LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS NEUŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDRA
DENIS PERVUŠIN
Karvių rujos vertinimas pagal progesterono koncentraciją
piene
Veterinarin÷s medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. dr. Vytuolis Žilaitis
1
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas
Karvių rujos vertinimas pagal progesterono koncentraciją piene 1. Yra atliktas mano paties;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2013 m. sausis 25 d. Denis Pervušin
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2013 m. sausis 25 d. Denis Pervušin
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO 2013 m. sausis 25 d. Prof. dr. Vytuolis Žilaitis
(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
2013 m. sausis 25 d. Doc., dr. Audrius Kučinskas
(aprobacijos data) (katedros ved÷jo/ vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra patalpintas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretor÷s/iaus parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
2
Pervušin D. (2013). Evaluation of cow estrus by progesterone concentration in milk. Research advisor – Prof., dr. Vytuolis Žilaitis. Kaunas.Veterinary Faculty of the Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences.
Summary
The decline of cow fertility is often connected to imprecise heat detection. One of the ways to monitor heat is to evaluate the concentration of progesterone and body temperature. The aim of this paper is to specify the connection between the concentration of progesterone in milk and rectal temperature during the heat period and insemination. The research was carried out in 2011-2012. Concentration of progesterone in milk during heat has been determined using a quick progesterone test IDEXX Cite® ProbeTM Milk Progesterone Test (USA) (testing I) and a semi-automated
progesterone concentration analyser FT MULTILYSER S20 (Germany) (testing II) with Förster-Technik GmbH (Germany) reagents. The concentration of progesterone has been evaluated at different times during heat after calf delivery. The temperature has been measured during heat. When clinical heat indicators have been identified (examined hitched cows‘ genitals had changed visually: mucous discharge, swollenness, redness, decline of milk secretion) after 12 hours a progesterone test has been performed, body temperature measured and cows have been inseminated. Milk samples to identify the concentration of progesterone have been taken 15 minutes after the evening milking. Altogether, 43 black and white breed Holstein cows from one Lithuanian milk farm have been selected. Cows were inseminated by using U.S.A. Holstein Regancrest Iota Alta bull sperm, sperm motility – 4 points, concentration – 20*106 sperms per dosage – 0,25 ml. Two months later the inseminated cows have been examined rectally on the matter of pregnancy. The level of progesterone of cows in heat has been 2,4 ± 0,6 ng/ml, independently of the testing method. An average rectal temperature has been 39,3 ± 0,2 0C. 52,17 percent of cows has been fertilised overall. 53,84 and 50,00 percent of cows have been impregnated accordingly during the first and the second testing, the difference 3,84 percent, (p<0,005). The factor analysed – temperature to determine the change of heat based on dispersive analysis data is an incorrect indicator (p=0,341). During the heat period rectal temperature has been within maximal physiological norm limits. The average progesterone concentration of the mating cows on the 40th day after a calving is 2,45 ± 0,4 ng/ml and compared to the already mated cows on the 30th day – 3,0 ± 0,8 ng/ml, 18 percent (p<0,05) smaller. Progesterone concentration established by different methods differs. The concentration of progesterone in milk is one of additional methods to evaluate heat. An increased to
3
maximum body temperature, unless pathologies detected, can be estimated as a heat factor. The minimal progesterone concentration in milk is during the heat after the lactation peak. It can be the base of the most favourable time for insemination.
4
Turinys
1. Santrumpos... 5
2. Įžanga... 6
3. Literatūros apžvalga ... 8
3.1. Lytinis ciklas ir jo reguliacija ... 8
3.2. Progesterono vaidmuo vertinant reprodukciją... 10
3.3. Progesterono nustatymo būdai ... 11
3.4. Testo taikymo sąlygos ... 11
3.5. Kas turi įtakos progesterono koncentracijos raidai ... 13
3.6. Progesterono ir temperatūros santykis... 14
4.Metodika... 16
4.1. Metodikos schema... 16
4.1. Trumpas ūkio aprašymas... 17
4.2. Darbo eiga... 17
4.4. Pieno progesterono I bandymas atlikimo metodika ... 18
4.4.1. Bendros instrukcijos ... 19
4.4.2. Testo atlikimo tvarka ... 19
4.4.3. Pieno progesterono testo interpretacija ... 20
4.5. II bandymo atlikimo tvarka... 21
4.6. Tyrimų rezultatai ... 21 5. Rezultatų aptarimas ... 24 6. Išvados... 26 7. Pasiūlymas... 26 8. Literatūros sąrašas ... 27 9. Pad÷kos ... 30
5
1. Santrumpos
et al. – ir kiti proc. – procentai val. - valandos P4 – progesteronas PGF2α – Prostaglandinas F2 alpha p – patikimumas ng/ml – nonagramų mililitre mmol/l – milimolių litre pav. – paveiksl÷lis Nr. – numeris µm – mikrometrų nm - nanometrų ml. – mililitrųCL - Corpus luteum (lt. geltonkūnis) LH – liuteinizuojantis hormonas
GnRH – gonadotropiną atpalaiduojantis hormonas FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas
6
2. Įžanga
Efektyvus reprodukcijos valdymas yra labai svarbus pieno pramonei. Nepasteb÷tos rujos ir v÷lyvas nes÷kmingo s÷klinimo nustatymas fermai gali tapti didelių finansinių nuostolių priežastimi.
Rujos nebuvimas arba karvių s÷klinimas netinkamu laiku yra viena didžiausių įvairaus amžiaus ir veislių karvių neapsivaisinimo priežasčių (Masiulis ir kt., 2003).
Apklausa parod÷, kad apvaisinimo dažnis svyravo tarp 35 proc. ir 40 proc. (Toolsee et al. 1996). Ispanijoje 1991 – 2000 metų laikotarpiu apsivaisinimas pirmo karto metu sumaž÷jo nuo 42 proc. iki 33 proc. (López-Gatius, 2003).
Naujų tyrimų pagalba buvo nustatyta, kad tik 47 proc. ūkininkams priklausančių karvių apvaisintos 120 dieną po veršiavimosi. Apie 35 proc. ūkininkų praleido ne mažiau kaip dvi karvių rujas po apvaisinimo, tai l÷m÷ veršiavimosi intervalo padid÷jimą. (Boodhoo et al., 1997).Jungtin÷se Amerikos Valstijose dvidešimties metų laikotarpiu dirbtinio apvaisinimo efektyvumas sumaž÷jo 0,45 proc. per metus. (Butler and Smith, 1989; Beam and Butler, 1999). Anglijoje toks sumaž÷jimas siek÷ 1 proc. per metus (Royal et al., 2000a; Royal et al., 2000b).
Laiku nustatyta ruja yra svarbi s÷kmingam dirbtiniam aps÷klinimui atlikti ir ankstyvam veršingumui nustatyti. Priešingu atveju gali ženkliai sutrump÷ti laikotarpis iki pakartotino apvaisinimo, jei jis būtinas. D÷l šių priežasčių labai svarbu taikyti patikimą metodą, tiksliai nustatyti rują ir kitas reprodukcijos stadijas. (Simersky et al. 2007).
