KARVIŲ PERIODO PO ATVEDIMO EIGOS TYRIMAS PAGAL PROGESTERONO KONCENTRACIJĄ PIENE

1

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Girmantas Gumauskas

KARVIŲ PERIODO PO ATVEDIMO

EIGOS TYRIMAS

PAGAL PROGESTERONO

KONCENTRACIJĄ PIENE

Daktaro disertacija Žemės ūkio mokslai,

veterinarija (02A)

2

Disertacija rengta 2011–2017 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos, Stambiųjų gyvūnų klinikoje; Marijampolės sav. Padovinio ŽŪB.

Mokslinis vadovas

prof. dr. Vytuolis Žilaitis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

Prof. dr. Ingrida Monkevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)

Nariai:

prof. dr. Vita Riškevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)

prof. dr. Loreta Šernienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)

doc. dr. Antanas Šarkinas (Kauno technologijos universitetas, technolo-gijos mokslai, chemijos inžinerija – 05T)

dr. Asta Tvarijonavičiūtė (Mursijos universitetas (Ispanija), žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)

Disertacija bus ginama viešajame Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2018 m. sausio 19 d. 13 val. Dr. S. Jankausko auditorijoje.

3

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES VETERINARY ACADEMY

Girmantas Gumauskas

RESEARCH THE PROCESS

PERIOD AFTER CALVING

ACCORDING PROGESTERONE

CONCENTRATION IN MILK

4

Disertation has been prepared at the Large Animal Clinic of Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2011–2017.

Scientific supervisor

Prof. Dr. Vytuolis Žilaitis (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)

Dissertation is defended at the Veterinary Research Council of Lithuanian University of Health Sciences.

Chairperson

Prof. Dr. Ingrida Monkevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)

Members:

Prof. Dr. Vita Riškevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)

Prof. Dr. Loreta Šernienė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)

Assoc. Prof. Dr. Antanas Šarkinas (Kaunas University of Technology, Technological Sciences, Chemical Engineering – 05T)

Dr. Asta Tvarijonavičiūtė (University of Murcia (Spain), Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)

Dissertation will be defended at the open session of the Lithuanian University of Health Sciences, on the 19th _{of January, 2018 at 1:00 p.m. in the}

Dr. S. Jankauskas Auditorium of the Veterinary Academy. Address: Tilžės 18, LT-47181 Kaunas, Lithuania.

5

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

Darbo tikslas ir uždaviniai ... 9

Darbo naujumas ir praktinė reikšmė ... 10

Darbo apimtis ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Hormoninė karvių lytinio ciklo reguliacija ... 11

1.2. Progesterono funkcija karvių organizme ... 14

1.3. Progesterono koncentracijos kaita karvių lytinio ciklo metu ... 15

1.3.1. Progesterono koncentracijos kaita po apsiveršiavimo ... 16

1.3.2. Progesterono koncentracijos kaita karvių rujos metu ... 17

1.3.3. Progesteronas ir embrioninis mirtingumas ... 18

1.4. Progesterono koncentracijos ir karvių produktyvumo ryšys ... 19

1.5. Progesterono koncentracijos piene ir kraujyje diagnostinė reikšmė ... 22

1.6. Progesterono koncentracijos kaip reprodukcinio sveikatingumo žymens taikymas bandos valdymo sistemose (praktikoje) ... 25

1.7. Reprodukciniai karvių bandos požymiai ... 26

2. TYRIMŲ METODAI IR ATLIKIMAS ... 29

2.1. Tyrimų vieta ir laikas ... 29

2.2. Tiriamųjų karvių atrinkimas ... 29

2.3. Tyrimo eiga ... 30

2.3.1. Pieno mėginių ėmimas progesterono koncentracijos ir pieno sudėties vertinimui ... 33

2.3.2. Pieno sudėties ir kiekio vertinimas ... 33

2.3.3. Kraujo mėginių ėmimas ... 34

2.4. Progesterono koncentracijos piene nustatymas ... 34

2.4.1. Progesterono koncentracijos piene nustatymas ELISA metodu ... 34

2.4.2. Progesterono koncentracijos piene nustatymas greitaisiais testais... 37

2.4.2.1. Hormonost®-Microlab metodas ... 37

2.4.2.2. FT multilyser S20 metodas ... 38

2.5. Statistinė rezultatų analizė ... 40

3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 41

3.1. Hormonost®-Microlab progesterono testo piene rezultatų palyginimas su pamatiniu (laboratoriniu ELISA) metodu ... 41

3.2. Karvių progesterono piene koncentracijos ribos vertinant karvių galimybę rujoti ... 43

6

3.3. Sveikų ir sergančių gimdos infekcija karvių progesterono koncentracijos

kaita ... 44

3.4. Rujos vertinimas pagal progesterono koncentracijos pokyčius piene ... 47

3.5. Veršingumo vertinimas pagal progesterono koncentraciją piene ... 49

3.6. Karvių pieno sudėties įtaka progesterono koncentracijai ... 50

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 53

IŠVADOS ... 64

REKOMENDACIJOS ... 65

LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 66

PASKELBTOS PUBLIKACIJOS DAKTARO DISERTACIJOS TEMA ... 78

DALYVAVIMAS KONFERENCIJOSE ... 79

SUMMARY... 95

CURRICULUM VITAE ... 118

7

SANTRUMPOS

ACTH – adrenokortikotropinis hormonas AST – aspartatanimotransferazė E2 – estradiolis

EGF – epidermio augimo faktorius FGF – fibroblastų augimo faktorius FSH – folikulus stimuliojantis hormonas GnTH – gonadotropin-realising hormonas

I – inhibinas

IFA – imunofermentinės analizės metodas IGF – insulinoidinis augimo faktorius LH – liutenizuojantis hormonas

MSH – melanocitus stimuliuojantis hormonas

P4 – progesteronas

PG – prostaglandinas

STH – somatotoropinis hormonas TNF – navikų nekrozės faktorius TTH – tirotropinis hormonas

VEGF – kraujagyslių endotelio augimo faktorius

8

ĮVADAS

Bandos reprodukcija yra vienas pagrindinių veiksnių, lemiančių pieno gamybos efektyvumą ir veršelių išeigą [1]. Produkcija su sveikata ir repro-dukcija itin siejasi didelio produktyvumo bandose [2], tačiau šiuolaikinių karvių reprodukcinė fiziologija neretai yra sutrikusi [3]. Didesnio produkty-vumo karvės, turi susilpnėjusią reprodukcinę funkciją [4]. Pastarajai būdingi silpnai išreikšti rujos požymiai ir ilgesnis atsinaujinimo laikotarpis po atsivedimo [5], o 15–20 proc. karvių pasireiškia slaptoji ruja [6]. Dėl nepaste-bėtų rujų ir vėlyvojo nesėkmingo sėklinimo karvių augintojai patiria didelių finansinių nuostolių [5]. Todėl sėklinimo laiko parinkimas ir tikslus rujos įvertinimas tampa ypač aktualia problema [5, 7]. Ūkiniu atžvilgiu karvės reprodukcinė funkcija yra esminis karvės naudingumą lemiantis veiksnys. Efektyvus reprodukcijos valdymas yra neatsiejamas sėkmingo pienininkystės verslo garantas.

Pagrindiniai veiksniai, lemiantys karvių reprodukcinį efektyvumą, yra tikslus rujos išaiškinimas, tinkama sperma, sėklinimo technologijos laiky-masis, apvaisinimas laiku. Svarbiausias iš šių faktorių yra tikslus rujos įverti-nimas. Tačiau rują tinkamai nustatyti keblu, nes karvės dažniausiai rujoja naktį, o jų elgseną stebėti visą parą nėra ekonomiškai naudinga [8]. Pailgėjęs

servis periodas, padidėjęs sėklinimo indeksas dažniausiai susijęs su netikslia

rujos diagnostika.

Su lytinio ciklo faze glaudžiai siejasi progesterono koncentracija [9]. Progesteronas yra svarbiausias kiaušidžių steroidas, kuris turi įtakos gimdos atsparumui infekcijoms. Apsiveršiavusių karvių endometriumo funkcijos tiesiogiai priklauso nuo cirkuliuojančio progesterono koncentracijos. Dauge-lio tyrimų, atliktų per pastaruosius 50 metų, duomenimis, karvės yra atsparios gimdos infekcijoms, jei progesterono koncentracija yra normali, tačiau padidėjus progesterono koncentracijai didėja gimdos infekcijų tikimybė.

Karvių reprodukcinę funkciją galima vertinti pagal pieno sudėtį, karvės elgseną ar net virškinimo sistemos darbą. Šie metodai šiuolaikiniame pieno ūkyje nėra pakankami reprodukcinei būklei įvertinti. Kai kuriose bandos valdymo sistemose, kaip reprodukcinės funkcijos žymuo, vertinama pro-gesterono koncentracija [10]. Karvėms po ovuliacijos kiaušidėje formuojasi geltonkūnis, kuris pradeda gaminti progesteroną, ruošiantį gimdą ir visą kar-vės organizmą veršingumui, o veršingai karvei stabdantis kitą lytinį ciklą. Pagal progesterono koncentraciją galima tiksliai nustatyti tinkamiausią sėkli-nimo laiką. Rujos metu progesterono koncentracija yra mažiausia. Jei karvė buvo apvaisinta, didelė progesterono koncentracija išlieka nuo veršingumo

9

pradžios iki laikotarpio prieš veršiavimąsi pabaigos. Padidėjęs šio hormono kiekis 21–24 parą po sėklinimo rodo, kad karvė yra veršinga.

Kadangi piene progesterono koncentracija būna didesnė nei kraujo plazmoje, analizuoti progesterono koncentraciją piene yra paprasčiau nei kraujyje. Pagal progesterono koncentracijos pokyčius piene galima diagno-zuoti „slaptąją rują“ arba „slaptąją ovuliaciją“ (subklinikinę rują), taip pat nustatyti tinkamiausią sėklinimo laiką (rujos metu progesterono koncentracija būna mažiausia), patvirtinti gimdos infekciją, įtarti, kad kiaušidėse yra cistų arba įvyko embriono žūtis. Progesterono koncentracijos piene nustatymo metodas yra palyginti paprastas, patogus ir nereikalaujantis centralizuoto tyrimo [11].

Karvių reprodukcinė funkcija yra susieta su steroidų apykaita. Pagrin-diniai steroidai yra estrogenas ir progesteronas. Progesterono koncentracija atspindi folikulus ir geltonkūnį. Pagal progesterono koncentraciją įmanoma spręsti apie karvės reprodukcinę būklę.

