Capitolo 2

39

Capitolo 2

40

2.1

_{Tecniche di clonaggio genico}

2.1.1

_{TRASFORMAZIONE DI CELLULE BATTERICHE COMPETENTI}

2.1.1.1

_C

_{EPPO BATTERICO}

_DH5

_Α

Per amplificare i plasmidi ricombinanti è stato utilizzato il ceppo di Escherichia Coli DH5α, il quale presenta mutazioni in specifici geni, volte a migliorare la stabilità e la qualità dei costrutti purificati mediante “mini-” e “midi-prep”: questo ceppo, ad esempio, porta una mutazione nulla a carico del gene endA1, che codifica per un'endonucleasi intracellulare che potrebbe degradare il DNA plasmidico; una mutazione nel gene RecA elimina la ricombinazione omologa, riducendo così la possibilità che si verifichino riarrangiamenti del plasmide. Le cellule batteriche contengono, inoltre, il marcatore φ80lacZ∆M15 che permette la α-complementazione del gene della β-galattosidasi e la selezione dei cloni ricombinanti mediante un test bianco-blu su piastra.

2.1.1.2

_P

_{REPARAZIONE DI CELLULE COMPETENTI MEDIANTE L}

_’

_{UTILIZZO DI}

_R

_B

_C

_L

Le cellule di Escherichia coli (ceppo DH5α) sono rese competenti per la trasformazione, ovvero capaci di assumere vettori o molecole di DNA plasmidico ricombinanti (contenenti, cioè l'inserto di nostro interesse), attraverso il metodo del Cloruro di Rubidio (RbCl): una colonia cresciuta “over night” (O/N) su terreno solido viene inoculata in 50ml di terreno liquido. La crescita viene mantenuta a 37°C in agitazione fintanto che la densità ottica (OD) misurata a 600nm non raggiunge il valore di 0,2. A questa densità ottica la crescita viene interrotta mantenendo le cellule per 3 minuti in ghiaccio. A questo punto si effettua una centrifuga in tubo sterile per 10 minuti a 5000 rpm a 4°C. Si elimina il sopranatante e si risospende il "pellet" in metà del volume iniziale (circa 25ml) di RbCl 50mM freddo. Dopo 30 minuti in ghiaccio si effettua una seconda centrifuga in tubo sterile per 10 minuti a 5000 rpm a 4°C. A questo punto viene eliminato il sopranatante e il “pellet” viene risospeso in 1/50 del volume iniziale (circa 0,8ml) di RbCl 50mM freddo. Le cellule così ottenute, dopo un’ulteriore incubazione in ghiaccio per 15 minuti, vengono frazionate in aliquote più piccole, e conservate a –70°C.

41

2.1.1.1

_T

_{RASFORMAZIONE BATTERICA}

Attraverso questo procedimento sono introdotte molecole di DNA plasmidico (vettori o prodotti di ligation) in cellule batteriche competenti. A 200µl di cellule batteriche DH5α vengono aggiunte 5ng di DNA plasmidico. A seguito di una incubazione in ghiaccio per 50 minuti, ed uno shock termico a 42°C per 90 secondi ed un’ulteriore incubazione in ghiaccio per 5 minuti, si aggiungono 800 µl di LB Medium e le cellule sono poste a 37°C per 1 ora, in agitazione per una fase di precrescita.

Trascorsa l'ora, si effettua una breve centrifuga a 13000 rpm, e si elimina il sovranatante. Il "pellet" viene risospeso con la piccola parte di liquido rimasta e la sospensione cellulare viene piastrata uniformemente su terreno solido selettivo e vengono incubate a 37°C O/N

La mattina successiva, sulla piastra Petri compaiono le colonie batteriche: l’antibiotico presente nel terreno di coltura in cui sono stati piastrati i batteri permette la crescita soltanto delle cellule che hanno assunto il plasmide, poiché quest'ultimo contiene il gene che conferisce resistenza a quello specifico antibiotico.

Ogni volta che è stata effettuata una trasformazione, abbiamo controllato l’efficacia dell’antibiotico e la mancanza di contaminazioni, piastrando, in parallelo, 200µl di cellule batteriche sottoposte a uguale trattamento, escludendo solamente l’aggiunta del DNA plasmidico (bianco). Le cellule prive del plasmide non presentano la resistenza all’antibiotico e, se l’antibiotico funziona nel modo corretto e non sono presenti batteri contaminanti Ampicillina resistenti, la piastratura di queste cellule non dà origine a colonie.

Terreni di coltura liquidi

Brodo Luria-Bertani (“L.B. Medium” o “L.B. Broth”)

Il brodo Luria-Bertani (“L.B. Medium” o “L.B. Broth”) è utilizzato per il mantenimento e la propagazione di cellule di Escherichia Coli. Il terreno, nutrizionalmente ricco, permette anche la crescita di cloni ricombinanti e ha la seguente composizione chimica:

1% Cloruro di Sodio (NaCl) 1% tryptone

0,5% estratto di lievito

42 Formula (grammi per litro)

10 grammi di tryptone

10 grammi di Cloruro di Sodio (NaCl) 5 grammi di estratto di lievito

Aggiungere acqua deionizzata fino al volume finale di 950ml.

Aggiustare il pH intorno a 7,3-7,5 con NaOH 10M; quindi, portare a volume finale di un litro con acqua deionizzata. Autoclavare ed aliquotare il brodo.

Terreni di coltura solidi Bottom Agar

agar sciolto in LB 1,5% (autoclavare)

Antibiotici usati per terreni selettivi Ampicillina 100 µg/µl

2.1.1.2

_S

_{EMINA DI COLONIE BATTERICHE TRASFORMATE}

Si raccoglie con un’ansa una colonia cresciuta su piastra e la si trasferisce in 5 ml di brodo LB (a cui si aggiunge ampicillina 100 µg/ml) contenuto in un tubo batteriologico da 15 ml. Il tubo viene, quindi, messo sulla ruota a 37°C O/N affinchè le cellule raggiungano la fase di crescita stazionaria.

2.1.2

_{ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO}

2.1.2.1

_E

_{STRAZIONE DI}

_DNA

_{PLASMIDICO SU PICCOLA SCALA MEDIANTE LISI ALCALINA}

(“

MINI

-

PREP SENZA FENOLO

”)

Tale metodo permette di estrarre da cellule trasformate una quantità limitata di DNA plasmidico, che potrà essere successivamente sequenziato o sottoposto a digestione diagnostica. La crescita batterica viene centrifugata a 12000 rpm per un minuto o a 4000 rpm per 10 minuti, allo scopo di ottenere un “pellet” di cellule batteriche. A seguito della centrifuga il sopranatante viene eliminato e il "pellet" risospeso in 400µl di “soluzione 1” (S1) con il vortex. La sospensione deve poi essere mantenuta 5 minuti a temperatura ambiente (R.T.). Alla suddetta sospensione si aggiungono 400µl di “soluzione

43 2” (S2), e si mescola la miscela, invertendo il tubo delicatamente 4-5 volte e poi mantenendo 5 minuti a R.T. In questo passaggio si ha la lisi della cellula batterica ad opera della soda (NaOH) e del Sodio Dodecil Solfato (SDS) ed il contenuto della cellula si riversa nella soluzione. La reazione di lisi alcalina non deve procedere per una durata superiore ai 5 minuti. Trascorsi i 5 minuti, si aggiungono al lisato 400µl di “soluzione 3” (S3), si invertire la provetta delicatamente 3-4 volte, e si mantiene 5 minuti a R.T. In questo passaggio si verifica la precipitazione di tutti i frammenti più grossolani della cellula: frammenti di membrana, DNA genomico, pareti delle cellule lisate, assieme al DNA cromosomico e all’RNA ad alto peso molecolare. A seguito di una centrifuga di circa 15-30 minuti a 13000 rpm si recupera il sopranatante (circa 900µl) in una nuova provetta. Il sopranatante contiene DNA plasmidico, RNA a basso peso molecolare e proteine batteriche. Si aggiungono poa alla fase acquosa contenente il DNA plasmidico, 0,6 volumi (V) di isopropanolo a R.T.; si capovolge delicatamente la provetta 3-4 volte e si lascia 5-10 minuti a R.T. A questo punto si ha la precipitazione del DNA plasmidico e dell’RNA a basso peso molecolare, che possono essere recuperati mediante centrifugazione. Si effettua una centrifuga a R.T. per 15-30 minuti a 13000 rpm. Il "pellet" si presenta piccolo e traslucido.Il "pellet" ottenuto viene lavato con 400µl di Etanolo (EtOH) al 70% ghiacciato. Il "pellet" ottenuto viene risospeso in 20µl di TE (o H2O mQ) contenente RNAsi A ad una concentrazione di 100µg/ml (TER), allo scopo di eliminare l’RNA a basso peso molecolare.

Soluzioni

S1 S2 S3 TE

25 mM Tris-HCl pH=8,0 0,2 M Na(OH) Acetato di Potassio 3 M 10 mM Tris-HCl 10 mM EDTA 1℅ SDS pH=5,3 1 mM EDTA 50 mM Glucosio pH=8,0

44

2.1.2.2

_{PURIFICAZIONE DI}

_DNA

_{PLASMIDICO MEDIANTE IL KIT}

_“W

_IZARD

_®

_P

_LUS

_M

_INIPREPS

DNA

P

URIFICATION

S

YSTEM

”

Per l'estrazione su piccola scala di DNA plasmidico (“miniprep”) a partire da una crescita O/N di cellule batteriche trasformate, è stato utilizzato il kit “Wizard® Plus Miniprep DNA Purification System”della Promega utilizzando il protocollo fornito dalla ditta.

