CAPITOLO 4
- 78 -
4. RISULTATI
4.1 Risultati degli studi in vitro sulla motilità delle cellule di Schwann di ratto in risposta a superfici anisotrope nanostrutturate
Esperimenti in vitro sono stati effettuati per analizzare le proprietà di migrazione della cellule di Schwann in relazione alla direzionalità del substrato, in particolare sono state testate superfici in PDMS piane e con nanostrutturazione di periodo diverso (solchi di 2 e 10 µm) identificate con le sigle T4 e T20 rispettivamente.
La risposta delle cellule di Schwann alla topografia dei substrati è stata misurata valutando la migrazione di ogni singola cellula in time-lapse per 17 ore. Le SC hanno aderito e sono cresciute su tutti i substrati in PDMS raggiungendo la confluenza dopo alcuni giorni.
Come primo step è stata confrontata la direzione della migrazione delle SC su superfici lisce e nano strutturate, questo ha messo in evidenza come le cellule coltivate su scaffold non strutturati presentavano una motilità random, mentre quelle in contatto con la nanostruttura si muovevano seguendo in maniera preferenziale l’asse maggiore del segnale topografico (Fig. 21).
- 79 - Figura 21: esperimenti in time-lapse, migrazione delle cellule di Schwann su
substrati lisci e nanostrutturati con periodo T4 e T20.
Nessuna delle superfici anisotrope ha inibito la migrazione cellulare, infatti valutando sia il tragitto totale (S) percorso in 17 ore, sia lo spostamento delle singole cellule (DS) avvenuto ogni 15 minuti, si sono ottenuti parametri paragonabili a quelli ottenuti sui substrati lisci, questo in accordo (Fig. 22).
Per quantificare l’orientamento cellulare in relazione alla topografia dello
scaffold, gli spostamenti delle cellule (DS) sono stati suddivisi in due
categorie: una parallela alla topografia del substrato 0°-15°, (angolo Vs direzione del disegno topografico) e l’altra perpendicolare ad essa 75°-90° (angolo Vs direzione del disegno topografico).
- 80 - Figura 22: i grafici mostrano rispettivamente la distanza complessiva
percorsa in 17 ore e la distanza media percorsa in 15 minuti.
Analizzando il DS parallelo per le superfici lisce si è visto come la direzione di migrazione delle cellule è stata scelta in modo del tutto casuale, mentre sulle superfici strutturate la percentuale di cellule orientate con il segnale topografico (DS align) raggiungeva il 42% con l’utilizzo della strutturazione T4, mentre addirittura raddoppiava usando le T20 (Fig. 23).
Figura 23: i grafici mostrano come le superfici T20 condizionino in modo
significativo l’allineamento parallelo delle SC ai solchi nanostrutturati, mentre riducano l’orientamento perpendicolare ad essi (P<0.05). Test statistico Anova on way
- 81 -
Per quanto riguarda invece gli spostamenti perpendicolari (75°-90°) utilizzando gli scaffold strutturati si otteneva una riduzione del 35% se paragonato a quello ottenuto con l’utilizzo delle superfici lisce.
Quindi, come atteso, le superfici nanostrutturate riducono la migrazione cellulare in direzione perpendicolare al segnale anisotropo, favorendo invece la motilità lungo la direzione dell’allineamento dello scaffold (Fig.
23).
A ciò deve essere aggiunto anche che la nanostrutturazione ha avuto un’influenza anche sulla direzione totale percorsa dalle SC, infatti le cellule seminate sulle superfici T20 sono migrate per distanze maggiori rispetto al punto di partenza (R) in 17 ore, rispetto alle cellule cresciute sulle superfici T4 (Fig. 24).
Figura 24: la colonna di destra mette in luce come le SC poste su substrato
T20 siano migrate per distanze maggiori dal punto di partenza (S) rispetto agli altri substrati.
In conclusione i risultati ottenuti in vitro hanno mostrato che la nanostrutturazione delle superfici in PDMS con un particolare periodo, sono
- 82 -
un mezzo valido per modificare la migrazione e la direzionalità delle cellule di Schwann.
4.2 Risultati degli esperimenti condotti in vivo
Tutti gli animali sono sopravvissuti e sono rimasti in buone condizioni fino alla fine dell’esperimento. Attraverso il monitoraggio giornaliero durante il periodo post-operatorio non sono state evidenziate alterazioni del comportamento (aggressività) né casi di auto-mutilazione, deiscenza della ferita chirurgica o ulcerazione della cute.