Darbo tikslas ir uždaviniai Disertacinio darbo tikslas:

Įvertinti progesterono koncentracijos piene reikšmę karvių periodo po atvedimo eigos vertinimui ir rujos prognozei pieno ūkio sąlygomis.

Darbo tikslui pasiekti atlikti tyrimai pagal šiuos uždavinius:

1. Įvertinti ir palyginti progesterono koncentracijos kilimo ribas karvių piene naudojant greituosius testus (FT Multilyser S20 ir Hormo-nost®-Microlab) stacionariuoju ELISE nustatymo metodu.

2. Nustatyti pieno progesterono pokytį, vertinant karvių galimybę surujoti, greituoju testu Hormonost®_-Microlab.

3. Nustatyti gimdos infekcijos įtaką progesterono koncentracijos kaitai, 10–50 parų pp.

4. Nustatyti progesterono koncentracijos pokytį rujos metu karvių piene 1–50 parų pp.

5. Nustatyti progesterono koncentracijos piene pokytį, vertinant veršin-gumą, greituoju testu FT Multilyser S20, progesterono testo ir rekti-nio tyrimo rezultatų sąryšį.

6. Įvertinti pieno sudėties 60 parą, 30 parą, sėklinimo metu ir 30 parų po sėklinimo sąryšį su progesterono koncentracija piene.

10

Darbo naujumas ir praktinė reikšmė

Pieninių karvių augintojams svarbu paprastais ir patikimais metodais įvertinti karvės galimybę apsivaisinti. Šiuo metu Lietuvoje pradėtas taikyti greitasis pieno testas progesteronui nustatyti. Nėra atlikta klinikinių tyrimų, pagrindžiančių, kad šis testas tinka karvių rujai, veršingumui ir karvių reprodukciniam pajėgumui vertinti.

Buvo palyginta progesterono koncentracija piene, nustatyta greitaisiais testais ir pamatiniu metodu.

Nustatytos progesterono koncentracijos ribos, vertinant karvių galimybę surujoti.

Nustatyta progesterono koncentracijos riba esant gimdos infekcijai. Nustatyta progesterono koncentracijos pokytis karvių, kurios rujojo iki 90 paros ir kurios nerujojo iki 90 paros.

Nustatytos progesterono koncentracijos ribos, vertinant veršingumą 21 parą pp, įvertinta pieno sudėties įtaka progesterono koncentracijai piene.

Darbo apimtis

Darbą sudaro: įvadas, literatūros apžvalga, tyrimų metodai ir atlikimas, rezultatai, rezultatų aptarimas, išvados, rekomendacijos, paskelbtos publika-cijos daktaro disertapublika-cijos tema, dalyvavimas konferenpublika-cijose, padėka, gyveni-mo aprašymas, darbe naudoti literatūros šaltiniai (214 šaltiniai). Darbo apimtis: 119 puslapiai, iliustruota 9 lentelėmis ir 20 paveikslu.

11

1

. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Hormoninė karvių lytinio ciklo reguliacija

Organizmo lytinę fiziologinę būklę ir brendimą lemia visos vidaus sekre-cijos liaukos ir nervų sistema. Karvių lytinis ciklas yra estrinis, trunkantis maždaug 18–24 dienas. Jis skirstomas į rujos (Oestrus; 0 diena), poovulia-cinio periodo (metoestrus; 1–4 diena), tarprujo (dioestus; 5–18 diena) – periodo, kuris atitinka liuteininę fazę, ir priešrujo (pro-oestrus;18–20 diena) – periodo iki rujos, laikotarpius [12].

Pagumburis (lot. hypothalamus) yra tarpinių smegenų dalis, esanti po gumburu, joje gausu nervinių ląstelių, atliekančių signalo perdavimo ir sekrecijos funkcijas. Tai vieta, kurioje kartu reguliuojama tiek nervinė, tiek ir endokrininė veikla. Pagumburio reguliacinė veikla dažniausiai pasireiškia per hipofizę, kuri dar vadinama pagumburio liauka. Taip yra reguliuojamos lyti-nės liaukos, skydliaukė, antinksčių žievė ir kita. Reguliuojant reprodukcinę funkciją, aktyviai dalyvauja endokrininė sistema: pagumburis (gamina gona-dotropinį hormoną (GnRH)), hipofizė (gamina folikulus stimuliojantį (FSH) ir liutenizuojantį (LH) hormonus), kiaušidės (gamina progesteroną (P4), estradiolį (E2) ir inhibiną (I)) bei gimda (gamina prostaglandiną F2α) [13].

Pagumburio neurosekretas GnRH skatina LH ir FSH hormonų išsiskyri-mą hipofizėje [14]. Daugeliui hipofizės sekretuojamųjų hormonų būdingas neigiamas grįžtamasis ryšys. Kai kurie pagumburio išskiriami neurosekretai skatina arba slopina kitų hipofizės hormonų (somatotropinio (STH), adreno-kortikotropinio (ACTH), tirotropinio (TTH), melanocitus stimuliuojančio (MSH) ir prolaktino) sekreciją. Šie hormonai taip pat turi įtakos reproduk-cijai, tačiau pagrindiniai yra FSH ir LH [15–17] (1.1.1 pav.).

Gonadotropiniai hormonai LH ir FSH yra glikoproteidai. LH skatina folikulų augimą ir brendimą kiaušidėse. Lytines funkcijas šis hormonas veikia per kiaušides. Dėl LH įtakos įvyksta ovuliacija ir formuojasi gelton-kūnis. Be to, LH reguliuoja geltonkūnio funkcijas, stimuliuoja pieno liaukos funkcijas laktacijos periodu. Optimalus karvių LH santykis su FSH viduti-niškai yra 1:7. Šių hormonų santykis kinta viso lytino ciklo metu [18, 19].

FSH skatina folikulų augimą ir brendimą kiaušidėse. FSH yra pagrindinis mažųjų folikulų gyvybingumą palaikantis veiksnys, apsaugantis juos nuo atrezijos (degeneracijos). LH užtikrina pasirinktinį folikulų brendimą. Vei-kiant FSH ir LH, folikuluose padidėja steroidų sekrecija. Padidinta LH kon-centracija (kokia karvėms yra lytinio ciklo pabaigoje) sukelia subrendusių folikulų trūkimą – ovuliaciją [17–22].

12

1.1.1 pav. Vaisingumo ašis. Ištisinė linija: teigiamas grįžtamasis ryšys;

punktyrinė linija: neigiamas grįžtamasis ryšys [23]

Kiaušidės organizme atlieka dvi svarbias funkcijas: gamina kiaušialąstes ir sekretuoja hormonus (estrogenus ir progesteroną) [24, 22]. Biologiškai aktyviausias kiaušidžių hormonas yra estradiolis, o estronas ir estriolis gali būti apibūdinami kaip estradiolio metabolitai [25, 22]. Estradiolio koncentra-cija karvių periferiniame kraujyje rujos metu yra žema. Jo lygis pakyla iki ovuliacijos likus 36 val. ir pasiekia aukščiausią ribą rujos dieną arba dieną iki rujos pradžios. Šis pikas būna anksčiau arba sutampa su priešovuliaciniu LH piku [26–28]. Estradiolis lemia specifinę patelės elgseną rujos metu. Didelė estradiolio koncentracija folikulinės fazės metu grįžtamuoju ryšiu veikia pagumburį. Žema estradiolio koncentracija liuteininės fazės metu sinergis-tiškai sąveikauja su progesteronu, sukeldama neigiamą grįžtamąjį efektą sekretuojant LH [29]. Folikulo granuliozinės ląstelės gamina nesteroidinį junginį – inhibiną, kuris stabdo FSH išskyrimą [30]. Inhibinas gali slopinti FSH išskyrimą ir slopinti FSH surišimą granuliozinėse folikulo ląstelėse. Manoma, kad inhibinas yra sekretuojamas dominuojančio folikulo priešovu-liaciniu periodu, jis slopina FSH išsiskyrimą ir kitų folikulų vystymąsi (slo-pina poliovuliaciją) [31].

Geltonkūnio ląstelės veršingumo metu gamina į insuliną panašų hormo-ną – relaksihormo-ną. Jo funkcija yra slopinti gimdos motoriką. Prieš veršiavimąsi dėl relaksino įtakos atsiveria gimdos kaklelis ir atsipalaiduoja makšties sienelės [32, 33].

Dauguma karvių lytinio ciklo metu patiria tris folikulų augimo bangas, nors kai kurios – tik dvi ar net keturias. Kiekvienos folikulų augimo bangos

13

metu subręsta vyraujantis folikulas, pasiruošęs ovuliacijai [34]. Kiekvieną folikulinę bangą sudaro folikulų susitelkimas, atranka, dominavimas ir išny-kimas (atrezija) [35]. Folikulinė banga prasideda nuo augančių susitelkusių folikulų, apie 4,0–5,0 mm diametro, augančių kartu iki 5–7 mm. Pasiekęs tokį dydį, vienas folikulas pradeda greičiau už kitus augti ir tampa vyraujantis, o kiti nustoja augę ir pamažu regresuoja [36]. Visi, didesni kaip 2 mm, folikulai pradeda augti, prasidėjus jų augimo bangai. Iš šių folikulų išsiskyrus vyraujančiam, masinis folikulų augimas slopinamas. Vyraujantis pirmosios bangos folikulas maksimalų dydį pasiekia 7–8 lytinio ciklo dieną. Vyraujantis folikulas morfologiškai ir funkciškai vyrauja maždaug iki 11 ciklo dienos. Vėliau jis pradeda regresuoti (11–14 dieną), ir prasideda antroji folikulų augimo banga [37]. Lytinio ciklo pradžioje ir viduryje pastebimai kyla FSH bangos, sutampančios su folikulų augimo bangomis. Antriniai folikulai intensyviai gali vystytis tik esant hormonų įtakai, todėl visose folikulų augimo bangose randami įvairaus išsivystymo ovocitai. Antroji augimo banga prasideda maždaug 10 dieną po ovuliacijos, o papildoma, trečioji, esant trijų bangų ciklui, prasideda 16 dieną po ovuliacijos. Esant dviejų ar trijų bangų ciklams, galintis ovuliuoti folikulas subręsta vienoje paskutiniųjų bangų [38]. Įprasto trijų bangų lytinio ciklo folikulų augimo bangos prasideda 1, 9 ir 16 dienomis. Po apsiveršiavimo pirmasis vyraujantis folikulas subręsta maždaug 9 lytinio ciklo dieną ir dažniausiai (85 proc. atvejų) randamas priešingoje gimdos ragui, kuriame buvo vaisius, kiaušidėje. Karvių, kurioms pasireiškia trys folikulų augimo bangos, pirmosios ir antrosios folikulų augimo bangos metu besivystančios kiaušialąstės degeneruoja įvairiose vystymosi fazėse, o antrinis ovocitas nesubręsta [39, 35].