Soluzioni

Soluzione di Lisi Cellulare

NaOH 0.2M

SDS 1% .

Soluzione di Risospensione Cellulare

Tris-HCl 50mM (pH 7.5) EDTA 10mM RNase A 100µg/ml.

Soluzione di Neutralizzazione

Cloridrato di guanidina 4.09M Acetato di potassio 0.759M Acido acetico glaciale 2.12M Il pH finale è circa 4.2.

Soluzione di Lavaggio della Colonnina

Acetato di potassio 162.8mM

Tris-HCl 22.6mM pH 7.5 EDTA 0.109mM pH 8.0

Aggiungere Etanolo al 95%, in modo che le concentrazioni finali siano rispettivamente 60% di Etanolo e 60mM di acetato di potassio.

2.1.2.3

_{ESTRAZIONE DI}

_DNA

_{PLASMIDICO SU MEDIA SCALA}

_(“

_MIDI

_-

_PREP

_”)

Il DNA plasmidico è estratto dalla cellule batteriche per mezzo del kit “NucleoBond PC-100” della Macherey-Nagel. Tale kit comprende colonnine cromatografiche a scambio anionico contenenti la resina di silicio “NucleoBond AX”, alcune soluzioni tampone e l'RNAsi A.

Con questa tecnica è possibile estrarre da 20 a 100µg di DNA plasmidico altamente purificato, a partire da 100ml di crescita batterica O/N in L.B.

45

Soluzioni

S1 S2 S3

RNasi A 100 µg/ml NaOH 200 mM K+_CH3COO- 2,8 M pH 5,1 Tris-HCl 50 mM SDS 1℅

EDTA 10 mM pH 8.0

N2 N3 N5

Tris 100 mM Tris 100 mM Tris 100 mM EtOH 15℅ EtOH 15℅ EtOH 15%

KCl+H3PO4 900 mM KCl + H3PO4 1150 mM KCl+H3PO4 1000 mM pH 6.3 pH 6.3 pH 8.5

Triton X-100 0,15%

2.1.3

_{CORSA ELETTROFORETICA SU GEL DI AGAROSIO}

La corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1% (peso/volume, o abbreviato w/v) permette di separare frammenti di DNA di diverso peso molecolare (P.M.), semplicemente ponendoli in un campo elettrico: una molecola di DNA, carica negativamente per la presenza di gruppi fosfato, se sottoposta ad una differenza di potenziale costante, tende a migrare verso il polo positivo (anodo), con una velocità che è inversamente proporzionale al suo P.M.

Questa tecnica presenta molteplici applicazioni: permette di verificare la completezza di una digestione enzimatica, di stimare la lunghezza in paia basi di una molecola di DNA, così come la purezza e la concentrazione di un DNA estratto.

Soluzioni

TBE pH 8,0 Tris base 0,089 M Acido borico 0,089 M EDTA 0,002 M

2.1.3.1

_CARICAMENTO

_DEL

_CAMPIONE

_E

_CORSA

_{ELETTROFORETICA}

Al campione viene aggiunto al il tampone di Caricamento (“loading buffer”) 6X nella quantità necessaria a renderlo 1X nella soluzione finale. Il “loading buffer” viene aggiunto al fine di appesantire il campione grazie alla presenza di glicerolo nel colorante, in modo che possa depositarsi sul fondo dei pozzetti del gel ripieni di tampone di corsa. Inoltre i due coloranti presenti (il Blu di Bromofenolo e lo Xilene Cianolo) permettono di seguire la corsa elettroforetica del DNA. Infatti, in

46 un gel di agarosio all'1% lo Xilene Cianolo migra come una molecola di DNA di 4000 pb mentre il Blu di Bromofenolo migra più velocemente, in modo simile ad una molecola di 800 pb. Sono disponibili anche coloranti contenenti solo Xilene Cianolo o solo Blu di Bromofenolo, che sono utilizzati per correre molecole di DNA di piccole e grosse dimensioni, rispettivamente. Le elettroforesi sono state condotte su apparati orizzontali con voltaggio costante di 50-110 V, utilizzando gel di agarosio in percentuale peso/volume dello 0,8-1%, contenenti bromuro di Etidio alla concentrazione di 0,1 µg/ml. Come sistema tampone è stato utilizzato TBE 1X . Per ogni corsa elettroforetica sono stati caricati 3-5 µl di “Ready-Load 1Kb Plus DNA ladder” (Invitrogen) come marcatori molecolari, idonei per determinare le dimensioni di frammenti lineari di DNA a doppio filamento da 200 pb a 12 Kb. I gel sono stati osservati ai raggi UV con transilluminatore Gel Doc 200 (Bio Rad) e fotografati con apparecchio fotografico collegato a stampante Polaroid BX6000.

Soluzioni

“Loading buffer” 6X per DNA “Loading buffer” 6X denaturante per RNA

Glicerolo 5% EDTA 18 mM Blu di Bromofenolo 0,05% Formammide 95 % Xilene Cianolo 0,05% SDS 0,025 %

Blu di Bromofenolo 0,025% Xilene Cianolo 0,025%

2.1.4

_{PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI}

2.1.4.1

_E

_{STRAZIONE E PURIFICAZIONE DI FRAMMENTI DI}

_DNA

_{DA GEL E PURIFICAZIONE DI}

PRODOTTI DI

PCR

Abbiamo utilizzato il kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” della Promega per purificare frammenti di DNA estratti da gel o prodotti di PCR. Tale metodo di purificazione si basa sulla capacità del DNA di legarsi alle membrane di silicio in presenza di ioni caotropici.

La banda del gel, corrispondente al frammento di DNA di interesse isolato mediante corsa elettroforetica, è estratta in un volume minimo di agarosio, utilizzando la lama di un bisturi e cercando di minimizzare il tempo di esposizione agli UV che possono danneggiare il DNA provocando rotture nello scheletro dell’acido nucleico (fenomeno noto come “nicking”), quindi è introdotta in una provetta. Il protocollo seguito per la purificazione è quello fornito dalla ditta.

Il DNA, così purificato, può essere utilizzato in una serie di applicazioni successive, come il clonaggio, la digestione con enzimi di restrizione, la trascrizione in vitro, il sequenziamento etc..

47

2.1.4.2

_P

_{URIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI}

_:

_{ESTRAZIONE FENOLICA E PRECIPITAZIONE}

ALCOLICA

Questa procedura rappresenta un'alternativa all'applicazione del kit descritto sopra, consentendo di purificare gli acidi nucleici (DNA o RNA) da altri componenti eventualmente presenti nella soluzione.

In particolare, questo protocollo è applicato per purificare il DNA dopo che è stato digerito con enzimi di restrizione, in modo da rimuovere gli enzimi utilizzati, i sali e il glicerolo.

Inizialmente viene aggiunto al campione da purificare TE a pH 8 in modo da portarlo al volume finale di 100µl; quindi aggiungere un ugual volume (100µl) di una soluzione fenolo-cloroformio-isoamil alcool 25:24:1 pH 8, precedentemente scongelata a 37°C.

Il fenolo e il cloroformio denaturano le proteine, il cloroformio facilita la separazione delle fasi mentre l'alcool isoamilico evita la formazione di schiuma durante la purificazione.

La miscela viene “vortexata” per qualche secondo, fino ad ottenere un'emulsione che è poi centrifugata 5 minuti a 12000 rpm a R.T. A questo punto, vedremo le due fasi separate e sarà necessario recuperare il sopranatante, ovvero il TE contenente il DNA purificato: a questo scopo, occorre inclinare la provetta, si avvicina la punta della gilson alla parete della provetta, e si toglie la punta non appena si vede che si forma una bolla e a questo punto si trasferisce ciò che si è recuperato in una nuova eppendorf. A questo segue una precipitazione alcoolica: si aggiunge un decimo del volume di NaAc pH 4.8 3M e 2.5 volumi di etanolo assoluto e si lascia a precipitare O/N a -20°C. Il giorno successivo, si centrifuga 25 minuti a 13000 rpm a R.T., e si vuota delicatamente l'eppendorf, in modo da scartare il sopranatante; si lava il "pellet", aggiungendo 200µl di Etanolo al 75% e si centrifuga 5 minuti a 13000 rpm a R.T.; quindi, si elimina l'etanolo e si lascia asciugare il "pellet" all'aria, che infine sarà risospeso in 20µl di H2O RF.

2.1.5

_{DIGESTIONE DI DNA PLASMIDICO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE}

In questa procedura si utilizzano enzimi o endonucleasi di restrizione, enzimi di origine batterica capaci di riconoscere specifiche sequenze nucleotidiche, chiamate siti di restrizione e di tagliare il DNA in corrispondenza di esse. I plasmidi presentano siti di policlonaggio, chiamati “polylinker”, costituiti da una serie di siti di riconoscimento per gli enzimi di restrizione più comuni, posti in stretta vicinanza per facilitare l'inserzione di DNA esogeno (“inserto”). I plasmidi non digeriti sono molecole di DNA circolari e superavvolte. Digerendo un plasmide ricombinante con due enzimi (o

48 con un solo enzima) che tagliano in due siti delimitanti l'inserto clonato nel vettore, è possibile “staccare” l'inserto dal vettore.

