KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
Analizin÷s ir toksikologin÷s chemijos katedra
Ingrida Mažeikait÷
FENOLINIŲ RŪGŠČIŲ IR FENILPROPANOIDŲ NUSTATYMAS
PROPOLYJE
Magistro darbas
Mokslinis vadovas: doc. Liudas Ivanauskas
Recenzavo: doc. K. Ramanauskien÷
KAUNAS
2008
Turinys
1. Įvadas...3
1.1. Temos aktualumas...3
1.2. Darbo tikslas...5
1.3. Darbo uždaviniai...6
1.4. Darbo praktin÷ reikšm÷...6
2. Literatūros apžvalga...6
2.1. Propolio istoriniai duomenys...6
2.2. Propolio prigimtis ir paskirtis...8
2.3. Fizikin÷s propolio savyb÷s, reikalavimai bičių pikiui...8
2.4. Chemin÷ propolio sud÷tis ir biologinis veikimas...9
2.5. Propolio panaudojimas medicinoje...13
2.6. Propolio tyrimų metodai...14
3. Eksperimentin÷ dalis...17
3.1. Tyrimo objektai...17
3.2. Tyrimo metodas...18
3.3. Tyrimo eiga...19
3.4. Tyrimo rezultatai ir jų aptarimas...27
Išvados...33
Literatūros sąrašas...34
Summary...37
1. Įvadas
1.1. Temos aktualumas
Propolis yra vienas iš nedaugelio natūralių vaistų, kuris plačiai vartojamas jau daugelį metų. Propolio preparatuose esančios biologiškai aktyvios medžiagos yra artimesn÷s žmogaus organizmui už sintetinius vaistus, tod÷l lengviau pasisavinamos, rečiau sukelia nepageidaujamą poveikį. Yra sukurta metodikų ir technologijų gydomiesiems preparatams gaminti [38]. Dabar propolis bei iš jo pagaminti preparatai vartojami daugelio ligų gydymui bei profilaktikai, nes turi antibakterinį, antivirusinį, anestezuojantį, imunitetą stiprinantį poveikį, veikia grybelius, slopina uždegimą [2,27].
Pastaraisiais dešimtmečiais ypač susidom÷ta propolio chemine sud÷timi. Tyrimų duomenys rodo, jog ji tiesiogiai priklauso nuo medžių ir augalų, iš kurių bit÷s renka medžiagas propoliui. Naudojant šiuolaikinius analiz÷s metodus, t. y. dujų chromatografiją - masių spektrometriją (DC-MS), efektyviąją skysčių chromatografiją (ESC), įvairiose pasaulio šalyse (Turkijoje, Egipte, Brazilijoje, Rusijoje, Šiaur÷s Amerikoje) tiriami surinkti propolio pavyzdžiai. Identifikuota daugiau kaip 200 cheminių junginių, iš kurių daugiau kaip 100 yra kiekviename pavyzdyje [27]. Tačiau skirtinguose propolio pavyzdžiuose nustatoma nevienoda veikliųjų medžiagų sud÷tis bei jų kiekiai – vieni junginiai randami beveik visuose propolio pavyzdžiuose, o kiti junginiai randami tik keliuose pavyzdžiuose, rinktuose iš tam tikros rūšies augalų [23].
Intensyviai tiriama ir Europoje surinkto propolio chemin÷ sud÷tis. Šiame regione bit÷s medžiagas propoliui dažniausiai renka nuo tuopų, beržų, kaštonų, alksnių, pušų [20,27]. Tiriant propolio etanolinius ekstraktus, dažnai randamos šios cheminių junginių grup÷s: fenoliniai junginiai, kurie sudaro daugiau nei 50 proc. propolio kiekio (f1avonoidai, fenolin÷s rūgštys ir jų esteriai); alifatin÷s, aromatin÷s rūgštys ir jų esteriai; terpenoidai [2,19], sud÷tingi eteriai, terpenai (bisabololas, pferostilbenas, fenolino trigliceroidai), organin÷s rūgštys (benzoin÷, vanilin÷), vanilino ir izovanilino aldehidai, betulenas, betulenolas ir kt. [1]. Bičių pikis yra vienintel÷ natūralios kilm÷s medžiaga, kurioje randamas toks platus kiekis polifenolinių junginių. Be to, propolio polifenolinių junginių nereikia atskirti ir koncentruoti, nes jie natūraliai egzistuoja koncentruotose formose. Nustatyta, kad pagrindin÷s farmakologiškai aktyvios propolio medžiagos yra flavonoidai ir fenolin÷s rūgštys bei jų esteriai. Vis d÷lto, nors ir nustatyta daug propolio polifenolinių junginių, dar ne visi junginiai atrasti. Mokslininkai pasteb÷jo, kad šių junginių poveikis n÷ra priskiriamas atskiram junginiui ir yra sinergistinis. Pastaraisiais metais
koronarine širdies liga, insultu bei v÷žiu [12], tod÷l fenolinių rūgščių išskyrimo ir nustatymo metodikų kūrimas ir tobulinimas palengvintų išsamesnius tyrimus, jų taikymą fitopreparatų gamyboje.
Lietuvoje propolis ir iš jo pagamintas propolio etanolinis ekstraktas bei kitos vaistin÷s formos vartojami gydymui ir profilaktikai, tačiau iki šiol dar nebuvo taip plačiai tirta jo chemin÷ sud÷tis bei nustatin÷jamos fenolin÷s rūgštys ir fenilpropanoidai. Lietuvoje surinkto propolio chemin÷s sud÷ties įvertinimui ir kokybiniam nustatymui naudojome efektyviąją skysčių chromatografiją (ESC).
1.2. Darbo tikslas
Darbo tikslas – efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ištirti Lietuvoje surinktų propolio pavyzdžių cheminę sud÷tį, kiekybiškai ir kokybiškai įvertinti šias fenolines rūgštis ir fenilpropanoidus: chlorogeno rūgštį, cinamono rūgštį, galo rūgštį, ferulo rūgštį, kavos rūgštį, kumaro rūgštį, protokatecho (3,4-dihidroksibenzoinę) rūgštį, rozmarino rūgštį, vaniliną ir vanilino rūgštį. Analizuotų junginių struktūrin÷s formul÷s pavaizduotos 1 pav.
1 pav. Analizuotų fenolinių rūgščių ir fenilpropanoidų struktūrin÷s formul÷s
1 - protokatecho rūgštis, 2 - kavos rūgštis, 3 - ferulo rūgštis, 4 - kumaro rūgštis, 5 - cinamono rūgštis, 6 - vanilino rūgštis, 7 - vanilinas, 8 - rozmarino rūgštis, 9 - galo rūgštis, 10 - chlorogeno rūgštis
1.3. Darbo uždaviniai
1. Skirtinguose Lietuvos regionuose surinkti propolio pavyzdžius, atitinkančius farmakop÷jos reikalavimus ir paruošti tyrimo objektus pasirinktam metodui.
2. Išstudijuoti literatūros šaltinius ir parinkti tinkamą tyrimo analiz÷s metodą.
3. Atlikti tyrimus paprastos ir greitos atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos optimizavimui ir įteisinimui.
4. Įteisinto metodo pagalba įvertinti propolio sud÷tį kokybiškai ir kiekybiškai. 5. Atlikus praktinę tyrimo dalį, rezultatus įvertinti statistiškai.
6. Pateikti išsamias tyrimo išvadas ir pasiūlymus.
1.4. Darbo praktin÷ reikšm÷
Fenolinių junginių nustatymas svarbus tiek jų apibūdinimui vaistuose, tiek efektyvesniam ir platesniam augalų panaudojimui. Įteisintų tyrimo metodikų vystymas šių junginių nustatymui (kokybiniam ir kiekybiniam žaliavų tyrimui) yra ypač svarbus augalinių vaistų, naudojamų klinikiniuose tyrimuose, standartizacijai ir kokyb÷s kontrolei bei augalinių vaistinių preparatų efektyvumo, saugumo ir kokyb÷s kontrolei.
2. Literatūros apžvalga
2.1. Propolio istoriniai duomenys
Propolis yra tarptautinis, plačiai vartojamas pavadinimas. Pats žodis „propolis“ yra kilęs iš graikų kalbos (pro – prieš, polis – miestas), kuris reiškia „stovintysis miesto priešakyje ir pirmasis atremiantis atakas“ [4,36]. „Miesto sargo“ apibūdinimas labai tinka, nes propolis užima pagrindinę vietą avilyje apsaugodamas bites nuo išorinių veiksnių bei infekcijos. Propolis saugo bičių ‘miestą’ savo ‘imunine sistema’. Šių dienų žmogui toks veikimas labai aktualus, nes jo pačio imunin÷ sistema vis sunkiau atsilaiko prieš tiek daug šiuolaikinių ligų.
Pasak istorinių šaltinių, pirmieji propolį panaudojo egiptiečiai. Egiptiečiams bit÷s tur÷jo religinę reikšmę, jos buvo drąsos bei narsos simbolis. Įvairias propolio formas egiptiečiai naudojo beveik visų ligų gydymui, taip pat ir mumifikavimo procese - jie ištirpindavo visą avilį
kartu su jame esančiu medum, vašku ir propoliu ir šiuo mišiniu sutepdavo tvarsčius. Egiptiečiai, šumerai, babiloniečiai ir asirai naudojo ir kitą mumifikavimo metodą – mirusiųjų kūnus panardindavo į dideles statines medaus ir jas sandariai užklijuodavo vašku. Graikų užkariautojas Aleksandras Didysis taip pat buvo palaidotas šiuo būdu [7,40]. Jo mokytojas Aristotelis (apie 350 m.p.k.) buvo pirmasis, tiksliai apibūdinęs propolį kaip medžiagą, ją išstudijavo ir plačiai apraš÷ [47].
Propolis buvo vartojamas ne tik liaudies medicinoje, bet ir kitiems tikslams. Pavyzdžiui, Egipte be mumifikavimo, pikio sakus naudojo smuiko lakui gaminti, sodininkyst÷je – sodo tepalui gaminti [1].
Graikų gydytojas Hipokratas (460-377 m.p.k.) pasteb÷jo gydomąsias propolio savybes ir skirdavo jį esant įvairiems susirgimams, žaizdoms, gyd÷ vidines ir išorines opas, „nepagydomas ligas“.
