KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Rimantas Treinys
ŠIRDIES LĄSTELIŲ L-TIPO Ca
2+KANALŲ,
SARKOPLAZMINIO TINKLO IR MITOCHONDRIJŲ SĄVEIKA
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, biofizika (02 B)
Kaunas, 2007
Disertacija rengta 2002 – 2006 metais Kauno medicinos universitete, Kardiologijos institute.
Mokslinis vadovas
habil. dr. Jonas Jurevičius (Kauno medicinos universitetas, Kardiologijos institutas,
biomedicinos mokslai, biofizika – 02 B)
TURINYS
1. SANTRUMPOS...3
2. ĮVADAS ...4
3. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI IR MOKSLINIS NAUJUMAS...6
4. LITERATŪROS APŽVALGA...8
4.1. L-tipo Ca
2+kanalai ir jų struktūra ...8
4.2. Sarkoplazminio tinklo Ca
2+kanalai (RyR) ir jų struktūra ...11
4.3. Ca
2+kanalų aktyvumo reguliavimas ...16
4.3.1. L-tipo Ca
2+kanalų reguliavimas baltymų kinazėmis...16
4.3.2. L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumo reguliavimas Ca
2+jonais ir nuo kalmodulino priklausoma kinaze CaMKII...21
4.3.3. L-tipo Ca
2+kanalų ir ATF sąveika...25
4.3.4. Acidozės įtaka L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumui...27
4.3.5. RyR kanalų reguliavimas Ca
2+ir Mg
2+jonais ...28
4.3.6. RyR kanalų reguliavimas kinazėmis ir fosfatazėmis ...29
4.4 Mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas ir jo inhibitoriai...32
4.5 Mitochondrijos, kalcis ir sarkoplazminis tinklas ...34
4.6 Oksidacinio fosforilinimo slopinimo įtaka Ca
2+kanalams ir ląstelės metabolitų koncentracijai ...40
5. MEDŽIAGOS IR TYRIMŲ METODAI...44
5.1. Miocitų išskyrimui ir elektrofiziologiniams eksperimentams naudoti tirpalai ...44
5.2. Žmogaus širdies miocitų išskyrimas ...45
5.3. Žiurkės širdies skilvelio miocitų išskyrimas...47
5.4. Varlės širdies skilvelio miocitų išskyrimas...49
5.5. Per L-tipo Ca
2+kanalus tekančios Ca
2+jonų srovės registracija ...50
5.6. Širdies raumenėlių elektromechaninių parametrų registracija...52
5.7. Duomenų pateikimas ir statistinis įvertinimas...53
5.8. Reagentai...54
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...56
6.1. Įvadas ...56
6.2. Metabolizmo slopinimo įtaka širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei ...58
6.2.1. β-adrenerginės stimuliacijos ir oksidacinio fosforilinimo skyriklių įtaka žmogaus širdies
ląstelių L-tipo Ca
2+srovei ...58
6.2.2. Oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP įtaka žiurkės širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei...64
6.2.3. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų blokavimo įtaka izoprenalinu stimuliuotai žiurkės širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei...67
6.2.4. Oksidacinio fosforilinimo skyriklio FCCP įtaka varlės širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei ...70
6.3. Širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovės priklausomybė nuo skirtingo sarkoplazminio tinklo išsivystymo bei patologinių pakenkimų...73
6.4. L-tipo Ca
2+srovės ir sarkoplazminio tinklo įtaka miokardo susitraukimo jėgai metabolizmo slopinimo metu...79
6.5. Šiltakraujų ir šaltakraujų gyvūnų širdies ląstelių sarkoplazminio tinklo įtaka L-tipo Ca
2+srovės fasilitacijai...82
6.6. Sarkoplazminio tinklo veiklos blokavimo įtaka žiurkės širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei ir L-tipo Ca
2+srovės fasilitacijai ...94
6.7. ATF gamybos blokavimo įtaka širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei metabolizmo slopinimo metu...100
6.7.1. F
0F
1ATF sintazės blokavimo įtaka žiurkės ir žmogaus širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei metabolizmo slopinimo metu...100
6.7.2. ADF-ATF translokazės blokavimo įtaka žiurkės širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei metabolizmo slopinimo metu...106
6.8. ATF hidrolizės įtaka L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumui metabolizmo slopinimo metu...109
6.8.1. Nehidrolizuojamų ATF analogų įtaka L-tipo Ca
2+srovei metabolizmo slopinimo metu ...109
6.8.2. Acidozės įtaka L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumui metabolizmo slopinimo metu ...116
7. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS...120
8. IŠVADOS ...126
9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ...127
10. PASKELBTI DARBAI...152
11. PADĖKA ...154
1. SANTRUMPOS
AC – adenilatciklazė
ADF – adenozin-5'-difosfatas
AMP-PCP – β,γ-metilenadenozin-5’-trifosfatas.