La digestione di DNA plasmidico con una o due endonucleasi di restrizione:

1) consente di costruire mappe di restrizione, ovvero di stabilire l'ordine dei siti riconosciuti da specifici enzimi di restrizione in una molecola di DNA plasmidico;

2) permette di preparare il “backbone” per il subclonaggio all'interno di un frammento di DNA avente estremità compatibili (“inserto”), ottenuto a partire da un altro costrutto mediante digestione con lo stesso (o gli stessi) enzimi; tali digestioni sono dette preparative;

3) può essere condotta per individuare i cloni ricombinanti, ovvero i cloni contenenti l'inserto di interesse, tra più molecole di DNA plasmidico estratte dai batteri trasformati con un prodotto di ligation;

4) può essere effettuata a scopo diagnostico, ovvero per verificare l'integrità del plasmide, per controllare la presenza e l'ordine dei siti di restrizione descritti nella mappa e per testare la capacità delle endonucleasi di riconoscere tali siti e tagliare il DNA in corrispondenza di essi. Ad esempio, si può digerire un plasmide ricombinante con due enzimi che tagliano ai lati dell'inserto, per poi controllare mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio in presenza di ladder se la lunghezza in pb dell'inserto è quella attesa.

Nell'allestire una digestione di DNA plasmidico con endonucleasi di restrizione occorre tener conto che ogni enzima ha una temperatura di reazione specifica e possiede un tampone (“buffer”), avente proprietà chimico-fisiche (pH, presenza di cofattori, composizione salina, forza ionica) tali da rendere l'attività dell'enzima al suo interno ottimale. Le ditte forniscono ciascun enzima associato al suo buffer ottimale. Nella doppia digestione, sarà necessario selezionare un buffer e una temperatura di reazione che siano compatibili con l'attività di entrambi gli enzimi utilizzati.

Il buffer di digestione viene fornito ad una concentrazione 10X e l'enzima alla concentrazione di 10 U.E./µl; tenendo conto che un'unità enzimatica (U.E.) è la quantità di enzima richiesta per digerire completamente un microgrammo di DNA substrato in un'ora a 37°C, occorre stabilire la quantità dell'enzima, o di ciascun enzima in caso di doppia digestione, in relazione alla quantità di DNA che si vuole digerire, che dipende dallo scopo della digestione.

Occorre prestare attenzione affinchè il volume totale degli enzimi presenti nella soluzione non superi un decimo del volume totale della miscela di reazione, poiché in tal caso il glicerolo in cui sono disciolti gli enzimi per evitarne il congelamento a -20°C potrebbe inibire l'attività degli stessi.

49 Quindi, la miscela di reazione contenente il DNA, l'enzima o gli enzimi, il buffer di digestione e l'acqua milliQ per arrivare a volume finale (solitamente di 15-30µl) è incubata a 37°C (enzimi che richiedono una temperatura diversa rappresentano eccezioni) per almeno 4 ore, preferibilmente O/N. In alcuni casi abbiamo utilizzato il kit della Fermentas “Fast Digest Restriction Enzymes” che permette di effettuare digestioni rapide in pochi minuti.

2.1.5.1

_D

_{IGESTIONI PARZIALI}

Nel caso in cui si voglia subclonare un gene o un frammento genico in un vettore, utilizzando un enzima che taglia anche all’interno della sequenza di DNA di interesse, non possiamo effettuare una digestione totale con l’enzima in questione, in quanto andrebbe ad alterare l’integrità del gene, frammentandolo in più parti. E’ necessario procedere con una digestione parziale, scegliendo, attraverso una serie di tentativi, le condizioni di reazione ottimali (buffer, tempo di incubazione della reazione enzimatica, etc..) perché l’enzima tagli soltanto nei siti voluti. Ad esempio, abbiamo subclonato la sequenza codificante per una proteina di fusione ppHHAA--MMSS22--eeGGFFPP--NNLLS e delimitata S nel costrutto iniziale dai siti di restrizione per gli enzimi NcoI e ClaI, nel vettore di espressione pCS2+. Durante la ricostruzione della mappa di restrizione, abbiamo dedotto che l’enzima NcoI taglia una volta anche all’interno della sequenza codificante da subclonare, suddividendola in due sub frammenti. Abbiamo effettuato così una serie di digestioni parziali, usando enzimi di diversa marca (NcoI della Bio Labs e e ClaI della Promega) e buffer E 10X della Promega, buffer ottimale per ClaI e non per NcoI, in modo da ostacolare l’attività enzimatica di quest’ultimo e, quindi, il riconoscimento del sito di restrizione per NcoI presente all’interno dell’inserto. Il protocollo utilizzato è il seguente:

6 X (6 doppie digestioni, come segue): circa 5 µg di ppHHAA--MMSS22--eeGGFFPP--NNLLS (x µl) S 0,5 µl NcoI

0,5 µl ClaI 5 minuti a 37°C ghiaccio

1,5 µl buffer E 10X + 1 µl di EDTA eventualmente H20 mQ + 3 µl di “loading buffer 6X”

15 µl Volume totale

Le aliquote vengono caricate nel minor numero di pozzetti doppi in un gel piuttosto spesso; le bande delle dimensioni attese (1200 pb), indicate da una freccia nel gel sottostante, sono estratte dal gel ed

50 il frammento di DNA plasmidico è eluito e purificato usando il kit “Wizard SV Gel and PCR-Clean”, cercando di eluire più bande insieme (in un’unica colonnina) in 30 µl di acqua mQ, in modo da concentrare al massimo il frammento.

2.1.6

_LIGATION

Il DNA da sottoporre alla reazione di “ligation” è precedentemente purificato mediante il kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” della Promega o mediante estrazione fenolica.

2.1.6.1

_R

_{EAZIONE DI}

_F

_ILL

_-

_IN

Nel caso di ligation tra un “backbone” avente estremità piatte (“blunt ends”) e un inserto avente estremità coesive (“sticky ends”), occorre rendere le estremità coesive dell'inserto piatte, effettuando una reazione di “fill-in”, ovvero di riempimento delle estremità 3'OH generate dalla digestione con l'enzima di restrizione, utilizzando il Frammento di Klenow (“Klenow Enzyme”, Roche), un frammento della DNA Polimerasi I di Escherichia Coli di 68 KDa, dotato di attività polimerasica 5’-3’ e di attività esonucleasica (“proofreading”) 5’-3’-5’ ma privo dell’attività esonucleasica 5’-5’-3’ propria della DNA Polimerasi I. L'enzima Klenow presenta uno specifico tampone di reazione, il Tampone di Riempimento (“Filling Buffer”) 10X , contenente 500 mM Tris (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM

DTT,500 µg/ml BSA. Allestire una miscela di reazione, così composta:

1 μg di DNA “template” 1 mM di ciascun dNTP

2 μl di Tampone di riempimento 10X 1 UE di enzima Klenow

acqua milliQ fino al volume finale di 20 μl.

Incubare 15 minuti a 37°C. Quindi inattivare l'enzima a 65°C per 10 minuti.

Abbiamo utilizzato questo enzima per riempire le estremità coesive della banda HHA-AMSMS22-GFGFPP-NNLLS S ottenute in seguito alla digestione con gli enzimi NcoI e ClaI, in modo da poter clonare la banda riempita nel vettore di espressione pCS2+, precedentemente digerito con l’enzima StuI che genera estremità piatte.

51 La miscela di reazione allestita è la seguente:

eluato della banda HHA-AMMSS22-GGFFPP-NNLLSS di 1200 pb 2μl 10X buffer

0,5μl dNTPs 2mM 0,5μl Klenow

eventualmente acqua mQ per arrivare a volume 20 μl Volume totale

La reazione è fatta procedere a 37°C per 10 minuti, quindi l’enzima è inattivato, mediante riscaldamento a 75 °C per 10 minuti.

2.1.6.2

D

EFOSFORILAZIONE

In alcune tipologie di clonaggio, ad esempio nel caso in cui il “backbone” sia ottenuto mediante digestione del vettore plasmidico con un solo enzima, le estremità 5' del “backbone” generate d alla digestione dovrebbero essere defosforilate, per sfavorire la richiusura del plasmide su se stesso, attraverso incubazione del plasmide linearizzato con la fosfatasi alcalina (“Alkaline Phosphatase, shrimp”, SAP, della Roche) a 37°C per 10 minuti (un'unità enzimatica di SAP ogni picomole di DNA), nel tampone di defosforilazione 10X (Tris-HCl 0.5M , MgCl2 50 mM, pH 8.5). Segue

l'inattivazione della SAP, per circa 15 minuti a 65°C.

Ad esempio, abbiamo utilizzato questa procedura per defosforilare le estremità 5’ del vettore pCS2+ digerito con StuI, mediante la seguente procedura:

Banda pCS2+/StuI purificata 1 μl 10X buffer SAP (Roche) 1 μl SAP (Roche)

eventualmente acqua mQ per arrivare a volume 10 μl volume finale

La reazione di defosforilazione è fatta procedere per 10 minuti a 37°C, quindi l’enzima è disattivato per 15 minuti a 65°C.