Rom÷nai propolį vadino stebuklinguoju vaistu, o Pl÷nijus teig÷, kad propolis gydo net tas žaizdas, kurios yra beviltiškos [4,36].
Medicininis propolio naudojimas tęs÷si ir po senųjų civilizacijų. Arabų gydytojas Avicena (980-1037) pasak÷, kad propolis‚ išstumia str÷l÷s galiuką ar dyglius, įstrigusius odoje, išvalo ir minkština ją‘. Propolis buvo minimas gruzinų medicininiuose tekstuose (iš Kaukazo regiono), parašytuose 1100-1400 metais (Debuyser‘as, 1984). Pietų Amerikos inkai 1500-aisiais propoliu gyd÷ uždegimus lydimus karščiavimo (Asis, 1989) [6].
Anglų kalbos tekstuose propolį 1393 metais pirmą kartą apraš÷ John‘as Trevisa, prancūzų kalbos tekstuose – Prancūzijos karalių chirurgas Ambroise‘as Paré‘as 1500-aisiais (Debuyser‘as, 1984) [6].
Europoje pirmasis propoliu susidom÷jo John‘as Herard‘as „Augalų istorijoje“ 1579 metais. Čia propolis buvo apibūdintas kaip preparatas, greitai ir efektyviai gydantis daugelį būklių [7].
Apiterapija buvo plačiai naudojama iki antibiotikų atsiradimo 1940-aisiais.
Per daugelį metų atlikti empiriniai propolio steb÷jimai moksliškai buvo įvertinti tik per pastaruosius 40-50 metų [1]. Iš 900 propolio mokslinių straipsnių, paskelbtų iki 1999 metų, 269-iuose iš jų aprašyta propolio sud÷tis, 458-269-iuose – jo savyb÷s, 337-269-iuose – indikacijos, 25-269-iuose – kontraindikacijos ir 15-oje – vartojimo būdai [43].
2.2. Propolio prigimtis ir paskirtis
Bičių pikis, arba propolis, bičių klijai,- biologiškai aktyvi, sakinga medžiaga, kurią bit÷s darbinink÷s renka iš medžių lipnių pumpurų, jaunų šakelių lapų, ūglių, augalų žiedų nektaro. Viena bičių šeima per dieną į avilį atneša 1 g pikio, o per metus - iki 150-200 g. Specializuojantis bičių pikio gavyboje, galima surinkti ir daugiau. Lietuvos bitininkai surenka jo palyginti nedaug. Pikyje yra įvairių augalų dervų arba balzamų, kitų aromatinių medžiagų. Šiomis medžiagomis bit÷s, sumaišiusios jas su savo seil÷mis, vašku, nektaru ir žiedadulk÷mis užklijuoja avilio plyšius, pritvirtina ir užtraukia korius, apklijuoja svetimkūnius (užbalzamuoja). Taip bit÷s apsirūpina, kad avilys v÷dintųsi, išvengia produktų gedimo, užkerta kelią ligoms kilti bei plisti, aromatizuoja avilį [38].
Kai saul÷s spinduliai įšildo avilį, esantis avilyje bičių pikis išskiria lakiąsias eterines medžiagas, kurioms būdingos antimikrobin÷s savyb÷s, tod÷l jos gerai dezinfekuoja avilį. Tai padeda bit÷ms apsisaugoti nuo invazinių ligų [1].
2.3. Fizikin÷s propolio savyb÷s
Bičių pikis yra sakinga, augalin÷s ir gyvulin÷s kilm÷s medžiaga, turi stiprų, bet malonų aromatą ir karčiai aštrų skonį.
Jo spalva – nuo gelsvos iki tamsiai rudos, raudonai rudos, pilkos ar žalsvos. Kuo pikis senesnis, tuo spalva tamsesn÷ [39].
Propolio gerai tirpsta organiniuose tirpikliuose – spirite ir eteryje, blogai – vandenyje (karštame vandenyje ištirpsta tik 5%). 15oC temperatūroje pikis tampa tamprus ir kietas, o pašildytas iki 30oC – minkštas ir lipnus [1].
1 lentel÷. Reikalavimai bičių pikio kokybei
Kontroliuojami kokyb÷s
rodikliai Rezultatai Metodai nustatymui
1. Savyb÷s
1.1. Išvaizda Lazdel÷s, gabal÷liai, kruopel÷s Organoleptinis 1.2. Spalva Rudai pilka, gelsvai ruda, šokolado Organoleptinis 1.3. Kvapas Būdingas dervai, medui, pušų, topolio Organoleptinis
1.4. Skonis Kartus, silpnai deginantis Organoleptinis
1.5. Konsistencija Klampi (36-38°C), kieta, trapi (mažiau kaip 15°C)
Organoleptinis 1.6. Tirpumas Sunkiai tirpsta vandenyje ir aliejuose, gerai
– etanolyje, eteryje
Ph. Eur. 01/2005, 1.2
2. Tapatyb÷
2.1. Reakcija A Teigiama (polifenoliai) FS 2:2001
2.2. Reakcija B Teigiama (flavonoidai) FS 2:2001
3. Fenolinių junginių kiekis
Ne mažiau kaip 30 % FS 2:2001
4. Vaškų kiekis Ne daugiau kaip 18 % FS 2:2001
5. Mechanin÷s priemaišos
Neturi būti FS 2:2001
6. Jodo skaičius Ne mažesnis kaip 35 FS 2:2001
7. Oksidacijos greičio rodiklis
Ne daugiau kaip 20 s FS 2:2001
8. Mikrobinis
užterštumas
Ne daugiau kaip 104 mikroorganizmai. Negali būti E. Coli, Salmonella
Ph. Eur. 01/2005 2.6.12, 2.6.13
2.4. Chemin÷ propolio sud÷tis ir biologinis veikimas
Įvairių studijų ir tyrimų duomenimis, propolio sud÷tyje gali pasitaikyti iki 300 skirtingų komponentų [7]. Propolio chemin÷ sud÷tis nepastovi. Ji priklauso nuo bičių šeimos vystymosi laiko, iš kokių augalų (500 metrų plote), kokiu laiku, kokioje geografin÷je zonoje rinktas pikis [20,27]. Veiksmingas gydomąsias savybes propolis išsaugo net iki 10 metų. Dauguma propolio chemin÷s sud÷ties tyrimų buvo atlikti nežinant augalų rūšies, iš kurių jis buvo rinktas, bei augalo pus÷s, nuo kurios buvo renkamos medžiagos.
Propolyje yra apie 50% augalinio balzamo, iki 30% vaško, apie 10% eterinio ar aromatinio aliejaus, apie 5% žiedadulkių ir apie 5% priemaišų ar atsitiktinių priedų [1,36].
Propolio sud÷tis:
1) Flavonoidai – chrizinas, tektochrizinas, akacetinas, kvercetinas, kemferidas,
ramnocitrinas, galanginas, izalpininas, ermaninas, pektolinaringeninas, pinostrobinas, pinocembrinas, sakuranetinas, izosakuranetinas, pinobanksinas, betuletolis, izoramnetinas, kemferolis, apigeninas, ramnazinas, ramnetinas, alnuzinas, alpinetinas, alnuzitolis ir kt.
Veikimas: antimikrobin÷s [11] ir antimikotin÷s [30] savyb÷s; priešuždegiminis, askorbo
rūgšties (Vitaminas C) aktyvumą didinantis poveikis ir poveikis į kraujagyslių sieneles (stiprina) [3,24]; antioksidacinis, spazmolitinis veikimas [24]; mažina kapiliarų pralaidumą (“vitamino P veikimas”); stabilizuoja kolageną slopindami hialuronidazę; antihemoraginis; in vitro flavanoidai įtakoja enziminį mukopolisacharidų (iš kojų venų) metabolizmą, suteikia bičių vaškui spalvą [5]; veikia citotoksiškai v÷žį [17,29]; veikia prieš Helicobacter pylori bakteriją [14], bakteriostatinis veikimas [32,44]; veikia pel÷sį, veikia prieš blastomicetus [30], in vitro ir išoriškai antimikrobinis ir antimikotinis [30], veikia prieš Candida [31], vietiškai anestezuojantis [30], vietiškai anestezuojantis [30]; gydo skrandžio opas [24]; antihistamininis veikimas [8], veikia prieš Mycobacterium phlei [30], veikia rūgštims atsparius mikroorganizmus; neutralizuoja laisvuosius radikalus, mažina oksidacinį stresą, uždegimą, reguliuoja padid÷jusios imunin÷s sistemos aktyvumą ir normalizuoja angliavandenių apykaitą;
2) Chalkonai – alpintino chalkonas, naringenino chalkonas, pinobanksino chalkonas,
pinocembrino chalkonas, pinostrobino chalkonas, sakuranetino chalkonas, 2,6-dihidroksi-4-metoksichalkonas, 2,4´,6-trihidroksi-4-metoksichalkonas.
3) Aromatin÷s (fenolin÷s) rūgštys ir jų dariniai - benzoin÷ rūgštis, salicilin÷ rūgštis,
4-hidroksibenzoin÷ rūgštis, 4-metoksibenzoin÷ rūgštis, 2-amino-3-metoksibenzoin÷ rūgštis, chlorogeno rūgštis, ferulin÷ rūgštis, izoferulin÷ rūgštis, izopentil ferulatas, metil ferulatas, vanilin÷ rūgštis, rozmarino rūgštis, veratrin÷ rūgštis, gentiso rūgštis, protokatecho rūgštis, galo rūgštis, benzoin÷s rūgšties fenilmetil esteris, salicin÷s rūgšties fenilmetil esteris, trans-p-kumaril benzoatas, trans-koniferil benzoatas.
Veikimas: stiprios antioksidacin÷s savyb÷s, antibakterinis (veikia teigiamus ir
gram-neigiamus mikroorganizmus, Staphylococcus aureus) ir fungicidinis veikimas [44], bakteriostatinis ir baktericidinis veikimas [19], antivirusinis veikimas (in vitro veikia prieš Influenza virusą A/Hong Kong) [21], antimikrobinis veikimas prieš Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia colli, antimikotinis veikimas prieš Mycobacterium phlei, M. smegmatic ir Candida albicans [30]; priešuždegiminis [2] ir vietiškai anestezuojantis [30] veikimas; balzamuojantis ir antiseptinis veikimas; veikia kaip laisvųjų radikalų akceptoriai; agliutinantinis
veikimas (naudinga gydant l÷tai gyjančias žaizdas silpnu propolio ekstraktu), in vivo slopina hemagliutinino gamybą; padeda kaupti kolageną ir elastiną; skatina sveikatos gerinimo procesus, greitina šašo susidarymą ir epitelio regeneraciją; slopinantis poveikis į mutagenezę ir karcinogenezę, veikia citotoksiškai [13].