ATF – adenozin-5’-trifosfatas
ATF-γ-S – adenozin - 5’- [γ-tio]trifosfatas cAMF –ciklinis adenozin -3’,5’-monofosfatas CaMK – baltymų kalmodulino kinazė
DHPR – įtampos valdomi L-tipo Ca
2+kanalai DNP – 2,4-dinitrofenolas
EGTA – etilenglikol-bis(β-aminoelileterio)- N,N,N',N' tetraacto rūgštis ET – endoplazminis tinklas
FCCP – karbonilcianid-p-[trifluorometoksi] fenilhidrazonas GTF – guanozin -5’-trifosfatas
HEPES – N-[2-hidroksietil] piperazino-N'-[2-etansulfonio rūgštis]
I
Ca– Ca
2+jonų srovė, tekanti per L-tipo Ca
2+kanalus
ISO – izoprenalinas (1-[3’,4’-dihidrofenil]-2-izopropilamino etanolio hidrochloridas) JSA– jaučio kraujo serumo albuminas
MS – metabolinis slopinimas PDE – fosfodiesterazė PKA – baltymų kinazė A PKC – baltymų kinazė C PKG – baltymų kinazė G PP – fosfatazė
PTK – baltymų tirozino kinazė
RyR – rianodinui jautrūs endoplazminio ir sarkoplazminio tinklo Ca
2+kanalai SERCA – sarkoplazminio tinklo Ca
2+ATF-azė
ST – sarkoplazminis tinklas
∆Ψ
m– mitochondrijų membraninis potencialas τ
50– pusinis raumenėlio atsipalaidavimo laikas β-AR – β-adrenerginiai receptoriai
[Ca
2+]
i– Ca
2+koncentracija ląstelės citoplazmoje
[Ca
2+]
m– Ca
2+koncentracija mitochondrijų matrikse
2. ĮVADAS
Išemijos metu vykstantys pakitimai gali įtakoti daugelio ląstelės sistemų veiklą, tame tarpe ir L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumą. L-tipo Ca
2+kanalai yra labai svarbi širdies Ca
2+jonų apykaitą reguliuojanti sistema. Nuo šių kanalų aktyvumo priklauso sarkoplazminio tinklo RyR2 kanalų aktyvumas ir širdies raumens susitraukimas. Šiltakraujų gyvūnų miokarde, esant normaliam elektromechaniniam ryšiui, santykinai nedidelis raumens susitraukimui reikalingo Ca
2+kiekis į ląstelę patenka per L-tipo Ca
2+kanalus. Šie Ca
2+jonai aktyvina didelio susitraukime dalyvaujančių Ca
2+jonų kiekio išmetimą iš sarkoplazminio tinklo per RyR2 Ca
2+kanalus [Bers, 2006 a; Sobie ir kt., 2006]. Viduląstelinės Ca
2+jonų koncentracijos padidėjimas greta plazminės membranos išaktyvina L-tipo Ca
2+kanalus [Bers, 2002; Amano ir kt., 2005; Cens ir kt., 2006], todėl, prasidėjus Ca
2+išmetimui iš sarkoplazminio tinklo, L-tipo Ca
2+srovė sumažėja [Bers, 2002]. Tokiu būdu širdies ląstelių sarkoplazminis tinklas aktyviai reguliuoja L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumą [Barrere- Lemaire ir kt., 2000; Richard ir kt., 2006] ir I
Cakinetiką. Toks glaudus sarkoplazminio tinklo ir plazminės membranos L-tipo Ca
2+kanalų funkcinis ryšys rodo, kad vieno šios sistemos komponento veiklos pakitimas neišvengiamai keis ir kito komponento aktyvumą, o tuo pačiu ir visos ląstelės Ca
2+jonų apykaitą. To pasėkoje gali pakisti pagrindinė širdies funkcija – susitraukimas ir organizmo aprūpinimas krauju, kadangi Ca
2+jonai yra pagrindinis veiksnys, lemiantis raumens susitraukimą ir atsipalaidavimą.
Metabolizmo slopinimas yra išeminės širdies ligos ir širdies nepakankamumo savybė.