52 Per defosforilare le estremità 5’del costrutto pCS2+-24X ms2 repeats, ottenute in seguito alla digestione con l’enzima XhoI, abbiamo utilizzato il seguente protocollo:

x μl (circa 100 ng) del primo eluato di pCS2+-24X ms2 digerito con XhoI e purificato 1 μl di buffer 10X

1 μl SAP Roche (10-x) μl H2O mQ

10 μl Volume totale

La defosforilazione è fatta procedere per un’ora a 37° C (anzichè 15 minuti come da protocollo Roche), quindi la fosfatasi alcalina è inattivata per 15 minuti a 65°C.

2.1.6.3

_LIGATION

Nella reazione di “ligation”, la T4 DNA ligasi (“T4 DNA Ligase”, Roche) catalizza la formazione di legami fosfodiesterici tra il 3'OH e il 5'-P. Preparare la miscela di reazione, mettendo fino a 1µg di DNA digerito; 3µl di tampone di ligation (“ligation buffer”) 10X costituito da Tris-HCl 660mM, MgCl2 50mM, DTT 50mM, ATP10mM, pH 7.5; 1-5 UE di T4 DNA ligasi e aggiungere H2O mQ,

fino al volume finale di 30µl. Incubare a 4-16°C O/N nel caso di estremità coesive (“sticky ends”) o a 16-25°C O/N nel caso di estremità piatte (“blunt ends”). Il “backbone” e il “frammento di DNA” devono essere aggiunti alla miscela di ligation nel rapporto molare vettore:inserto di 1:3 nel caso di estremità “sticky”, quando il vettore e l'inserto hanno approssimativamente la stessa lunghezza in pb; quando il vettore e l'inserto non hanno lunghezza similare il rapporto molare dovrebbe essere di 1:1 o di 1:2 (vettore:inserto di DNA). Nel caso di ligation con estremità piatte, è consigliabile un rapporto molare vettore:inserto di 1:5.

Nel caso di ligation tra un prodotto di PCR e il vettore “pGEM-T Easy Vector” occorre seguire il protocollo allegato al vettore; ad esempio abbiamo clonato nel suddetto vettore l’amplificato del gene lin7A isolato da embrioni di X.laevis a stadio di neurula, mediante il seguente protocollo:

5 μl di “2X rapid ligation buffer”

1 μl (50 ng) di pGEM-T Easy Vector

3 μl del prodotto di PCR purificato, ovvero del 1 eluato del prodotto di amplificazione di lin7A

1 μl T4 DNA ligasi

53 La quantità di prodotto di PCR da includere nella reazione di ligation è stata determinata tenendo conto del fatto che pGEM-T Easy Vector è un vettore di circa 3 Kb ed è fornito alla concentrazione di 50 ng/ml, che il nostro prodotto di PCR è lungo circa 1 Kb e che desideriamo ottenere un rapporto molare finale inserto:vettore di 3:1. La concentrazione dell’eluato ottenuto dalla purificazione da gel del prodotto di PCR è stata stimata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio. La ligation è incubata a 4° C O/N. Il prodotto della ligation è stato trasformato in cellule batteriche DH5α, che poi sono state piastrate in piastre L.B. contenente Ampicillina, IPTG e Xgal, incubate a 37° C O/N.

Abbiamo messo a crescere più colonie bianche, generatesi quindi con buona probabilità da cellule batteriche contenti il plasmide ricombinante, in L.B. con Amp 1 µg/ml; il DNA plasmidico è stato estratto mediante ”MINI-preps” rapide allo scopo di individuare i cloni ricombinanti ed i cloni identificati sono stati digeriti O/N con EcoRI per vedere se contengono l’inserto di 1 Kb; un clone (Neu1) risultato positivo nelle digestioni diagnostiche è stato messo a crescere ed il suo DNA plasmidico è stato estratto mediante ”MIDI preps”, quindi mandato a sequenziare. Il clone contiene un inserto che mostra elevata omologia con le EST di lin-7a presenti nei database.

54

2.1.7

_{AMPLIFICAZIONE DEL DNA MEDIANTE PCR}

Per l'amplificazione del DNA da clonare abbiamo utilizzato la DNA Polimerasi “Advantage HD Polymerase” della Clontech, che garantisce un'amplificazione del DNA stampo (“template”) molto accurata. Sono forniti due buffer: il “10X Adavantage 2 SA PCR Buffer” sarà utilizzato per l'amplificazione di una sequenza di DNA dal DNA genomico, mentre il “10X Adavantage 2 PCR Buffer” per l'amplificazione da DNA plasmidico o cDNA.

Allestire in una provetta Eppendorf sterile in ghiaccio una miscela di 50µl così composta:

1 μl di DNA template

5 μl di 10X “Adavantage 2 PCR Buffer” o “Adavantage 2 SA PCR Buffer” 1 μl della mix di dNTP 50X (10 mM ciascuno)

1 μl Primer Forward 10 μM 1 μl Primer Reverse 10 μM 1 μl 50X Polimerasi Advantage 40 μl di H20

Quindi sottoporre la miscela ad un protocollo di PCR standard, in un termociclizzatore; le condizioni di amplificazione variano in relazione al tipo di primer, al templato e ad altre condizioni sperimentali. I primer sono forniti liofilizzati e devono essere risospesi nel volume di acqua milliQ indicato nel foglietto allegato; “vortexare” e lasciare in ghiaccio per almeno 30 minuti. Sotto ho riportato, a scopo esemplificativo, la sequenza nucleotidica di alcuni primer (forward e reverse) utilizzati per amplificare le regioni 3’-UTR di geni di interesse:

Xotx2- XhoI 3’UTRfor 5'-CAAACCTCGAGTTGGAAATTCCAGGTTTTGTG-3' Xotx2- XhoI 3’UTRrev 5'-GTGCACTCGAGACAATCCGTTGCACAATTCAC-3' Xotx5b- XhoI 3’UTRfor 5'-TTAGCTCGAGGAAATTTCAAGTCTTGTAAATC-3' Xotx5b- XhoI 3UTRrev 5'-AACACTCGAGAAGTTTGTACTGATTCGGCGGA-3'

55 lin7- for

5’-TGACTACCCGTATCCCGTCGTCTTTC-3’ lin7-A rev

5’-AAACTGTCATACAAGCAGCATAAGCACC-3’

Ad esempio, per l’amplificazione mediante PCR del 33’’UUTTRRddii XXoottxx22eeddii XXoottxx55bb, abbiamo utilizzato il seguente protocollo:

1 μl DNA plasmidico Xotx2 o Xotx5b (“vettori sensori”) diluito 1:200 5 μl 10X buffer Advantage

1 μl dNTPs 10 mM

1 μl primer forward 20 μM specifico per 3’UTR di Xotx2 o di Xotx5b 1 μl primer reverse 20 μM specifico per 3’UTR di Xotx2 o di Xotx5b 1 μl Advantage Taq

40 μl H2O mQ

50 μl Volume finale

95°C 95°C 72°C 1 min 30sec 68°C 10 min 58°C 1 min

30 sec 18° C 25 cicli ∞

I prodotti di amplificazione sono stati sottoposti a corsa elettroforetica, eluiti e purificati da gel. Gli eluati sono digeriti con gli enzimi EcoRI e XhoI e le digestioni sono nuovamente purificate mediante colonnina, usando il kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up” della Promega; quindi, le digestioni degli amplificati dei 3’UTR genici, purificati sono state sottoposte a ligation con un altro costrutto digerito con gli stessi enzimi e purificato da gel.

56 Lin7a è un altro gene che abbiamo amplificato a partire da una libreria di cDNA, ottenuta mediante retrotrascrizone da un “pool” di mRNA purificati da embrioni di Xenopus laevis a stadio di neurula. Le condizioni utilizzate per l’amplificazione di lin7a sono le seguenti:

1μl di cDNA ovario stadio 17/18 5 μl 10X buffer Advantage

1μl dNTPs 10 mM 1μl Primer forward lin-7A 20 μM

1μl Primer reverse lin7-A 20 μM 1 μl Advantage Taq

40 μl H2O mQ 50 μl Volume finale

I prodotti di amplificazione di lin7a sono sottoposti a corsa elettroforetica su gel di agarosio, quindi eluiti e purificati da gel e poi clonati nel vettore “pGem-Teasy”, mediante una semplice reazione di ligation.