4) Aldehidai – benzaldehidas, vanilinas, izovanilinas
5) Cinamono rūgštis ir jos dariniai – cinamil alkoholis, cinamono rūgštis, 3,4-dimetoksicinamono rūgštis, o-kumaro rūgštis, p-kumaro rūgštis, p-kumaro rūgšties benzilo esteris, kavos rūgštis, prenil kofeatas, 3-metil-but-2-enil kofeatas, metil kofeatas, hidrokavos rūgštis, cinamono rūgšties metil esteris, cinamono rūgšties etil esteris, cinamiliden-acetatin÷ rūgštis ir kt.
6) Vaškų rūgštys ir jų dariniai – arachidin÷ rūgštis, cerotin÷ rūgštis, laurinin÷ rūgštis,
linolein÷ rūgštis, miristin÷ rūgštis, sorbin÷ rūgštis, stearo rūgštis, palmitin÷ rūgštis, palmitino rūgšties etil esteris ir kt.
7) Alkoholiai, ketonai, fenoliai ir heteroaromatiniai junginiai – ksilitolis, benzilo alkoholis,
heksadekanolio acetatas, ksantoroeolis, kumarinas, skopoletolis, pinosilvinas ir kt.
8) Seskviterpenai ir triterpenų hidrokarbonatai – selenenas, aromadendrenas, kalarenas,
kopaenas, kalamenenas, skvalenas ir kt.
9) Alifatiniai hidrokarbonatai – eikozanas, eikozinas, heneikozanas, trikozanas,
pentakozanas, 1-oktadecenas.
10) Terpenai – geraniolis, nerolidolis, farnezolis, β-bisabololas, 1,8-cineolis, cimenas,
limonenas, pterostilbenas, stirenas, naftalenas, dihidroeudesmolis, klerodano diterpenoidai ir kt.
Veikimas: priešuždegiminis, priešv÷žinis ir antibakterinis veikimas; antidiabetinis veikimas
(nepatvirtinta) [24], padeda prie kv÷pavimo nepakankamumo; antimikrobinis veikimas prieš Bacillus subtilis ir Bacillus cerius, antimikotinis veikimas prieš Mycobacterium phlei ir M. Smegmatis
11) Amino rūgštys – laisvos amino rūgštys sudaro > kaip 1 proc. pikio mas÷s, iš jų 46 proc.
sudaro argininas ir prolinas, taip pat randamas alaninas, asparaginas, cistinas, cisteinas, glicinas, histidinas, hidroksiprolinas, izoleucinas, leucinas, lizinas, metioninas, ornitinas, fenilalaninas, serinas, treoninas, triptofanas, tirozinas, valinas ir kt.
Veikimas: stimuliuoja mitozę ir didina proteinų biosintezę [10]; padeda kaupti kolageną ir
elastiną [10].
12) Mineralai – geležis ir cinkas (dažniausiai randami), manganas, kobaltas, varis, kadmis,
aliuminis, silicis, alavas, švinas, titanas, sidabras, vanadis. Jų kiekiai svyruoja nuo p÷sakų iki 11,6 mkg/100g [1].
Veikimas: dalyvauja baltymų, riebalų angliavandenių balanse, taip pat baltymų sintez÷je,
terminiam balanse, hemopoez÷je, osteogenez÷je, ląstelių dalijimęsi ir imunobiologin÷se reakcijose; varis prisideda prie raudonųjų kraujo kūnelių gamybos ir kraujotakos sistemos, nervų, imunin÷s sistemos ir kaulų formavimosi (Fe, Cu); padeda mažinti cholesterolio kiekį kraujyje (Zn); didina vitamino B1 poveikį (Mn); aktyvina baltųjų kraujo kūnelių fagocitozę, didina
organizmo atsparumą prieš infekcines ligas (Co).
13) Steroliai ir steroidų hidrokarbonatai – cholestrilenas, cholinasterolis, stigmasterolis,
lanosterolis, cholesterolis, β-dihidrofukosterolis.
14) Cukrūs – ribofuranoz÷, fruktoz÷, gliucitolis, guloz÷, taloz÷, sukroz÷,
d-gliukoz÷.
Propolio biologinis veikimas:
Aktyvina makrofagus, skatina citokinus ir slopina v÷žinių ląstelų augimą storojoje žarnoje; agliutinantinis, antialerginis, antibakterinis (vietiškai ir sistemiškai), antibiotinis, antidepresinis veikimas, veikia prieš melancholiją ir liūdesį; antiedeminis, antihemoraginis, antiherpetinis, antioksidacinis, antimikotinis, antimikrobinis, antiparazitinis, antipiretinis, antiproteolitinis, antiseptinis, antivirusinis, balzamuojantis veikimas.
Didina organizmo atsparumą infekcin÷ms ligoms ir proteinų biosintezę; fitoinhibitorius; imunomoduliacinis veikimas; intensyvina fagocitozę.
Mažina: aukštą kraujo spaudimą, aukštą cholesterolio kiekį kraujyje, aukštą akių spaudimą (esant glaukomai), kapiliarų pralaidumą, šalutinius chemo- ir radio- terapijos poveikius; padeda kaupti kolageną ir elastiną; priešv÷žinis (slopina ir veikia citotoksiškai) ir priešuždegiminis veikimas.
Stimuliuoja: žinduolių audinių regeneraciją, mitozę, ląstelinį kv÷pavimą, organizmo atsparumą, interferono gamybą, epitelio, endotelio ir ląstelių membranų regeneraciją; veikia rūgštims atsparius mikroorganizmus.
Veikia prieš: Blastomycetes, dr÷gmę, infekcijas, leukemines ląsteles, Mycobacterium tuberculosis, pel÷sį, prostaglandinus, pūsles, Trichomonas (vaginalis,gallinae, microti); vietiškai anestezuojantis veikimas.
2.5. Propolio panaudojimas medicinoje
Yra atlikta daug tyrimų su propoliu, jie įrodo per 60 skirtingų propolio efektų žmogui [45]. Senov÷je bičių pikis daugiausia vartotas kaip išorinis, gana retai – kaip vidinis vaistas [38]. Šiuolaikin÷je medicinoje dažniausiai naudojami etanoliniai ir aliejiniai bičių pikio tirpalai, taip pat naudojami tepalai, kapsul÷s, tablet÷s, aerozoliai, žvakut÷s ir kt.
Ausų, nosies ir gerkl÷s ligos. Sloga (rinitas) gydomas 20% aliejiniu pikio tirpalu ar 5%
tepalu. Laringitas, tracheitas ir bronchitas gydomi pikio inhaliacijomis su medaus tirpalu. Medicinos mokslų kandidat÷ A. Kočetkova vartojo 20% aliejinį pikio tirpalą su žuvų taukais (1:1 ar 1:2) gerklų tuberkuliozei gydyti. Gydytoja P. Počinkova gyd÷ l÷tinį nosiarykl÷s ir gerkl÷s gleivin÷s uždegimą bičių pikio vandens bei spirito emulsija ir elektroforeze. Gydytojas G. Kačnijus gyd÷ ūminį ir l÷tinį vidurin÷s ausies uždegimą 30% spiritiniu pikio tirpalu. Gydytojas I. Peršakotas panašiai gyd÷ d÷l įvairių priežasčių nusilpusią klausą. Gydytojas I. Matelis su bendradarbiais 3-5% spiritinio bičių pikio tirpalo lašais gyd÷ išorin÷s ausies uždegimą, l÷tinį vidurin÷s ausies uždegimą, d÷l traumos trūkusį ausies būgnelį, l÷tinį gerklų ir gerkl÷s uždegimą, dvokiąją slogą [38].
Plaučių ligos. Vaikų tuberkulioz÷ ir pneumonija aliejiniu bičių pikio tirpalu derinant jį
kartu su antibiotikais gydomi nuo 1964 m., bronchitas – nuo 1966 m.: duodama gerti, purškiama, leidžiama į trach÷ją, o mažesniems vaikams – į trach÷ją pro kateterį. Obstrukcinis bronchitas gydomas 10% vandeniniu tirpalu. Bronchin÷ astma gydoma derinant bičių pikį aerozoliniu pavidalu su bičių pieneliu. Kosulys ir nespecifin÷s kv÷pavimo organų ligos dažniausiai gydomos 10% vandeniniu bičių pikio tirpalu aerozoliniu būdu arba 20% aliejiniu tirpalu injekcijomis [38].
Burnos ertm÷s ligos. 30% spiritiniu propolio tirpalu daugelis stomatologų pridegina
dantenų ir gomurio opas. Parodontoz÷ gydoma pikio tepalo kompresais, profilaktiškai rekomenduojama vartoti dantų pastą su pikio tepalo ar aliejinio tirpalo priemaiša. Gydytojai J. Pisarevas ir M. Dimitrova 6-7% pikio tirpalą vartoja parodontopatijai gydyti elektroforez÷s būdu. [36]. Burnos gleivin÷s išop÷jimas, parodontoz÷, periodontitai, perikoronitai gydomi 20% spiritiniu tirpalu [1].
Virškinimo organų ligos. Skrandžio ir dvylikapiršt÷s žarnos opos, l÷tinis gastritas gydomi
30% spiritiniu ir 20% aliejiniu propolio tirpalais, bičių pikio sviestu. Storosios žarnos uždegimas (kolitas) gydomas bičių pikio spiritiniu tirpalu (1:5). Tulžies pūsl÷s, jos latakų ir kepenų ligos gydomi 20-30% spiritiniu pikio tirpalu, nes aliejinio bičių pikio tirpalo sergantiesiems kepenų ligomis negalima duoti [1].