Nepaisant to, kad šis reiškinys širdies audiniuose yra tyrinėjamas, jo poveikis ląstelių Ca
2+kanalų
veiklai iki šiol nėra visiškai aiškus. Paprastai teigiama, kad oksidacinio fosforilinimo blokavimas
sukelia ATF trūkumą ląstelėje, tačiau per kokį mechanizmą tai veikia Ca
2+kanalų veiklą nėra
tiksliai žinoma. Yra duomenų, kad metabolinio slopinimo metu L-tipo Ca
2+kanalų veikla ir I
Cagali
nekisti [Verkerk ir kt., 1996], tačiau daugelio tyrimų metu nustatyta, kad metabolizmo slopinimas
mažina L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumą ir I
Ca[Furukawa ir kt., 1994; Overend ir kt., 2001; Dufer ir kt.,
2002; Kanaporis ir kt., 2004; Fukumoto ir kt., 2005]. Be to, turime duomenų, kad metabolizmo
slopinimas kai kuriais atvejais gali stimuliuoti širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovę. Metabolinio
slopinimo metu pakinta ne tik L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumas, tačiau keičiasi ir sarkoplazminio
tinklo struktūrų veikla. Manoma, kad slopinant metabolizmą mažėja sarkoplazminio tinklo RyR2
kanalų aktyvumas ir Ca
2+jonų išmetimas iš sarkoplazminio tinklo [Overend ir kt., 2001; Fukumoto
ir kt., 2005]; taip pat sulėtėja Ca
2+jonų sugrąžinimas į sarkoplazminį tinklą dėl sumažėjusio
sarkoplazminio tinklo Ca
2+ATF-azės aktyvumo [Overend ir kt., 2001; Ju ir Allen, 2003], o tai irgi
mažina Ca
2+išmetimą iš sarkoplazminio tinklo. Tokie pakitimai, vykstantys metabolizmo
blokavimo metu, neišvengiamai keičia L-tipo Ca
2+kanalų ir sarkoplazminio tinklo tarpusavio
sąveiką. Šią plazminės membranos ir sarkoplazminio tinklo sąveiką gali įtakoti labai svarbus ląstelės organoidas – mitochondrija. Mitochondrijos ląstelėje išsidėsto ties endoplazminiu tinklu ir plazmine membrana ir gali susidaryti tam tikros membranų apribotos erdvinės mikrostruktūros [Crompton ir kt., 2002; Filippin ir kt., 2003; Malli ir kt., 2005; Gherghiceanu ir Popescu, 2006].
Apie širdies ląstelių L-tipo Ca
2+kanalų, sarkoplazminio tinklo ir mitochondrijų sąveiką duomenų yra mažai, todėl svarbu ištirti, kaip glaudi šių ląstelės organoidų lokalizacija veikia Ca
2+kanalų aktyvumą ir širdies raumens susitraukimą metabolinio slopinimo metu. Žinoma, kad metabolizmo blokavimas mažina ląstelės ATF kiekį [Hasham ir kt., 1994; St-Pierre ir kt., 2000]. Mitochondrijų fermentas ATF sintazė, sumažėjus mitochondrijų membraniniam potencialui, ne tik negamina ATF, bet gali veikti kaip ATF-azė ir intensyviai hidrolizuoti viduląstelinį ATF [St-Pierre ir kt., 2000;
Vinogradov, 2000; Weber ir Senior, 2003; Grover ir kt., 2004]. Toks mitochondrijų veiklos sutrikimas neišvengiamai veikia greta esančių L-tipo Ca
2+ir sarkoplazminio tinklo Ca
2+kanalų aktyvumą. Be to, metabolinio slopinimo metu ląstelėje didėja Ca
2+ir Mg
2+koncentracija [Satoh ir kt., 2001; Bers, 2002; Kahlert ir Reiser, 2002; Sugishita ir kt., 2003], vystosi acidozė [Hayashi ir kt., 1992; Satoh ir kt., 1995; Lancaster ir Harrison 1998; Hudman ir kt., 2002; Bers, 2002;
Vaughan-Jones ir kt., 2006], kinta K
+ir Na
+koncentracija [Bright ir Ellis, 1992; Fralix ir kt., 1993;
Satoh ir kt., 2001]. Šie metabolitų koncentracijų pakitimai metabolinio slopinimo metu gali keisti L- tipo Ca
2+kanalų ir sarkoplazminio tinklo Ca
2+kanalų aktyvumą ir jų tarpusavio sąveiką.
Be to yra žinoma, kad išemijos metu, esant širdies nepakankamumui, kai dėl deguonies
trūkumo mažėja ląstelių energetiniai resursai, suaktyvėja simpatinė nervų sistema ir padidėja
katecholaminų kiekis kraujyje [Marks ir kt., 2002; Lohse ir kt., 2003; Marian, 2006]. To pasėkoje
yra aktyvinami β-adrenerginiai receptoriai ir per cAMP stimuliuojami L-tipo Ca
2+kanalai. β-
adrenerginė stimuliacija didina L-tipo Ca
2+srovę ir keičiasi L-tipo Ca
2+kanalų ir sarkoplazminio
tinklo sąveika. Apie mitochondrijų įtaką β-adrenerginės stimuliacijos aktyvintų L-tipo Ca
2+kanalų
ir sarkoplazminio tinklo RyR2 kanalų sąveikai duomenų yra mažai. β-adrenerginė stimuliacija yra
vienas iš svarbiausių širdies veiklos reguliacijos mechanizmų [Marian, 2006; Wilk ir kt., 2006],
todėl labai svarbu ištirti kaip metabolizmo slopinimas keičia L-tipo Ca
2+kanalų, sarkoplazminio
tinklo ir mitochondrijų sąveiką, vykstant šiai širdies ląstelių stimuliacijai.