Lytinio ciklo metu GnRH skatina FSH ir LH sekreciją, o šie skatina folikulų susidarymą ir augimą folikulinėmis bangomis [38, 40]. Šių hormonų išskyrimas yra kontroliuojamas grįžtamuoju neigiamu gonadiniu ryšiu. Lytinio ciklo pabaigoje, maksimaliai padidėjus estrogenų koncentracijai, suaktyvėja pagumburio funkcija. Padidinta GnRH koncentracija sukelia priešovuliacinę LH ir kiek mažesnę FSH bangą, tai lemia ovocito subrendimą ir ovuliacijos refleksą, vadinamąjį teigiamą tiesioginį reguliacinį ryšį. Priešovuliacinė banga LH ir FSH banga kyla 24–30 val. iki ovuliacijos. Po LH ir FSH bangos estrogenų koncentracija mažėja ir karvės rujos požymiai silpnėja. LH bangai įtakos turi nervinė reguliacija [38, 41].

14

1.2. Progesterono funkcija karvių organizme

Progesteronas yra steroidinis lytinis hormonas, sintetinamas geltonkūny-je, placentoje ir antinksčių žievėje. Tai kortikosteroidų, androgenų ir estroge-nų biosintezės tarpinis produktas. Karvių antinksčiuose ir placentoje pro-gesterono pasigamina nedaug [42]. Didžiausi šio hormono kiekiai pasigamina geltonkūnio liuteininėse ląstelėse [43, 44].

Pagrindinė progesterono funkcija yra paruošti gimdą embriono implan-tacijai – skatinti vaskularizaciją, slopinti gimdos peristaltiką ir blokuoti lytinį ciklą. Su estrogenais progesteronas reguliuoja karvės elgseną rujos metu [45]. Progesteronas taip pat būtinas folikulų augimui sustabdyti ankstyvajame embrioniniame periode. Progesteronas yra svarbus implantacijos procese bei nėštumo metu. Jis taip pat veikia į pieno liauką, skatindamas pieno liaukų vystymąsi ir laktaciją, bei apsaugo nuo kaulų lūžių [31, 46].

Procesas, sukeliantis geltonkūnio regresiją (inovuliaciją) lytinio ciklo metu bei leidžiantis vystytis Grafo folikului, yra vadinamas liuteolitiniu pro-cesu. Šio proceso mechanizmas siejasi su nesočiąja riebalų rūgštimi – prostaglandinu F2α (PGF2α), kurią išskiria endometriumas, kai gimdoje

nesi-vysto embrionas [42]. Geltonkūnio gyvavimo trukmė priklauso nuo

trumpa-laikio PGF2α išsiskyrimo iš endometriumo. Mechanizmas, kontroliuojantis

geltonkūnio vystymąsi ir sekrecinę funkcijas, apima faktorius, kurie gamina-mi tiek geltonkūnyje, tiek ir už kiaušidžių ribų (1.2.1 pav.). Kai kurie iš šių faktorių veikia kaip autokrininiai ir (arba) endokrininiai veiksniai, vieni iš jų yra prostaglandinai, kiti – arachidono rūgšties metabolitai (PGE2, PGF2α,

leukotrienai, neuropeptidai (noradrenalinas), peptidiniai hormonai (oksitoci-nas), augimo faktoriai ir hormonai (kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF), fibroblastų augimo faktorius (FGF), epidermio augimo faktorius (EGF), augimo hormonas, prolaktinas ir steroidai (P4 ir 17β-estradiolis (E2))

[47].

15

Progesterono koncentracija kraujo plazmoje tiesiogiai atspindi geltonkū-nio išsivystymą. Progesteronas yra tikslus reprodukcinių procesų žymuo, todėl, remiantis jo koncentracija, galima kontroliuoti veršingumą, rujos ciklus bei kiaušidžių veiklą po apsiveršiavimo.

1.3. Progesterono koncentracijos kaita karvių lytinio ciklo metu

Progesterono koncentracija lytinio ciklo metu kinta žymiai. Progesterono koncentracija rujos metu būna mažiausia ir ima didėti po ovuliacijos, vystantis geltonkūniui. Koncentracija ovuliacijos metu siekia ne daugiau kaip 2 ng/ml., o vėliau palaipsniui didėja ir maksimumą pasiekia 13–15 ciklo dienomis (maždaug 10–20 ng/ml) [49]. Po ovuliacijos kiaušidėje formuojasi geltonkūnis, kuris pradeda gaminti progesteroną, ruošiantį gimdą ir visą karvės organizmą veršingumui bei apsaugantį nuo kitos rujos pasireiškimo [34]. Esant fiziologinei lytinio ciklo eigai, progesterono koncentracija krau-jyje padidėja 4-ą ciklo dieną, o 8 dieną pasiekia aukščiausią lygį ir išsilaiko iki 17 dienos. Jei karvė buvo apvaisinta, didelė progesterono koncentracija išlieka nuo veršingumo pradžios iki laikotarpio prieš veršiavimąsi pabaigos. Jei karvė neapsivaisino, apie 17 lytinio ciklo parą geltonkūnis degeneruoja, ir kraujyje nustatoma mažiausia progesterono koncentracija, o nuo 19 iki 23 ciklo paros karvė vėl surujoja [50, 51] (1.3.1 pav.).

16

1.3.1. Progesterono koncentracijos kaita po apsiveršiavimo

Viena iš karvių neapsivaisinimo priežasčių yra sutrikusi progesterono apykaita [53]. Lytinio aktyvumo atsinaujinimas ir folikulų augimas lydimas progesterono koncentracijos padidėjimu. Progesterono koncentracija po veršiavimosi yra labai maža (<2 ng/ml) ir padidėja po pirmosios ovuliacijos ir susiformavus geltonkūniui. Pirmoji ovuliacija gali įvykti jau 12 dieną. Padidėjusi progesterono koncentracija (>7 ng/ml), rodo, kad formuojasi geltonkūnis. Kitos rujos galima tikėtis maždaug po 15–17 dienų. Custer ir kiti 1990 m. nurodo, jog tarp pirmosios ir antrosios rujos po apsiveršiavimo lytinis ciklas trunka maždaug 15 dienų [54]. Roelofs ir kitų tyrėjų duomeni-mis 2010 m., pirmoji ovuliacija dažniausiai nėra lydima rujos ir apytikriai 50 proc. pirmųjų lytinių ciklų gali trukti tik 10 parų [55].

Stronge ir kitų autorių 2005 m., [50] duomenimis, kad karvės sėkmingai apsivaisintų, optimali progesterono koncentracija turi būti 7–8 ng/ml. Telyčių progesterono koncentracija dažniausiai yra didesnė nei laktuojančių karvių [56]. Šis skirtumas aiškinamas karvių medžiagų apykaitos ypatumais [57, 58] ir geltonkūnio išsivystymu [59]. Pasak Butler ir kitų autorių 1981 m., anksty-vuoju laikotarpiu po veršiavimosi, karvėms trūkstant energijos, nesubrandi-nama visavertė kiaušialąstė ir nepaleidžiamas elgsenos stereotipas, būdingas rujai [60].

Kai kurie autoriai nurodo, kad karvių lytinis ciklas atsinaujina 25–30 parą po veršiavimosi [61]. Wiltbank ir bendraautorių 2006 m., duomenimis visa-vertis lytinis ciklas po veršiavimosi didelio produktyvumo karvėms atsinau-jina vėliau. Padidinta progesterono koncentracija siejasi su intensyvesne steroidų apykaita ir lytinio ciklo visavertiškumu [62].

Progesterono koncentracija kraujyje ir piene reprodukcinio ciklo metu kinta panašiai [9]. Pastebėta, kad piene progesterono koncentracija ima didėti praėjus 15 parų po sėklinimo [63]. Šia aplinkybe remiamasi atliekant pro-gesterono testą veršingumui nustatyti. Žemiausias arba nežymiai padidėjęs progesterono kiekis bus 4–6 parą po ovuliacijos. Progesterono koncentracija nedidės iki 10–17 reprodukcinio ciklo paros. Jeigu po sėklinimo karvė neapsi-vaisino, progesterono kiekis staigiai pradeda mažėti [64]. Vertinant progeste-rono koncentraciją po sėklinimo, galima anksti nustatyti, ar karvė veršinga ir, esant reikalui, tinkamiausiulaiku taikyti gydymą ar profilaktiką [65].

Viena svarbiausių karvių reprodukcijos problemų – nuolat didėjantis bandos sėklinimo indeksas. Lamming ir Darwash 1998 m. nurodo, kad pieno progesterono koncentracijos stebėsena yra objektyvus ir tikslus metodas, leidžiantis įvertinti kiaušidžių funkciją po apsiveršiavimo bei patikslinti sėklinimo laiką [66].

17

Ankstyva ovuliacija ir progesterono koncentracijos dydis siejasi su kar-vių produktyvumu ir lytinio ciklo trukme [67]. Tinkamai prižiūrint karves, jos surujoja praėjus 25–30 dienų po apsiveršiavimo. Pirmąjį mėnesį po apsi-veršiavimo apsivaisina apie 18–30 proc. karvių. Sėklinti rekomenduojama sulaukus antrosios rujos, o karves rekordininkes – po trečiosios rujos [65]. Maža progesterono koncentracija gali turėti įtakos fiziologiniams procesams prieš apvaisinimą ir po apvaisinimo [68, 69]. Sumažėjusi progesterono kon-centracija yra viena iš karvių neapsivaisinimo priežasčių [50, 70]. McCoy ir kitų autorių duomenimis [71], jeigu progesterono koncentracija yra maža (<3 ng/ml), tokios karvės yra linkusios į uždelstąovuliaciją, ir ruja praeina be klinikinių požymių. Nuo 10 iki 40 proc. karvių rujos požymiai išvis nepa-sireiškia. Melžiamosioms karvėms rujos (anoestrus) laikotarpis neturėtų viršyti 60 dienų [72, 73]. Tačiau statistiškai patikimo ryšio tarp ilgesnio ano-vuliacinio periodo ir vaisingumo nenustatyta [69]. Įdomu tai, kad karvėms, turinčioms atraminio aparato sutrikimų, progesterono koncentracija būna mažesnė net 50 proc. [3].