Odos ligos. Labai plačiai ir efektyviai bičių pikiu gydomos odos ligos, nes pikis mažina
skausmą ir niežulį, stabdo bakterijų bei grybų dauginimąsi, skatina opų gijimą. Grybelin÷s odos ligos gydomos 0,1-2% etanoliniais pikio tirpalais [40]. Gydytoja E. Maurina pikiu gyd÷ furunkulus, egzemą ir hidradenitą. S. Palmbacha 30% spiritiniu bičių pikio tirpalu gydo kojų nuotrynas. 30% spiritiniu propolio tirpalu ir tepalu daugelis mokyklų gydytojų gydo epidermofitiją. Gydytoja V. Bolšakova pikį vartoja dermatozei gydyti, taip pat odos tuberkuliozę. 300 ligonių pikio tepalu s÷kmingai gydyta hiperkeratoz÷. 500 asmenų 10% spiritiniu tirpalu ir 30% tepalu gydytas lizdinis išplikimas. 30-40% tepalu s÷kmingai gydyta rož÷. Rumunų gydytojai pikio tepalu gyd÷ žvynelinę, tačiau pad÷jo ne visiems ligoniams. 10% pikio tepalas vartotas supleiš÷jimams tarpupirščiuose ir kūdikiams apie išangę gydyti, jei liga grybelin÷s kilm÷s. Propoliu taip pat gydoma odos uždegimai bei opos, atsiradę d÷l jonizuojančiojo spinduliavimo, per trumpą laiką išgydomi spindulių sukelti uždegimai bei žaizdos. Gydytojai A. Vasilka ir E. Milka rekomenduoja pikio tepalą profilaktiškai ligoniams, kurie bus švytinami d÷l onkologinių ligų. Lenkijoje aktyvios pikio frakcijos vartojamos piodermijoms gydyti [36]. Austrijoje pikio tepalu ir tinktūra s÷kmingai gydyta nuo Acne simplex ar Acne pustulosa [16]. Įrodytas ir propolio vandeninio tirpalo veikimas į Herpes simplex [18].
Chirurgin÷s ligos. Profesorius N. Atiasovas su kolegom 15% pikio tepalu gyd÷ gilias
nudegimo žaizdas. 30% pikio tepalu bulgarų gydytojai gyd÷ l÷tai gyjančias žaizdas (pooperacines) [38].
Gana svarbi propolio savyb÷ – stimuliuoti imuninę sistemą. Propolis yra specifinių ir nespecifinių faktorių stimuliatorius. Jis pagreitina pirminio imuninio atsako induktyvinę fazę, didina leukocitų aktyvumą. Jame esančios biologiškai aktyvios medžiagos taip pat skatina ir fagosomų susidarymą [25].
2.6. Propolio tyrimų metodai
1) Lietuvoje surinkto propolio chemin÷ sud÷tis buvo tiriama taikant dujų
chromatografiją-masių spektrometriją (DC-MS) [26]. Tai palyginus greitas ir informatyvus
metodas tiriant nevalytus ekstraktus [33].
Tirtas propolis buvo surinktas iš avilių, esančių kaimo vietov÷se toli nuo miškų, tod÷l bit÷s kaip medžiagas jam gaminti rinko balzamus iš pievose ir soduose augančių augalų bei medžių. Tyrimo eiga: propolis iki ekstrakto ruošimo buvo laikomas sausoje tamsioje vietoje. Jo kokyb÷ atitiko farmakop÷jos straipsnio FS 2:2001 reikalavimus. Prieš ekstrakciją propolis buvo
atšaldytas ir susmulkintas. Ekstrakcija atlikta 80 proc. etanoliu (1:10) kambario temperatūroje 24 val. Gautas ekstraktas buvo nufiltruotas. Pagrindinių veikliųjų medžiagų kokybin÷ analiz÷ buvo atlikta dujų chromatografu „Agilent Technologies 6890 N“, turinčiu selektyvų mas÷s detektorių „Agilent 5973 N“. Tyrimo metu švirkštu į dujų chromatografą buvo sušvirkščiama 1,0 µl ekstrakto. Chromatografavimo sąlygos: kolon÷l÷ - stiklo kapiliarin÷, 30 m ilgio, vidinis skersmuo - 0,25 mm; skysta-nejudančioji faz÷ - DB - 5 MS; nešančiosios dujos - argonas, dujų tek÷jimo greitis - 25 cm3/min. Kolon÷l÷s temperatūra - 45°C - 1 min., po to kas minutę temperatūra didinama 30°C iki 130°C; po 3 min. temperatūra didinama po 12°C per min. iki 180°C; v÷liau didinama po 7°C per min. iki 240°C, dar v÷liau - po 12°C per min. iki 300°C ir kolon÷lių temperatūra laikoma 5 min. Temperatūra angoje - 250°C.
Šiuo metodu buvo identifikuota visa eil÷ cheminių junginių, esančių propolyje. Tai terpenoidai (32 junginiai), aromatinių rūgščių esteriai (11 junginių), alifatinių rūgščių esteriai (9 junginiai), sotieji angliavandeniliai (5 junginiai) ir kiti aromatiniai junginiai (11 junginių). Propolio etanoliniame ekstrakte identifikuota nedaug fenolinių junginių. Tirto propolio etanoliniame ekstrakte pagrindin÷s medžiagos yra terpenoidai ir aromatinių bei alifatinių rūgščių esteriai. Tyrimų duomenys rodo, kad propolio sud÷tis yra nepastovi ir tiesiogiai priklauso nuo augalų, iš kurių bit÷s surenka dervas, įvairov÷s.
Daugelio tyr÷jų įrodyta, kad Europoje ir Šiaur÷s Amerikoje pagrindinis dervų šaltinis yra įvairių rūšių tuopos, kurios turi flavonoidų ir kitų fenolinių junginių. Tačiau Lietuvoje surinktame propolyje medžiagų, būdingų „tuopų“ propoliui, nerasta. Atlikta tyrimų, kur įrodyta, jog propolio pavyzdžiuose fenolinių junginių nerandama, arba jų yra labai nedideli kiekiai. Tai būdinga propolio pavyzdžiams, surinktiems šalyse, kur tuopos neauga arba retai auga, pvz., Turkijos regione surinktame propolyje pagrindiniai junginiai buvo diterpenoidai. Propolio pavyzdyje iš Sicilijos bei Brazilijos (2 lentel÷) rasta labai mažai fenolinių junginių (mažiau kaip 1,3 proc.), o pagrindiniai junginiai buvo taip pat diterpeno rūgštys. Egipte, Ismailo provincijoje, surinktame propolyje nebuvo flavonoidų, aromatinių rūgščių ir jų esterių, o pagrindiniai junginiai - triterpenoidai, alifatin÷s rūgštys ir cukrai [26].
2 lentel÷. Pagrindin÷s junginių grup÷s, nustatytos etanoliniuose propolio ekstraktuose (proc.).
Pavyzdys Aromatin÷s rūgštys Fenolinių rūgščių esteriai Flavonoidų aglikonai Di- ir triterpenoidai
Bulgarija 3 24 42 -
Mongolija 4 35 24 -
Albanija 4 53 38 -
Egiptas 47 12 5 18
Brazilija 14 1 10 10
2) Taikant masių spektrometrijos metodą, propolyje esantys junginiai nustatomi struktūriškai, o kiekin÷ analiz÷ atliekama žinant mišinio ir tiriamojo junginio MS spektrus [38].
3) Vandeniniai propolio ekstraktai gali būti tiriami kapiliarine elektroforeze (KE), etanolinis-vandeninis (70:30 v/v) tirpalas - miceline elektrokinetine kapiliarine chromatografija
(MEKC). Metodų selektyvumas skirtingas, bet gauti rezultatai panašūs, medžiagos
identifikuojamos pagal elektroferogramas [15].
4) UV- ir matomos šviesos spektrofotometrija. Spektrofotometrin÷ analiz÷ yra
pakankamai sparti ir pasižymi dideliu atrankamu, santykinai nebrangi ir prieinama aparatūra, pakankamai jautrių metodikų. Fitocheminio tyrimo metu spektrofotometrin÷ analiz÷ naudojama kokyb÷s ir kiekio įvertinimui, taip pat junginių struktūros nustatymui. Dažniausiai naudojamas kalibravimo kreiv÷s metodas [35]. Taip nustatomi flavonai ir flavonoliai, sudaroma kalibracin÷ kreiv÷ pagal kvercetino ir naringenino ekvivalentus [22].
5) Plonasluoksn÷ chromatografija gali būti naudojama žaliavos identifikavimui ir
priemaišų nustatymui. Tai tikslus, paprastas, greitas, nebrangus ir jautrus metodas, tiriant mažus junginių kiekius. Plačiai taikomas fenolinių junginių, polifenolių ir flavanoidų tyrimui [35].
6) Vienos dimensijos branduolinio magnetinio rezonanso (1H BMR) spektroskopija irgi
buvo panaudota propolio sud÷čiai tirti. Identifikuojant struktūrą registruojamas identifikuojamo junginio spektras, iš spektro nustatomi cheminiai poslinkiai, įvertinamas signalų intensyvumas ir gauti duomenys lyginami su literatūros duomenimis [35]. Šis metodas turi pranašumą prieš kitus metodus tuomet, kai propolyje tiriami vaškai ir terpenoidai, tačiau d÷l specifinių reagentų poreikio ir brangios aparatūros vartojimo galimyb÷s ribotos [46].
7) Patikimiausias ir geriausiai pritaikytas, bei plačiausiai naudojamas metodas fenoliniams junginiams augalin÷je žaliavoje nustatyti yra efektyvioji skysčių chromatografija
(ESC). Dažniausiai tyrimai atliekami naudojant atvirkščių fazių chromatografiją. Šiam metodui
būdinga didel÷ skiriamoji geba, didelis efektyvumas, geras atrankamas ir rezultatų atkuriamumas. ESC gali būti naudojama propolio priemaišų nustatymui, kokybiniams ir kiekybiniams tyrimams [28]. Propolis gali būti analizuojamas efektyviąją skysčių chromatografiją taikant su masių spektrofotometrija. ESC naudojama mišinio skirstymui, o masių spektrofotometras – kaip detektorius. Fenoliniams junginiams ir flavonoidams naudojama SC-MS, kurios atmaina ir yra ESC-MS. Didelis metodo privalumas yra trumpas mišinio analiz÷s laikas (nuo 6 minučių) [35].