3. DARBO TIKSLAS, UŽDAVINIAI IR MOKSLINIS NAUJUMAS
Darbo tikslas: ištirti šiltakraujų ir šaltakraujų gyvūnų širdies ląstelių L-tipo Ca
2+kanalų, sarkoplazminio tinklo ir mitochondrijų tarpusavio sąveiką vykstant metaboliniam slopinimui.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo skyriklių ir kvėpavimo grandinės kompleksų blokatorių poveikį šiltakraujų ir šaltakraujų gyvūnų širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei esant normai ir vykstant β-adrenerginei stimuliacijai;
2. Ištirti ar ATF sintazės ir ADF/ATF translokazės slopinimas keičia mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo skyriklių poveikį širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovei;
3. Ištirti šiltakraujų ir šaltakraujų gyvūnų širdies ląstelių, kurių sarkoplazminis tinklas išsivystęs skirtingai, mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo skyriklių poveikį L-tipo Ca
2+srovės fasilitacijai;
4. Ištirti žmonių, sergančių išeminiu širdies nepakankamumu, kardiomiocitų sarkoplazminio tinklo ir mitochondrijų įtaką L-tipo Ca
2+srovei, bei įvertinti sarkoplazminio tinklo ir mitochondrijų poveikį miokardo susitraukimo jėgai.
Tyrimo objektas: šiltakraujų (žmogaus ir žiurkės) ir šaltakraujų (varlės) gyvūnų širdies
ląstelės, žmogaus širdies raumens preparatai ir žiurkių skilvelio papiliariniai raumenėliai.
Mokslinis darbo naujumas
Šiuo darbu pirmą kartą nustatėme dvifazį šiltakraujų gyvūnų širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovės kitimą metabolinio slopinimo metu: poveikio pradžioje metabolinis slopinimas stimuliavo L- tipo Ca
2+srovę, o vėliau ją slopino. Darbo metu ištyrėme L-tipo Ca
2+kanalų, sarkoplazminio tinklo ir mitochondrijų sąveiką vykstant β-adrenerginei stimuliacijai. Mūsų tyrimų metu turėjome unikalią galimybę tirti ne tik eksperimentinių gyvūnėlių, bet ir žmogaus miokardo ląstelių L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumą. Tuo pasinaudodami pirmą kartą ištyrėme šiltakraujų gyvūnų (žmogaus ir žiurkės)
širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovės stimuliavimo, vykstančio metabolinio slopinimo metu,
mechanizmą ir nustatėme, kad L-tipo Ca
2+srovė didėja dėl susilpnėjusios L-tipo Ca
2+kanalų ir
RyR2 kanalų sąveikos. Eksperimentų su širdies raumens preparatais metu pirmą kartą nustatėme,
kad L-tipo Ca
2+srovės padidėjimas, slopinant metabolizmą, nedarė įtakos šiltakraujų gyvūnų
miokardo susitraukimo jėgai. Žmogaus ir žiurkės širdies ląstelių metabolizmo slopinimas padidino
L-tipo Ca
2+srovės amplitudę, o po to ją mažino. Tuo tarpu šaltakraujo gyvūno (varlės) širdies
ląstelių metabolizmo slopinimas tik mažino L-tipo Ca
2+srovę. Tiek šiltakraujų, tiek šaltakraujų
gyvūnų širdies ląstelių L-tipo Ca
2+srovės mažėjimas metabolizmo slopinimo metu yra žinomas,
tačiau tokio mažėjimo priežastys nėra visiškai aiškios ir literatūroje aiškinamos skirtingai. Mūsų
eksperimentų metu nustatėme, kad L-tipo Ca
2+kanalų aktyvumą mažina metabolinio slopinimo
metu vykstanti ATF hidrolizė ir vidinės ląstelės terpės rūgštėjimas. Šiuo metu literatūroje daugėja
duomenų apie lokaliai vykstančius procesus ląstelėse ir tai, kad šie procesai bei lokalios metabolitų
koncentracijos gali skirtis nuo koncentracijų ir procesų kitose citoplazmos vietose. Pagal mūsų
tyrimų rezultatus galima teigti, kad L-tipo Ca
2+srovės kitimas metabolinio slopinimo metu yra
susijęs su lokalios ATF ir kitų metabolitų koncentracijos pokyčiais ląstelėje ir su pakitusia L-tipo
Ca
2+kanalų ir sarkoplazminio tinklo sąveika.
4. LITERATŪROS APŽVALGA 4.1. L-tipo Ca
2+kanalai ir jų struktūra
Įtampos valdomus Ca
2+jonų kanalus pirmą kartą paminėjo Fatt ir Katz [1953], o skirtingus šių Ca
2+kanalų tipus pirmą kartą pasiūlė ir aprašė Hagiwara ir kt. [1975]. Remiantis įtampos valdomų Ca
2+kanalų elektrofiziologinėmis savybėmis jie buvo suskirstyti į dvi pagrindines klases:
žemo potencialo sužadinamus (angl. low voltage activated) Ca
2+kanalus ir aukšto potencialo sužadinamus (angl. high voltage activated) Ca
2+kanalus. Pagal įtampos valdomų Ca
2+jonų kanalų farmakologines ir biofizikines savybes jie suskirstyti į keletą funkcinių kanalų tipų ir pavadinti T, L, N, P/Q ir R Ca
2+kanalais. Žemo potencialo sužadinamų kanalų klasei priklauso tik T-tipo Ca
2+kanalai, kurie atsidaro esant nedidelei membranos depoliarizacijai ir greitai išsiaktyvina. R tipo Ca
2+kanalai dar kartais vadinami vidutinio potencialo sužadinamais Ca
2+kanalais (angl. intermediate voltage activated). Ca
2+kanalai į atskirus tipus suskirstyti atsižvelgiant į jų sužadinimo slenkstį, laidumą, inaktyvacijos priklausomybę nuo potencialo ir laiko, selektyvumą kitiems dvivalenčiams katijonams, kanalo valdymą, atsidarymo bei užsidarymo trukmę, farmakologines kanalo savybes [Varadi ir kt., 1995; De Waard ir kt., 1996; Yamakage ir Namiki, 2002].