1.3.2. Progesterono koncentracijos kaita karvių rujos metu

Subklinikinė ruja – tai ovuliacija be rujai būdingų elgsenos pasikeitimų. Pirmoji ovuliacija gali įvykti 17–67 parą po atsivedimo [74]. Praktikų stebė-jimais, pirmoji ovuliacija dažnai įvyksta be rujos požymių [55]. Dažniausiai subklinikinės rujos diagnozuojamos iki 70 laktacijos paros. Antrojiovuliacija pasitaiko 46 proc., trečioji – 13 proc. [75]. Ranasinghe 2010 m., teigia, kad trečdalis visų ovuliacijų iki 90 paros po atsivedimo yra be rujos požymių. Rujoti karvės pradeda nuo 21 paros po veršiavimosi[6]. Pagal progesterono koncentracijos pokyčius galima spręsti, kad šiuo laikotarpiu vyksta pirmosios ovuliacijos. Rujos stebimos nuo 30 laktacijos paros. Daugiausia karvių rujoja nuo 35 iki 60 laktacijos paros, tačiau šiuo metu rują lengviau nustatyti stebint progesterono koncentraciją piene, nes tik kas ketvirta karvė rujoja su klini-kiniais požymiais. Šiuo laikotarpiu taip pat dažniausiai nustatoma ir pirmoji ovuliacija. Po 60 laktacijos paros daugiau karvių rujoja, tačiau bendras rujo-jančių karvių skaičius (įskaitant subklinikines rujas) mažėja. Šiuo laktacijos tarpsniu karvėms vyksta antroji–trečioji ovuliacijos [35, 39].

López-Gatius ir kiti 2005 m., bei Yániz su bendraautoriais 2006 m., pastebėjo neigiamą pieningumo poveikį rujos požymiams [76, 77]. Didelio produktyvumo karvėms ovuliacija įvyksta vėliau ir ruja po veršiavimosi nu-statoma apie 4 paras vėliau [78]. Ovuliacijos nebuvimas ankstyvajame laiko-tarpyje po atsivedimosiejamas su neigiamu energijos balansu ir liuteinizuo-jančiojo hormono trūkumu [79]. Didesnio produktyvumo karvių estrogenų koncentracija visada yra mažesnė, tai siejasi su silpniau išreikšta ruja arba net

18

rujos nebuvimu [80]. Pieningumo neigiamas poveikis rujos išraiškai aiški-namas genų, atsakingų už lytinę dominantę, ekspresijos sutrikimu [81]. Tik apie penktadalio šiuolaikinių veislių karvių pieningumo kreivė atitinka Wood aprašytąją [82]. Daugumos karvių pieningumas sėklinimo metu išlieka didelis ir rujos požymių slopinimas dėl padidinto pieningumo yra viena iš priežasčių, dėl ko netiksliaiparenkamas sėklinimo laikas.

Progesterono koncentracijos vertinimas gali būti laikomas karvių repro-dukcinės būklės žymekliu [83]. Sumažėjusi progesterono koncentracija sieja-si su reprodukcinės funkcijos pokyčiais [84]. Geltonkūnio, susieja-siformavusieja-sio subklinikinės rujos metu, gaminamas progesteronas lemia kitos rujos požy-mius [85]. Vailes ir kiti 1992 m., taip pat teigia, kad estrogenai ir progest-eronas yra atsakingi už karvės lytinę elgseną [86].

Moksliškai įrodytas ryšys tarp karvių pieningumo ir steroidinių hormonų koncentracijos. Steroidų metabolizmas siejasi su padidintu karvių pienin-gumu. Didėjant pieningumui mažėja progesterono koncentracija ir nustatoma mažiau progesterono metabolitų [51]. Sumažėjusi steroidų koncentracija pie-ningoms karvėms siejama su intensyvesne kraujo apytaka kepenyse dėl padidinto pašarųsuvartojimo ir greitėjančiu metabolizmu [57]. Intensyvesnė medžiagų apykaita siejasi su intensyvesniu visų steroidų metabolizmu [62]. Mažiausia progesterono koncentracija karvės reprodukcinio ciklo laikotarpiu būna iki 40 paros po veršiavimosi, tačiau laktacijos metu ji didėja. Panašų progesterono koncentracijos kitimą piene nustatė ir Pollott ir Coffey 2008 m. [87].

1.3.3. Progesteronas ir embrioninis mirtingumas

Diskin ir kiti 2008 m. nustatė, kad su embrioniniu mirtingumu, kuris įvyksta iki 16 veršingumo paros, susieti esminiai pieno ūkio nuostoliai [88]. Diskin su bendraautoriais 2015 m. teigia, kad daugiausia embrionų (50– 75 proc.) žūva per pirmąsias tris savaites po apvaisinimo [89]. Kiti moksli-ninkai teigia, jog 25 proc. embrioninio mirtingumo įvyksta po 21 veršingumo paros [90]. Sreenen ir Diskin 1980 m. nustatė, kad 20–25 proc. embrionų žūva iki 42 dienos, o 8–9 proc. – tarp 8–13 dienos po apvaisinimo[91]. Dar 5– 8 proc. gemalų žūva laikotarpiu tarp 42 apvaisinimo dienos ir veršingumo pa-baigos [92]. Short 1973 m. pirmasis įvedė terminą, kad būtent tuo laikotarpiu motininis organizmas atpažįsta nėštumą ir prasideda atitinkami persi-tvarkymai, nes tik praėjus 16 dienų po apvaisinimo, jei apvaisinimas būna sėkmingas, endometriume pradeda gamintis specifiniai baltymai (galvijų trofoblastinis baltymas, vėliau atpažįstamas kaip interferonas tau (IFNt),

ku-rių negamina neveršingų telyčių endometriumas [93]. Endometriumas veikia kaip sudėtingas ir labai jautrus biologinis mechanizmas [94].

19

Karvės išsimetimasdažniausiai įvyksta pereinamuoju embrioninio vys-tymosi laikotarpiu, kai embrionas tampa vaisiumi.

Embriono implantacijos metu labai svarbus yra tinkamas ryšio tarp embriono ir motininio organizmo palaikymas. Embrionus praradus po 16–17 dienų, karvės ruja gali pasireikšti laiku, praėjus 18–24 dienoms po praėjusios rujos. Embrionams žuvus vėliau, karvės lytinis ciklas sutrinka, jis gali tapti nereguliarus ir jam reikia laiko normalizuotis [95]. Padidėjusi progesterono koncentracija liuteininės fazėspradžioje yra susijusi su padidinta embrionų vystymosi rizika [92].

Embrionų išgyvenimui turi įtakos mityba, temperatūra, karščio stresas, sėklinimo laikas, lyties organų infekcijos [96], karvės amžius, genetiniai, imunologiniai ir endokrininiai veiksniai [97].

Manoma, jog laikotarpis, kada įvyksta karvės išsimetimas, neturi esmi-nės įtakos progesterono koncentracijai, taip pat ir progesterono testo tikslu-mui. Įvykus karvės išsimetimui, progesterono koncentracija iki 15 parų išlie-ka mažai pakitusi [98]. Rektinio ir progesterono testo veršingumo atžvilgiu nesutapimą galima paaiškinti embrioniniu mirtingumu.

Progesteronas siunčia signalą gimdos audiniuose esantiems genams pra-dėti gaminti specifinius produktus, kurie būtini embriono vystymosi palaiky-mui ir tinkamos aplinkos jam sukūripalaiky-mui. Sumažėjusi progesterono ir estrofa-no koncentracija didelio produktyvumo karvių kraujyje dėl jų medžiagų apykaitos ypatumų apsivaisinimo ir embriono implantacijos metu gali būti viena iš didesnio embrioninio mirtingumo priežasčių [95].

1.4. Progesterono koncentracijos ir karvių produktyvumo ryšys

Karvės produktyvumas ir pieno sudėtis priklauso nuo laktacijos tarpsnio bei gyvulio sveikatos būklės [99]. Šiuolaikinių veislių karvės pasiekia pro-dukcijos maksimumą 4–8 laktacijos savaitę ir jų pieno produktyvumas išlieka didelis iki laikotarpio, kada tikslinga apvaisinti [82]. Skirtingais laktacijos etapais karvės gebėjimas apsivaisinti skiriasi. Praktikams svarbu vertinti karvės galimybę apsivaisinti ir likti veršingai paprastais ir patikimais meto-dais. Vienas iš tokių – karvių produkcijos raida. Vertinant karvių reprodukciją pagal gebėjimą apsivaisinti, derėtų patikslinti, kaip ši savybė siejasi su karvės produktyvumu. Didėjant karvių pieningumui, prastėja karvių reprodukcinės savybės [50, 100], silpnėja visavertės rujos požymiai. Wiltbank su kitais mokslininkais 2006 m. nurodo, kad, kol produktyvumas didėja, apvaisinti karvę sudėtinga, kadangi didėjantis pieno kiekis (iki 80 d.) prailgina servis periodą ir veršiavimosi intervalą [62]. Yra ir prieštaringų nuomonių: Eicker su bendraautoriais 1996 m. teigia, jog nėra statistiškai patikimo ryšio tarp

20

didėjančio pieno kiekio (iki 60 d.) ir reprodukcijos (apvaisinimo) [101]. Hansen 2011 m. taip pat teigia, kad karvių vaisingumasnepriklauso nuo pieno kiekio [53]. Teiginį patvirtina ir Patton su bendraautoriais 2007 m. teigdami, kad reprodukcijos rodikliai nepriklauso nuo pieningumo [102].

Netipinė progesterono koncentracijos raida (nebūdinga lytinam ciklui) maksimalaus pieningumo metu ir rujos požymių nebuvimas patvirtina paste-bėjimus, kad pieno kiekio didėjimas pirmąsias 40 dienų po apsiveršiavimo turi neigiamos įtakos sėklinimo indeksui. Ilgą laiką buvo manoma, kad tai susiję su neigiamu energijos balansu ir pokyčiais kiaušidėse [103–105].