Pieno gamintojai gerai žino, kad jų bandų reprodukcijos efektyvumas turi didel÷s įtakos pelningumui. Pagrindiniai veiksniai, lemiantys reprodukcinį paj÷gumą, yra tikslus rujos nustatymas, tinkama sperma, s÷klinimo technologijos laikymasis, savalaikis apvaisinimas. Svarbiausias iš šių veiksnių yra tikslus rujos įvertinimas. Deramai rują nustatyti yra keblu, nes karv÷s dažniausiai rujoja naktį, o steb÷ti elgseną kiaurą parą neekonomiška (Hirad and Rajamahendran 2001).
Bandos reprodukcija - vienas iš pagrindinių veiksnių, lemiančių pieno gamybos efektyvumą, veršelių išeigą (Esslemont, 1992).
Teisinga rujos bei savalaik÷ veršingumo diagnostika yra bandos reprodukcijos geros vadybos rezultatas. Pra÷jusį dešimtmetį Didžiojoje Britanijoje bandos reprodukcijai gerinti buvo pritaikytas progesterono nustatymo tyrimas piene. Šią technologiją per÷m÷ JAV. Tačiau šiuo metu pieno progesterono testą kaip diagnostinę reprodukcin÷s funkcijos vertinimo priemonę naudoja mažiau kaip 10 proc. bandų (Karl-Johan Petersson, 2007).
7
Pilnavert÷s rujos metu progesterono koncentracija piene ir kraujyje itin maža. Progesterono koncentracija yra rujos fiziologiškumo žymuo. Svarbu greitai ir tiksliai nustatyti rują. Praktikoje taikomi metodai, kurių pagalba operatyviai nustatoma progesterono koncentracija. Vienas iš jų yra taip vadinamas „greitasis“ (Express) metodas ir pusiau automatinis metodas, atliekamas analizatoriumi FT MULTILYSER S20.
Darbo tikslas: patikslinti ryšį tarp progesterono koncentracijos piene rujos metu ir apsivaisinimo.
Darbo uždaviniai:
1. Apibendrinti literatūros duomenis apie progesterono kaitos reikšmę karvių rujos metu ir vertinant karvių reprodukciją.
2. Nustatyti progesterono koncentraciją piene rujos metu, naudojant IDEXX Cite® ProbeTM Milk Progesterone Test (JAV).
3. Nustatyti progesterono koncentraciją piene rujos metu, naudojant FT MULTILYSER S20 (Vokietija) analizatorių ir firmos Förster-Technik GmbH (Vokietija) reagentus. 4. Įvertinti progesterono koncentraciją rujos metu skirtingu laiku po veršiavimosi. 5. Patikslinti rektinę temperatūrą rujos metu.
8
3. Literatūros apžvalga
3.1. Lytinis ciklas ir jo reguliacija
Karvių lytinis ciklas yra neurohumoralinis procesas, kurio metu pasireiškia fiziologiniai ir morfologiniai pokyčiai tiek lytiniuose organuose, tiek ir visame karv÷s organizme (Masiulis ir kt., 2003).
Pav.1 pav. Karvių neuroendokrinin÷ reguliacija.
Pagal Coleman, (www.wvu.edu/~agexten/forglvst/Dairy/dirm25.pdf.)
Karvių lytinis ciklas skirstomas į keturias fazes: rujos (oestrus − 0 diena), poovuliacinio periodo (metoestrus − 1–4 diena), tarprujo (dioestrus − 5–18 diena, atitinkanti luteininę fazę) ir priešrujo (prooestrus − 18–20 diena), periodo iki rujos. Neveršingos karv÷s ovuliacija vyksta maždaug kas 21 dieną (intervalas nuo 17 iki 24 dienų). Folikulų augimo dinamika kiaušid÷je buvo tiriama ultragarsu ir nustatyta, kad folikulai auga vadinamosiomis augimo bangomis. Folikulų augimo bangos yra labai būdingos karv÷ms. Dauguma karvių lytinio ciklo metu patiria tris folikulų augimo bangas, nors kai kurios − tik dvi ar net keturias. Kiekvienos folikulų augimo bangos metu subręsta vyraujantis folikulas, pasiruošęs ovuliacijai. Kiekvieną folikulinę bangą sudaro folikulų susitelkimas, atranka, dominavimas ir išnykimas (atrezija). Folikulin÷ banga prasideda nuo augančių susitelkusių folikulų, apie 4,0 mm diametro, augančių kartu iki 5–7 mm. Pasiekęs tokį dydį, vienas folikulas pradeda greičiau už kitus augti ir tampa vyraujančiu, o kiti nustoja augę ir
9
pamažu regresuoja. Vyraujantis folikulas vidutiniškai užauga nuo 4,0 mm iki 8,5 mm, o subordinarinis (antras pagal dydį) – iki 7,5 mm (Masiulis ir kt., 2003).
Vyraujantis pirmosios bangos folikulas maksimalų dydį pasiekia 7–8 lytinio ciklo dieną (rujos diena žymima kaip 0 diena), nors, kitų autorių duomenimis, maksimalų dydį (10–13 mm) pasiekia per 5 dienas nuo augimo pradžios. Vyraujantis folikulas morfologiškai ir funkciškai dominuoja maždaug iki 11 ciklo dienos. V÷liau jis pradeda regresuoti (11–14 dieną), ir prasideda antroji folikulų augimo banga (Masiulis et. al., 2003).
2 pav. Folikulin÷s bangos (Noseir, 2003). http://www.rbej.com/content/figures/1477-7827-1-50-2-l.jpg
Antroji augimo banga prasideda maždaug 10 dieną po ovuliacijos, o papildoma, trečioji, esant trijų bangų ciklui, prasideda 16 dieną po ovuliacijos. Esant dviejų ar trijų bangų ciklams, galintis ovuliuoti folikulas subręsta vienoje paskutiniųjų bangų. Įprasto trijų bangų lytinio ciklo folikulų augimo bangos prasideda 1, 9 ir 16 dieną. Po apsiveršiavimo pirmas vyraujantis folikulas subręsta maždaug 9 lytinio ciklo dieną ir dažniausiai (85 proc. atvejų) randamas priešingoje gimdos ragui, kuriame buvo vaisius, kiaušid÷je. Lytinio ciklo metu GnRH (gonadotropinių hormonų išskyrimą stimuliuojantis hormonas) skatina folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) ir liuteinizuojančio hormono (LH) sekreciją, o šie skatina folikulų susidarymą ir augimą folikulin÷mis bangomis. GnRH yra proteinas, kurį gamina ląstel÷s, esančios smegenų pagrinde. GnRH − hormonas, natūraliai besigaminantis karvių organizme ir stimuliuojantis LH ir FSH sekreciją adenohipofiz÷je. LH kartu su FSH veikia kiaušidžių folikulo, brandinančio kiaušin÷lį, augimą. Didelis LH kiekis sukelia ovuliaciją (kiaušin÷lio išsilaisvinimą). Po ovuliacijos kiaušid÷je formuojasi geltonasis
10
kūnas, kuris pradeda gaminti progesteroną, ruošiantį gimdą ir visą karv÷s organizmą veršingumui bei apsaugantį nuo kitos rujos pasireiškimo (Masiulis ir kt., 2003).