L-tipo Ca
2+kanalai (angl. “L”ong lasting) literatūroje dažnai vadinami dihidropiridinų receptoriais (arba DHPR). Jie yra jautrūs įvairiems 1,4-dihidropiridinams, kurie blokuoja L-tipo Ca
2+kanalus (nifedipinas, nikardipinas) arba didina Ca
2+srovę per L-tipo Ca
2+kanalus (Bay K8644) [Kohlhardt, 1975; Yamakage ir Namiki, 2002]. Šie aukšto potencialo sužadinami kanalai paplitę labai įvairiuose audiniuose – griaučių raumenyse, širdyje, smegenyse, endokrininėse ląstelėse, neuronuose ir kitur. Jiems būdinga gana didelis laidumas (nuo 11 iki 25 pS) ir lėta nuo laiko ir įtampos priklausoma inaktyvacija (~500 ms). Pačių L-tipo Ca
2+kanalų įvairovė yra gana didelė ir toje pačioje ląstelėje gali būti ekspresuojami skirtingi L-tipo Ca
2+kanalai. Šių kanalų funkcinės savybės širdyje, sekretuojančiose ląstelėse ir neuronuose yra gana panašios, tuo tarpu skersaruožių raumenų L-tipo Ca
2+kanalai, kurių laidumas yra gana mažas (~11 pS), savo savybėmis gana stipriai skiriasi [De Waard ir kt., 1996].
Širdies L-tipo Ca
2+kanalai yra sudaryti iš keturių polipeptidinių subvienetų: α
1, β, α
2/δ ir sudaro heterotetramerinį kompleksą, kurio molekulinė masė yra apie 400 kDa (4.1 pav.). Griaučių raumenų ir smegenų Ca
2+kanalų sudėtyje yra penktasis subvienetas (γ), tačiau širdyje jis neekspresuojamas [Yamakage ir Namiki, 2002; Wang ir kt., 2004; Bodi ir kt., 2005]. α
1polipeptidas yra hidrofobiškas ir įsitvirtina ląstelės membranoje, β subvienetas išsidėsto ląstelės
viduje. δ subvienetas yra įsitvirtinęs ląstelės membranoje, šį baltymą sudaro vienas
transmembraninis segmentas, trumpa viduląstelinė seka ir didelė ekstraląstelinė dalis, kuri yra glikozilinama. α
2yra ekstraląstelinis Ca
2+kanalo polipeptidinis subvienetas. L-tipo Ca
2+kanalo α
2ir δ subvienetai tarpusavyje yra tvirtai surišti disulfidinėmis jungtimis. [De Waard ir kt., 1996;
Striessnig, 1999; Bodi ir kt., 2005] (4.1 pav.).
.1 pav. L-tipo Ca2+ kanalo struktūra.
homologiniai domenai (I-IV), kurių kiekvienas sudarytas iš šešių subvieneto EF hand, A, C, IQ motyvai yra specifinės baltymo kalmodulino 1) Nuo įtampos priklausančią aktyvaciją reguliuojanti seka.
AID (angl. α interaction domain) – α subvieneto sąveikos vieta su β subvienetu.
su α subvienetu vieta.
ilaminų prisijungimo vieta (IVS6).
seka.
asilitaciją).
2) 3) BID (angl. β interaction domain) – β subvieneto sąveikos
4) Nuo įtampos priklausančios inaktyvacijos regionas (IS6 ir gretimos sekos).
5) Jonų selektyvumą lemiantis kanalo poros regionas (S5-S6).
6) Įtampos sensorius (teigiamai įkrauti segmenti) – IS4, IIS4, IIIS4, IVS4.
7) 1,4-dihidropiridinų (DHP) prisijungimo vieta (IIIS5, IIIS6).
8) Elektromechaninio ryšio vieta.
9) Nuo jaudinimo dažnio priklausomo blokavimo zona.
10) Benzotiazepinų, DHP ir fenilalk
11) Nuo Ca2+ priklausančioje inaktyvacijoje dalyvaujanti
12) CaMKII fosforilinimo vieta (lemia nuo fosforilinimo priklausančią f 13) PKA fosforilinimo vieta.
4α1C subvienetas formuoja kanalo porą. Jį sudaro keturi transmembraninių segmentų (S1-S6). α1C
prisijungimo sekos. α2 subvienetas yra ekstraląstelinis. δ subvienetas sudarytas iš transmembraninio segmento, viduląstelinio galo ir išorinės grandinės, kuri jungiasi su α2 disulfidinėmis jungtimis. Ca kanalo β subvienetas išsidėsto ląstelės viduje. γ subvienetas širdyje neekspresuojamas ir paveikslėlyje nepavaizduotas. [Pagal Bodi ir kt., 2005].