Rabiee su bendraautoriais 2002 m. teigia, jog progesterono koncentracija piene nepriklauso nuo pieno kiekio [51]. Hommeida [106] bei Wiltbank su bendraautoriais [107] nustatė, kad negatyvus ryšys tarp progesterono kon-centracijos piene ir pieno kiekio būna pirmąsias 15 dienų po sėklinimo. Didė-jant pieningumui stebima tendencija, kad veršingų karvių skaičius pagal pro-gesterono koncentraciją mažėja, o neveršingų karvių skaičius išlieka atitin-kamas ir nepriklauso nuo pieningumo. Masilo ir kiti 1992 m. nurodo didelę pieningumo įtaką karvės gebėjimui apsivaisinti [108]. Diskin ir Morris 1994 m. teigia energijos, gaunamos su pašaru, balanso reikšmingą įtaką embriono raidai [85]. Energijos disbalansas būdingas didesnio produktyvumo karvėms. Tai neprieštarauja eksperimento metu pastebėtai tendencijai, kad karvių produktyvumo įtaka progesterono koncentracijai yra minimali. Karvių produktyvumas labiau turi įtakos gebėjimui apsivaisinti ir išnešioti vaisių.

Mažėjanti pieno produkcija organizme leidžia optimizuoti energijos vartojimą, ir susidaro palankesnės sąlygos reprodukcinės sistemos funkcijai. Kiti autoriai teigia, kad karvės sėkmingiau apsivaisina, jei sėklintos po 60 laktacijos paros [109]. König 2008 m., nurodo, kad yra išreikštas neigiamas statistinis ryšys tarp pieno produktyvumo ir apsivaisinimo sėkmingumo [110]. Šia aplinkybe galima paaiškinti, kad progesterono testu nustatytų veršingų karvių produkcija iki sėklinimo yra mažesnė nei neveršingų arba abejotinų. Veršingų karvių produktyvumo kreivė turi tendenciją leistis žymiau nei abejotinų arba neveršingų karvių. Veršingumas turi neigiamos įtakos pieno produkcijai maždaug nuo ketvirto veršingumo mėnesio [111].

Vienfaktorinės dispersinės analizės duomenimis, progesterono testo rezultatams turi įtakos pieno sudėtis iki sėklinimo. Reksen su bendraautoriais 2002 m. teigia, kad padidinta laktozės koncentracija piene ankstyvajame pe-riode po atsivedimo siejasi su ankstyvesniuoju kiaušidžių liuteininiu akty-vumu [112]. Kuo piene didesnė laktozės koncentracija, tuo didesnė tikimybė, kad karvė anksčiau surujos [112]. Laktozės koncentracija piene siejasi su energijos balansu. Pastebėta, kad racione padidinus gliukogenines medžiagas, subalansuojama energijos pusiausvyra organizme ir tai teigiamai veikia reprodukciją [113].

21

Pieno sudėtis iš dalies siejasi su energetiniu organizmo balansu [114]. Padidėjusi laktozės koncentracija rodo palankias sąlygas reprodukcinei funk-cijai pasireikšti.

Mesilati-Stahy 2015 m. duomenimis, yra pastebimas teigiamas ryšys tarp pieno riebumo ir progesterono koncentracijos [115]. Ankstyvosioselaktacijos stadijose riebalų koncentracija piene siejasi su energijos balansu [116]. Padidinta riebalų koncentracija, nesant kitos patologijos ar mitybos pokyčių, siejasi su energijos trūkumu ir lipolize [117]. Gurcan 2011 m., nuomone, mažėjant produktyvumui, didėja pieno baltymingumas [118].

Somatinių ląstelių skaičius piene SLS gali būti vienas iš požymių, siejančių karvės sveikatingumą ir produkciją [119]. Dawuda ir bendraautorių 1990 m. teigimu, SLS tiesiogiai siejasi su progesterono koncentracija sėkli-nimo metu arba po sėklisėkli-nimo [120]. Teigiama, kad padidintas SLS neigiamai veikia reprodukciją, slopindamas kiaušidžių aktyvumą [121]. Pinedo ir kiti 2009 m. nustatė, kad padidintas SLS (subklinikiniai mastitai) didina abortų riziką, reprodukcinė sistema tampa itin pažeidžiama [122]. Padidėjęs SLS taip pat turi įtakos didėjančiam bandos sėklinimo indeksui [119].

Karvė yra naudingiausia, jei laiku apvaisinama. Praktikai pabrėžia rujos nustatymo svarbą [55]. Laikoma, kad tinkamiausias laikas, kada karvės pradedamos sėklinti, yra apie 70 parų po veršiavimosi [123]. Karvės ne visuomet apvaisinamos iš pirmo karto. Produktyvių karvių laikotarpis, per kurį jos apvaisinamos, gali pailgėti iki 46–50 parų [124].Dėl netiksliai diag-nozuojamos karvių rujos pailgėja servisperiodas ir padidėja sėklinimo indek-sas. Grohn ir kiti 2000 m. nustatė statistiškaipatikimą ryšį tarp karvės gebėji-mo apsivaisinti ir pieningugebėji-mo [125]. Ververs ir bendraautoriai 2010 m. teigia, kad produktyvios karvės pirmą kartą surujoja vidutiniškai tik 52 parą po veršiavimosi [126]. Cavalieri 2003 m. nuomone, pagal klinikinius požymius galima identifikuoti apie 80 proc. rujojančių karvių [127]. Teigiama, kad didėjant karvių produktyvumui, ruja silpnėja [128]. Ranasinghe ir kiti 2010 m. nustatė, kad su padidintu produktyvumu siejasi „slaptosios rujos [6]. Su lytinio ciklo faze siejasi progesterono koncentracija [9]. Piene progesterono koncentracija yra didesnė nei kraujo plazmoje, be to, tarp šių dydžių nusta-tytas statistiškai patikimas ryšys [129]. Analizuoti progesterono koncentraciją iš pieno yra paprasčiau nei iš kraujo. „Slaptoji ruja“ arba „slaptojiovuliacija“ (subklinikinė ruja) diagnozuojama pagal progesterono koncentracijos poky-čius. Požymis, kad buvo subklinikinė ruja, yra progesterono koncentracijos padidėjimas nuo itin mažos iki 5 ng/ml [6]. Mažesnė nei 6 ng/ml progeste-rono koncentracija siejasi su ruja [130]. Trečdaliui karvių, kurioms nustatyta maža progesterono koncentracija, rujos požymių nepastebėta [131].

22

1.5. Progesterono koncentracijos piene ir kraujyje diagnostinė reikšmė

Pieno progesterono analizės metodai praktikų neretai naudojami kaip priemonė karvių reprodukcinei būklei vertinti [132, 133]. Teigiama, kad pagal progesterono koncentraciją tiksliau galima įvertinti karvės rują ir patikslinti sėklinimo laiką [134].

Progesterono koncentracija kraujo plazmoje yra artima progesterono koncentracijai piene, tačiau piene ji gali būti 2–3 kartus didesnė, nes proges-teronas lengvai tirpsta riebaluose, todėl lengvai patenka į pieno riebalus [6].

Pieno progesterono koncentracija gali būti nustatoma radioimuniniu arba imunofermentiniu metodu [135–137]. Europoje progesterono kiekis nuo 1973 m. buvo nustatomas itin tiksliu radioimuniniu metodu, kuriam atlikti būtinas įgudimas, taip pat ir radioaktyvūs reagentai. 1980 m. sukurtas prie-taisų ir antikūnų rinkinys progesteronui nustatyti. Tyrimas pagrįstas imunine ir fermentine reakcija (Progesterone enzime immunoassay) – unikalia antikū-nų savybe sąveikauti su antigenu in vitro [136, 138]. Šiuo metu hormonai nustatomi imunofermentinės analizės metodu (IFA), kurio pagrindu sukurti diagnostiniai rinkiniai įvairiems hormonams identifikuoti. Metodas pagrįstas antigeno ir tiriamojo hormono ir antikūno sąveika. Tuo tikslu monokloniniai antikūnai tik prieš tam tikrą antigeną sujungiami su fermentu, galinčiu taip paveikti bespalvę medžiagą, kad ji virstų tam tikra išreikšta spalva. Jei nėra antigeno – tiriamojo hormono, tai fermentas būna neaktyvus, nes jis sujungtas su antikūnais. Įvykus sąveikai antigenas–antikūnas, fermentas atblokuojamas ir taip paveikia bespalvį substratą, kad jo metabolitai tampa pastebimi ir lengvai matomi, spalvoti. Tyrimų rezultatai nuskaitomi spektrofotometru, naudojant atitinkamą, metodikoje nurodytą filtro bangos ilgį.

Siekiant nustatyti progesterono koncentraciją piene ar kraujyje, nuo 18 iki 24 dienos po sėklinimo rekomenduojama taikyti imunologinį metodą. Tai vienas iš netiesioginių būdų veršingumui nustatyti [139].

Siūloma alternatyva progesterono testui. Jau 28 parą po karvės apsėklinimo kraujo serume arba plazmoje aptinkamas specifinis veršingumo baltymas (glikoproteinas). Jis yra veršingumo žymuo ir nustatomas ELISA metodu. Taikant komercinius šio žymens nustatymo testus, rezultatai gaunami jau mėginių pristatymo dieną. Metodo trūkumas yra tas, kad veršingumo žymuo aptinkamas iki 60 parų po veršiavimosi ir iki 20 parų nustatomas karvei išsimetus. Progesterono testo rezultatai siejasi tik su esamu veršingumu, o karvei išsimetus šio steroido koncentracija nukrenta 3 parą. Pieno progesterono koncentracijos nustatymas yra tinkamesnis prognostinis būdas, nes leidžia įvertinti geltonkūnio funkcinę būklę ir kiaušidžių aktyvumą [140].

23

Progesterono koncentracijos pokytis siejasi su daugeliu reprodukcinių sutri-kimų [84]. Vertinant progesterono koncentraciją po sėklinimo, galima anksti įvertinti, ar karvė veršinga ir prireikus tinkamiausiulaiku taikyti gydymą arba profilaktiką [65]. Progesterono koncentracija kraujyje ir piene reprodukcinio ciklo metu kinta atitinkamai (1.5.1 pav.), tačiau piene progesterono koncent-racija nustatoma lengviau nei plazmoje [9].

1.5.1 pav. Progesterono koncentracijos kitimas karvių piene ir kraujyje

lytinio ciklo metu [141]

Progesterono koncentracijos vertinimas iš pieno sėkmingai taikomas kompiuterinėse bandos valdymo sistemose. Pagal progesterono koncentra-ciją, nustatomą iš pieno, apie karvės nevaisingumą, veršingumą ir reproduk-cinę būklę gali spręsti ir ūkininkai [142]. Progesterono nustatymas piene turi du pranašumus prieš kraujo plazmą: pieną paprasčiau gauti ir tyrimo procedūra yra paprastesnė. Šis tyrimas yra taikomas norint nustatyti anksty-vąjį veršingumą, taip pat profilaktiškai tiriant kiaušidžių veiklą po apsiveršia-vimo [143]. Progesterono tyrimas suteikia galimybę gauti papildomos infor-macijos apie lytino ciklo procesą (1.5.1 pav.). Parkinson su bendraautoriais 1994 m. teigia, kad lytinio ciklo metu progesterono koncentracija pasiekia maksimumą praėjus13–14 dienų po rujos [144]. Karvei esant veršingai, pro-gesterono lygis nuolat didės iki 21 dienos po apvaisinimo. Pats geriausias būdas stebėti reprodukcinę veiklą ir geltonkūnio būklę yra nustatyti progeste-rono koncentraciją piene arba kraujyje [144].