Kol geltonasis kūnas gamina progesteroną, tol organizme slopinama GnRH ir LH sekrecija ir ovuliacija nevyksta. Jei karv÷ neapsivaisina, geltonasis kūnas nustoja gaminti progesteroną ir regresuoja. Po geltonojo kūno regresijos išsiskiria daugiau GnRH ir LH, vyraujantis folikulas pradeda augti, kiaušid÷s − gaminti estrogenus, kurie sukelia rujos požymius. FSH ir LH smarkiai padaug÷ja − įvyksta ovuliacija (Masiulis ir kt., 2003).
3.2. Progesterono vaidmuo vertinant reprodukciją
Progesteronas yra steroidas, kurį, lytinio ciklo metu pagrinde produkuoja laikina moteriška lytin÷ liauka – geltonas kūnas. Šio hormono koncentracija yra žemiausia rujos metu ir ima did÷ti po ovuliacijos, vystantis geltonajam kūnui. Jei karv÷ apsivaisino, šio hormono aukšta koncentracija (virš 10 ng/ml) išlieka nuo veršingumo pradžios iki laikotarpio prieš veršiavimąsi. Jei karv÷ neapsivaisino, apie 17 parą geltonasis kūnas degeneruoja ir 21 parą kraujyje nustatoma minimali progesterono koncentracija mažiau kaip 3 ng/ml), - 19 -23 parą karv÷ v÷l surujoja. Progesterono koncentracija kraujyje ir piene koreliuoja. Faktas, kad progesteronas yra steroidinis hormonas ir giminingas pieno riebalams, tod÷l nustatoma progesterono koncentracija piene yra didesn÷. Moksliniais tikslais progesterono koncentracija nustatin÷jama jau eil÷ metų. Buvo naudojamas itin tikslus radioimuninis metodas, reikalaujantis didelio technikų įgudimo ir radioaktyvių reagentų. Europoje šis metodas naudojamas nuo 1973 metų ir 1980 metais sukurtas komercinis metodas. (Karl-Johan Petersson, 2007).
Šiuo metu plačiausiai naudojamas pieno progesterono koncentracijos nustatymo metodas paremtas fermentus rišančiu imunoabsorbcijos metodu (Enzyme-Linked Immunosorbent – ELISA testas. Metodo esm÷ – monokloninių antikūnų panaudojimas prieš 11alfa – hidroksiprogesterono-hemisukcinatą ir jų susijungimo konkurencija su laisvu progesteronu arba žym÷tu progesteronu. Mūsų tyrimuose bandytas kokybinis metodas, kur apie progesterono koncentraciją sprendžiama pagal m÷ginio intensyvumą. Į indą kur įvyko reakcija su ieškomu hormonu, įpilama antigeno su enzimu. Prid÷jus substrato, kurį gali ardyti enzimas, belieka prid÷ti tik „ryškalo“, fiksuojančio spalvą. Kadangi metodas veikia konkurenciniu principu, tai progesterono koncentracija m÷ginyje yra atvirkščiai proporcinga spalvos intensyvumui. Metodas jautrus, lengvai paruošiamas ir finansiškai prieinamas. Praeinanti per tiriamą m÷ginį šviesa proporcinga baltymo koncentracijai.
11
Kiek susijung÷ su žym÷tu progesteronu gali būti išmatuojama pagal lazerio šviesos absorbciją. Tokiu principu veikia neseniai išbandytas pusiau automatinis kiekybinis pieno progesterono analizatorius - FT-Multilyser. Tyrimas yra itin jautrus, galima nustatyti progesterono koncentraciją vieno nanogramo/mililitre tikslumu (Žilaitis ir kt. 2008).
3.3. Progesterono nustatymo būdai
Kraujo m÷giniai. Kraujas turi būti paimtas iš uodegos venos. Iš vieno gyvūno imama ne mažiau kaip 2 ml į atskirus m÷gintuv÷lius, kurie paženklinami etikete su gyvūno identifikavimo numeriu. Siekiant išvengti kryžmin÷s taršos m÷giniai turi būti imami naudojant vienkartines adatas. Jas galima įsigyti iš veterinarijos gydytojų arba veterinarijos įrankių teik÷jų. Paimti m÷giniai paruošiami siuntimui į laboratoriją - jie kruopščiai supakuojami į konteinerį, kuriame yra gerai įtvirtintas stovas. M÷ginių šaldyti nereikia. Kai m÷giniai pristatomi į laboratoriją, visas procesas nuo pasiruošimo iki atsakymo apdorojimo užtrunka 27 val. Jei m÷ginys į laboratoriją atsiunčiamas ryte, rezultatai gaunami jau kitą dieną. Tyrimo tikslumas - 97 proc. Rezultatai tikslesni už tuos, kurie gaunami atliekant rektinį tyrimą. (Angie Stump Denton. 2006).
Pieno m÷giniai. Ankstesniais darbais nustatyta, kad karvių progesterono koncentracija 30 – 210 veršingumo dieną buvo beveik 4 kartus didesn÷ piene negu kraujo plazmoje, kai m÷giniai buvo surenkami po rytinio melžimo pra÷jus 2 valandoms. (Ginther et al., 1974). Panašūs dideli hormono kiekiai piene buvo nustatyti tarprujo vidurio metu naudojant radioimunologinį tyrimą ir chromatografiją.(Nuti et al., 1975). Buvo pasteb÷ta teigiama koreliacija tarp pieno progesterono ir riebalų koncentracijos, priklausanti nuo m÷ginių ÷mimo laiko.(Hoffmann et al., 1974; Nuti et al., 1975) Piene, surinktame iš karto po rytinio melžimo, buvo daugiau hormono, negu m÷giniuose, surinktuose prieš melžimą ir pra÷jus 3 valandoms po melžimo. Progesterono kiekio padid÷jimas ir koreliacija su pieno riebalais yra pastovi. Šie atradimai parodo, kad, norint nustatyti hormono koncentraciją piene ir kraujyje, m÷ginius reikia rinkti rūpestingai (Ginther et al. 1976).
3.4. Testo taikymo sąlygos
Komerciniai progesterono testavimo rinkiniai yra pagrįsti fermentus jungiančios imunoabsorbcijos metodu. Pažym÷tas peroksidaze 11alfa – hidroksiprogesterono–hemisukcinatas naudojamas kaip žym÷tas antigenas. Polikloniniai antikūnai prieš 11alfa – hidroksiprogesterono–hemisukcinatą buvo
12
gauti imunizavus triušius galvijų kraujo serumu.(Strnad et al., 1997). Po 5-to imunizavimo triušiai buvo nukraujinami, antiserumas nusodintas amonio sulfatu ir 5 dienas vykdoma dializ÷. V÷liau serume nustat÷ imunoglobulino G (IgG) kiekį, naudojant 280 nm spektro ultravioletine šviesą. Išgrynintus antikūnus laik÷ -20ºC temperatūroje. Antikūnai, naudojami pieno progesterono teste, nereaguoja su kitais n÷štumo hormonais (Simersky et al., 2007).