3. Eksperimentin÷ dalis
3.1. Tyrimo objektai
Tyrimo objektas - iš skirtingų Lietuvos regionų 2007 metų rugpjūčio – spalio m÷nesiais surinktas bičių pikis. Tyrimui buvo surinkta 18 pavyzdžių iš šių vietų:
1) Kelm÷s raj.
2) Pajotijo km., Šakių raj. 2 3) Tyruliai, Radviliškio raj. 4) Luknos km., Švenčionių raj. 5) Varžų km., Ukmerg÷s raj. 6) Mik÷nų km., Utenos raj. 2 7) Mineiškiemio km., Utenos raj. 8) Zatišiaus km., Vilniaus raj. 9) Senieji Trakai, Trakų raj.
10) Boreišūnų km., Švenčionių raj. 2 11) Kreivių km., Šilal÷s raj.
12) Puodžių km., Var÷nos raj. 13) Subačių km., Kupiškio raj. 14) Klaip÷dos raj.
15) Grybienų km., Ignalinos raj. 16) Troškūnų sen., Anykščių raj. 17) Jurbarko raj.
18) Šakių raj.
2 pav. pavaizduotas geografinis tiriamųjų objektų pasiskirstymas. Iš šio geografinio vaizdo matome, kad didžioji dalis tiriamųjų objektų surinkta Aukštaitijos regione – Panev÷žio ir Utenos apskrityse, bei Dzūkijos regione – Vilniaus apskrityje. Kita dalis tiriamųjų objektų surinkta Suvalkijos regione – Marijampol÷s apskrityje, bei Žemaitijos regione – Taurag÷s ir Šiaulių apskrityse. Vienas pavyzdys yra iš Mažosios Lietuvos regiono – Klaip÷dos apskrities. Šis vaizdas palengvins rezultatų apibendrinimą ir bus galima vizualiai įvertinti rezultatų geografinę priklausomybę.
2 pav. Geografinis tiriamųjų objektų pasiskirstymas
V÷liav÷l÷ nurodo tiriamojo objekto kilm÷s vietą, o skaičius – jo eil÷s numerį tyrimo metu.
3.2. Tyrimo metodas
Išstudijavus papildomą literatūrą, buvo nuspręsta šiam tyrimui kaip analiz÷s metodą pasirinkti efektyviąją skysčių chromatografiją (ESC). Metodas pasirinktas d÷l prieinamos aparatūros, patikimumo, didel÷s skiriamosios gebos, didelio efektyvumo, gero atrankamo, rezultatų atkuriamumo bei plataus pritaikymo fenolinių rūgščių ir fenilpropanoidų nustatymui.
Chemin÷s medžiagos.
Metanolis ir etanolis įsigyti iš Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Vokietija). Distiliuotas vanduo, naudojamas tirpalų paruošimui, filtruojamas per 0.45µm porų dydžio membraninį filtrą. Fenolinių rūgščių ir fenilpropanoidų standartai įsigyti iš ChromaDex (Santa Ana, JAV).
Įranga.
Analizei naudojama chromatografin÷ sistema Waters 2690 (Waters, Milford, JAV), su Waters 2487 UV/Vis detektorium ir Waters 996 diodų matricos detektoriumi. Atskyrimui naudojama Hichrom kolon÷l÷ Hypersil H5ODS-150A 150×4.6 mm (Hichrom Ltd., Berkshire, UK) ir prieškolon÷ H5ODS-10C. Duomenys rinkti ir analizuoti personalinio kompiuterio ir programin÷s įrangos Waters Millennium 2000® (Waters Corporation, Milford, JAV) pagalba.
Analiz÷.
Tinkamiausio chromatografinio metodo judri faz÷ sudaryta iš tirpiklio A (metanolio) ir tirpiklio B (0.5% (v/v) acto rūgšties tirpalas vandenyje). Eliucijos gradientas: 1min. - 10% tirpiklio A tirpiklyje B; 28.6min. - 60% tirpiklio A tirpiklyje B; 30min. - 10% tirpiklio A tirpiklyje B. Visi gradientai buvo tiesiniai. T÷km÷s greitis 1ml/min., kolon÷l÷s temperatūra lygi aplinkos, įvedamas kiekis – 0.001ml. Nustatytas UV bangos ilgis 290nm. Išplautos medžiagos nustatytos pagal jų sulaikymo laiką lyginant jį su etalonų sulaikymo laiku. Medžiagų identifikacija taip pat patvirtinta DMD detektoriaus pagalba lyginant su etalonų UV spektrais esant 190-400nm bangų diapazonui.
3.3. Tyrimo eiga
Bandinio ruošimo žingsniai:
1) Bandinio ÷mimas. Bandiniai buvo surinkti iš skirtinguose Lietuvos regionuose esančių avilių.
Surinktas bičių pikis iki ekstrakto ruošimo buvo laikomas sausai, tamsoje 4oC temperatūroje [37]. Jo kokyb÷ atitiko farmakop÷jos straipsnio FS 2:2005 reikalavimus [9]. Mas÷s matavimas: kiekvieno bandinio tyrimui buvo atsverta po 2,5 g.
2) Bandinio pirminis ruošimas (homogenizavimas). Pavyzdžiai buvo šaldomi iki -20oC, susmulkinti ir ekstrahuojami 96 proc. etanoliu 1:10 (1 g propolio paimta 10 ml 96 proc. etanolio) 24 valandas. Gauta suspensija laikoma kambario temperatūroje tamsoje 5 dienas retkarčiais suplakant [37].
3) Tiriamųjų junginių išskyrimas (ekstrakcija). Po 5 dienų pavyzdžiai centrifuguojami 15
4) Valymas (gryninimas). Tada mikstūra šaldoma -20oC temperatūroje 2 valandas ir v÷l centrifuguojama 15 minučių, kad atsiskirtų vaškai ir sakai [37].
5) Tūrio formavimas (praskiedimas). Likutis praskiedžiamas 96 proc. etanoliu iki 25 ml ir
laikomas 4oC temperatūroje tamsoje iki tolimesnio tyrimo etapo [37].
Kiekybinis nustatymas.
Fenolinių rūgščių ir fenilpropanoido kiekyb÷ buvo nustatin÷jama išorinio standarto metodu. Smail÷s plotas panaudotas kiekybiniam nustatymui. Kalibracinio grafiko sudarymui buvo šviežiai paruošti šešių skirtingų koncentracijų standartiniai medžiagų tirpalai metanolyje. Standartiniai tirpalai matuoti tris kartus, gautų chromatogramų aukščiausi taškai buvo lyginami su įvestų medžiagų chromatogramomis. Visi standartiniai tirpalai buvo filtruojami per membraninius filtrus, kurių porų dydis 0.22µm (membraniniai filtrai švirkštams, nailonin÷ membrana, kurios skersmuo 13mm; Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija).
Analiz÷s metodo optimizavimas.
Keli efektyvios skysčių chromatografijos metodai su UV nustatymu buvo prapl÷sti fenolinių rūgščių standartinei analizei. Fenolin÷s rūgštys ir fenilpropanoidas buvo atskiriami naudojant gradientinę eliuciją, judrią fazę sudar÷ vanduo ir metanolis ar vanduo ir acetonitrilas. Reikiamam rūgštingumui pasiekti dažniausiai dedama acto rūgštis ir retai – trifluoracto rūgštis.
Sekantis chromatografinio metodo optimizavimo etapas buvo pasirenkant eliuento sud÷tį. Junginių atskyrimas optimizuotas pasirinktus šiuos optimizavimo kriterijus: skiriamoji geba Rs ne mažesn÷ nei 1,5 ir analiz÷s trukm÷ ne ilgesn÷ kaip 30 min. Chromatografiniam išplovimui, atsižvelgiant į literatūros duomenis, buvo pasirinktos empirin÷s gradientin÷s tirpiklių sistemos, susidedančios iš tirpiklio A (metanolis) ir tirpiklio B (0,5 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninis tirpalas). Pirminiam išplovimui buvo pasirinkta tirpiklių sistema, atitinkamai susidedanti iš 30 proc., 20 proc. ir 10 proc. tirpiklio A bei 70 proc., 80 proc. ir 90 proc. tirpiklio B. Linijin÷ gradiento priklausomyb÷ buvo stebima kol tirpiklių sistemose tirpiklio A buvo 60 proc. Trukm÷ buvo 30 min.
3 pav. Fenolinių junginių standartų mišinio ESC chromatograma esant skirtingoms metodo sąlygoms (30% ir 20% tirpiklio A gradiento pradžioje).
1 - galo rūgštis, 3 chlorogeno rūgštis, 4 - vanilino rūgštis, 5 - kavos rūgštis, 6 – vanilinas, 7 - kumaro rūgštis, 8 - ferulo rūgštis, 9 - rozmarino rūgštis, 10 - cinamono rūgštis
Esant dviems min÷toms metodo sąlygoms (30% ir 20% tirpiklio A gradiento pradžioje) kai kurių smailių skiriamoji geba ne didesn÷ nei 1,5 (3 pav.). Pirmos gradacijos metu (30% tirpiklio A gradiento pradžioje) protokatecho ir chlorogeno rūgščių smailių skiriamosios gebos mažesn÷s nei 1,5, vanilino ir kavos rūgščių smailių - <0,5. Kito gradiento (20 % tirpiklio A gradacijos pradžioje) vanilino ir kavos rūgščių smailų skiriamosios gebos mažesn÷s nei 1,5. Trečio gradiento (10 % tirpiklio A gradacijos pradžioje) skiriamoji geba tinkamiausia ir šis būdas yra pasirinktas išrinktų fenolinių junginių atskyrimui. Esant optimalioms atskyrimo sąlygoms, analiz÷ atliekama 27 min., sulaikymo laikas 4,04 min (galo rūgštis), 6,93 min (protokatecho rūgštis), 11,30 min (chlorogeno rūgštis), 12,26 min (vanilin÷ rūgštis), 12,93 min (kavos rūgštis), 13,80 min (vanilinas), 16,97 min (kumaro rūgštis), 17,95 min (ferulo rūgštis), 22,29 min (rozmarino rūgštis) ir 26,30 min (cinamono rūgštis). Optimalus atskyrimas pavaizduotas 4 pav.
4 pav. Optimizuoto fenolinių rūgščių ir fenilpropanoidų standartų ESC atskyrimo chromatograma
Analit÷s: 1 - galo rūgštis, 2 – protokatecho rūgštis, 3 - chlorogeno rūgštis, 4 - vanilino rūgštis, 5 - kavos rūgštis, 6 – vanilinas, 7 - kumaro rūgštis, 8 - ferulo rūgštis, 9 - rozmarino rūgštis, 10 - cinamono rūgštis.