2.1.8

_{DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE E DELLA}

PUREZZA DEGLI ACIDI NUCLEICI MEDIANTE LETTURA ALLO

SPETTROFOTOMETRO

Lo spettrofotometro è uno strumento che misura l'assorbanza (ABS) di una soluzione ad una certa lunghezza d’onda. Attraverso la legge di Lambert-Beer, è possibile risalire dall’assorbanza alla concentrazione della sostanza. Diluire la soluzione di cui vogliamo misurare la concentrazione in 100µl di acqua milliQ in una provetta Eppendorf; per le MIDI di solito si diluisce 100 volte (1µl di campione+ 1µl di acqua milliQ). Preparare un'eppendorf con 100µl di acqua milliQ che servirà come bianco. Le soluzioni sono trasferite in cuvette di quarzo, che quindi sono inserite all'interno dello strumento, facendo attenzione a disporre le pareti opache ai lati. Le misurazioni sono effettuate tramite lo spettrofotometro (Beckman DU-60). Si misura l’assorbanza alla lunghezza d’onda a cui assorbono gli acidi nucleici, cioè a 260nm; ogni misurazione viene compiuta più volte, in modo da poterne calcolare la media aritmetica e al termine delle misurazioni si reinserisce il bianco per un ultimo controllo. Per misurare la concentrazione di campioni poco abbondanti, si ricorre ai capillari di vetro, nei quali sono caricati solo 3 microlitri (1µl di campione diluito con 2µl di acqua). L’apparecchio rileva il rapporto ABS 260/280, ovvero il rapporto tra l'assorbanza a 260nm, relativa agli acidi nucleici e l'assorbanza a 280nm, relativa alle proteine. Se tale valore è uguale o superiore a

57 1.8, allora il nostro campione può definirsi puro ed esente da contaminanti proteici. Il rapporto ABS 230/280, ovvero il rapporto tra l'assorbanza a 230nm e l'assorbanza a 280nm, rappresenta un ulteriore indice di purezza degli acidi nucleici, relativo però a contaminanti che assorbono a 230nm (carboidrati, fenolo, EDTA etc..). Se tale rapporto assume un valore di 2.0-2.2 o superiore, il campione di acido nucleico può definirsi sufficientemente puro. Se i due rapporti ABS 260/280 e ABS 230/280 sono nel range di accettabilità, allora il valore della concentrazione calcolato dallo strumento potrà considerarsi attendibile.

2.2

Ibridazione in situ su sezioni

2.2.1

_{RACCOLTA DEGLI EMBRIONI DI XENOPUS LAEVIS}

La generazione degli embrioni di Xenopus laevis avviene mediante fecondazione in vitro. Il maschio è immerso in una soluzione anestetizzante, costituita da MSS-222 (metansulfonato dell’estere etilico dell'acido 3-aminobenzoico) allo 0,1%; segue la rimozione dei testicoli. I testicoli possono essere conservati per 3-5 giorni in una Soluzione per il Testicolo a 4°C. Le femmine di Xenopus laevis sono sottoposte a stimolazione ormonale con la gonadotropina corionica, la quale è iniettata nel sacco perilinfatico 10-15 ore prima della fecondazione; ciò stimola la maturazione degli ovociti e la loro deposizione. Al momento della fecondazione è esercitata una leggera pressione sull’addome degli animali; le uova rilasciate sono raccolte in piastre Petri contenenti MMR 0.1X; questa operazione può essere ripetuta a intervalli di 1-2 ore. La fecondazione in vitro è attuata depositando sulle uova un omogenato di testicolo, ottenuto sminuzzando una parte del testicolo in MMR 1X. Alla fecondazione segue la digestione delle proteine che legano l’uovo al gel di rivestimento; gli embrioni, liberi di ruotare, si dispongono con il polo vegetativo, più pesante perché ricco di vitello, rivolto verso il basso. Se la fecondazione è avvenuta correttamente, un'ora dopo osserveremo il fenomeno della rotazione corticale. Quindi, gli embrioni sono posti in una Soluzione Degellificante per circa 5 minuti o almeno fino a quando il rivestimento gelatinoso non è stato perso. La soluzione degellificante viene rimossa mediante 3-4 lavaggi in MMR 0.1X. Infine, gli embrioni sono mantenuti in piastre Petri contenenti la soluzione salina MMR 0.1X, dove si sviluppano senza la necessità di fornire ulteriore nutrimento fino allo stadio 46-47. E' essenziale cambiare quotidianamente la soluzione di MMR 0.1X con una soluzione pulita e rimuovere, utilizzando una pipetta sterile, gli embrioni portatori di anomalie dello sviluppo, oltre agli embrioni morti, che potrebbero innescare infezioni. Inoltre, occorre evitare di sottoporre gli embrioni a sbalzi termici che

58 potrebbero risultare fatali. Lo stadio di sviluppo embrionale può essere valutato sulla base dei criteri di Nieuwkoop e Faber [Nieuwkoop e Faber, 1967]. E' possibile modulare la velocità di sviluppo degli embrioni, variando la temperatura a cui sono mantenuti (14°C, 16°C, 18°C e temperatura ambiente).

Soluzioni

MMR 10X Soluzione per il testicolo Soluzione Degellificante

NaCl 0,1 M MMR 1X DTT 3.2 mM

KCl 2 mM Siero di agnello 10% Tris-HCl 0.2 M pH 8.8 MgSO4 1 mM Gentamicina 20 µg/µl

CaCl2 2 mM

HEPES 5 mM pH 7.8 EDTA 0.2 M

H2O milliQ a volume

2.2.2

_{SINTESI IN VITRO DELLE SONDE}

Per la trascrizione di sonde antisenso o di mRNA senso da utilizzare per esperimenti di “ibridazioni in situ su sezioni”, occorre innanzitutto linearizzare il costrutto in cui è clonato il frammento genico di interesse, mediante digestione con un enzima che taglia una sola volta, nella regione posta a monte o a valle dell'inserto. A tale scopo, una miscela di reazione contenente il DNA plasmidico e l'enzima linearizzante con il suo specifico buffer è incubata O/N alla temperatura di funzionamento dell'enzima. Il giorno successivo, una piccola aliquota della digestione è corsa su gel di agarosio, in parallelo con una quantità simile di DNA plasmidico non digerito. Se la digestione è giunta a compimento, si osserva una singola banda in corrispondenza del plasmide linearizzato, a diversa altezza rispetto al plasmide “supercoiled”: il plasmide linearizzato, infatti, migra in modo diverso rispetto al plasmide non digerito. Quindi, il plasmide linearizzato è purificato mediante estrazione fenolica e precipitazione alcolica, oppure attraverso il kit descritto sopra (in quest'ultimo caso, se la digestione è completa può essere direttamente purificata, altrimenti occorre caricarla su gel ed estrarre la banda corrispondente al plasmide linearizzato, quindi procedere alla purificazione mediante colonnina). Per la sintesi di sonde antisenso ad RNA marcate con Digossigenina (Dig) si effettua una reazione di trascrizione in vitro utilizzando opportune RNA polimerasi (SP6, T7 o T3). L’RNA polimerasi è scelta in base all’orientamento di clonaggio della sequenza di interesse nel vettore.

59 Allestire a temperatura ambiente una miscela di reazione, così composta:

1-1,5 μg di DNA linearizzato e purificato 2μl DTT 200mM

2μl tampone di trascrizione 10X (Roche) 2μl RNA polimerasi

S1μl Inibitore della RNAsi (20 UE/μl) 2μl “DIG-labeling mix”

H2O mQ RF fino a 20μl.

1) Incubare la miscela a 37°C per due ore.

2) Aggiungere 2µl di DNAsi (1mg/ml) e incubare a 37°C per un massimo di 20 minuti. Questo passaggio serve per degradare l'eventuale DNA plasmidico che potrebbe contaminare il trascritto.

3) Prelevare 2µl del volume di reazione e conservare in ghiaccio per la successiva corsa elettroforetica di controllo su gel.

4) Per effettuare la precipitazione alcolica, aggiungere 1µl di EDTA 0,5M pH 8; 1/10 di volume di NH4Ac 5M e 1 volume di isopropanolo. Mescolare il tubo delicatamente.

5) Mettere il tutto a precipitare, preferibilmente O/N a -20°C.

6) A questo punto centrifugare a circa 13000 rpm, a 4°C per 15 minuti.

7) Eliminare il sopranatante e lavare il "pellet" con circa 200µl di EtOH al 75% ghiacciato; 8) Centrifugare a 13000 rpm a 4°C per 10 minuti.

9) Eliminare il sopranatante e lasciar asciugare il "pellet", piccolo e traslucido, dall'Etanolo residuo, lasciandolo evaporare all’aria a R.T.

10)Risospendere il "pellet" in 11µl di H2O RF.

11)Prelevare 1 µl del campione e caricarlo in un gel di agarosio 1% con il “loading buffer 6x” per RNA assieme al campione prelevato in precedenza e a soluzioni di tRNA a concentrazione nota usate come marcatori di quantità. Sarà così possibile stimare la quantità di trascritto ottenuta. L’assenza della banda corrispondente al DNA stampo nell'aliquota prelevata dopo trattamento con DNAsi indica il buon fine della reazione.

60

2.2.3

_ISTOLOGIA

Ho applicato le comuni tecniche istologiche alla preparazione di sezioni di retina di embrioni di Xenopus laevis a diversi stadi di sviluppo, da sottoporre ad ibridazione in situ con sonde antisenso per geni di interesse.

Gli embrioni sono fissati ed inclusi, quindi tagliati in sezioni trasversali a livello dell'occhio.

Le procedure di fissazione, inclusione e taglio cambiano, a seconda che gli embrioni siano inclusi in paraffina e quindi tagliati al microtomo oppure vengano inclusi in OCT e quindi tagliati al criostato; di seguito descriverò le due tecniche istologiche.