2+
Nustatyta, kad α
1subvienetas yra svarbiausias polipeptidas iš visų Ca
2+kanalą formuojančių baltymų, jis sudaro jonus praleidžiančią kanalo porą. α
1subvienetą sudaro keturi homologiniai domenai (I-IV), kurių kiekvienas susideda iš šešių transmembraninių segmentų (S1-S6) (4.1 pav.).
α
1dalelytė užtikrina nuo potencialo priklausomą Ca
2+kanalų atsidarymą (S4 segmente esančios teigiamai įkrautos arginino ir lizino amino rūgščių liekanos yra įtampos sensorius) ir kanalo selektyvumą kalcio jonams. Šis α
1subvienetas turi specifines receptorines vietas, kuriose prisijungia Ca
2+kanalų blokatoriai (1,4-dihidropiridinai, fenilalkilaminai ir benzotiazepinai) [Striessnig, 1999; Bodi ir kt., 2005]. α
1subvieneto viduląstelinėje dalyje yra išsidėsčiusios sritys, vadinamos L ir K domenais, kurios dalyvauja nuo Ca
2+priklausančioje kanalo inaktyvacijoje, tiek kaip baltymo kalmodulino (CaM) prisijungimo vieta, tiek kaip Ca
2+sensorius [Abernethy ir Soldatov, 2002; Bodi ir kt., 2005]. Šiuo metu nustatyta mažiausiai 10 skirtingų genų koduojančių L- tipo Ca
2+kanalų α
1subvienetą, iš kurių du koduoja širdyje aptinkamus Ca
2+kanalus [Ertel ir kt., 2000; Yamakage ir kt., 2002; Bodi ir kt., 2005]. Širdies raumenyje gausiai ekspresuojama tik α
1Cizoforma (Ca
v1.2). Taip pat yra duomenų, kad L-tipo Ca
2+kanalus formuojanti α
1D(Ca
v1.3) α
1subvieneto izoforma yra ekspresuojama prieširdžiuose [Takimoto ir kt., 1997; Platzer ir kt., 2000].
Eksperimentais parodyta, kad kai ląstelėse buvo išreikštas tik α
1subvienetas, kanalo aktyvacijos ir inaktyvacijos kinetika buvo sulėtėjusi. Kai ląstelėje α
1subvienetas yra kartu su β ir α
2-δ subvienetais, atsistato normali Ca
2+srovės kinetika, keičiasi kanalo aktyvacijos slenkstis, be to, padidėja kanalo reguliacinių centrų skaičius [Singer ir kt., 1991; Neely ir kt., 1995; Birnbaumer ir kt., 1998]. Aprašytos keturios skirtingos Ca
2+kanalo β subvieneto izoformos (β
1- β
4). Nustatyta, kad širdyje išreikšta šio subvieneto β
2izoforma [Bodi ir kt., 2005]. Skirtingų gyvūnų širdyje β
2raiška šiek tiek skiriasi ir gali būti išreikštos β
2izoformos modifikacijos [Collin ir kt., 1993; Pichler ir kt., 1997]. β subvienetas dalyvauja α
1subvieneto ekspresijoje. Jis atlieka šaperono vaidmenį transportuojant pastarąjį subvienetą iš sarkoplazminio/endoplazminio tinklo į lokalizacijos vietą plazminėje membranoje ir suformuojant čia reikalingą jo konformaciją [Yamakage ir kt., 2002;
Bodi ir kt., 2005]. β subvienetas svarbus β-adrenerginiame Ca
2+kanalo reguliavime ir reaguojant į ląstelės pH pokyčius, taip pat jis įtakoja Ca
2+kanalų fasilitaciją [Bodi ir kt., 2005]. β subvienetai dalyvauja kanalo veiklos reguliavime, kurio metu fosforilinami kanalą sudarantys baltymai. Juose nustatytos vietos, kurios gali būti fosforilintos įvairių baltymų kinazių (PKG, PKA, PKC) [Striessnig, 1999; Keef ir kt., 2001]. Be to, β subvienetas didina Ca
2+srovės amplitudę ir greitina kanalo aktyvacijos kinetiką, veikia kanalo farmakologines savybes [Singer ir kt., 1991; Birnbaumer ir kt., 1998; Striessnig, 1999; Bodi ir kt., 2005].
Kanalo α
2ir δ subvienetus koduoja tas pats genas [De Jongh ir kt., 1990], ir šiuo metu yra
žinomos keturios šių baltymų izoformos (α
2/δ
1,2,3,4), koduojamos skirtingų genų [Bodi ir kt., 2005].
α
2/δ subvienetų įtaka L-tipo Ca
2+kanalų veiklai yra mažesnė, nei β subvieneto. Šie subvienetai šiek tiek padidina Ca
2+srovės amplitudę ir nežymiai pagreitina kanalo inaktyvaciją, gali pakeisti kanalo aktyvacijos savybes. Be to, α
2/δ gali keisti Ca
2+kanalų raiškos lygį ląstelėje, dalyvauti α
1subvieneto transportavime į plazminę membraną [Shistik ir kt., 1995; Bangalore ir kt., 1996; Bodi ir kt., 2005].