Analiz÷s metodo įteisinimas.
Buvo atlikti tyrimai įteisinimui. Optimizuoto metodo rezultatas – patikimi parametrai: skiriamoji geba, linijiškumas, ribojamas aptikimas, kiekyb÷ ir tikslumas.
Skiriamoji geba buvo aprašyta aukščiau (skyriuje „analiz÷s metodo optimizavimas“). Visos smail÷s atskirtos kuomet Rs>1,5. 3 pav. parodo dvi skiriamosios gebos vertes: žemiausias ir aukščiausias naudojant skirtingas standartinių tirpalų koncentracijas.
Detektoriaus linijiškumas (smail÷s plotas lyginant su koncentracija) nustatytas paruošus penkis kalibracinius pavyzdžius. Kiekvienas pavyzdys buvo injekuotas tris kartus ir br÷žiamas smail÷s ploto priklausomyb÷s nuo koncentracijos grafikas. Buvo stebima antros eil÷s daugianar÷ kalibracija. Po registracijos pakeitimo, buvo suteikta linijin÷ funkcija visiem standartiniam tirpalam, kurios lygtis:
Y = a + bX, kur Y smail÷s ploto dydis, o X pavyzdžio kiekio vert÷.
Kalibracin÷s kreiv÷s parametrai ir jų santykiniai koeficientai patvirtina linijiškumą tirtame koncentracijų diapazone (3 lentel÷).
Aptikimo riba (LOD) ir nustatymo riba (LOQ), apibr÷žiamos kaip žemiausia analit÷s koncentracija, kurią galima aptikti ir kiekybiškai nustatyti, nustatytos lyginant smail÷s aukštį su bazin÷s linijos triukšmu. Smail÷, kurios aukštis 3 kartus didesnis už bazin÷s linijos triukšmą ir atitinka aptikimo ribą, o kurios aukštis 10 kartų didesnis už bazin÷s linijos triukšmą ir atitinka nustatymo ribą. Nustatymo riba buvo įvertinta naudojant dvigubai arba keturiskart skiestus (metanoliu) mažiausios kalibracijos standartų tirpalus. Aptikimo riba ir nustatymo riba buvo atitinkamai tarp 0,004–0,021 ir 0,014-0,07 mkg/ml (3 lentel÷).
Metodo tikslumas ir teisingumas pasiekti įteisinimo eigoje. Metodo tikslumas nustatytas pakartotinai matuojant vidutines tikslias smailų sritis. Pakartojamumas (dienos eigoje) nustatytas atliekant kartotinus įvedimus (n = 4). Santykinis standartinis nuokrypis (SSN, proc.) buvo apskaičiuotas lyginant stebimas koncentracijas. 4 lentel÷je santykiniai standartiniai nuokrypiai duoti smailių plotams ir kiekiams. Kelių dienų tikslumas (atkuriamumas) apskaičiuotas tris skirtingas dienas įvedant tris rinkinius kontrolinių tirpalų. Visais atvejais metodo SSN buvo mažesnis nei 3,5 proc. smailių plotams ir 2,6 proc. kiekiams. Vienos dienos ir kelių dienų teisingumas buvo 95,1-106,4 proc.
24 3 lentel÷. Fenolinių junginių skiriamosios gebos ir kalibravimo kreivių parametrai
Cmin and Cmax - mažiausios ir didžiausios etaloninių tirpalų koncentracijos`; LOD - aptikimo riba, LOQ - nustatymo riba
Skiriamoji geba Nr.
Analit÷
Nustatytas tiesinis
intervalas (µg/ml) Cmin Cmax Lygtis R 2 LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) 1 Galo rūgštis 0,17-6,80 - - Y = 1,90×104 X - 4,43×102 0,99985 0,021 0,070 2 Protokatecho rūgštis 0,13-5,24 8,77 8,66 Y = 1,82×104 X - 6,48×102 0,99990 0,017 0,057 3 Chlorogeno rūgštis 0,10-4,00 16,12 14,99 Y = 2,14×104 X - 5,81×102 0,99988 0,019 0,064 4 Vanilino rūgštis 0,08-3,23 3,75 3,42 Y = 2,27×104 X + 1,05×102 0,99990 0,009 0,031 5 Kavos rūgštis 0,08-3,20 2,35 2,36 Y = 4,12×104 X - 3,74×102 0,99989 0,008 0,026 6 Vanilinas 0,07-2,80 3,30 3,18 Y = 3,59×104 X - 3,34×102 0,99995 0,006 0,021 7 Kumaro rūgštis 0,04-1,60 11,73 11,26 Y = 7,06×104 X + 3,08×102 0,99988 0,004 0,014 8 Ferulo rūgštis 0,07-2,80 3,94 3,48 Y = 3,91×104 X - 6,21×102 0,99989 0,018 0,058 9 Rozmarino rūgštis 0,09-3,60 18,27 15,96 Y = 2,03×104 X - 5,03×102 0,99988 0,016 0,054 10 Cinamono rūgštis 0,05-2,00 15,21 14,44 Y = 6,85×104 X + 3,23×102 0,99994 0,004 0,014
4 lentel÷. Kiekinio tyrimo tikslumas (vienos dienos ir kelių dienų tyrimai). SSNa, % smail÷s plotui Nustatytas vidutinis kiekis (µg/ml) SSN, % kiekiui Atkuriamumas % Analit÷ Įvedamas kiekis (µg/ml) WDb BDc WD BD WD BD WD BD Galo rūgštis 3,400 0,1 2,2 3,483 3,419 0,1 1,5 102,3-102,6 97,3-102,4 Protokatecho rūgštis 2,624 0,5 3,5 2,785 2,706 0,5 2,6 105,6-106,4 97,8-106,4 Chlorogeno rūgštis 2,000 2,0 3,1 2,023 1,998 1,9 2,1 100,0-103,8 95,1-100,9 Vanilino rūgštis 1,615 0,7 3,5 1,702 1,657 0,7 2,4 104,7-106,2 97,3-105,3 Kavos rūgštis 1,600 0,5 3,2 1,681 1,638 0,5 2,2 104,5-105,4 97,7-105,4 Vanilinas 1,400 0,3 3,5 1,485 1,439 0,3 2,6 105,7-106,3 97,8-106,2 Kumaro rūgštis 0,800 0,4 3,3 0,841 0,821 0,4 2,2 104,7-105,5 97,4-105,5 Ferulo rūgštis 1,400 0,4 2,7 1,455 1,427 0,4 1,7 103,6-104,4 97,5-104,4 Rozmarino rūgštis 1,800 0,4 1,8 1,805 1,781 0,4 1,8 99,9-100,7 97,2-100,2 Cinamono rūgštis 1,000 0,2 3,2 1,055 1,031 0,2 2,4 105,2-105,6 98,2-105,2 SSN – santykinis standartinis nuokrypis (kitaip variacijos koeficientas), WD (within day) – tą pačią dieną atliktų analizių rezultatai, BD (between day) – skirtingom dienom atliktų to pačio bandinio analizių rezultatai.
Paruoštą metodiką mes pritaik÷me Lietuvoje surinkto bičių pikio chemin÷s sud÷ties analizei. 5 pav. pavaizduota vieno iš 18 propolio pavyzdžių tirpalo chromatograma.
5 pav. Propolio tirpalo chromatograma
1 - galo rūgštis, 3 - chlorogeno rūgštis, 4 - vanilino rūgštis, 5 - kavos rūgštis, 6 - vanilinas 7 - kumaro rūgštis, 8 - ferulo rūgštis, 9 - rozmarino rūgštis, 10 - cinamono rūgštis
Iš 5 pav. pavaizduotos propolio chromatogramos matome, kad Lietuvoje tirtuose propolio pavyzdžiuose nenustatyta tik protokatecho rūgštis. Didžiausias kiekis rastas kumaro rūgšties, taip pat ferulin÷s rūgšties bei vanilino. Mažiausi kiekiai galo ir chlorogeno rūgščių.
3.4. Tyrimo rezultatai ir jų aptarimas
Atlikus tyrimą, kompiuterin÷ programa apdorojo duomenis ir pateik÷ juos grafiškai (chromatogramos) bei matematiškai – junginių kiekius nurod÷ µg/ml. Tam, kad būtų lengviau įvertinti rezultatus, reik÷jo gautus kiekius perskaičiuoti į µg/g, o kadangi kai kurie kiekiai buvo labai dideli, galutiniai rezultatai pateikti mg/g.
5 lentel÷je esantys kiekiai apskaičiuoti taikant formulę: VVAŽ (ml) x C (µg/ml)
X (mg/g) =
mVAŽ (g) x 1000
VVAŽ – visas paruoštos vaistin÷s augalin÷s žaliavos ištraukos tūris mililitrais
C – nustatytos tiriamos medžiagos koncentracija µg/ml
mVAŽ – vaistin÷s augalin÷s žaliavos, sunaudotos ištraukai gauti, mas÷ gramais
Nustatyta, jog beveik visuose propolio pavyzdžiuose vyrauja kumaro rūgštis (4,1 – 13,27 mg/g, vidutiniškai – 7,59 mg/g), tik Šakių, Ukmerg÷s, Utenos ir Kupiškio propolyje vyrauja ferulin÷ rūgštis (likusiuose propolio pavyzdžiuose ji užima antrą vietą – 3,53 – 10,53 mg/g, vid. – 6,89 mg/g). Trečioje vietoje – vanilinas (1,54 – 6,92 mg/g, vid. – 3,25 mg/g). Panašiais kiekiais yra ketvirtoje vietoje esančios vanilin÷s rūgšties (0,76 – 2,9 mg/g, vid. – 1,41 mg/g) ir penktoje vietoje esančios rozmarino rūgšties (0,04 – 5,45 mg/g, vid. – 1,24 mg/g). Šešta vieta – cinamono rūgštis (0,01 – 3,44 mg/g, vid. 0,83 mg/g). Septinta vieta – kavos rūgštis (0,33 – 1,56 mg/g, vid. – 0,75 mg/g). Mažiausi kiekiai propolio pavyzdžiuose yra chlorogeno rūgšties (0,01 – 0,22 mg/g, vid. – 0,13 mg/g) ir galo rūgšties (0,09 – 0,36 mg/g, vid. – 0,14 mg/g) (5 lentel÷, 6 pav. ir 8pav.).