2.2.3.1

_I

_{NCLUSIONE DEGLI EMBRIONI IN PARAFFINA E TAGLIO AL MICROTOMO}

2.2.3.1.1

_{Fissazione degli embrioni per inclusione in paraffina}

1) Gli embrioni giunti allo stadio desiderato sono fissati in MENFA 1X: a tal scopo sono lasciati in 4ml circa di MEMFA 1X in falcon da 15ml per 1,5-2 ore sulla piattaforma oscillante a R.T.

2) A questo punto, sottoponiamo gli embrioni ad una scala ascendente di ETANOLO al 25%,50%, 75% e 100% in MENFA 1X: lasciamo gli embrioni in ciascuna soluzione 5 minuti. Quindi sostituiamo la soluzione con Etanolo fresco, in cui lasciamo gli embrioni 30 minuti. Poniamo gli embrioni in EtOH assoluto a –20°C O/N.

2.2.3.1.2

_{Inclusione degli embrioni in paraffina}

Il giorno dell’inclusione occorre avere paraffina filtrata in quantità sufficiente per l’inclusione degli embrioni. Far sciogliere le pasticche di paraffina in cilindri di vetro nella stufa a 60°C circa e filtrare la paraffina sciolta facendola passare attraverso una carta cromatografica Whatman 3MM posto in un imbuto di vetro; lasciare la paraffina filtrata in una stufa a 66°C O/N la sera prima dell’esperimento.

Preriscaldare dei becker piccoli, uno per ogni gruppo di embrioni, precedentemente puliti con Xilolo. Mettere gli embrioni agli stadi desiderati in 4ml di Etanolo assoluto in falcon da 15ml (oppure in 4ml di EtOH al 100% in “vial” da 8ml puliti con Xilolo).

1. Sostituire l’Etanolo con lo Xilolo, un solvente della paraffina, lavorando sotto cappa chimica, sopra un foglio di alluminio, in maniera graduale: sottoponiamo gli embrioni ad una scala ascendente di Xilolo, facendoli passare attraverso soluzioni al 25%-50%-75% e 100% di Xilolo in Etanolo e lasciandoli in ciascuna soluzione per 5 minuti. Infine, sostituiamo la soluzione con Xilolo e lasciamo gli embrioni in questa soluzione 15 minuti a R.T. Ripetiamo

61 2 lavaggi di 15 minuti ciascuno in Xilolo.

2. Sostituire lo Xilolo con la paraffina, nel modo seguente: trasferire gli embrioni in Xilolo in un becker di vetro piccolo, preriscaldato a 66°C e aggiungere un ugual volume di paraffina; lasciare gli embrioni in tale soluzione 50% Xilolo e 50% paraffina 45 minuti a 60°C; sostituire con paraffina al 100% e lasciare O/N a 60°C oppure 3 ore a 60°C; sostituire con paraffina al 100% e lasciare 20 minuti a 60°C. Nel frattempo preriscaldare le piastre Petri, una pipetta di plastica ed un ago.

3. Versare gli embrioni inclusi in paraffina sulla Piastra Petri; aggiungere altra paraffina, se quella che c'è non è sufficiente, immediatamente in modo che non si formino due strati di paraffina sovrapposti e distinti. Orientare gli embrioni con l'ago preriscaldato, in modo che non siano obliqui, siano ben separati l’uno rispetto all’altro e sufficientemente distanti dai bordi della piastra. Lasciar solidificare la piastra a R.T., quindi porre a 4°C.

2.2.3.1.3

Montaggio dei blocchetti di paraffina con gli embrioni inclusi e taglio degli

embrioni al microtomo

Gli embrioni fissati ed inclusi in paraffina sono tagliati al microtomo Reichert-Jung in sezioni di 6µm di spessore che sono disposte sulla superficie di vetrini “SuperFrost”. A tale scopo, la piastra con gli embrioni inclusi in paraffina è tagliata in piccoli blocchetti contenenti ciascuno un solo embrione, usando una lama riscaldata alla fiamma Bunsen; i blocchetti sono inseriti all’interno di una cavità creata, con un rastrellino riscaldato, su uno strato di paraffina lasciato solidificare su un blocchetto di legno, in modo che gli embrioni inclusi in paraffina presentino l'estremità craniale rivolta verso l'operatore. Il blocchetto di legno è inserito in un'apposita morsa sullo strumento. A questo punto si procede con il taglio dell'embrione: raccogliamo, servendoci di un piccolo pennello, le sezioni su un vetrino ricoperto con qualche goccia di acqua milliQ. I vetrini sono posti su una piastra riscaldata a 44°C O/N, in modo che l'acqua evapori completamente.

2.2.3.2

_I

_{NCLUSIONE DEGLI EMBRIONI IN}

_OCT

_{E TAGLIO AL CRIOSTATO}

2.2.3.2.1

_{Fissazione e disidratazione}

La fissazione è un trattamento che ha lo scopo di conservare la morfologia dei tessuti, preservandoli da fenomeni degenerativi. Gran parte dell’acqua presente nei tessuti è poi rimossa (disidratazione): ciò impedisce la formazione di microcristalli di ghiaccio che potrebbero causare, durante il passaggio successivo di congelamento, la rottura delle cellule. Gli embrioni da fissare sono mantenuti per 30 minuti-2 ore a R.T. in paraformaldeide 4% in tampone PBS 1X all'interno di falcon di plastica, in

62 agitazione orizzontale. Questo passaggio provoca la morte degli embrioni e fissa la morfologia tissutale, dato che la paraformaldeide è un agente “cross-linking”, promuove cioè la formazione di legami crociati tra le proteine. La soluzione di fissativo è sostituita con saccarosio 20% in PBS 1X. Gli embrioni sono incubati in questa soluzione 1-3 ore a R.T. in agitazione oppure O/N a 4°C, lasciando la falcon in posizione verticale. Il saccarosio permea i tessuti ed ha funzione crioprotettiva.

2.2.3.2.2

_{Inclusione degli embrioni in resina OCT o “Tissue-Tek”}

Gli embrioni sono quindi inclusi in una miscela a basso punto di congelamento, costituita da glicoli solubili in acqua e resine, detta OCT o “Tissue-Tek”.

Si tolgono gli embrioni dalla soluzione disidratante e si dispongono in numero di circa 8-10 sul fondo di una vaschetta di plastica, allineati tra di loro e con le teste rivolte tutte nella stessa direzione. E' importante rimuovere tutto il saccarosio residuo, usando pasteur di vetro dotate di “tettarelle”, in quanto potrebbe favorire il verificarsi di rotture durante la fase di taglio al criostato.

Gli embrioni vengono ricoperti con la resina e le vaschette contenenti gli embrioni inclusi in OCT sono poste in un bagnetto di Etanolo a -80°C per circa 15 minuti, in modo che la resina solidifichi in brevissimo tempo, quindi conservate a -80°C fino al giorno del taglio.

2.2.3.2.3

_{Sezioni al criostato}

I blocchetti con gli embrioni inclusi in OCT sono tagliati nella regione dell'occhio utilizzando il criostato Leica C1850, in sezioni trasversali dello spessore di 12 µm. La tecnica di inclusione in OCT e taglio al criostato garantisce un livello di conservazione della morfologia tissutale inferiore rispetto all'inclusione in paraffina seguita da taglio al microtomo, tuttavia presenta il vantaggio di essere molto più rapida. Le sezioni tagliate al criostato sono disposte su vetrini portaoggetto SuperFrost, sulla cui superficie è posta una carica positiva permanente che attrae elettrostaticamente le sezioni di tessuto, permettendone l'adesione senza la necessità di adesivi speciali. I vetrini con le sezioni sono conservati a -80°C fino al momento dell’uso.

Soluzioni

Soluzione di PARAFORMALDEIDE (PFA) al 20%:

La soluzione di paraformaldeide al 20% deve essere preparata sotto cappa chimica, come spiegato di seguito:

1) Riscaldare 80ml di acqua distillata (milliQ) rigorosamente a 50°C in un becker contenente un'ansa magnetica e un termometro per monitorare la temperatura (che non deve mai superare i 50°C).

63 2) Aggiungere 20µl di NaOH 10N (un µl ogni grammo di paraformaldeide).

3) Aggiungere lentamente 20 grammi di paraformaldeide.

4) Mescolare la soluzione fino a che non appare chiara: questo non dovrebbe richiedere più di 30-60 minuti.

5) Filtrare la soluzione attraverso una carta cromatografica Whatman 3MM.

6) Aggiungere acqua distillata fino ad un volume finale di 100ml. Questa soluzione di paraformaldeide al 20% (=PFA 5X) è stabile fino ad un mese a 4°C.

Nota: troppo NaOH o una temperatura troppo elevata inattiva le proprietà fissative della paraformaldeide.

Soluzione di lavoro:

diluire 5 volte con PBS 1X per ottenere paraformaldeide al 4%

utilizzarla immediatamente o conservarla a 4°C per non più di 2-3 giorni.

Soluzione PBS 1X (pH 7.3):

NaCl 130 mM KCl 2,7 mM Na2HPO4 8 mM

KH2PO4 1,4mM

2.2.4

_{IBRIDAZIONE IN SITU SU SEZIONI IN PARAFFINA}

Primo giorno

Preparare le seguenti soluzioni utilizzando, come è norma generale prima dell’ibridazione delle sezioni con la sonda, cilindri graduati di vetro:

• PBT (PBS 1X più tween-20 0,1%)

• glicina 0,5 M in PBT.
DEPARAFFINAZIONE

I vetrini con le sezioni di embrioni sono disposte in un rastrellino di metallo e sottoposte ai seguenti lavaggi di deparaffinazione, in vaschette di vetro. Si prepara un volume di ciascuna soluzione sufficiente a ricoprire completamente i vetrini (almeno 200ml).

