, taip pat 200 išmatų mėginių iš žmonių, gyvenančių arti laukinių gyvūnų buveinių. Tyrimams pasirinkta 10 skirtingų antibiotikų, kurie tame regione vartojami maliarijai ir tuberkuliozei gydyti. Gauti rezultatai parodė, kad 40 proc. laukinių gyvūnų, tarp jų leopardų, dramblių, krokodilų ir 90 proc. žmonių išskirtų E. coli padermių buvo atsparios bent vienam tirtam antibio-tikui. Daugiau nei 10 proc. iš gyvūnų ir 70 proc. iš žmonių išskirtos E. coli bakterijos buvo atsparios trims ar daugiau tirtoms antimikrobinėms medžia-goms. Iš žmonių ir laukinių gyvūnų išskirtiems E. coli izoliatams, nustatytas panašus atsparumas. E. coli padermės iš visų tirtų antibiotikų dažniausiai buvo atsparios ampicilinui, doksiciklinui, streptomicinui, tetraciklinui ir tri-metoprimo / sulfametoksazolo deriniui. Daugiausia panašus atsparumas
E. coli padermėms nustatytas iš vandens laukinių gyvūnų ir šalia žmonių
gyvenviečių įsikūrusių laukinių gyvūnų išskirtuose izoliatuose. Atlikto tyri-mo išvados – antibiotikams atsparios bakterijos per vandenį patenka į žtyri-mo- žmo-gaus ir laukinių gyvūnų organizmus [135].
Dažnėjanti žmonių, naminių gyvūnų ir laukinės faunos tarpusavio ryšių sąveika didina tikimybę patogeniškiems mikroorganizmams plisti tarp žmo-nių ir gyvūnų.
29
2. TYRIMŲ METODAI
2.1. Tyrimų eiga, vieta ir tyrimo objektai
Tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veteri-narijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute 2013–2017 metais. Tyrimai buvo atliekami kartu su mokslininkais, kurie dalyvavo vykdant laimėtus Lietuvos mokslo tarybos projektus. Projektams vadovavo dr. Modestas Ružauskas (projekto Nr. SIT-6/2015) ir dr. Marius Virgailis (projekto Nr. SVE-05/2014). Atliekant paukštienos gaminių tyrimus – nustatant Staphyloccoccus spp. ir E. coli, doktorantė dirbo kartu su dr. Rita Šiugždinienė, dr. Irena Klimienė. Laukinių paukščių medžiagos rinkimo ir bakterijų išskyrimo darbams vadovavo dr. Modestas Ružauskas, medžiagą rinko ir visus tyrimus atliko doktorantė. Tyrimų planas ir eiga pateikti 2.1.1 pav.
30 Pirmasis tyrimų etapas:
Tiriamoji paukštienos medžiaga t. y žalios paukštienos produktai, skirti žmonių maistui, atitinkantys galbūt užkrėstus maisto produktus atspariomis indikatorinėmis bakterijomis (Staphylococcus spp. ir E. coli) buvo renkami mažmeninės prekybos vietose: keturiuose Kauno turgavietėse ir keturiuose prekybos centruose. Mėginiai buvo imami atsitiktine tvarka, neatsižvelgiant į paukštienos gamintoją. Vištienos mėginiai paimti iš prekybos vietų ir 2–3 valandų laikotarpiu, pristatyti, esant ne didesnei nei +5 °C temperatūrai, į LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institutą mikrobiologiniams tyri-mams atlikti. Atliekant tyrimą buvo tirtas 351 vienetas paukštienos mėginių. Vištienos produktai ir jų skaičius pateikti 2.1.1 lentelėje.
2.1.1 lentelė. Paukštienos produktų rūšys, įsigijimo vieta, mėginių skaičius
(n = 351) Paukštienos
produktai
Įsigyjimo vieta, vnt. Bendras mėginių
skaičius, vnt.