24

Tiriant progesterono koncentraciją piene – svarbus ir pieno mėginių ėmimo laikas. Nurodoma, jog progesterono koncentracija piene, paimtame iš karto po rytinio melžimo, yra didesnė negu pieno mėginiuose, surinktuose prieš melžimą arba praėjus 3 val. po melžimo. Taip pat buvo pastebėta teigiama koreliacija tarp pieno progesterono ir riebalų koncentracijos, kuri priklauso nuo mėginių ėmimo laiko. Progesterono koncentracija kraujyje koreliuoja ir su jo koncentracija piene. Tai yra steroidinis hormonas, jis artimas pieno riebalams, todėl jo kiekiai piene būna didesni negu kraujyje [145, 146]. Santykinė kraujo ir pieno progesterono koncentracija yra tokia pat. Lytinio ciklo stadija arba veršingumas progesterono koncentracijos pokyčiui turi didesnę įtaką negu pieno riebumo pokytis. Tyrimui netinka pieno mėginiai, paimti iš mastitu sergančių karvių, nes dėl uždegimo pakinta pieno sudėtinių dalių santykis. Pieno mėginiai 7–10 parų gali būti saugomi užšaldyti arba konservuoti natrio dichromatu. Siekiant nustatyti pirmąją ovuliaciją, rekomenduojama atlikti progesterono koncentracijos vertinimą 19 parą pp. Pirmoji aukšta progesterono vertė (>7 ng/ml) rodo, kad formuojasi pirmasis geltonkūnis. Kitos rujos galima tikėtis maždaug po 17 dienų, nes sukaupti visą progesterono pajėgumą po ovuliacijos užtruks 5–7 dienas. Žema progesterono koncentracija 5 dieną po ovuliacijos arba lėtas progesterono koncentracijos didėjimas 4–5 dienas po ovuliacijos yra susijęs su sumažėjusiu veršingumo dažniu [147, 148].

Progesterono lygiui išlikus ≥10 ng, galima daryti prielaidą, kad taip yra dėl liuteino cistų sutrikimo arba dėl susilaikiusio geltonkūnio. Progesterono vertė ≤7 ng/ml parodo rują. Ruja pagal progesterono testo rezultatus laikoma neteisingai diagnozuota, jei iš karto po sėklinimo paimto pieno mėginyje nustatoma didelė progesterono koncentracija [50].

Beltman ir bendraautorių duomenimis 2009 m., maža progesterono koncentracija 19–24 parą po sėklinimo 95 proc. tikslumu įrodo, kad karvė yra neveršinga [149]. Progesterono koncentracijos tyrimas 19–20 parą po sėkli-imo leistų išaiškinti neveršingas arba rujojančias be ryškių požymių karves. Didelė progesterono koncentracija 20–24 parą po sėklinimo leidžia nustatyti veršingumą 75 proc. tikslumu. Paprastai testas taikomas 20–23 parą po sėkli-nimo. Lytinio ciklo trukmė yra 24–28 paros. Tuo laikotarpiu nustatyta žema progesterono koncentracija gali nurodyti, kad karvė susirgo gimdos infekcija, kiaušidėse yra cistų arba įvyko embriono žūtis. Tikrinant veršingumą, labai svarbu, kokiu laiku tai atliekama. Vėliau kaip 24 parą po sėklinimo tikrinti veršingumą pagal progesterono koncentraciją netikslinga, nes daugumos neveršingų karvių organizme natūraliai didėja progesterono sekrecija, ir tai gali būti supainiojama su veršingumu. Karvę apsėklinus prieš rują, 20–24 parą po sėklinimo atitiks fiziologinio lytinio ciklo liuteininę fazę, ir tai bus viena iš klaidingos veršingumo diagnostikos priežasčių [150].

25

Kai kurių mokslininkų duomenimis, testo tikslumas nustatant ankstyvąjį veršingumą siekia 75 proc. ir 100 proc. nustatant neveršingumą 22 nėštumo dieną [135, 151].

Dabas su bendraautoriais 1989 m., teigia, kad aukšta progesterono kon-centracija (>1 ng/ml) rodo, jog karvės turi liuteininių cistų, o žema progeste-rono koncentracija (<1 ng/ml) parodo folikulines cistas [152]. Kai kurie autoriai nurodo, kad karvių, sergančių kiaušidžių cistomis arba gimdos infek-cijomis, kraujyje gali būti didelė progesterono koncentracija, jos gali būti diagnozuotos kaip veršingos [153–155]. Subklinikine kepenų suriebėjimo forma sergančioms karvėms pieno progesterono koncentracija buvo apie 1,6 ng/ml, pirmieji grafo folikulai pasirodė 30–35 dieną po apsiveršiavimo, o progesterono koncentracija pradėjo didėti tik 38–60 dieną [156, 157].

1.6. Progesterono koncentracijos kaip reprodukcinio sveikatingumo žymens taikymas bandos valdymo sistemose (praktikoje)

Progesterono vertinimo testas iš pieno yra priemonė, padedanti ūkio vadybininkams, ūkininkams ir veterinarijos specialistams reguliuoti bandos reprodukciją. Didelėse bandose sudėtingiau diagnozuoti rują, todėl siekiant palengvinti darbą stambesniuosiuose pieno ūkiuose diegiamos kompiuterines bandos valdymo sistemos. Dažniausiai kompiuterinėse bandos valdymo sistemose yra įdiegtas kompiuterinis modulis ir gyvulio būklė modeliuojama pagal progesterono koncentraciją. Veterinarijos specialistams svarbu žinoti skaitinę progesterono koncentracijos vertę.

Praktikoje plinta greitieji (pusiau kiekybiniai) progesterono nustatymo metodai, kuriuos dėl paprastos atlikimo metodikos galėtų naudoti ir veterina-rijos specialistai, ir ūkininkai. Progesterono koncentracija pateikiama skaitine reikšme, todėl rezultatą galima interpretuoti. Dėl šios priežasties praktikoje naudojamų greitųjų progesterono nustatymo metodų pritaikymas gali būti platesnis.

Progesterono koncentracijos matavimu piene yra paremta viena iš bandos valdymo programų – Herd Navigator (DeLaval). Ši programa leidžia nusta-tyti karvių rują 95 proc. tikslumu, taip pat registruoja ankstyvus abortus, foli-kulines bei geltonkūnio cistas, užsitęsusio nerujojimo riziką. Dėl šios progra-mos sutrumpėja intervalas tarp veršiavimųsi, karvės geriau apsivaisina, nes sėklinamos laiku, o pieninių karvių augintojai gali sutaupyti 1–2 val. per dieną. Be to, sistema gali identifikuoti mastito ir ketozės pradžią [158].

Progesterono testas naudojamas įvairiems karvių reprodukcinės funk-cijos etapams vertinti. Intensyviai selekcionuojant bandą produkfunk-cijos kryp-timi, būtina vertinti karvių reprodukciją kompleksiškai – nuo laikotarpio po

26

atsivedimo iki veršingumo nustatymo. Tokiu veterinariniu ir zootechiniu įrankiu karvių reprodukcijos valdyme galėtų tapti sistemiškai taikomas pro-gesterono testas.

1.7. Reprodukciniai karvių bandos požymiai

Vertinant karvių bandos reprodukcijos efektyvumą naudojami įprasti bandos reprodukcijos rodikliai: servis periodas, sėklinimo ir apvaisinimo indeksas, veršingumo indeksas [159].

Servis periodas. Ne visi bandos rodikliai vienodai aiškinami. Derėtų

aptarti dažniausiai vertinamus rodiklius. Senoji reprodukcijos mokykla bandos būklei įvertinti plačiai taikė rodiklį, nurodantį, per kiek laiko po veršiavimosi karvė apvaisinama. Jis vadinamas servis periodu [160]. Nuro-doma, kad tai yra laikotarpis nuo atvedimo iki apsivaisinimo. Specialiojoje literatūroje gana populiarus ir prigijęs angliškas terminas „open days“, kurį dažniausiai vartoja JAV gyvulininkystės specialistai. (Lietuviškai – „atviros dienos“) [161]. „Atviros dienos“ – visuma dienų nuo karvės veršiavimosi iki apsivaisinimo. Šis posakis atitinka mums labiau priimtiną servis periodo terminą. Mokslinėje literatūroje taip pat aptinkamas terminas „uterine repose“ arba „gimdos poilsis“ [162]. Tai reiškia tą patį, ką ir servis periodas arba atviros dienos – laikotarpį nuo veršiavimosi iki sėkmingo apvaisinimo. Išvertus į lietuvių kalbą, servis periodas reikštų paslaugos suteikimo arba aptarnavimo laikotarpį. Kai kurie autoriai nurodo, kad tai tas pats, kas ir veisimo periodas (angl. breeding period), – laikotarpis, per kurį karvė pradedama vaisinti, kol tampa veršinga. Dažnai karvės ir telyčios iš pirmo karto neapsivaisina, todėl servis periodo trukmė priklauso nuo to, per kiek laiko jos sėkmingai apsivaisina. Galimybė apsivaisinti kartojasi kas 21 parą, teoriškai šis laikotarpis yra karvės lytinio ciklo trukmės kartotinis. Šiam rodikliui turi įtakos gyvulio sveikata, svarbu, ar laiku nustatoma ruja ir ar laiku atliekama apvaisinimo procedūra.

Sėklinimo metas Labai svarbu, kada karves po veršiavimosi įmanoma

sėklinti. Literatūroje šis rodiklis įvardijamas kaip „pasirinktas laukimo periodas“ (angl. voluntary waiting period) [163]. Didžiausias pieno kiekis ir geriausia kokybė siejasi su laktacijos piku. Kuo greičiau karvė apvaisinama po atsivedimo, tuo dažniau jai nustatomas laktacijos pikas. Pabrėžtina, kad po veršiavimosi karvės organizme natūraliai susidaro energijos trūkumas, todėl išsikreipia jos reprodukcinė fiziologija. Stengiantis po atsivedimo kuo anks-čiau sėklinti, patiriama daugiau nuostolių negu laukiant, kol karvės organiz-mas gebės visaverčiai funkcionuoti ir apsivaisinti. Karvę sėklinant nepalankiu laiku, paprastai ji neapsivaisina, išlieka galimybė sukelti gimdos infekciją.