1) Due lavaggi in Xilolo 100% di 10 minuti ciascuno; lo Xilolo è tossico per cui almeno questi due lavaggi e il successivo devono essere fatti sotto cappa chimica.

64 2) Due lavaggi in Etanolo al 100% di 5 minuti ciascuno.

3)

Un lavaggio di 5 minutiin Etanolo al 75% in PBS 1X

.

4) Un lavaggio di 5 minutiin Etanolo al 50% in PBS 1X.

5)

Un lavaggio di 5 minutiin Etanolo al 25% in PBS 1X

.

6)

Un lavaggio di 5 minuti in PBS 1X al 100%

.

7) Due lavaggi di 3 minuti ciascuno in PBT a R.T.

8) Trattamento con la proteinasi K che ha lo scopo di degradare le proteine, rendendo il tessuto accessibile alla sonda: disporre su ogni vetrino 200µl di proteinasi K 1 µg/ml in PBT; non coprire con vetrino coprioggetto. Lasciare a R.T. per non più di 10 minuti.

9) Due lavaggi di 5 minuti ciascuno a R.T. in glicina 2mg/ml in PBT: la glicina, essendo un substrato della proteinasi K, ha lo scopo di inibire l’enzima in modo che non continui a degradare le proteine tissutali.

10)Due lavaggi di 3 minuti ciascuno in PBT a R.T.

11)Disporre su ciascun vetrino sotto cappa chimica un ml di paraformaldeide al 4% e incubare per 15 minuti a R.T.

12)Sgocciolare bene i vetrini sotto cappa, quindi fare 3 lavaggi di 3 minuti ciascuno in PBT a R.T. sotto cappa.

Preibridazione

1. Disporre su ciascun vetrino 200µl di Soluzione o Buffer di Ibridazione (“Hybridization Buffer”, HB), non coprire con vetrino coprioggetto. Mettere i vetrini in una scatola con carta “Whatman” umidificata con una soluzione di sali 1X (diluire 10 volte lo stock di sali 10X in acqua mQ) al 50% e formammide; quindi incubare a 65°C per almeno 30 minuti, meglio un’ora.

2. Preparare la sonda antisenso diluendola nella Soluzione di Ibridazione alla concentrazione finale di 0,1-1µg/ml; stimare il volume totale di HB in cui diluire la sonda, sapendo che ne occorrono 200µl per ciascun vetrino (arrotondare il volume per eccesso). Denaturare la sonda, riscaldando la soluzione in cui è disciolta a 80°C per 5 minuti o a 70°C per 10 minuti. Sotto cappa chimica (perché il filtro è imbevuto di formammide), scolare i vetrini dalla Soluzione di Ibridazione e versare a goccia 200µl della soluzione di ibridazione con diluita la sonda, coprire ciascun vetrino con un vetrino coprioggetto precedentemente pulito con Etanolo. Porre i vetrini in incubatore a 65°C O/N, in presenza di due vaschette

65 ripiene di acqua, affinchè possa avvenire l'ibridazione, ovvero l'appaiamento tra la sonda antisenso ed eventuali mRNA presenti nelle sezioni.

3. Preparare 800ml di Soluzione di Lavaggio (“Washing solution”), costituita da formammide 50% + SSC 1X + Tween20 0,1%, e porla in incubatore a 65°C O/N, insieme alla scatola con i vetrini.

Secondo giorno

1) Immergere i vetrini uno alla volta in circa 200ml di Soluzione di Lavaggio, posta in un'apposita vaschetta di vetro, il tempo necessario perché il vetrino coprioggetto si distacchi; disporre i vetrini con le sezioni in un rastrellino (“rack”) di metallo ed effettuare il primo dei lavaggi di post-ibridazione, 15 minuti a 65°C nella Soluzione di Lavaggio; aliquotare la rimanente Soluzione di Lavaggio in tre vaschette di vetro e disporle nell'incubatore a 65°C, in modo che la soluzione si riscaldi. I lavaggi post-ibridazione hanno lo scopo di rimuovere dalle sezioni la sonda non ibridata o legatasi all'mRNA in maniera aspecifica, che potrebbe dare origine a segnale di fondo.

2) Seguono 3 lavaggi di 30 minuti ciascuno a 65°C nella Soluzione di Lavaggio preriscaldata.

3) Preparare 1,8 litri di MABT (MAB 1X + Tween 20 0,1%) ed effettuare 2 lavaggi di 30 minuti ciascuno dei vetrini in MABT (circa 200ml di MABT per ogni lavaggio) a temperatura ambiente; il primo lavaggio deve essere fatto sotto cappa chimica, per eliminare eventuali residui della Soluzione di Lavaggio contenente formammide.

4) Preparare un volume opportuno di Soluzione di Bloccaggio (“Blocking Solution”), la quale è costituita dal 2% di “Reagente di bloccaggio” (lo stock è una soluzione al 10%), il 20% di “Siero di agnello inattivato al calore” in MABT. Nel calcolo del volume finale, tenere conto che occorre un ml per vetrino di Soluzione di Bloccaggio per bloccare i siti antigenici aspecifici prima del trattamento con anticorpo e, in un secondo momento, 200µl per vetrino per diluire l’anticorpo. Arrotondare il volume per eccesso.

5) Dopo aver scolato i vetrini versare un ml di Soluzione di Bloccaggio su ogni vetrino. Disporre i vetrini in una scatola, precedentemente pulita con alcool, ricoperta sul fondo da striscioline di carta assorbente “Whatman”, che sarà imbevuta in un secondo momento. Non coprire con il vetrino coprioggetto e lasciare in incubazione a R.T. per almeno un’ora.

66 Soluzione di Bloccaggio sufficiente, tenendo conto che occorrono 200µl di Soluzione di Bloccaggio contenente anticorpo per ogni vetrino: centrifugare l’anticorpo a 3000 rpm per 5 minuti, quindi diluire l' anticorpo anti-DIG nella Soluzione di Bloccaggio, avendo cura di non prendere il corpuscolo che è precipitato. Miscelare la soluzione in modo uniforme, picchiettando la “falcon” in cui è stata preparata la soluzione, quindi depositarne 200µl su ogni vetrino. Coprire con vetrino coprioggetto, riporre i vetrini in camera umida con carta “Whatman” imbevuta in PBS 1X ed incubare a R.T. O/N.

Terzo giorno

1. Eliminare il vetrino coprioggetto, immergendo i vetrini in MABT. Quindi effettuare 5 lavaggi di 30 minuti ciascuno in MABT a R.T., per eliminare l’anticorpo che non si è legato.

2. Sia per la rivelazione con il FAST-RED che per la rivelazione NBT-BCIP, seguono 2 lavaggi di 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente nel tampone di reazione cromogenica della fosfatasi alcalina (“AP-Buffer” o “staining buffer minus NBT-BCIP”), così costituito:

per 500 ml: a. 10ml di NaCl 5M b. 25ml di MgCl2 1M c. 50ml Tris-HCl 1M pH 9.5 d. 5ml Tween 10% e. 250mg Tetramisole

3. A questo punto, il procedimento cambia a seconda che si proceda con una rivelazione mediante FAST-RED o NBT-BCIP. E' preferibile eseguire i passaggi successivi in semi-oscurità.

Per una rivelazione mediante FAST-RED occorre prendere una pasticca (che basta per 10 vetrini) di FAST-RED con una pinzetta, metterla in una provetta Eppendorf da 2ml, ricoperta di stagnola e lasciarla per 30 minuti a R.T. al buio. Quindi aggiungere 2ml di Tris-HCl pH 8.2 0.1M e vortexare per 2 minuti. Fare uno spin di 1 minuto a 12000 rpm. Trasferire il sopranatante su una nuova provetta Eppendorf ricoperta da stagnola. Quindi disporre su ciascun vetrino 30µl di FAST-RED diluito in Tris-HCl, coprire con un vetrino coprioggetto e lasciare i vetrini a R.T. in camera umidificata con PBS 1X. Usare una scatola ricoperta di carta stagnola e far progredire la reazione al buio. Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza dopo mezz’ora per controllare l'intensità del segnale. Monitorare costantemente

67 la progressione della rivelazione.

Se invece si procede con il metodo NBT-BCIP, preparare una soluzione di “staining buffer” e NBT-BCIP, in un volume da stabilirsi in base al numero di vetrini, tenendo conto che per ogni vetrino occorrono (200-300)µl di soluzione. Diluire 18µl di substrato della fosfatasi alcalina NBT-BCIP (stock liquido della Roche) per ogni ml di “staining buffer”. Quindi depositare 200 (o 300)µl della soluzione di rivelazione su ciascun vetrino, coprire con un vetrino coprioggetto o con un pezzo di parafilm tagliato a misura di coprioggetto ed incubare in camera umida ricoperta da carta stagnola. La velocità della reazione di rivelazione può essere modulata facendo variare la temperatura, lasciando cioè i vetrini a R.T., a 14°C o a 4°C.