Bendras junginių pasiskirstymas.
Didžiausias suminis kiekis fenolinių rūgščių ir fenilpropanoido rastas Šilal÷s rajono bičių pikyje (bendras kiekis – 37,09 mg/g), taip pat Kelm÷s rajone (34,75 mg/g), Klaip÷dos rajone (31,91 mg/g) ir Trakų rajone (30,44 mg/g).
Mažiausi kiekiai junginių rasti propolyje iš Švenčionių rajono (12,24 – 13,3 mg/g), Anykščių rajono (15,08 mg/g), Jurbarko rajono (17,04 mg/g) ir Var÷nos rajono (17,98 mg/g) (7 pav.)
Taigi galima padaryti išvadas, kad Dzūkijos regione (Švenčionių raj., Var÷nos raj.) ir Aukštaitijos regione (Anykščių raj.) surinkto bičių pikio sud÷tis daugelyje tyrimo objektų pasižymi mažu fenolinių rūgščių ir fenilpropanoido kiekiu. Žemaitijos regiono propolyje (Šilal÷s raj., Kelm÷s raj., Klaip÷dos raj.) beveik visuose tyrimo objektuose fenolinių rūgščių ir fenilpropanoido kiekiai didžiausi.
Galo ir chlorogeno rūgščių daugiausiai rasta Kelm÷s rajono pikyje (10 pav.), kavos rūgšties daugiausiai – Šakių rajone (18 pavyzdys), vanilin÷s rūgšties, vanilino, kumaro rūgšties ir ferulin÷s rūgšties daugiausiai – Šilal÷s rajone (9 pav.), o rozmarino ir cinamono rūgščių daugiausiai – Klaip÷dos rajone.
Galo rūgšties mažiausiai rasta propolyje iš Švenčionių rajono, Var÷nos rajono ir Šakių rajono (18 pavyzdys), chlorogeno rūgšties mažiausiai rasta Radviliškio ir Anykščių rajonuose (10 pav.). Vanilin÷s, kavos, kumaro, ferulin÷s ir cinamono rūgščių mažiausiai rasta Švenčionių rajone, vanilino rūgšties – Šakių rajone (18 pavyzdys) (6, 9 pav.). Rozmarino r. – Var÷nos rajone (6 pav.).
5 lentel÷. Fenolinių rūgščių ir fenilpropanoido kiekiai sausuose propolio ekstraktuose (mg/g)
Galo rūgštis Chlorogeno rūgštis
Vanilin÷
rūgštis Kavos rūgštis Vanilinas Kumaro rūgštis Ferulin÷ rūgštis Rozmarino rūgštis Cinamono rūgštis 1pvz 0,36 0,22 2,82 0,67 4,37 13,16 10,29 2,12 0,74 2pvz 0,1 0,19 1,19 0,92 3,52 6,38 8,43 0,36 0,98 3pvz 0,16 0,09 1,59 0,72 4,34 5,91 5,35 0,05 0,64 4pvz 0,09 0,11 0,76 0,44 2,12 4,10 3,53 0,70 0,39 5pvz 0,14 0,01 1,68 0,62 3,68 7,43 7,45 1,32 1,20 6pvz 0,13 0,12 1,37 0,55 3,66 6,80 7,11 1,29 0,15 7pvz 0,1 0,12 1,12 1,01 2,10 8,24 6,70 0,55 0,08 8pvz 0,12 0,14 1,09 0,68 2,45 6,62 6,01 1,07 1,44 9pvz 0,13 0,13 1,47 1,01 3,23 9,49 8,57 3,16 3,25 10pvz 0,14 0,11 1,11 0,33 2,26 4,89 3,88 0,57 0,01 11pvz 0,27 0,17 2,94 0,91 6,92 13,27 10,53 1,92 0,16 12pvz 0,09 0,16 1,13 0,77 1,62 7,99 5,63 0,04 0,55 13pvz 0,1 0,14 1,14 0,78 3,89 6,64 7,74 0,35 0,91 14pvz 0,13 0,12 1,36 0,93 2,56 9,72 8,20 5,45 3,44 15pvz 0,17 0,15 1,69 0,57 4,67 7,09 6,89 0,99 0,80 16pvz 0,11 0,09 1,10 0,41 2,93 4,96 4,37 0,99 0,12 17pvz 0,14 0,14 1,12 0,54 2,57 6,29 5,50 0,72 0,02 18pvz 0,09 0,10 0,80 1,56 1,54 7,67 7,76 0,61 0,03
6 pav. Fenolinių r. ir fenilpropanoido pasiskirstymas visuose regionuose
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
R
e
g
io
n
ų
e
il
÷
s
N
r.
Jungini
ų
kiekiai mg/g
Cinamono r.
Rozmarino r.
Ferulin
÷
r.
Kumaro r.
Vanilinas
Kavos r.
Vanilin
÷
r.
Chlorogeno r.
Galo r.
7 pav. Bendras junginių pasiskirstymas tirtose vietov÷se
Šilal÷s raj.; 37,09 Kelm÷s raj.; 34,75 Klaip÷dos raj.; 31,91 Trakų raj.; 30,44 Ukmerg÷s raj.; 23,53 Ignalinos raj.; 23,02 Kupiškio raj.; 21,69 Utenos raj. 2; 21,18 Utenos raj.; 20,02 Vilniaus raj.; 19,62 Radviliškio raj.; 18,85 Var÷nos raj.; 17,98 Jurbarko raj.; 17,04 Anykščių raj.; 15,08 Šakių raj. 2; 22,07 Šakių raj.; 20,16 Švenčionių raj. 2; 13,3Švenčionių raj.; 12,24
0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25 27,5 30 32,5 35 37,5 Rūgščių bendras kiekis regione mg/g
8 pav. Fenolinių r. ir fenilpropanoido pasiskirstymas visuose propolio
pavyzdžiuose
2,57 2,31 25,48 13,42 58,43 136,65 123,94 22,26 14,91 0 20 40 60 80 100 120 140 Junginiai B e n d ra s j u n g in i ų k ie k is p ro p o ly je m g /g Galo r. Chlorogeno r. Vanilin÷ r. Kavos r. Vanilinas Kumaro r. Ferulin÷ r. Rozmarino r. Cinamono r.9 pav. Didžiausią kiekį propolyje sudarančių junginių
pasiskirstymas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18Pikio bandinių eil÷s nr.
J u n g in i ų k ie k is m g /g Kumaro r. Ferulin÷ r. Vanilinas
10 pav. Mažiausią kiekį propolyje sudarančių junginių
pasiskirstymas
0 0,1 0,2 0,3 0,4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18Pikio bandinių eil÷s nr.
J u n g in i ų k ie k ia i m g /g Chlorogeno r. Galo r.
Išvados
1) Šiam tyrimui parinktas analiz÷s metodas - efektyvioji skysčių chromatografija (ESC). Metodas pasirinktas d÷l prieinamos aparatūros, patikimumo, didel÷s skiriamosios gebos, didelio efektyvumo, gero atrankamo, rezultatų atkuriamumo bei plataus pritaikymo fenolinių rūgščių ir fenilpropanoidų nustatymui.
2) Atlikti tyrimai paprastos ir greitos atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos optimizavimui ir įtiesinimui. Optimizavimo rezultatas – patikimi parametrai: skiriamoji geba, linijiškumas, aptikimo ir nustatymo ribos ir tikslumas. Aptikimo riba ir nustatymo riba buvo atitinkamai tarp 0,004–0,021 ir 0,014-0,07 µg/ml. Kiekybinis metodo pakartojamumas yra didesnis nei 2,6 procento. Vienos dienos ir kelių dienų teisingumas buvo 95,1-106,4 proc.
3) Nustatyta, jog beveik visuose propolio pavyzdžiuose vyrauja kumaro rūgštis (4,1 – 13,27 mg/g, vidutiniškai – 7,59mg/g), tik Šakių, Ukmerg÷s, Utenos ir Kupiškio propolyje vyrauja ferulin÷ rūgštis (likusiuose propolio pavyzdžiuose ji užima antrą vietą – 3,53 – 10,53 mg/g, vid. – 6,89 mg/g). Mažiausi kiekiai propolio pavyzdžiuose yra chlorogeno rūgšties (0,01 – 0,22 mg/g, vid. – 0,13 mg/g) ir galo rūgšties (0,09 – 0,36 mg/g, vid. – 0,14 mg/g).
4) Didžiausias suminis kiekis fenolinių rūgščių ir fenilpropanoido rastas Šilal÷s rajono bičių pikyje (bendras kiekis – 37,09 mg/g), taip pat Kelm÷s rajone (34,75 mg/g), Klaip÷dos rajone (31,91 mg/g) ir Trakų rajone (30,44 mg/g). Mažiausi kiekiai junginių rasti propolyje iš Švenčionių rajono (12,24 – 13,3 mg/g), Anykščių rajono (15,08 mg/g), Jurbarko rajono (17,04 mg/g) ir Var÷nos rajono (17,98 mg/g).
5) Dzūkijos regione (Švenčionių raj., Var÷nos raj.) ir Aukštaitijos regione (Anykščių raj.) surinkto bičių pikio sud÷tis daugelyje tyrimo objektų pasižymi mažu fenolinių rūgščių ir fenilpropanoido kiekiu. Žemaitijos regiono propolyje (Šilal÷s raj., Kelm÷s raj., Klaip÷dos raj.) beveik visuose tyrimo objektuose fenolinių rūgščių ir fenilpropanoido kiekiai didžiausi.
6) Norint išgauti didžiausią kiekį fenolinių rūgščių ir fenilpropanoidų, pikį reik÷tų rinkti Šilal÷s rajone, Kreivių kaime (1,48 proc.), Kelm÷s rajone (1,39 proc.) ir Klaip÷dos rajone (1,28
Literatūros sąrašas
1. Baltuškevičius A. Bičių produktai – žmonių sveikatai. Salix alba. Kaunas, 2003, 37-44. 2. Bankova V, Popova M, Bogdanov S, Sabatini AG. Chemical composition of European
propolis: expected and unexpected results. Z Naturforsch [C] 2002;57:530-3. 3. Budavari, S. (ed.) 1989. The Merck Index. Merck & Co., Rahway, NJ
4. Castaldoa S., Capassob F. Propolis, an old remedy used in modern medicine, Fitoterapia 73, Suppl. 1, S1–S6, 2002.
5. Cellular and Molecular Life Sciences. Examination of the chemical composition of propolis I. Isolation and identification of the 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid) from propolis. Volume 26, Number 7/July, 1970.