27

Teigiama, kad produktyvias karves (ir pirmaveršes, ir daugiavedes) tikslinga sėklinti po veršiavimosi praėjus vidutiniškai 56 paroms [164]. Dažnai po veršiavimosi praėjus 60 parų, sumažėja produktyvumas. Jei tai susiję tik su laktacijos fiziologija, galima manyti, kad karvė pasirengusi apsivaisinti. Intensyviai šeriant karves, nebūna laktacijos piko, ir padidintas pieningumas išsilaiko iki 100–110 parų. Norint palaikyti užsibrėžtą reprodukcinį karvių cikliškumą, tokiose bandose tikslinga sinchronizuoti rują.

Rujos vertinimas. Rujos požymių išreikštumas tiesiogiaisiejasi su kar-vių priežiūra, laikymo sistema ir rujos stebėjimu [165]. Rują šiuolaikinių veis-lių produktyvioms karvėmsnustatyti nėra lengva. Pastebėta, kad rujos trukmė priklauso nuo produktyvumo [166]. Kuo produktyvesnė karvė, tuo trumpiau ji rujoja ir rujos požymiai būna silpnesni. Manoma, kad tai susieta su sumažėjusia estrogenų koncentracija [167]. Ruja gali būti stebima pagal daugelį požymių, o tikrasis rujos požymis yra stovėjimo refleksas [168]. Daugiau kaip pusei rujojančių karvių šis požymis nepastebimas [169]. Tai reiškia, kad pusei karvių rujos pradžia nustatoma teisingai, ir jos laiku yra sėklinamos. Rodiklis, apibūdinantis, ar tiksliai nustatoma ruja, yra rujos nustatymo indeksas (angl. heat detection rate) [170]. Jis išreiškiamas procen-tu karvių, kurių ruja pastebėta, nuo galimai rujojančių per tam tikrą laikotarpį. Stebimos teoriškai galinčios rujoti tik sveikos karvės (be mastito arba gimdos uždegimo požymių ir nesergančios sisteminėmis ligomis), kurios apsiveršia-vo prieš 40–45 paras. Suskaičiuojama, kiek karvių rujojo per tris savaites, ir apskaičiuojama procentinė išraiška nuo visų galinčių rujoti (atsnaujinusių ir kliniškai sveikų) karvių. Optimaliu atveju šis rodiklis turi siekti 80–85 pro-centus.

Apsivaisinimo indeksas. Labai svarbus rodiklis, tiesiogiai atspindintis

rujos vertinimo ir sėklinimo laiko parinkimą, yra karvių apsivaisinimas po pirmojo sėklinimo. Šis rodiklis (literatūroje vadinamas apsivaisinimo indek-su, angl. conception rate) apskaičiuojamas kaip santykis apsivaisinusių ir sėklintų vieną kartą karvių arba telyčių (procentais) [171]. Šiam rodikliui turi įtakos beveik visos pieno ūkio vadybos grandys. Ypatingos reikšmės turi karvių rujos nustatymo efektyvumas ir laikas, kada pradedama po veršia-vimosi sėklinti. Vertinima, jei bandoje du trečdaliai karvių yra sveikos, rujos nustatymo indeksas yra 80 proc., sperma kokybiška, be paklaidų atlikta sėkli-nimo procedūra, o apsivaisisėkli-nimo indeksas siekia apie 46 procentus.

Sėklinimo indeksas. Sėklinimo indeksas (angl. insemination index) – tai

rodiklis, ar efektyviai vykdoma sėklinimo procedūra. Tai visuma sėklinimo procedūrų, kol patelė tampa veršinga. Dydis išreiškiamas atliktų sėklinimų ir veršingų karvių skaičiaus santykiu [160, 171]. Geriausia, jei karvių sėklinimo indeksas yra apie 2,2, o telyčių – apie 1,6. Norint apvaisinti karvę, vidutiniš-kai reikėtų sėklinti daugiau vidutiniš-kaip du kartus. Netiksliai parinkus sėklinimo laiką

28

arba netiksliai įvertinus rują, sėklinimo indeksas labai padidėja. Kai kuriuose ūkiuose rujojančios karvės pakartotinai sėklinamos po 10–12 valandų. Tai labai didina sėklinimo savikainą, bet nepagerina karvių apsivaisinimo.

Veršingumo indeksas. Priešingas dydis sėklinimo indeksui yra

verši-ngumo indeksas (angl. pregnancy rate), kuris parodo, kiek karvių (procentais) bandoje yra veršingų iš visų galėjusių tapti veršingomis [172]. Rodiklis priklauso nuo bandos dydžio. Didesnėje bandoje daugiau karvių dėl įvairių priežasčių negali būti apvaisintos, bet statistiškai jos priklauso bandai. Dėl šios priežasties mažoje bandoje šis indeksas yra didesnis. Nėštumo indeksas – tai dydis, rodantis, ar greitai po veršiavimosi karvės vėl tampa veršingos. Šis dydis priklauso nuo laukimo periodo ir rujos nustatymo indekso. Šių dydžių sąsajos matyti iš šios išraiškos: nėštumo indeksas = rujos nustatymo indeksas × apsivaisinimo indeksas /100 arba = 21/(servis periodas – laukimo periodas + 11) × 100. Šie dydžiai ypač naudingi, kai sudaromas bandos eko-nominis modelis. Jie apima daug technologinių grandžių ir leidžia objektyviai vertinti bandos vadybą.

29

2. TYRIMŲ METODAI IR ATLIKIMAS

Tiriamasis darbas atliktas 2010–2014 m. LSMU Veterinarijos akademios Stambiųjų gyvūnų klinikoje.

Eksperimentinė šio darbo dalis atlikta Padovinio žemės ūkio bendrovės pieno ūkyje, esančiame Marijampolės savivaldybėje, kur, vadovaujantis Lie-tuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymu (Žin., 1997-11-28, Nr. 108-2728) ir Ūkinės paskirties gyvūnų gerovės reikalavimais (Žin., 2002-05-22, Nr. 51-1974), laikoma apie 2100 galvijų, melžiama vidu-tiniškai apie 850 karvių.

2.2. Tiriamųjų karvių atrinkimas

Tyrimui atrinkta 122 trečiosios ir ketvirtosios laktacijų Lietuvos juod-margių veislės karvė (holšteinizacijos lygis 85 proc.), praėjus 10–90 parų po veršiavimosi. Karvių produktyvumas per laktaciją siekė 6500–7500 kg. Karvės laikytos saitine sistema, kartą per dieną išvedant po 2 val. mociono. Karvės grupuojamos atsižvelgiant į jų produkciją ir reprodukcinius kriterijus. Mėšlas šalinimas buldozeriniu būdu, kreikiama šiaudais. Tiriamosios karvės veršiavosi laikotarpiu nuo 2010 m. balandžio iki 2013 m. gegužės, joms laiku atsidalijo nuovalos (per 5–6 val.), po veršiavimosi komplikacijų (metritai, endometritai, mastitai, acidozė, ketozė, virškinimo sistemos sutrikimai, reprodukcinio ciklo sutrikimai) nebuvo nustatyta. Trečiojo etapo, antrojo bandymo, metu buvo tirtos tokios pat veislės karvės (n = 7), kurioms nustatyta gimdos infekcija.

Karvės buvo šeriamos visaverčiais pašarais (2.2.1 lentelė). Karvių racio-ną sudarė žolės silosas, kukurūzų silosas, šiaudai, cukrinių runkelių griežinė-liai, rapso išspaudos, melasa, kukurūzo grūdainis, kombinuotas pašaras, vitamininiai ir mineraliniai priedai. Pašaras dalijamas specialiu pašarų dalytuvu „Kuhn“ (Prancūzija) du kartus per parą (8 val ir 14 val.), vanduo girdymui neribojamas. Koncentruotųjų pašarų kiekis karvėms buvo skiriamas individualiai, priklausomai nuo produktyvumo. Karvės melžtos 2 kartus per parą, kas 12 valandų. Karvės melžiamos „GEA“ (Vokietija) melžimo įranga. Karvės veršiuojasi kas mėnesį, vidutiniškai apie 70 karvių per mėnesį. Sezoniškumas stebimas pavasarį.

30

2.2.1 lentelė. Tiriamųjų karvių raciono maistingumas

Rodikliai Maistingumas SM, kg 23,88 Žalia masė, kg 29,32 NEL, MJ 170,4 Baltymai, g 4,224 Kalcis, g 0,177 Fosforas, g 0,132 Magnis, g 0,059 Natris, g 0,042 Kalis, g 0,168 2.3. Tyrimo eiga

Tyrimas buvo vykdomas etapais, kurie pavaizduoti schemoje (2.3.1 pav.).

31

Pirmojo etapo metu progesterono koncentracija tiriamųjų karvių piene buvo nustatoma pamatiniu (ELISA) metodu ir greituoju testu Hormonost®

-Microlab. Iš viso ištirta 10 pieno mėginių skirtingais karvių lytinio ciklo

laikotarpiais. Iš viso ištirta 10 pieno mėginių, kurie paimti iš karvių, po jų veršiavimosi praėjus 80–100 parų ir esant skirtingiems lytinio ciklo laikotar-piams: veršingos (n = 4), rujojančios (n = 3) ir karvės lytinio ciklo viduryje (n = 3).

Antrojo etapo metu buvo palyginta tiriamųjų karvių pieno progesterono koncentracija, tirta skirtingais tyrimo metodais: Hormonost®_-Microlab ir FT

multilyser S20. Iš viso ištirta 10 pieno mėginių, kurie paimti iš karvių, po jų veršiavimosi praėjus 80–100 parų ir esant skirtingiems lytinio ciklo laiko-tarpiais: veršingos (n = 4), rujojančios (n = 3), karvės lytinio ciklo viduryje (n = 3).

Trečiojo etapo metu atlikti 4 bandymai su (n = 109) karvėmis.

Pirmajame bandyme pagal progesterono koncentraciją piene progno-zuota galimybė rujoti; Hormonost®-Microlab metodu:

 1 grupė (n = 12) – karvės, kurioms ruja nustatyta iki 90 dienos po apsiveršiavimo;

 2 grupė (n = 13) – karvės, kurioms ruja nenustatyta iki 90 dienos po apsiveršiavimo.