Tyrimams reikalingas indas, kurio paviršius padengtas antikūnais prieš progesteroną. Į indą įpilamas tiriamos karv÷s pienas, kuriame progesteronas reaguoja su antikūniais. Į kontrolinį indą su antikūnais įpilamas m÷ginys su žinoma progesterono koncentracija. Kuri nustatoma 4 parą po rujos. Abu m÷giniai išpilami ir į abu įpilamas progesterono – fermentų komplekso tirpalas. Kompleksas reaguoja su „neužimtais“ antikūnais. Po trumpos inkubacijos m÷gintuv÷lių turinys išpilamas, praskalaujama, kad neliktų „nesusirišto“ komplekso. Pridedama tam tikros medžiagos – substrato, kurią gali skaidyti fermentas susietas su antikūniu. Pridedama „ryškalo“ – medžiagos, kuri reaguoja su suskaidytu substratu. Jei spalva intensyvesn÷, nei kontroliniame m÷ginyje - progesterono koncentracija mažesn÷, negu 4 parą po rujos, vadinasi m÷ginio ÷mimo metu ji rujojo. Jei spalva blankesn÷ – progesterono koncentracija didesn÷, nei 4 para po rujos. Rezultatai priklauso nuo m÷ginio pa÷mimo sąlygų, bet jei m÷ginys paimtas po s÷klinimo, tai karv÷ greičiausiai veršinga.
Šiuo metu kuriami paprastesni naudojimui testai, kur reakcija vyksta tiesiog ant sorbento ir nereikalingas „ryškalas“. Paprastai gamintojas paruošia absorbcinę medžiagą ant kurios yra patalpinti antikūnai prieš progesteroną. Užlašinus pieno, progesteronas, esantis piene, kaip antigenas reaguoja su antikūnais. Fiksuotas prie antikinio fermentas, po antikūnio sąveikos, tampa aktyvus ir skaldo substratą. Substratas paprastai parenkamas toks, kad paveikus fermentui pasikeistų jo spalva. Taigi, kuo daugiau „atsilaisvins“ fermento, tuo daugiau bus suskaidyta substrato, tuo intensyvesn÷ taps bandinio spalva. Fermento tuo daugiau atsilaisvins, kuo daugiau bus antigeno – agento priverčiančio reaguoti antikūniui.
Svarbu atkreipti d÷mesį, kokiam pienui (prieš ar po melžimo) tirti yra skirtas progesterono nustatymo rinkinys. Tyrimui netinka pieno m÷giniai, paimti iš mastitu sergančių karvių, nes d÷l uždegimo pakinta pieno sud÷tinių dalių santykis. Pieno m÷giniai 24 val. gali būti saugomi šaldytuve. Jeigu reikia saugoti ilgiau nei 24 val., m÷giniai turi būti užšaldyti -200C temperatūroje (Pierre Rioux, Denis Rajotte, 2004).
13
4 pav. (Pierre Rioux, Denis Rajotte, 2004)
A: Vidin÷ indo sienel÷ padengta specifiniais progesterono antikūnais. Pieno m÷ginio ir pažym÷to progesterono mišinys inkubuojamas su progesterono antikūnais.
B: Antikūno susijungimas su žym÷tu progesteronu ir tiriamojo pieno progesteronu. C: Ryškalas (chromogenas) reaguoja su žym÷to progesterono fermentu.
D: Po inkubacijos ryškalas nudažo m÷ginį
3.5. Kas turi įtakos progesterono koncentracijos raidai
Karvių, sergančių kiaušidžių cistomis ar gimdos infekcijomis, progesterono koncentracija kraujyje taip pat gali būti didel÷.
Kiaušidžių cistomis serga daugelis naminių gyvulių. Pienin÷ms karv÷ms kiaušidžių cistos yra sunkus reprodukcin÷s funkcijos sutrikimas. Atlikti skaičiavimai parod÷, kad kiaušidžių cistomis serga 5 - 20 proc. karvių. JAV pienin÷se bandose šia liga serga 16,2 - 47,4 proc. karvių.
14
Vyresn÷ms karv÷ms kiaušidžių cistos pasitaiko dažniau (39 proc.), nei pirmaverš÷ms (11 proc.). Kiaušidžių cistos dažniausiai atsiranda per pirmąsias 60 dienų po veršiavimosi. Jei karv÷ serga cistomis, laikotarpis iki pirmos rujos pailg÷ja 10-30 proc.
Kai kurie autoriai išskiria tiktai dvi kiaušidžių cistų rūšis – folikulines ir liuteinines.
Folikulin÷ cista dažniausiai pasitaikanti (70 proc.) cistų rūšis. Tokios cistos susidaro d÷l LH trūkumo. Subrendęs folikulas neovuliuoja, jame kaupiasi skysčiai. Folikulo sienel÷s ląstel÷s produkuoja nedidelį kiekį progesterono ir estrogeną. Folikulin÷s cistos gali progresuoti ir liuteinizacijos proceso išdavoje tapti liuteinin÷mis cistomis.
Liuteinin÷ folikulo cista dažnai būna viena ir vienoje kiaušid÷je. Cista gali išskirti vidutinius progesterono kiekius. Atlikus bandymus su 200 karvių, kurioms buvo nustatytos kiaušidžių cistos, 71 proc. buvo klinikiškai diagnozuotos folikulin÷s, o 29 proc. - liuteinin÷s cistos atvejai. Progesterono tyrimas parod÷, kad diagnoz÷ buvo teisinga 84 proc. folikulin÷s cistos atvejų ir 54 proc. luteinin÷s cistos atvejų. Atlikus pieno progesterono testus 74 proc. patvirtintų cistinių atvejų į gydymą atsiliep÷ per dvi savaites. 80 proc. karvių tapo veršingomis pra÷jus 38 dienoms po gydymo. (Rhodes 2003).
3.6. Progesterono ir temperatūros santykis
Žinoma, kad temperatūra parodo šiltakraujų gyvūnų biologinius pokyčius. Pas pieninius galvijus, įvertinus jų psichologinius ir elgsenos rodiklius, buvo įrodytas paros ir lytinio ciklo eiliškumas. (Suthar, Burfeind, et al. 2011).
Kad vyktų fiziologiniai procesai karvių temperatūra gali svyruoti nuo 37,8 0C iki 40,0 0C (Pei Jun Chen 1998).
Kūno temperatūra rujos metu pakyla per 3 - 6,5 valandas. Ji pakyla 0,9 ± 0,30 C laipsniais. Temperatūros pokyčiai rujos metu buvo matuojami rektiškai ir makštyje. Buvo nustatyta, kad pokyčiai susiję su LH kilimu ir ovuliacija. Šaltiniuose taip pat teigiama, kad temperatūros kilimas rujos metu susijęs su padid÷jusiu fiziniu aktyvumu. Kiti tyrimai rodo, kad progesterono (P4) termogeninis efektas, kuris pasireiškia liuteinines fazes metu, sąlygoja temperatūros k÷limą. Tačiau tiesiogin÷s koreliacijos tarp P4 koncentracijos ir kūno temperatūros n÷ra. (Suthar, Burfeind, et al. 2011).