Tiek pagrindinis Ca
2+kanalą formuojantis subvienetas α
1, tiek pagalbiniai subvienetai β ir α
2/δ turi daug baltymų izoformų. Tokia ekspresuojamų subvienetų gausa ir jų kombinacijų įvairovė užtikrina reikiamą Ca
2+kanalų veiklą ir jų funkcijų skirtumus įvairiuose audiniuose. Esant skirtingiems Ca
2+kanalą sudarantiems subvienetams kanalo savybės šiek tiek skiriasi, pavyzdžiui, kai kanalą sudaro β
2subvienetas, kanalas greičiau inaktyvuojasi, palyginus su kanalais, kurių struktūroje yra β
1, β
3, ar β
4subvienetai [Hullin ir kt., 1992; Striessnig, 1999]. Pastaruoju metu siekiama nustatyti L-tipo Ca
2+kanalų erdvinę struktūrą. Serysheva ir kt. [2002] nustatė trimatę griaučių raumenų L-tipo Ca
2+kanalo sandarą ir teigia, kad kanalas yra asimetriškas ir sudarytas iš dviejų dalių, kurias autoriai pavadino širdies pavidalo ir rankenėlės pavidalo regionais. Širdies L- tipo Ca
2+kanalų erdvinė struktūra panaši į griaučių raumenų kanalų sandarą, tačiau širdies Ca
2+kanalai yra kompaktiškesni (jie neturi γ subvieneto) ir funkcinis baltymas membranoje yra labiau kūgiškas palyginus su griaučių raumenų Ca
2+kanalu [Wang ir kt., 2004].
Širdies ląstelių Ca
2+jonų srovė per L-tipo Ca
2+kanalus (L-tipo Ca
2+srovė arba I
Ca) yra pagrindinis Ca
2+patekimo kelias iš ląstelės išorės į citoplazmą ir sukelia širdies raumens susitraukimą [Bers, 2002; Richard ir kt., 2006; Bers ir Despa, 2006].
4.2. Sarkoplazminio tinklo Ca
2+kanalai (RyR) ir jų struktūra
Rianodino receptoriai (RyR) yra viduląsteliniai Ca
2+kanalai ir yra išsidėstę visų tipų ląstelių endoplazminiame ir sarkoplazminiame tinkle (ET ir ST). Per šiuos kanalus Ca
2+jonai yra išmetami iš viduląstelinių talpyklų į ląstelės citoplazmą. Kita viduląstelinių Ca
2+kanalų klasė yra vadinamieji inozitol 1,4,5-trifosfato receptoriai (IP
3R), kurie savo struktūra yra panašūs į RyR, tačiau skiriasi funkciniu svoriu [Dulhunty ir Pouliquin, 2003; Wehrens ir kt., 2005]. Rianodino receptoriai yra jautrūs augalų alkaloidui rianodinui. Rianodinas yra specifinis ST Ca
2+kanalų – rianodino receptorių blokatorius. Jis pakeičia RyR kanalų laidumą ir jautrumą Ca
2+[Meissner, 1986; Malecot ir Katzung, 1987; Meissner, 1994; Li ir kt., 1997; Masumiya ir kt., 2001] ir slopina Ca
2+išmetimą iš ST per RyR kanalus [Fabiato, 1985; Hudman ir kt., 2002]. RyR yra gyvybiškai svarbūs Ca
2+išmetimą ir raumens susitraukimą reguliuojantys širdies ir griaučių raumenų ląstelių baltymai.
Tyrimai parodė, kad transgeninių pelių jaunikliai, neturintys išreikštų RyR, žūdavo arba gimdavo
negyvi [Takeshima ir kt., 1998; Dulhunty ir Pouliquin, 2003], o žmogaus širdies rianodino receptorių (RyR2) mutacijos siejamos su dalimi staigių neišaiškintų mirčių atvejų ir su kai kuriomis širdies ligomis [Tester ir kt., 2004; Wehrens ir Marks, 2004]. Raumens susitraukimui reikalinga Ca
2+koncentracija greta kontraktilinių baltymų paprastai yra pasiekiama sinchroniškai atsidarius ST RyR kanalams ir Ca
2+jonams pagal koncentracijos gradientą plūstelėjus iš ST į citoplazmą [Bers, 2002; Bers ir Despa, 2006]. RyR kanalai reikšmingi ir kitiems organizmo gyvybiniams procesams, kuriuos reguliuoja ET ir ST Ca
2+jonai. RyR receptorių vaidmuo labai svarbus vykstant transkripcijai, apvaisinimo procese, sinapsiniam signalo perdavimui, aktyvinant nuo Ca
2+priklausomus K
+kanalus [Piskorowski ir Aldrich, 2002; Wehrens, 2005].