I risultati ottenuti dalla parte sperimentale di questo lavoro sono tratti dall’osservazione dei campioni (20 scaffold) prelevati dai 10 ratti utilizzati. Dopo la riapertura dell’incisione chirurgica abbiamo proceduto all’esposizione del nervo mediano e dello scaffold. All’ esame ispettivo macroscopico le superfici in PDMS (sia lisce che nano strutturate) apparivano ricoperte di tessuto biologico in maniera e quantità diversa a seconda dei casi e del tempo trascorso dell’intervento (Fig. 25).
Figura 25: l’immagine mostra la morfologia macroscopica dell’impianto, si
- 83 -
Successivamente le superfici in PDMS (sia lisce che nanostrutturate) sono state valutate con l’ausilio del microscopio ottico DM4000B al quale è stato collegato un apparecchio fotografico. Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento 20x ed è stata dimostrata la presenza di materiale biologico di color bianco madreperlaceo, simile per struttura e colore al tessuto nervoso, in continuità con il moncone prossimale (Fig 26).
Figura 26: immagine ottenuta con microscopio ottico che dimostra la
presenza di tessuto simil-nervoso a colmare il gap dopo sette giorni.
Terminata la valutazione al microscopio ottico i campioni sono stati preparati, come esposto precedentemente (vedi paragrafo 3.2.2) ed esaminati con l’indagine mmunoistochimica.
I due anticorpi sono stati marcati con anticorpo anti-neurofilamento poi coniugato (via anticorpo secondario marcato) ad un fluorescente verde e con l’anticorpo S-100 poi coniugato ad un fluorescente rosso.
- 84 -
Dalle indagini ottenute si è vista la presenza di alcune cellule gliari e neurofilamenti già dopo tre giorni dalla neurotmesi. Tali componenti biologiche erano maggiormente rappresentate e meglio definite
all’end-point dell’esperimento.
L’orientamento dei neurofilamenti e delle cellule di Schwann è stato tuttavia diverso a seconda del tipo di scaffold preso in esame (liscio o nanostrutturato).
Scaffold lisci: il tessuto di rigenerazione presente sulle superfici lisce
all’immunoistochimica si presentava come un insieme di neurofilamenti e cellule gliari di forma grossolanamente rotondeggiante connesso prossimalmente con il moncone nervoso.
Dal tronco prossimale infatti originano queste componenti, frutto dello
sprouting iniziale che si estendono verso il moncone distale seguendo
l’orientamento della superficie dello scaffold.
Il loro percorso è però lineare solo per un breve tratto, infatti precocemente sia gli assoni che le cellule di Schwann tendono a formare un agglomerato globulare, con la perdita pressoché completa del loro orientamento longitudinale (Fig 27).
- 85 - Figura 27: l’immunoistochimica dimostra il tessuto in rigenerazione già
dopo tre giorni dall’impianto dello scaffold. Da notare la forma globulare che le fibre nervose assumono dopo l’iniziale sprouting.
Scaffold a superficie anisotropa nanostrutturata: un diverso comportamento è stato osservato per quanto riguarda le cellule nervose e gliari rigenerate su membrane anisotrope nanostrutturate.
Già dopo tre giorni dall’intervento chirurgico, avvenuto lo sprouting, le componenti del rigenerato hanno assunto progressivamente una morfologia allungata, allineandosi fra di loro ed alla struttura del substrato. Questa tendenza è stata poi mantenuta fino a sette giorni dopo l’impianto degli scaffold. (Fig 28).
- 86 - Figura 28: l’immagine mostra la prevalente tendenza delle fibre ad allinearsi
con i segnali topografici provenienti dal substrato già dopo tre giorni. La restante parte dello scaffold appare ricoperta da tessuto estraneo alla rigenerazione.
Al termine delle procedure è stata utilizzato il microscopio elettronico a scansione (SEM) per ottenere delle immagini tridimensionali.
Dalle immagini ottenute è stato possibile apprezzare, su di una scansione in particolare, la continuità del tessuto rigenerato che dal moncone prossimale si estendeva fino a congiungersi col moncone distale (Fig. 29).
Figura 29: immagine ottenuta con SEM, dopo 7 giorni dall’impianto dello
scaffold si dimostra che il gap nervoso è stato colmato da tessuto rigenerato proveniente dal moncone prossimale.