6. Crane E. The World History of Beekeeping and Honey Hunting. Taylor & Francis 1999, 550-551.
7. Deutscher Apitherapie Bund e.V. Informationen uber Beinenprodukte. 2003.
8. Di Maggio, G., Ciaceri, G. (1961) (Italy) - Il potere istamiopessico della quercetina (Italian), in Archo. Ital. Sci. farmac., 11, p.191-200.
9. European pharmacopoeia. Fifth Editon. Strasbourg: Council of Europe, 2005.
10. Gabrys J, Konecki J, Krol W, Scheller S, Shani J. Free amino acids in bee hive product (propolis) as identified and quantified by gas-liquid-chromatography. Pharmacol Res Comm. 1986;18:513–8.
11. Ghisalberti E.L. Propolis: a review, Bee World 60, 1979, 59–84.
12. Grange J.M., Davey R.W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). J. R. Soc. Med., 1990, 83, 159-60.
13. Grunberger D, Banerjee R, Eisinger K, et al. Preferential cytotoxicity on tumor cells by caffeic acid phenylethyl ester isolated from propolis. Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS). Volume 44, Number 3, 1988, 230-232.
14. Hasimoto T., Aga H., Tabuchi A., Shibuya T., Chaen H., Fukuda S. and Kurimoto M. Anti-Helicobacter pylori compounds in Brazilian propolis. Natural medicine. Volume 52, Number 6, 1998, 518-520.
15. Hilhorst M. J., Somsen G. W., Jong G. J. Potential of Capillary Electrophoresis for the Profiling of Propolio. Journal of high resolution chromatography. Volume 21, Issue 11, Pages 608 – 612, 1998.
17. Hladon B, Bylka W, Ellnain-Wojtaszek M, et al. In vivo studies on the cytostatic activity of propolis extracts. Arzneimittelforschung. 1980;30: 1847-1848
18. Huleihel M., Isanu V. Anti – herpes simplex virus effect of an aqueous extract of propolis. Journal of Israel Medical Association, 2002, 4:923-927.
19. Janes K. and Bumba V., Beitrag zur Zusammensetzung des Bienenharzes (Propolis). Pharmazie, 29, 544-545 (1974)
20. Kartal M., Kaya S., Kurucu S. GC-MS analysis of propolis samples from two different regions of Turkey. Z Naturforsch [C] 2002;57: 905-909.
21. König B. and Dustmann J. H. Naturwissenschaften 72, 659 (1985).
22. Kosalec I. et al.: Flavonoid analysis and antimicrobial activity of commercially available propolis products, Acta Pharm. 55 (2005) 423–430.
23. Kujumgiev A, Tsvetkova I, Serkedjieva Y, Bankova V, Christov R, Popov S. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. J Ethnopharmacol 1999;64:235-40.
24. Langstroth L.L. The Hive and the Honey Bee, Dadant & Sons, 1992.
25. Mackevičius L., Reingardien÷ D. Propolis kompleksiškai gydant LOR ligonius. Bičių produktai – sveikatos šaltinis. Straipsnių rinkinys. Kaunas, 2000, 50-52.
26. Majien÷, Daiva; Trumbeckait÷, Sonata; Grūnovien÷, Danguol÷; Ivanauskas, Liudas; Gendrolis, Antanas Juozas. Propolio ekstrakto chemin÷s sud÷ties tyrimai // Medicina. ISSN 1010-660X. 2004, t. 40, Nr. 8. p. 771-774. [MEDLINE; Index Copernicus].
27. Marcucci M.C., Ferreres F., Garcia-Viguera C., Bankova V.S., de Castro S.L., Dantas A.P., et al. Phenolic compounds from Brazilian propolis with pharmacological activities. Journal of Ethnopharmacology, 2001;74: 105-112.
28. Marška A., Kornyšova O., Machtejevas E. Efektyviosios skysčių chromatografijos pagrindai. Kaunas: Vytauto Didžiojo universiteto leidykla, 2005.
29. Matsuno, T. O efeito terapêutico da propolis. New York: Columbia University, Institute of Cancer Research; 1997.
30. Metzner, Bedemeier, Paintz, Schneidewind. 1979. Antimicrobial activity of propolis and propolis constituents. Pharmazie 34 (2), 97-102.
31. Metzner, Schneidewind. 1978. Effect of pinocembrin on the course of experimentally-induced Candida infections in the mouse. Mykosen 21(8), 257-62.
32. Pepeljnjad, Jalsenjak, Maysinger. 1985. Flavonoid content in propolis extracts and growth inhibition of Bacillus subtilis. Pharmazie 40(2), 122-3.
33. Pereira A. S., Norsell M., Cardoso J. N., Aquino Neto F. R. Rapid Screening of Polar Compounds in Brazilian Propolis by High-Temperature High-Resolution Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Food Chem., 48 (11), 5226 -5230, 2000.
34. Pietta P.G., Gardana C, Pietta A.M. Propolis: chemical and pharmacological aspects, Naples , Italie (24/02/2001) 2002, vol. 73, SUP1 (64 p.) (8 ref.), pp. S7-S20
35. Popova M., Bankova V., Butovska D. et al. Validated Methods for the Quantification of Biologically Active Constituens of Poplar-type Propolis. Phytochem. Anal. 2004, 15, 235-40. 36. Propolis informational sheet. The propolis informational bureau, Filey. 1994.
37. Quiroga E.N., Sampietro D.A., Ioberon J.R., Sgariglia M.A., Vattuone M.A. Propolis from the northwest of Argentina as a source of antifungal principles. Journal of Applied Microbiology. ISSN 1364-5072: 104
38. Ruks. V. Bičių produktų gydomosios ypatyb÷s. Avicena. Vilnius. 1996, 6-36. 39. Straigis J. Bitininkyst÷. Vilnius, 1994.
40. Travelyan J. Spirito f the beehive. Nurs Times 1997; Feb 12-18, 93(7): 72-74. 41. Uccusic P. Bit÷ gydo. Avilio gydomoji galia. Vilnius, 1999.
42. Velikova M., Bankova V., Marcucci M.C., Tsvetkova I., Kujumgiev A. Chemical composition and biological activity of propolis from Brazilan meliponinae. Naturforsch [C], 2000, 55, 785-789.
43. Vennat B., Arvouetgrand A., Gross D., Pourrat A. Qualitative and quantative anglysis of flavanoids and identification of phenolic acids from propolis extract. J Parm Belg 1995;50: 438-444.
44. Villanueva V.R., Bogdanovsky D., Barbier M., Gonnet M., Lavie P. Sur l’identification de la 3,5,5-trihydroxy flavone (galangine) à partir de la propolis. Ann l'Institut Pasteur. 1964;106:292–302.
45. Vynograd N, Vynograd I, Sosnowski Z. A comparative multi-centre study of the efficacy of propolis, acyclovir and placebo in the treatment of genital herpes (HSV). Phytomedicine 2000;7(1):1-6.
46. Watson D. G., Peyfoon E., Zheng L., Lu D., Seidel. V., Johnston B., Parkinson J. A. And Fearnley J. Application of principal pomponents anglysis to 1H-NMR data obtained from propolis samples of different geographical origin. Phytochemical analysis17: 323-331 (2006).
Summary
Keywords: propolis, phenolic acids, phenylpropanoids, chemical composition, high performance liquid chromatography (HPLC).
The phenolic acids and phenylpropanoids have an important biological activity and are therapeutic agents of crude drugs. Development of validated analysis techniques of these phytotherapeutic agents (fingerprinting and assay procedures) is an important practice for efficacy, safety and quality control of herbal drug preparations. 18 samples of propolis were collected from different districts of Lithuania. The aim of the present work was to study chemical composition of collected samples and estimate analytical capabilities of the evaluation of selected phenolic acids and phenylpropanoids: caffeic acid, chlorogenic acid, cinnamic acid, coumaric acid, ferulic acid, gallic acid, protocatechuic (3,4-dihydroxybenzoic) acid, rosmarinic acid, vanillic acid and vanillin. Optimization and validation procedures of rapid and simple method of reversed phase high performance liquid chromatography were carried out. The mobile phase of the optimized chromatographic method consisted of methanol and 0.5 per cent acetic acid solvent in water. Under the optimal separation conditions (described in Methods), analysis was done in 27 min, with the retention times 4.04 min (gallic acid), 6.93 min (protocatechuic acid), 11.30 min (chlorogenic acid), 12.26 min (vanillic acid), 12.93 min (caffeic acid), 13.80 min (vanillin), 16.97 min (coumaric acid), 17.95 min (ferulic acid), 22.29 min (rosmarinic acid) and 26.30 min (cinnamic acid). The limits of detection and the limits of quantitation were between 0.004–0.021 and 0.014-0.07 µg/ml, respectively (Table 3). Repeatability was better than 2.6 per cent for amount. The within-day and between-day accuracy was also measured in range 95.1-106.4 per cent. Coumaric acid (4,1 – 13,27 mg/g) and ferulic acid (3,53 – 10,53 mg/g) are the dominating phenolic acids of propolis. Chlorogenic acid (0,01 – 0,22 mg/g) and gallic acid (0,09 – 0,36 mg/g) were determinated at the lowest amounts. The largest amounts of phenolic acids and phenylpropanoids were determinated in propolis from Šilal÷ district (total amount - 37,09 mg/g), also Kelm÷ district (34,75 mg/g), Klaip÷da district (31,91 mg/g) and Trakai district (30,44 mg/g). The lowest amounts were determinated in propolis from Švenčioniai district (12,24 – 13,3 mg/g), Anykščiai district (15,08 mg/g), Jurbarkas district (17,04 mg/g) and Var÷na district (17,98 mg/g). Recommendation would be collect propolis in Šilal÷ region, Kreiviai village (1,48 proc.), Kelm÷ region (1,39 proc.) and Klaip÷da region (1,28 proc.) if the largest amounts of phenolic acids and phenylpropanoids is