RyR yra dideli homotetrameriniai baltymai, kurie jungiasi į makromolekulinius kompleksus su kitais reguliaciniais ir struktūriniais baltymais ir yra didžiausi žinomi kanalų baltymai. Šie viduląsteliniai Ca
2+kanalai savo dydžiu ir topologija smarkiai skiriasi nuo plazminės membranos įtampos valdomų joninių kanalų [Wehrens ir kt., 2005]. Pirmieji buvo klonuoti žinduolių griaučių raumenų (RyR1) ir širdies rianodino receptoriai (RyR2) [Takeshima ir kt., 1989; Otsu ir kt., 1990], o kiek vėliau Hakamata ir kt. [1992] klonavo triušio smegenų rianodino receptorius (RyR3). Šios trys pagrindinės žinduolių RyR izoformos daugiausia yra aptinkamos jau minėtuose audiniuose, tačiau mažesniais kiekiais yra ekspresuojamos ir kituose organizmo audiniuose. RyR1 aptinkamas Purkinje ląstelėse ir smegenyse, RyR2 randamas neuronuose, RyR3 – smegenyse, diafragmoje, griaučių raumenyse, pilvo organuose [Dulhunty ir Pouliquin, 2003; Wehrens ir kt., 2005]. Tam tikrų rianodino receptorių ekspresijos lygis tuose pačiuose audiniuose gali skirtis skirtingose organizmo vystymosi stadijose ir gali priklausyti nuo ląstelės stimuliacijos – RyR3 yra gausiai ekspresuojamas besivystančiuose griaučių raumenyse, tačiau jų beveik nėra suaugusio organizmo griaučių raumenyse [Ogawa ir kt., 2000]. Panašios į jau minėtas, RyR izoformos buvo aptiktos ir kituose stuburiniuose gyvūnuose (ne žinduoliuose), kur RyRα izoforma yra homologiška RyR1, tuo tarpu RyRβ izoforma artima RyR3 [Ottini ir kt., 1996; Franck ir kt., 1998; Ogawa ir kt., 2000]. Be to, šaltakraujų gyvūnų širdies ląstelėse RyR ekspresija skiriasi nuo šiltakraujų gyvūnų. Tijskens ir kt.
[2003], panaudoję radiologinius-farmakologinius, imunologinius ir elektroninės mikroskopijos metodus, nustatė, kad varlės širdies skilvelyje rianodino receptorių nėra, o prieširdyje jų ekspresija labai menka. Žinduolių miokarde gausiai ekspresuojama ir pagrindinį ST Ca
2+kanalų vaidmenį raumens susitraukimo mechanizme atlieka rianodino receptoriaus izoforma RyR2 [Wehrens ir kt., 2005; Bers, 2006 a; Xue ir kt., 2007].
Kaip minėta, viduląstelinis Ca
2+kanalas (RyR) yra sudarytas iš 4 didelių homologiškų
polipeptidų, kurių kiekvieno masė yra apie 560 kDa. Žinduolių RyR izoformų (RyR1 – RyR3)
amino rūgščių sekos panašumas yra didelis ir siekia 66 proc. tarp RyR1 ir RyR2, 67 proc. tarp
RyR1 ir RyR3, ir 70 proc. tarp RyR2 ir RyR3 [Dulhunty ir Pouliquin, 2003]. RyR kanalus
formuojantys baltymai turi tris stipriai besiskiriančias savo amino rūgščių seka sritis D1, D2 ir D3, kurios, manoma, nulemia funkcinius skirtumus tarp RyR izoformų.
Citoplazma
ST membrana
ST
TM seka
Kalstabinas 2
(A) (B)
LIZ (Spinofilinas, PP1)
LIZ (PR130, PP2A) CaM
Ser 2809 P Ser 2815 P LIZ AKAP CaM
CaMKII
PKA
Citoplazma
ST membrana
ST
TM seka
Kalstabinas 2
(A) (B)
LIZ (Spinofilinas, PP1)
LIZ (PR130, PP2A) CaM
Ser 2809 P Ser 2815 P LIZ AKAP CaM
CaMKII
PKA
4.2 pav. Širdies ląstelių sarkoplazminio tinklo Ca2+ kanalo (RyR2) strukūra.
(A) Erdvinė RyR2 struktūra. Apibrėžta sritis žymi transmembraninius (TM) segmentus, kurie įsitvirtinę sarkoplazminio tinklo (ST) membranoje ir formuoja kanalo porą.
(B) Linijinė RyR2 kanalą sudarančio monomero amino rūgščių seka. Joje pažymėtos RyR2 ir kitų baltymų sąveikos vietos, bei baltymų kinazės A (PKA) ir nuo Ca2+ ir kalmodulino priklausančios kinazės II (CaMKII) foforilinimo vietos (Ser2809P ir Ser2815P). LIZ (angl. leucine/isoleucine zippers) žymi su RyR2 sąveikaujančių baltymų taikinius – amino rūgščių sekas kurios yra bendros su įtampos valdomų joninių kanalų atitinkamomis sekomis. CaM – baltymas kalmodulinas, PP1 ir PP2A – fosfatazės, AKAP – PKA inkarinis baltymas, PR130 – PP2A nukreipiantis baltymas.
[Pagal Wehrens ir kt., 2005].