4. Al momento opportuno, bloccare la reazione, effettuando 2 lavaggi di 5 minuti ciascuno in PBS 1X (nel primo lavaggio, far staccare i vetrini coprioggetto). Quindi, disporre su ciascun vetrino 200µl del colorante nucleare Hoecst, diluito 1:1000 in PBS 1X (1 µl di Hoecst+ 1 ml di PBS 1X per 5 vetrini, in un’Eppendorf coperta con stagnola; vortexare); coprire con vetrino coprioggetto e lasciare in incubazione per almeno 8 minuti. Quindi verificare al microscopio che la colorazione sia avvenuta. In caso positivo, montare i vetrini, facendo 3 lavaggi in PBS 1X di 5 minuti ciascuno (il primo serve per distaccare il vetrino coprioggetto); quindi asciugare bene, versare 3 gocce di montante acquoso Polymount al centro di ciascun vetrino e coprire con un vetrino coprioggetto, precedentemente pulito con Etanolo assoluto, cercando di evitare che si formino bolle sulle sezioni. Lasciar asciugare a R.T., in camera non umida. Osservare al microscopio l’avvenuta ibridazione ed acquisire le immagini. Conservare i vetrini nella loro scatola a 4°C nel caso di rivelazione mediante FAST-RED o a temperatura ambiente nel caso di rivelazione NBT-BCIP.

2.2.5

_{IBRIDAZIONE IN SITU SU SEZIONI AL CRIOSTATO}

1) Recuperare i vetrini con le sezioni conservati a -80° C e lasciarli scongelare, tenendoli a R.T. per circa 1 ora.

2) Nel frattempo, diluire la sonda nella Soluzione di Ibridazione fino ad ottenere una concentrazione finale della sonda di 0,1-1ng/µl.

3) Denaturare la sonda opportunamente diluita per 10 minuti a 65°C. Vortexare e fare uno spin. 4) Aggiungere 140µl di Soluzione di Ibridazione contenente la sonda su ciascun vetrino e

68 5) Disporre i vetrini in una camera umida contenente carta assorbente “Whatmann” 3MM

imbevuta con Sali 1X + 50% di formammide.

6) Porre i vetrini disposti nella camera umida in incubatore, alla temperatura di 65°C e lasciarli O/N per far avvenire l’ibridazione.

7) Preparare la Soluzione di Lavaggio (“washing buffer”) costituita da formammide 50% + SSC 1X + Tween20 0,1%, e lasciarla O/N a 65°C, assieme alla scatola contenente i vetrini.

I passaggi del “secondo giorno” e del “terzo giorno” sono del tutto identici all'ibridazione

in situ su sezioni in paraffina (vedi sopra).

Soluzioni per ibridazione in situ

Sali 10x (1 lt.) SSC 20X MAB

NaCl 114 g NaCl 3M Acido maleico 100 mM Tris HCl 14,04 g Na citrato 0.3M NaCl 150 mM pH 7,5 Tris Base 1,34 g MAB

NaH2PO4 2H2O 7,8 g NaH2PO4 7,1 g EDTA 0,5 M 100 ml Soluzione di “blocking” Triton X-100 0,1%

Siero di agnello (Lamb serum) 5% PBS 1X, pH 7.3

2.2.6

_{ACQUISIZIONE DI IMMAGINI AL MICROSCOPIO E SUCCESSIVA}

ELABORAZIONE

Le sezioni su vetrino ottenute sono state analizzate con un microscopio Nikon Eclipse 600, dotato di obbiettivi 4X, 10X, 20X e 40X. Le osservazioni in luce bianca (es. ibridazioni in situ rivelate con substrato della fosfatasi alcalina NBT-BCIP) sono state effettuate contrastando i preparati con il dicroismo circolare. Le osservazioni in fluorescenza sono state effettuate utilizzando blocchi ottici con spettri di eccitazione-emissione standard per i tre tipi di

fluorocromo usati: rodamina e Cy3 (luce in emissione rossa), fluoresceina e Oregon green (luce in emissione verde) e DAPI (luce in emissione blu; questo è stato utilizzato esclusivamente per la rivelazione dei nuclei cellulari con fluorocromo Hoechst).

Le immagini sono state acquisite con fotocamera digitale Photometrix, modello “Cool Snap”

(dotata di sensore CCD a colori). I pannelli delle figure mostrate nella tesi sono stati costruiti utilizzando i programmi Adobe Photoshop e Microsoft PowerPoint.

69

2.3

_{Colture cellulari}

2.3.1

_{LINEA CELLULARE E CONDIZIONI DI COLTURA}

Per gli esperimenti di trasfezione abbiamo utilizzato la linea cellulare HN9.10e, costituita dalla fusione somatica di cellule ippocampali embrionali di topo e cellule di neuroblastoma murino. Le cellule sono coltivate nel mezzo F12 a cui si aggiunge il 10% del volume totale di siero bovino fetale (FBS), 2 mM di L-glutamina, 100 IU/ml di penicillina e 100 µg/ml di streptomicina, per avere un terreno completo. Le cellule sono tenute in incubatore a 37°C e al 5% di CO2, in piastre da 10 cm o

60mm. Prima che raggiungano la confluenza, il mezzo è estratto, utilizzando una pasteur di vetro sterile e un aspiratore; quindi le cellule sono lavate in un tampone fosfato salino PBS, in modo da rimuovere il terreno di coltura residuo: il siero del mezzo, infatti, inibirebbe la tripsina, nel passaggio successivo. Aspirare il mezzo di lavaggio e staccare le cellule dalla piastra, aggiungendo la tripsina e lasciandola agire per circa 10 minuti a 37°C. Controllare che le cellule si siano distaccate al microscopio. Aggiungere 4-5 ml di PBS e recuperare la sospensione in un tubo da 15ml quindi centrifugare per 5 min a 2000 RPM a R.T. Eliminare il sopranatante e risospendere le cellule in un volume opportuno di mezzo fresco per piastrarle, a seconda delle esigenze, in una nuova piastra (da 100 o 60mm) o in una “multi-wells” da 24 o 96 pozzetti.

2.3.2

_{CONGELAMENTO DELLE CELLULE}

Per congelare le cellule è necessario preparare un tubino da congelamento costituito da: 0.45ml di mezzo completo (finale 45%)

0.45ml di FBS 10% (finale 45%) 0.10ml di DMSO (finale 10%)

Per ciascun tubo da 1ml si congelano circa 5X106 cellule. Le cellule a confluenza sono dapprima staccate dalla piastra, quindi centrifugate; a questo punto, è eliminato il sopranatante e le cellule sono risospese nel terreno di congelamento, quindi la sospensione cellulare è suddivisa in aliquote in un numero opportuno di tubini da congelamento. Le cellule sono quindi congelate a -80°C e in seguito poste in azoto liquido, avendo cura che il congelamento avvenga progressivamente (teoricamente circa 1°C al minuto fino a -20°C).

70

2.3.3

_{DEPRIVAZIONE DEL SIERO E TRASFEZIONE DEI COSTRUTTI}

Le cellule sono indotte a differenziare, emettendo i prolungamenti cellulari, mediante deprivazione da siero: le cellule sono mantenute in un mezzo contenente FBS all'1% per circa una settimana cambiando il mezzo stesso ogni 48 ore mantenendone il 50% già condizionato. Quindi, sono trasfettate con i costrutti di interesse. La trasfezione consiste nell'introduzione di molecole di DNA esogeno in cellule riceventi mediante metodi fisici o chimici. Noi abbiamo utilizzato la lipofectamina (lipofectamine2000, Invitrogen), una molecola formata da una coda policationica a cui si lega il DNA (molecola anionica per la presenza di gruppi fosfato carichi negativamente) e da una porzione lipidica che facilita l'ingresso del complesso DNA-lipofectamina nella cellula, attraverso la membrana cellulare. La trasfezione consente un'espressione transiente del DNA introdotto nella cellula ricevente. Il protocollo adottato è il seguente:

1) Staccare le cellule con tripsina per 10 minuti.

2) Piastrare 4x104 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti con FBS 1% in 500 ml di mezzo di coltura DMEM-F12 (Gibco). In ciascun pozzetto è stato posto un vetrino sterile precedentemente trattato con poly-D-lysina.

3) Dopo 48 ore aggiungere 500 ml di mezzo fresco FBS 1%.

4) Dopo altre 48 ore eliminare 500 ml di mezzo e aggiungere 500 ml di mezzo fresco FBS 1%.

5) Dopo 48-72 ore le cellule hanno differenziato il neurite; a questo punto si procede con la trasfezione.

6) Eliminare tutto il mezzo* (che mantengo in incubatore) e aggiungere 400 µl di mezzo OPTIMEM (Gibco).

7) Preparare la mix per la trasfezione; per ogni pozzetto: (50 µl di OPTIMEM + 3 µl Lipofectamine2000) + (50 µl di OPTIMEM +0,8 µg DNA) volume totale 100µl. Lasciare incubare la miscela 20 minuti a R.T.

8) Poi mettere la mix sulle cellule e incubare 2-3 ore in incubatore.

9) Eliminare tutto e aggiungere 500 µl del mezzo precedentemente eliminato* che era stato mantenuto in incubatore + 500 µl di mezzo fresco FBS 1%.