15
Pav.5: A-PG = 48 val. prieš trečią PGF2α injekciją; PG-E = nuo trečios PGF2α injekcijos iki pirmų rujos požymių; E-OV = ruja; OV = apytiksliai 4 val. ovuliacijos; P-OV = 96 val. po ovuliacijos. (Suthar, Burfeind, et al. 2011)
Dešimta A-PG laikotarpio diena, P4 koncentracija kraujyje buvo 5,0 ± 1,5 ng/mL. Prostaglandino F2 alpha panaudojimas 12 dieną sumažino geltonkūnį ir suk÷l÷ rują per 50.7 ± 16.9
val. Rujos metu (E-OV), P4 koncentracija svyravo 0,3 ± 0,1 ng/mL. Vidutin÷ rujos trukm÷ buvo
20,6 ± 2,5 val. Besiformuojantis geltonkūnis buvo rastas 114,9 ± 3,8 val. po ovuliacijos. Tuo pačiu metu kraujo P4 koncentracija pakilo iki 0,9 ± 0,2 ng/mL.(Suthar, Burfeind, et al. 2011).
Aukščiausios kūno temperatūros buvo pasteb÷tos rujos (39,0 ± 0,5°C) metu, o mažiausia kūno temperatūra buvo pamatuota per 4 val. po ovuliacijos pradžios (38,5 ± 0,2°C). PG-E laikotarpio metu kūno temperatūra buvo 0,1°C žemesn÷ (38,6 ± 0,3°C) palyginus su A-PG (38,7 ± 0,2°C) laikotarpiu. (Suthar, Burfeind, et al. 2011).
16
4.Metodika
4.1. Metodikos schema
Pieno ūkis
Holštinizuotos Lietuvos juodmarges n=127
Rujojančios karves
20-90 parų po apsiveršiavimo 6500-7500 kg/laktaciją produktyvumo, trečios – ketvirtos laktacijos
n=43
I bandymas n=13
II bandymas n=10
Progesterono koncentracija piene rujos metu skirtingu laiku po veršiavimosi
n=20
Matuojama kūno t0
S÷klinimas
Veršingumo nustatymas
17
4.1. Trumpas ūkio aprašymas
2001 – 2002 metais rekonstruota X karvių ferma. Joje sumontuota firmos De Laval pieno melžimo įranga, automatin÷ pieno linijų plovimo linija, firmos Westfalia pieno šaldymo įranga, įrengtos pagalbin÷s patalpos, išasfaltuoti privažiavimo keliai. Fermoje įdiegta pieno gamybos savikontrol÷s sistema pagal gero ūkininkavimo reikalavimus ir X fermai, pirmajai Lietuvoje, 2002-06-01 Valstybin÷ maisto ir veterinarijos tarnyba suteik÷ teisę parduoti savo produkciją, pažym÷tą sveikatingumo ženklu LT – 01 – 01 F. Ūkyje yra 127 melžiamos karv÷s ir laikoma 20 telyčių.
4.2. Darbo eiga
Tyrimai buvo atliekami 2011-2012 metais. Viso atrinktos 43, 6500-7500 kg/laktaciją produktyvumo, trečios – ketvirtos laktacijos, 20-90 parų po apsiveršiavimo holštinizuotos Lietuvos juodmargių veisl÷s karv÷s. Karv÷s laikytos saitine sistema, kartą per dieną suteikiant po 2 val. mociono. Buvo matuojamas progesterono kiekis piene skirtingu laikotarpiu po apsiveršiavimo.
Nustačius klinikinius rujos požymius (pririštoms nustatomi išorinių lytinių organų vizualūs pokyčiai: gleiv÷tumas, paburkimas, paraudimas, sumaž÷jusi pieno produkcija, mociono metu - stov÷jimo refleksas), po 12 valandų buvo atliekamas progesterono tyrimas, matuota kūno temperatūra naudojant gyvsidabrinį termometrą ir s÷klinamos karv÷s. Karv÷s buvo s÷klintos naudojant JAV holšteinų veisl÷s Regancrest Alta Iota buliaus spermą, kurios judrumas po atšildymo 4 balai, koncentracija – 20 *106 spermatozoidų doz÷je – 0,25 ml. Aps÷klintos karv÷s po 2 m÷nesių buvo tirtos rektiškai d÷l veršingumo.
Eksperimentams buvo naudojamas IDEXX Cite® ProbeTM Milk Progesterone Test (JAV) (toliau I bandymas) testas progesteronui pieno m÷giniuose nustatyti ir pusiau automatinis progesterono analizatorius FT MULTILYSER S20 (Vokietija) (toliau I bandymas), naudojant firmos Förster-Technik GmbH (Vokietija) reagentus. I bandymas pagal instrukciją buvo laikomas šaldytuve 2,77-7,22 0C temperatūroje. Karv÷s buvo padalintos į tris grupes po 13, 10 ir 20 karvių. Pieno m÷giniai po 4 - 10 ml buvo imami 15 minučių po vakarinio melžimo į plastikinius m÷gintuv÷lius. Tyrimai buvo atliekami iš karto po pieno m÷ginio pa÷mimo.
Statistin÷ duomenų analiz÷ atlikta statistiniu paketu Statistica 6.0 (Statsoft Inc., 2004). Skaičiuota koks yra min÷tų rodiklių vidurkis (vidutin÷ požymio (šiame tyrime progesterono
18
koncentracija ng/ml, temperatūra, apsis÷klinimas) reikšm÷ nustatyta tiriant karves. Paskaičiuoti: patikimumas, standartinis nuokrypis, statistin÷ koreliacija (Pearson), dispersin÷ analiz÷ ANOVA. Duomenys patikimi, kai P<0,05.
4.4. Pieno progesterono I bandymas atlikimo metodika
Pav. 6
Pav. 7
19
4.4.1. Bendros instrukcijos
Pieno progesterono testas atliekamas kambario temperatūroje (+20ºC). Testas pašildomas iki kambario temperatūros.
Pienas paimamas į m÷gintuv÷lį ir uždengiamas, kad jo neveiktų šalutiniai veiksniai.
4.4.2. Testo atlikimo tvarka
• Testą išpakuojame, nuimame apsauginę pl÷velę.
• Į pirmąją duobutę pipete įlašiname 4 lašus pieno ir atsargiai išmaišome.
• I pirmąją duobutę su m÷giniu įstatome zondą ir spaudžiame tol, kol pasigirsta spragtel÷jimas.
• Laukiame 1 minutę.
• Zondą išimame (filtras turi likti šulinyje). • Zondo viršuje spaudžiame žalią mygtuką. • Zondą įstatome paeiliui į sekančias
duobutes ir laikome nustatytą laiką. • 2 duobut÷ – 30 sekundžių,
• 3 duobut÷ – 10-15 sekundžių, • 4 duobut÷ – 10-15 sekundžių,
• Tada zondą apverčiame ir laukiame dar 1 minutę. Po to vertiname rezultatus.
20
4.4.3. Pieno progesterono testo interpretacija
Pav.9
Jeigu kontrolinis taškas tokios pačios spalvos arba šviesesnis, tai reiškia, kad progesterono koncentracija piene yra žema (2ng/ml arba mažesn÷). Tai rodo, kad karv÷ rujoja.
