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Conclusioni e sviluppi futuri
Il lavoro svolto durante la tesi ha consentito di raggiungere obiettivi importanti per la messa a punto di un sistema in grado di eseguire misure quantitative di mRNA in estratti cellulari nell’ambito di studi sull’espressione genica.
Sono stati caratterizzati in modo approfondito alcuni quarzi in varie condizioni (aria, acqua e soluzioni a varie densità e viscosità) ed è stato messo in evidenza il comportamento dell’impedenza elettrica nella condizione di immersione in liquido di un elettrodo. Si è osservata una diminuzione dell’ampiezza dei picchi di risonanza dovuta allo smorzamento esercitato dal liquido, con conseguente diminuzione del fattore di merito Q, e una riduzione dei valori della curva di fase tra le due frequenze di risonanza. Queste deviazioni dal normale comportamento in atmosfera inerte hanno giustificato il malfunzionamento in liquido di alcune configurazioni circuitali classiche, come quelle in cui il quarzo si deve comportare come una induttanza di elevata qualità (Colpitts) o altre in cui la condizione di oscillazione è abbastanza critica in relazione ai parametri RLC equivalenti (Ponte di Meacham).
Definiti i requisiti richiesti dall’utilizzo di QCM in fase liquida, è stato studiato e realizzato, su scheda millefori, un prototipo di circuito oscillatore il cui funzionamento è stato verificato sperimentalmente.
È stato studiato e realizzato un prototipo di una cella di flusso che permette di risolvere alcuni dei problemi riscontrati in alcuni modelli commerciali (rottura dei quarzi conseguente alla chiusura della cella o alla trasmissione di sollecitazioni meccaniche da parte delle molle di contatto, tenuta idraulica).
Il processo di misura è stato automatizzato mediante lo sviluppo di un software in ambiente LabVIEW che permette di acquisire, visualizzare e salvare i dati, di pilotare l’elettrovalvola impostandone temporizzazione e modalità di commutazione, di controllare la pompa peristaltica (velocità del flusso, senso di rotazione, start/stop) e di visualizzare in ogni momento lo stato del sistema e lo stadio di avanzamento della misura.
Le misure eseguite hanno avuto la valenza di test preliminari atti a verificare il buon funzionamento del sistema, a valutare l’effetto di fattori di disturbo sulla misura e a misurare l’entità delle variazioni di frequenza in condizioni di esercizio. Una serie di
109 esperimenti con soluzioni di glicerolo a diverse concentrazioni ha evidenziato una linearità tra aumento del prodotto densità/viscosità e diminuzione della frequenza di oscillazione, così come previsto teoricamente nell’intervallo di valori considerato. È stata inoltre condotta una serie di misure con un analizzatore di impedenza, utilizzando una soluzione target di molecole sintetiche che riproducono le caratteristiche di mRNA estratto da cellule umane. L’andamento della frequenza di risonanza serie è stato ricavato dall’analisi dei dati di impedenza, come punto di attraversamento dello zero del diagramma di fase. Questo primo test della misura finale, che avrebbe dovuto avere una funzione di verifica dei risultati del prototipo, è stato invece effettuato, per problemi di disponibilità dello strumento, prima che il circuito oscillatore fosse ultimato. Le indicazioni ottenute lasciano intravedere, in un prossimo futuro, ulteriori positivi sviluppi del lavoro svolto. E’ in corso un’estesa campagna di misure per verificare il comportamento del sensore con il target finale, costituito da un enzima che ripara i danni prodotti nel DNA da sostanze alchilanti. L’acquisto di un frequenzimetro con risoluzione superiore a quella dello strumento utilizzato (3 Hz) consentirà di apprezzare variazioni più fini della frequenza di oscillazione e quindi di estendere verso il basso l’intervallo di concentrazioni di mRNA in cui il dispositivo è utilizzabile. Viste le buone prestazioni fin qui registrate con il circuito, è stato deciso di realizzarne alcuni esemplari in tecnologia SMD, per minimizzare i disturbi, diminuire l’ingombro e per soprattutto per poter leggere contemporaneamente la frequenza di più sensori, in modo da sottrarre al segnale proveniente dal sensore trattato i disturbi dovuti a fattori estranei alla misura acquisiti con un quarzo di riferimento non trattato.