Antrasis bandymas: gimdos infekcijos įtaka progesterono koncentracijai; Hormonost®_-Microlab metodu:

 1 grupė (n = 7) – karvės, kurioms nenustatyta gimdos infekcija;  2 grupė (n = 7) – karvės su gimdos infekcijos požymiais. Klinikiniai

metrito požymiai buvo vertinami apžiūrint karvių išorinių lytinių organų paburkimą, gleivių spalvą ir kiekį. Gimdos didumas vertintas rektiniu būdu.

Gimdos infekcijos klinikiniais požymiais nuo 1 iki 19 paros po apsiver-šiavimo laikyta karvės kūno temperatūra aukštesnė kaip 39,3 °C, pūlingos ištakos iš lytinių organų, mažesnis pašaro suvartojimas, mažesnė pieno pro-dukcija. Gimdos infekcijos (metritas) diagnozei patvirtinti buvo imti kraujo ir pieno mėginiai. Sergančios karvės gydytos METRICURE gimdos suspen-sija (vienkartiniame švirkšte yra 19 g suspensijos, veiklioji medžiaga cefapi-rinas (benzatino druska) 500 mg) 2 kartus kas 7 paros.

Trečiasis bandymas: vertinta pagal išorinius požymius ruja ir lyginta su P4 koncentracija piene; FT multilyser S20 metodu. Atrinktos rujojančios karvės įvairiu laktacijos tarpsniu (n = 28).

Siekiant nustatyti rują pagal išorinius lytinius požymius, tiriamosios karvės buvo stebimos kasdien tris kartus po 15 min.: per rytinį melžimą (nuo 5 iki 8 val.), dienos mociono metu (nuo 11 iki 14 val.) bei vakarinio melžimo metu (nuo 16 val. iki 19 val.). Karvė laikoma rujojanti, jei mociono metu yra

32

stovėjimo refleksas, stebimas išorinių lytinių organų regimi pokyčiai; glei-vėtumas, paburkimas, paraudimas, sumažėjusi pieno produkcija.

Buvo registruojama, kiek karvių rujojo su požymiais arba be jų iki lakta-cijos piko (nuo 21 iki 30 paros po veršiavimosi), laktalakta-cijos piko metu (35–60 parą po veršiavimosi) ir laktacijos mažėjimo laikotarpiu (65–90 paros po veršiavimosi), sprendžiant pagal klinikinius požymius ir pagal progesterono koncentraciją. Būklė, kai dviejuose pieno mėginiuose, imtuose iš eilės kas parą, nustatyta maža progesterono koncentracija (<3,5 ng/ml), o trečiajame, imtame trečią parą, koncentracija padidėjo daugiau kaip 5 ng/ml, laikyta ruja be klinikinių požymių [6]. Vidutinė progesterono koncentracija rujos metu apskaičiuota kaip matavimų rujos pradžioje ir po 24 val. vidurkis.

Produktyvumo ir progesterono koncentracijos duomenys pateikti dešim-tainio logaritmo išraiška.

Ketvirtasis bandymas: vertinta pieno sudėties įtaka pieno progesterono koncentracijai, priklausomai nuo reprodukcinės būklės, FT multilyser S20 metodu. Tiriamosios karvės buvo suskirstytos į tris grupes, atsižvelgiant į pa-ros produktyvumą sėklinimo metu:

1 grupė – 20–23 kg/d., n = 15; 2 grupė – 24–27 kg/d, n = 15; 3 grupė – 28–31 kg/d, n = 12.

Siekiant diagnozuoti veršingumą pagal progesterono koncentraciją, pieno mėginiai buvo imami po melžimo, praėjus 20–21 parai po sėklinimo. Atsižvelgiant į progesterono koncentraciją piene, karvė laikyta veršinga, kai progesterono koncentracija buvo didesnė kaip 10 ng/ml, abejotina, kai 7– 10 ng/ml, ir neveršinga, kai mažiau kaip 7 ng/ml.

Karvių veršingumas rektiniu būdu buvo nustatomas praėjus 60 parų po sėklinimo. Veršinga laikyta tokia karvė, kurios gimdos ragai buvo asimet-riški, padidėjusiam gimdos rage jaučiama fliuktacija ir embriono kontūrai.

Karvių klinikiniai tyrimai, pieno progesterono koncentracija, pieno kiekis nustatyti pieno ūkyje. Pamatiniu metodu pieno mėginiai tirti sveikų ir sergančių gimdos infekcija karvių, biocheminiai kraujo tyrimai atlikti LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratorijoje.

Pieno sudėties tyrimai atlikti pagal bendrąsias metodikas VĮ „Pieno tyri-mai“.

Pieno kiekis melžimo metu matuojamas standartus atitinkančiais skaitik-liais „GEA“ Demotron 70 (Vokietija).

33

2.3.1. Pieno mėginių ėmimas progesterono koncentracijos ir pieno sudėties vertinimui

Pieno mėginiai imti po melžimo į standartinį mėgintuvėlį (BD Vacu-tainer, 6 ml, Anglija) iš visų ketvirčių po lygiai apie 1/3 mėgintuvėlio.

Pirmajam ir antrajam etapams 3 pieno mėginiai imti tik pastebėjus rują, 4 pieno mėginiai – 60 veršingumo parą (nustačius rektiškai veršingumą) ir 3 pieno mėginiai – 10 parų po rujos.

Trečiajame etape pirmam bandymui karvių pieno mėginiai imti nuo 10 paros po apsiveršiavimo kas 3 dienos iki 90 paros po apsiveršiavimo.

Antrajam bandymui pieno mėginiai imti praėjus 15 parų po apsiveršia-vimo kas 5 paros iki 50 paros.

Trečiajam bandymui – nuo 21 iki 90 paros po apsiveršiavimo kas tris paras imti pieno mėginiai. Paimtame pieno mėginyje nustačius mažesnę nei 3,5 ng/ml progesterono koncentraciją, kitas mėginys imtas po 24 val. Nusta-čius didesnę nei 3,5 ng/ml koncentraciją, mėginys imtas po 3 parų.

Ketvirtajame bandyme, praėjus 20 parų po sėklinimo, buvo paimtas pieno mėginys veršingumui nustatyti.

Ketvirtajame bandyme pieno sudėties ir somatinių ląstelių skaičiaus (SLS) nustatymui pieno mėginiai buvo imami į vienkartinius plastikinius 70 ml indelius su konservantu „Sedupolas“ 60, 30 parų iki sėklinimo, sėklinimo metu ir 30 parų po sėklinimo.

2.3.2. Pieno sudėties ir kiekio vertinimas

Tiriamųjų karvių produktyvumas (kg/d.) vertintas melžimo metu trečia-jame ir ketvirtatrečia-jame bandymuose. Trečiatrečia-jame bandyme karvių produktyvu-mas buvo registruojaproduktyvu-mas tris kartus: pirmą kartą – 21–30 laktacijosparą, antrą kartą – 35–60 laktacijosparąir trečią kartą – 65–90 laktacijosparą. Ketvirta-jame bandyme pieno kiekio tyrimai atlikti 60, 30 parą iki sėklinimo, sėkli-nimo metu ir 30 parą po sėklisėkli-nimo. Produktyvumą vertina „GEA“ Dematron 70 (Vokietija) automatizuota sistema po kiekvieno melžimo.

Pieno riebalų (R, proc.), baltymų (B, proc.), laktozės koncentracija (L, proc.) ir somatinių ląstelių skaičius (SLS, tūkst./ml) tirti VĮ „Pieno tyrimai“ pieno sudėties ir kokybės tyrimo laboratorijoje pagal standartizuotas metodi-kas. Pieno riebalų, baltymų ir laktozės kiekis nustatytas prietaisu „Lactoscope 550“ („Delta Instruments“, Olandija). Somatinių ląstelių skaičius nustatytas prietaisais „Somascope MK2“ („Delta Instruments“, Olandija).

34 2.3.3. Kraujo mėginių ėmimas

Antrajam bandymui karvių kraujo mėginiai buvo imami po melžimo iš uodegos venos į sterilius vienkartinius vakuuminius mėgintuvėlius (BD Vacutainer 6 ml, Anglija) be koncervanto, praėjus 15 parų po apsiveršiavimo. Paimti kraujo mėginiai per 3 val. buvo pristatomi į LSMU VA Gyvūnų reprodukcijos laboratoriją, kur kraujas 10 min. buvo centrifuguojamas 3000x apsisukimų per 1 min. greičiu. Atsiskyręs serumas (1–3 ml) Pastero pipete (Einweg-Pasteurpipetten, Carl Roth GmbH, Vokietija) buvo nusiurbiamas į 3,5 ml tūrio mikromėgintuvėlius (Eppendorf, Hamburg, Vokietija) ir tiriamas automatizuotu aparatu Selectra Junior (Vital Scientific N. V., Nyderlandai). Buvo nustatytos kraujo biocheminių rodiklių: bendrųjų baltymų (BB), kalcio (Ca), fosforo (P), gliukozės (Glu), aspartat amino transferazės (AST), šlapalo (U) ir magnio (Mg) koncentracijos kraujo serume.

2.4. Progesterono koncentracijos piene nustatymas 2.4.1. Progesterono koncentracijos piene nustatymas ELISA metodu

Pieno mėginiai per 1,5 valandos buvo atgabenamiį laboratoriją tyrimui. Progesterono tyrimui atlikti buvo naudotas imunofermentinės analizės (ELISA) rinkinys (EuroProxima, Olandija). Rinkinį sudaro:

1. Mikroplokštelės, padengtos antikūnais, prieš triušio IgG. 2. Skiedimo buferis: Na2HPO4 0,77 g,

KH2PO4 0,18 g, NaCl 8,94 g, pH 7,4 (7,3–7,5). 3. Plovimo buferis. 4. Substratas; TMB (tetrametilbenzidinas). 5. Stop tirpalas. 6. Konjugatas (PROG–HRPO). 7. Antikūnai. 8. Progesterono standartas.

Pieno mėginys buvo inkubuojamas +45 °C temperatūroje 1 val., tuomet centrifuguojamas 20 min. apverstame mėgintuvėlyje 2000 × g, siekiant atskir-ti liesą pieną. Tyrimui naudota 50 μl lieso pieno.

Plovimo buferis paruoštas į 12 ml plovimo buferio įpylus 228 ml disti-liuoto vandens. Substratas TMB (tetrametilbenzidinas) atšildomas kambario temperatūroje, tamsoje.