Jeigu kontrolinis taškas yra tamsesnis nei m÷ginio, tai reiškia, kad progesterono koncentracija yra aukšta (virš 2ng/ml). Aukšta progesterono koncentracija gali reikšti, kad geltonkūnis yra aktyvus ir karv÷ yra veršinga arba lytinio ciklo viduryje.
21
4.5. II bandymo atlikimo tvarka
• Paimame pieno m÷ginius į m÷gintuv÷lius, po maždaug 10,0 mililitrų. • Reagentus ir pieno m÷ginius sudedame į analizatorių.
• Suvedame m÷ginių kiekį nuo 1 iki 42. • Įjungiame analizatorių.
• Nuskaitome rezultatus.
4.6. Tyrimų rezultatai
Atrinktų ir nustatytų rujojančių karvių progesterono vidurkis buvo 2,4 ± 0,6 ng/ml, vidutin÷ temperatūra 39,3 ± 0,20C. Iš visų apvaisintų karvių, apsivaisino 52,17 proc. Matuojant progestroną I bandymo metu apsivaisino 53,84 proc., II – 50,00 proc., skirtumas 3,84 proc. (p<0,005). Tiriamas veiksnys - temperatūra rujos nustatymo patikimumui yra statistiškai netinkamas (p=0,341).
Dispersin÷s analiz÷s duomenimis testo rūšys turi 98,61 proc. įtaką analizei. Nustatyta stipri koreliacija tarp progesterono nustatymo būdo ir koncentracijos (r = 0,909). Koreliacija tarp progesterono kiekio ir temperatūros yra labai silpna (r = -0,162).
I bandymas Eil÷s Nr. Testo rezultatas ng/ml Temperatūra C° veršinga/neveršinga 1 2,0 39,2 veršinga 2 2,0 39,5 veršinga 3 2,0 39,6 neveršinga 4 2,0 39,2 veršinga 5 2,0 39,1 neveršinga 6 2,0 39,3 veršinga 7 2,0 39,6 neveršinga 8 2,0 39,4 veršinga
22 9 2,0 39,0 neveršinga 10 2,0 39,6 neveršinga 11 2,0 39,4 veršinga 12 2,0 39,5 veršinga 13 2,0 39,6 neveršinga 1 lentel÷
Iš 1 lentel÷s duomenų matome, kad taikant I bandymą, nustatytas progesterono vidurkis buvo 2,0 ± 0,0 ng/ml. S÷kmingai apsis÷klino 53,84 proc. rujojusių karvių. Vidutin÷ rujojančių karvių temperatūra šioje grup÷je buvo 39,4 ± 0,20C. S÷kmingai apsis÷klinusių karvių vidutin÷ progesterono koncentracija buvo 2,0 ± 0,0 ng/ml, vidutin÷ temperatūra 39,4 ± 0,10C.
II bandymas Eil÷s Nr. ng/ml Temperatūra veršinga/neveršinga 1 3,0 39,6 neveršinga 2 3,2 39,2 veršinga 3 3,4 39,3 neveršinga 4 3,3 39,0 neveršinga 5 2,9 39,4 veršinga 6 2,1 39,1 veršinga 7 3,1 39,6 veršinga 8 3,2 39,4 veršinga 9 2,8 39,3 neveršinga 10 3,2 39,1 neveršinga 2 lentel÷
2 lentel÷je pateikti duomenys rodo kad taikant II bandymą, visų rujojančių karvių progesterono vidurkis buvo 3,0 ± 0,4 ng/ml. Mažiausia progesterono koncentracija buvo 2,1 ng/ml, o maksimali - 3,4 ng/ml. Apsis÷klino 50,00 proc. karvių. Vidutin÷ grup÷s temperatūra siek÷ 39,3 ± 0,20C. S÷kmingai apsis÷klinusių karvių vidutin÷ progesterono koncentracija buvo 2,9 ± 0,4 ng/ml,
23
vidutin÷ temperatūra 39,3 ± 0,20C. Neapsis÷klinusių karvių progesterono vidutin÷ koncentracija buvo 3,14 ± 0,2 ng/ml.
Pav. 11
Progesterono koncentracija rujos metu skirtingu laiku po veršiavimosiKaip pavaizduota 11 paveiksle, mažiausia šio hormono koncentracija yra apie 40 parą po veršiavimosi. Pirmųjų rujų po veršiavimosi metu progesterono koncentracija piene didžiausia. Iki 40 laktacijos paros rujojančių karvių progesterono koncentracija piene turi polinkį maž÷ti. Rujojančių apie 40 parą po veršiavimosi vidutin÷ progesterono koncentracija yra 2,45 ±0,4 ng/ml, lyginant su surujojusių 30 parą – 3,0 ± 0,8 ng/ml, 18 proc. (p<0,05) mažesn÷.
24
5. Rezultatų aptarimas
Cavalieri ir kitų nuomone (2003), pagal klinikinius požymius identifikuoti galima apie 80 proc. rujojančių karvių. Michael L. O’Connor (2012) nuomone, netikslus ar neefektyvus rujos nustatymas yra pagrindin÷ mažo apvaisinimo dažnio ir ilgo apsiveršiavimo intervalo priežastis. Bet yra įrankis, kuris padeda ūkininkams ir veterinarams išspręsti sumaž÷jusios reprodukcijos problemas, o ypač problemas, susijusias su rujos aptikimu. Šis įrankis yra progesterono piene analiz÷. Pagal Ranasinghe ir kitų nuomone (2010), analizuoti progesterono koncentraciją piene paprasčiau nei kraujyje. „Slapta ruja“ arba „slapta ovuliacija“ (subklinikin÷ ruja) diagnozuojama pagal progesterono koncentracijos pokyčius. Lourens ir kitų teigimu (2002), mažesn÷ nei 6 nmol/l progesterono koncentracija piene siejasi su ruja. Mūsų duomenimis, nustatyti karvių klinikiniai rujos požymiai sutapo su mažomis progesterono koncentracijomis piene. Vidutin÷ progesterono koncentracija piene rujos metu buvo 2,4 ± 0,6 ng/ml. Neapsis÷klinusių karvių progesterono koncentracija piene buvo nežymiai didesn÷ - 2,5 ± 0,6 ng/ml.
Pagal Regan ir Richardson (1938), sveikų karvių temperatūra yra nuo 38.30C iki 38,90C. Kaip teig÷ Rajamahendran, et al. (1989), Clapper et al., 1990, Mosher et al., (1990), temperatūros padid÷jimas rujos metu yra geras rodiklis ovuliacijai nustatyti. Pagal Kyle et al. (1998) ir Piccione et al. (2003), temperatūra rujos metu gali padid÷ti nuo 0,9 iki 1,30C. Tokie dideli temperatūros pokyčiai dažniausiai siejami su fiziniu aktyvumu. Atlikus tyrimus buvo nustatyta padid÷jusi rujojančių karvių temperatūra, bet padid÷jimas buvo ne toks ženklus, kaip aprašytas kitu autorių. Toki nežymų temperatūros padid÷jimą gali įtakoti tai, kad karv÷s laikomos taikant saitinę sistemą.