Kauno turgavietės Prekybos centrai
Blauzdelės 70 20 90 Kepenėlės 150 36 186 Sriubos rinkiniai 15 0 15 Sparneliai 35 10 45 Krūtinėlė 3 2 5 Faršas 5 5 10
Laukinių paukščių tiriamoji medžiaga išmatos, kloakos, žiočių mėginiai buvo renkama natūraliai gamtoje gyvenančių (migracijų metu trumpam apsistojančių) paukščių vietose – Kauno parkuose, Ventės rago ornitologinėje žiedavimo stotyje (55°20'28.1"Š 21°11'25.3"R) – bei padidėjusios epidemio-loginės rizikos vietoje Lapių sąvartyne. Leidimas tirti laukinius paukščius buvo patvirtintas Aplinkos apsaugos agentūros (protokolo Nr. 15.10-A4-8844).
Atlikus bakteriologinius tyrimus buvo tirta 415 laukinių paukščių mėgi-nių. Mėginiai surinkti iš 29 skirtingų laukinių paukščių rūšių (2.1.2 lentelė).
31
2.1.2 lentelė. Laukinių paukščių rūšys, vieta, iš kurios surinkti mėginiai, ir
bendras mėginių skaičius (n = 415) Laukinių paukščių rūšis
Tyrimo vieta ir mėginių skaičius,
vnt. Bendras mėginių skaičius, vnt. Kauno parkai Lapių sąvar-tynas Ventės rago ornitologinė žiedavimo stotis
Sidabrinis kiras (Larus argentatus) 36 80 0 116 Rudagalvis kiras (Larus ridibundus) 26 50 0 76
Kovas (Corvus frugilegus) 25 0 0 25
Pilkoji varna (Corvus cornix) 6 0 0 6
Paprastasis kranklys (Corvus corax) 4 0 0 4 Didžioji antis (Anas platyrhynchos) 35 0 0 35
Gulbė nebylė (Cygnus olor) 32 0 0 32
Tulžys (Alcedo atthis) 0 0 3 3
Bukutis (Sitta europaea) 0 0 1 1
Ilgauodegė zylė (Aegithalos caudatus) 0 0 14 14 Dūminė raudonuodegė (Phoenicurus
ochruros) 0 0 1 1
Alksninukas (Carduelis spinus) 0 0 6 6
Juodagalvė devynbalsė (Sylvia
atricapilla) 0 0 1 1
Geltonbruvė pečialinda (Phylloscopus
inornatus) 0 0 1 1
Didžioji zylė (Parus major) 0 0 26 26
Erškėtžvirblis (Prunella modularis) 0 0 0 3
Liepsnelė (Erithacus rubecula) 0 0 17 17
Eurazinis liputis (Certhia familiaris) 0 0 2 2 Karetaitė (Troglodytes troglodytes) 0 0 11 11 Raiboji devynbalsė (Sylvia nisoria) 0 0 1 1
Kikilis (Fringilla coelebs) 0 0 9 9
Ūsuotoji zylė (Panurus biarmicus) 0 0 4 4
Pilkoji pečialinda (Phylloscopus
collybita) 0 0 5 5
Juodasis strazdas (Turdus merula) 0 0 3 3
Strazdas giesmininkas (Turdus
philomelos) 0 0 1 1
32 2.1.2 lentelės tęsinys
Laukinių paukščių rūšis
Tyrimo vieta ir mėginių skaičius,
vnt. Bendras mėginių skaičius, vnt. Kauno parkai Lapių sąvar-tynas Ventės rago ornitologinė žiedavimo stotis
Šiaurinė pilkoji zylė (Poecile montanus) 0 0 6 6
Varnėnas (Sturnus vulgaris) 2 0 0 2
Uolinis karvelis (Columba livia) 2 0 0 2
2.2. Medžiagos paėmimas (rinkimas) ir pristatymas į laboratoriją
Paukštienos mėginiai tyrimams buvo sudėti į skirtingus sterilius maiše-lius. Kiekvienas paukštienos mėginys buvo sunumeruotas ir pažymėta jo įsigijimo vieta. Laboratorijoje numeracijos tvarka imami subproduktai ir steriliu bakteriologiniu tamponėliu išvedžiota kuo daugiau mėginio pavir-šiaus. Tuomet sterilia bakteriologine kilpele atliekami sėjimai į bakterijų pasirinktą selektyviąją terpę.