Pirmoji ovuliacija gali įvykti 17-67 parą po veršiavimosi (Shipka, 2000). Kaip pastebi praktikai, pirmoji ovuliacija dažnai įvyksta be rujos požymių (Roelofs et al., 2010). Dažniausiai subklinikin÷s rujos diagnozuojamos iki 70 laktacijos paros. Antra ovuliacija be klinikinių požymių pasitaiko 46 proc., trečia – 13 proc. (Isobe et al., 2004). Ranasinghe (2010) praneša, kad, bendrai pa÷mus, viena trečioji visų ovuliacijų iki 90 paros po veršiavimosi yra be klinikinių rujos požymių. Wiltbank et al. (2006) praneš÷, kad karv÷ms su aukšta pieno gamyba rujos trukm÷ yra trumpesn÷, lyginant su žemesnio produktyvumo karv÷mis. Intensyvi laktacija ir mitybos paklaidos gali išbalansuoti hormoninę reguliaciją. Tokios karv÷s rujos požymiai neryškūs. Tod÷l, s÷klinant produktyvias karves, tikslinga patikslinti rują. Rujoti karv÷s pradeda nuo 21 paros po veršiavimosi. Pagal progesterono koncentracijos pokyčius galima spręsti, kad šiuo laikotarpiu vyksta pirmosios ovuliacijos, tod÷l karves tikslinga s÷klinti.
Švedijos pienininkų asociacijos duomenimis (2006), Švediškų Holšteinų karvių veršingumas iš pirmo s÷klinimo maž÷jo nuo 41proc., 1998 metais - iki 38 proc., 2005 metais - Švediškų žalųjų
25
karvių s÷klinimo s÷km÷ iš pirmo karto maž÷jo nežymiai - nuo 43 proc. iki 41 proc. Karl-Johan Petersson (2007), nustat÷, kad karv÷s, kurių progesterono kiekis yra netipiškas, apsis÷klina prasčiau, tik 47 proc., negu tos, kurių progesterono rodiklis geras - 52 proc. Iš visų karvių, kurioms buvo nustatytos žemos progesterono koncentracijos - 2,4 ± 0,6 ng/ml, po pirmo s÷klinimo s÷kmingai apsis÷klino 52 proc. karvių.
Rujos metu progesterono kiekis piene maž÷ja, tod÷l gali būti vertinamas kaip klinikinis rujos požymis, kada reikia s÷klinti. S÷klinant pagal progesterono koncentraciją piene apsivaisino 52,17 proc. karvių. Progesterono koncentracija piene 12 valandų nuo rujos pradžios buvo 2,4 ± 0,6 ng/ml Iki 40 laktacijos paros rujojančių karvių piene progesterono koncentracija turi polinkį maž÷ti. Mažiausia šio progesterono koncentracija yra rujojančių apie 40 parą po veršiavimosi - 2,1 mg/ml. Padid÷jusi kūno temperatūra iki 39,50C, kai nenustatytos patologijos, gali būti vertinama kaip rujos požymis.
26
6. Išvados
1. Rujos metu progesterono kiekis piene maž÷ja, tod÷l gali būti vertinamas kaip optimalaus s÷klinimo laiko požymis. Iš s÷klintų pagal progesterono koncentraciją apsivaisino 52,17 proc. karvių.
2. Progesterono koncentracija piene, nustatyta rujos metu naudojant IDEXX Cite® ProbeTM Milk Progesterone Test (JAV), buvo vidutiniškai 2,0 ± 0,0 ng/ml.
3. Progesterono koncentracija piene, nustatyta rujos metu naudojant FT MULTILYSER S20 (Vokietija), buvo vidutiniškai 3,0 ± 0,4 ng/ml.
4. Mažiausia šio progesterono koncentracija yra rujojančių apie 40 parą po veršiavimosi - 2,1 mg/ml. Iki 40 laktacijos paros rujojančių karvių piene progesterono koncentracija turi polinkį maž÷ti.
5. Padid÷jusi kūno temperatūra iki maksimalios 39,50C temperatūros, kai n÷ra patologijų, gali būti vertinama kaip rujos požymis.
7. Pasiūlymas
Kad padidinti karvių apsivaisinimą, rujos metu, reikia pra÷jus 12 val. nuo rujos pradžios matuoti progesterono koncentraciją piene. Esant jai 2,4 ± 0,6 ng/ml, karves s÷klinti ir galima tik÷tis 52,17 proc. apsivaisinimo.
27
8. Literatūros sąrašas
1. Angie Stump Denton. Is She Pregnant? Blood test allows producers to determine if a cow is pregnant 30 days after conception. Hereford world. July. 2006. P. 1–2. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per Internetą: http://hereford.org/static/files/0706_IsShePregnant.pdf
2. Beam S.W., Butler W.R. Effects of energy balance on follicular development and first ovulation in post partum dairy cows. Journal of reproduction and fertility. Supplement. 1999. Vol. 54. P. 411–424.
3. Boodhoo K., Toolsee P., Rangasamy M., Mooneeramsing M. and Boodoo A. A. An assessment of the reproductive performance of small-holders’ dairy cows using the milk progesterone radio immunoassay technique. 1997. Second Annual Meeting of Agricultural Scientists. P. 131. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per internetą:
http://iveta2002.intnet.mu/portal/sites/ncb/moa/farc/amas97/pdf/finalm97.pdf#page=153
4. Butler W. R, Smith R. D. Interrelationships between energy balance and postpartum reproductive function in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 1989. Vol. 72. P. 767–783.
5. Cavalieri J., Eagles V., Ryan M., Macmillan K. L. Comparison of four methods for detection of oestrus in dairy cows with resynchronised oestrous cycles. Australian Veterinary Journal. 2003. Vol. 81. P. 422–425.
6. Clapper J. A., Ottobre J. S., Ottobre A. C., Zartman D. L. Estrual rise in body temperature in the bovine I. Temporal relationships with serum patterns of reproductive hormones. Animal Reproduction Science. 1990. Vol. 23. P. 89–98.
7.Coleman D. A. Cystic Ovarian Disease. West Virginia University 2008. P. 3. [Žiūr÷ta 2013– 01–07]. Prieiga per Internetą: http://www.wvu.edu/~agexten/forglvst/Dairy/dirm25.pdf
8. Dr. R.C. Rhodes. The Use of Milk Progesterone Assays for Reproductive Management. 2003. P. 1–4. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per internetą:
http://www.wvu.edu/~agexten/forglvst/Dairy/dirm9.pdf
9.Esslemont R. J. Measuring dairy herd fertility. Veterinary Record. 1992. Vol. 131. P. 209– 212.
10.Ginther O. J., Nuti L. C., Garcia M. C., Wentworth B. C., Tyler W. J. Factors affecting progesterone concentration in cow's milk and dairy products. Journal of Animal Science. 1976. Vol. 42. P. 155–159. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per Internetą:
28
11.Hirad M. and Rajamahendran R. Estrus Synchronization and Timed Breeding (Heat Detection Not Required). The University of British Columbia. Faculty of land and food systems. Research reports. 2001. Vol. 1. P. 1–2. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per Internetą:
http://landfood.ubc.ca/sites/www.landfood.ubc.ca.dairycentre/files/research_report3.pdf
12.Hoffmann B., Hamburger R., Gunzler O., Korndorfer L., Lohoff H. Determination of Progesterone in Milk applied for Pregnancy Diagnosis in the Cow. Theriogenology. 1974. Vol. 2. P. 21–28.