Laukinių paukščių mėginių medžiaga rinkta steriliais vienkartiniais tamponėliais, kurie iš karto po medžiagos paėmimo dėti į transportinę terpę (TRANSWAB, MNE, JK). Medžiaga pristatyta į laboratoriją tą pačią ar kitą dieną. Medžiaga imta tamponėliu iš paukščio žiočių, kloakos ar merkiant į išmatas. Laboratorijoje atlikti sėjimai į tiriamųjų bakterijų pasirinktą selekty-viąją terpę.
2.3. Tiriamosios medžiagos įsėjimas į mitybines terpes bakterijoms išskirti
Į laboratoriją atvežta medžiaga tą pačią ar kitą buvo įsėjama į mitybines terpes. Bakterijų padermės išskirtos mikrobiologijos metodais.
Staphyloco-ccus spp. išskirti naudotas Kolumbijos agaras su 5 proc. avies kraujo priedu
(E&O Laboratories, Jungtinė Karalystė) ir manitolio druskos agaras
(Liofil-chem, Italija).
Escherichia coli išskirti naudota TBX agaras (Liofilchem, Italija),
MacCon-key agaras (Liofilchem, Italija), ESBL (Thermo Scientific, Jungtinė Karalystė) standžiosios terpės. Bakterijos buvo kultivuotos termostate +35 °C tempe-ratūroje 48 valandas.
33
2.4. Išskirtų bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymas 2.4.1. Kokybinis jautrumo tyrimo metodas
Remiantis EUCAST (European Committee on Antimicrobial
Suscepti-bility Testing) ir CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
standar-tais, šis tyrimas atliktas standartiniu būdu [136, 137]. Antibiotikų rūšys parinktos pagal EUCAST ir CLSI, rekomendacijas t. y. parinktos tyrimui medžiagos, kurios klinikinėje praktikoje gali būti naudojamos nuo atitinkamų rūšių ligų sukėlėjų. Pagal šių organizacijų reikalavimus atlikta ir rezultatų interpretacija: rezultatai vertinti kaip „jautri padermė“, „vidutiniškai jautri padermė“ ir „atspari padermė “. Išaugintų Staphylococcus spp. ir E. coli bak-terijų atsparumas parinktiems antibiotikams nustatytas difuzijos į agarą diskų metodu (Kirbio-Bauerio) Miulerio-Hintono agare (Mueller-Hinton II Agar,
BBL, Cockeysville, JAV). Šis metodas atliktas, kuomet morfologiškai
pana-šios bakterijų kolonijos sterilia kilpele įlašinamos į mėgintuvėlį su 0,9 proc. sterilaus fiziologinio tirpalo. Bakterijų suspensija standartizuojama 0,5 drum-stumo standartu pagal McFarlendą, makfarlandometru DEN-1B (Biosan, Latvija).
Standartizuota suspensija sėjama tamponu ant Miulerio-Hintono agaro paviršiaus. Vėliau specialiu dėtuvu (Oxoid, Anglija) uždedami antibiotikų diskai.
Tuomet paruoštos lėkštelės su tiriamąja medžiaga inkubuojamos 37 °C temperatūroje 24 valandas termostate. Bakterijų neaugimo zonos skersmuo matuojama liniuote. Tyrimo duomenys vertinami remiantis EUCAST ir CLSI rekomendacijomis. Pažymėtina, kad ne visų bakterijų rūšių ir ne visoms antimikrobinėms medžiagoms yra nustatytos klinikinės atsparumo vertės. Jei Europos atsparumo antibiotikams tyrimo komiteto (EUCAST) rekomenda-cijas nebuvo nurodyta klinikinių lūžio taškų tam tikriems antibiotikams pagal tiriamas bakterijų gentis, tuomet klinikiniai lūžio taškai buvo vertinami atsižvelgiant į CLSI standartą.
Tolesnėse 2.4.1.1, 2.4.1.2 lentelėse pateiktos kokybiniu metodu atliktų bakterijų tyrimų, naudotų antibiotikų sąrašas, koncentracija diskuose bei interpretavimo duomenys.