13.Karl-Johan Petersson. Milk Progesterone as a Tool to Improve Fertility in Dairy Cows. Doctoral dissertation. Uppsala. 2007. P. 9–26. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per Internetą:
http://pub.epsilon.slu.se/1433/1/Thesis.pdf
14.Kyle B. L., Kennedy A. D., Small J. A. Measurement of vaginal temperature by radiotelemetry for the prediction of estrus in beef cows. Theriogenology. 1998 Vol. 49. P. 1437– 1449.
15.López-Gatius, F. Is fertility declining in dairy cattle? A retrospective study in northeastern Spain. Theriogenology. 2003. Vol. 60. P. 89–99. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per Internetą: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0093691X02013596
16.Lourens D. C., Thompson P. N., Bertschinger H. J., Ameen M. Evaluation of oestrus observation and conception rates in suckling beef cows using whole milk progesterone concentration. Journal of the South African Veterinary Association. 2002. Vol. 73. P. 190–194.
17.Masiulis M., Žilinskas H., Riškevičien÷ V. Folikulų augimo dinamika. Dalmerin (Lecilerinas) ir depherelin® (Gonavet® 50) preparatai karvių rujai stimuliuoti. Veterinarija ir zootechnika. 2003. T. 23. P. 10–12. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per Internetą:
http://vetzoo.lva.lt/data/vols/2003/23/pdf/masiulis.pdf
18.Michael L. O’Connor. Milk progesterone analysis for determining reproductive status. Department of Dairy and Animal Science The Pennsylvania State University. 2012. P. 1–5 [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per Internetą: http://home.cc.umanitoba.ca/~plaizier/P4.pdf
19.Mosher M. D., Ottobre J. S., Haibel G. K., Zartman D. L. Estrual rise in body temperature in the bovine II. The temporal relationship with ovulation. Animal Reproduction Science. 1990. Vol. 23. P. 99–107.
20.Isobe N., Yoshimura T., Yoshida C., Nakao T. Incidence of silent ovulation in dairy cows during post partum period. Dtsch Tierarztl Wochenschr. 2004. Vol. 111. P. 35–38.
21.Noseir W. Ovarian follicular activity and hormonal profile during estrous cycle in cows: the development of 2 versus 3 waves. 2003. Vol. 1. P. 1–6. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per Internetą: http://www.rbej.com/content/pdf/1477-7827-1-50.pdf
29
22.Nuti L. C., Wenthworth B. C., Karavolas H. J., Tyler W. .J., Ginther O. J. Comparison of Radioimmunoassay and Gas-Liquid Chromatography Analyses of Progesterone Concentrations in Cow's Milk. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 1975. Vol. 149. P. 877–880.
23.Ginther J., Nuti L., Wentworth B. C. and Tyler W. J. Progesterone Concentration in Milk and Blood during Pregnancy in Cows. Experimental Biology and Medicine. 1974. Vol. 146. P. 354–357
24.Pei Jun Chen. . Temperature of a Healthy Cow. 1998. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per internetą: http://hypertextbook.com/facts/1998/PeiJunChen.shtml
25.Piccione G., Caola G., and Refinetti R. Daily and estrous rhythmicity of body temperature in domestic cattle. BMC Physiology. 2003. Vol. 3. P. 7. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per internetą: http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1472-6793-3-7.pdf
26.Pierre Rioux and Denis Rajotte. Progesterone in milk: a simple experiment illustrating the estrous cycle and enzyme immunoassay. Advances in Physiology Education, 2004. Vol. 28. P. 64– 67. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per internetą:
http://advan.physiology.org/content/28/2/64.full.pdf
27.Rajamahendran R, Robinson J, Desbottes S, Walton J. S. Temporal relationships among estrus, body temperature, milk yield, progesterone and luteinizing hormone levels, and ovulation in dairy cows. Theriogenology. 1989. Vol. 31. P. 1173–1182.
28.Ranasinghe R. M., Nakao T., Yamada K., Koike K. Silent ovulation, based on walking activity and milk progesterone concentrations, in Holstein cows housed in a free-stall barn. Theriogenology. 2010. Vol. 73. P. 942–949.
29.Roelofs J., López-Gatius F., Hunter R. H., van Eerdenburg F. J., Hanzen Ch. When is a cow in estrus? Clinical and practical aspects. Theriogenology. 2010. Vol. 74. P. 327–344.
30.Royal M, Mann G. E., Flint A. P. Strategies for reversing the trend towards subfertility in dairy cattle. Veterinary Journal (London, England, 1997). 2000b. Vol. 160. P.53–60.
31.Royal M. D., Darwash A. O., Flint A.P., Webb R., Woolliams J. A., Lamming, G.E. Declining fertility in dairy cattle: changes in traditional and endocrine parameters of fertility. Animal Science 2000a. Vol. 70. P. 487–501.
32.Shipka M. P. A note on silent ovulation identified by using radiotelemetry for estrous detection. Applied Animal Behaviour Science. 2000. Vol. 66. P. 153–159.
33.Simersky R., Swaczynova J., Morris D.A., Franek M., Strnad M. Development of an ELISA-based kit for the on-farm determination of progesterone in milk. 2007. P. 19–20. [Žiūr÷ta 2013–01– 07]. Prieiga per Internetą: http://www.vri.cz/docs/vetmed/52-1-19.pdf
30
34.Strnad M., Hanus J., Vanek T., Kaminek M., Ballantine J.A., Fussel B., Hanke D.E. (1997): Meta-topolin, a highly active aromatic cytokinin from poplar leaves (Populus x canadensis Moench, cv. Robusta). Phytochemistry, 1997. Vol. 45. P. 213–218.
35.Suthar V. S., Burfeind O., Patel J. S., Dhami A. J. and Heuwieser W. Body temperature around induced estrus in dairy cows. Journal of Dairy Science. 2011. Vol. 94. P. 2368–2373. [Žiūr÷ta 2013–01–07]. Prieiga per internetą:
http://www.journalofdairyscience.org/article/S0022-0302(11)00212-8/fulltext
36.Swedish Dairy Association Husdjursstatistik (Cattle Statistics) 2006. Svensk Mjölk, S-101 24 Stockholm, Sweden
37.Regan W. M., Richardson G. A. Reactions of the Dairy Cow to Changes in Environmental Temperature Journal of Dairy Science Vol. 21. 1938. P. 73–79.
38.Wiltbank M., Lopez H., Sartori R., Sangsritavong S., Gümen A. Changes in reproductive physiology of lactating dairy cows due to elevated steroid metabolism. Theriogenology. 2006. Vol. 65. P.17–29.
9. Pad÷kos
Nuoširdžiai d÷koju darbo vadovui Prof. dr. Vytuoliui Žilaičiui už visapusišką pagalbą, d÷mesingumą ir rūpestį.
