ACIL SACCAROSIO

Gli zuccheri esterificati sono un gruppo di composti molto abbondante in tutte le suddivisioni effettuate: lo zucchero è quasi esclusivamente il saccarosio. Tali composti sono stati identificati in molte piante della famiglia delle Solanaceae e non al di fuori di essa. Gli acil saccarosio sono la seconda maggiore classe di composti chimici non volatili presenti nelle foglie. I tricomi sono ghiandole secretorie epidermiche aventi un ruolo centrale nei meccanismi di difesa delle piante poiché responsabili della sintesi di acil saccarosio a partire da una unità di saccarosio e da acidi attivi provenienti dal metabolismo degli amminoacidi. Alcuni acil saccarosio, prodotti nei tricomi, possiedono attività antibiotica, di regolazione della crescita della pianta, proprietà organolettiche (70) e attività di difesa contro gli insetti (71).

In studi precedenti si è verificata la capacità dei tricomi delle foglie di tabacco di produrre, oltre agli acil saccarosio, anche dei terpenoidi, a partire dalla CO2 dell’atmosfera. Inoltre la prevalenza dello zucchero

saccarosio, rispetto al glucosio, è giustificata dalla maggior velocità con cui tale zucchero viene trasportato fino ai tricomi (71).

Il saccarosio è formato da una unità di glucosio e una di fruttosio: i gruppi ossidrilici di ciascuna unità possono essere esterificati determinando due tipi di acil saccarosio differenti.

In figura 87, infatti, sono indicati con il generico gruppo R tutti gli ossidrili del saccarosio che potrebbero essere esterificati. Il gruppo R è un atomo di idrogeno, se il gruppo ossidrilico corrispondente non è esterificato, oppure una catena acilica o acetilica con lunghezza variabile (72).

Si differenziano inoltre nel numero e nella lunghezza delle catene esteree. Tale gruppo di composti viene indicato con la lettera S (se lo zucchero è il saccarosio), due numeri separati da ”:” i quali indicano il numero di catene aciliche e il numero totale di atomi di carbonio presenti nelle catene laterali. In alcuni studi questa simbologia è completata da una parentesi tonda con i numeri degli atomi di carbonio contenuti in ciascuna catena acilica. Inoltre sono presenti il tempo di ritenzione dello ione, lo ione principale e i frammenti di massa. In alcuni casi, la molecola differisce per il numero di atomi di carbonio delle catene aciliche, mantenendo però costante il numero totale: il tempo di ritenzione e i frammenti sono informazioni essenziali per l’identificazione e la loro distinzione.

Con la ionizzazione negativa si nota innanzitutto la formazione, per tutte le molecole selezionate, confermato da studi presenti in letteratura, di addotti con l’acido formico, presente come soluzione acidificante della fase mobile: lo ione identificato nello spettro di massa per gli acil saccarosio non è mai lo ione della massa base priva di un protone ma lo ione [M+ CHO2]-. Con la ionizzazione positiva, invece,

l’addotto più comune è con il sodio [M+Na+_].

Nello spettro di frammentazione di massa, invece, sono presenti per la ionizzazione negativa, gli ioni [M]-

con intensità relativa del 30-40% circa e [M+Na-X]- _{come picco base: X è un termine generale con cui si}

indicano per esempio l’acido butirrico, l’acido pentanoico o quello esanoico a cui corrisponde la perdita dalla porzione glucosidica di 88, 102 o 116 Da (70). Tali frammenti differiscono per un frammento metilenico (14 Da) e possono costituire anche catene più lunghe, come si verifica in questo lavoro di tesi con la perdita di 172 Da (116 + 4*(-CH2)). OR OR RO O RO O OR OR RO RO O

Figura 87 Schema generale acil saccarosio.

Per quanto riguarda gli addotti, la presenza di quello sodiato in modalità positiva si giustifica, oltre che con la grande quantità di sodio rilevata nelle foglie di tabacco, anche con il sodio presente nella vetreria di laboratorio utilizzata durante la preparazione dei campioni (70).

L’addotto si forma con la parte glucosidica del saccarosio e non con il fruttosio: tra le due parti, il glucosio sembra avere maggiore affinità chimica (72). La forza di tale legame conferma la presenza del sodio anche dopo la frammentazione dello ione e la corrispondente perdita del frammento fruttosio: la perdita del frammento 162 per la ionizzazione positiva corrisponde all’identificazione di un acil saccarosio del primo tipo (acile sul glucosio e quattro gruppi ossidrilici liberi per il fruttosio). La rottura del legame avviene tra l’atomo di ossigeno e il residuo fruttosidico. La perdita di un frammento 204, invece, indica che il fruttosio è esterificato e perciò si tratta di un acil saccarosio del tipo II (72).

Il restante spettro di frammentazione è privo di ioni con intensità di segnale significativa: questo rappresenta una caratteristica identificativa, unicamente per questi composti. La seconda frammentazione di massa riguarda, in tutti i casi, il picco base.

Anche per quanto riguarda la ionizzazione positiva, si ottiene uno spettro pulito, in cui l’unico frammento presente nella prima frammentazione è rappresentato dalla perdita di un’unità di fruttosio non esterificato (162 Da) o con un unico gruppo acetato (204 Da). In entrambi i casi, l’addotto Na+ _{permane nello ione}

prodotto (72).

Per mettere in evidenza alcune caratteristiche ripetute di questo abbondante gruppo di composti chimici, presenti sia in campioni analizzati in positivo che in negativo, si riassumono in tabella gli acil saccarosio identificati. Per la ionizzazione negativa non sono riportati i valori di m/z della molecola [M-H+_]- _{ma lo ione}

più significativo e abbondante. I dati, suddivisi per modificazioni genetiche e/o stress come presentati in appendice I, sono stati ordinati in modo crescente per il valore di m/z dello ione ricercato e sono stati riportati solo i dati relativi ad acil saccarosio non ripetuti.

In tabella 6, si riportano inoltre i tempi di ritenzione della frammentazione e la differenza, in termini di massa, tra lo ione ricercato e il picco base.

Tabella 6 Identificazione acil saccarosio in ionizzazione negativa. IONIZZAZIONE NEGATIVA

ione (m/z) identificazione picco base (m/z) tRbase picco differenza (Da) 597.27478 S3:12 425.16455 25.45 172.11023 611.25403 S3:13 523.23822 24.79 88.01581 639.28528 S3:15 551.26825 27.98 88.01703 653.30066 S4:15 565.28387 28.02 88.30066 667.27978 S4:16 579.263 27.48 88.01678 667.31647 S3:17 537.25269 29.09 130.06378 681.29541 S4:17 593.2785 28.12 88.01691 709.3266 S4:19 621.30094 30.65 88.02566 723.34375 S4:20 635.32489 31.34 88.01886 723.37891 S3:21 635.1358 32.88 88.37891 737.35791 S4:21 649.35138 32.47 88.00653 737.39441 S3:22 565.2832 33.57 172.11121 751.37347 S4:22 663.35663 33.34 88.01684 765.38928 S4:23 677.3718 34.66 88.01748 117

765.42596 S3:24 593.31561 35.34 172.11035 779.4046 S4:24 691.38855 35.48 88.01605 807.43579 S5:25 719.45449 36.78 87.9813 807.43604 S4:26 719.41907 37.15 88.01697

Tabella 7 Identificazione acil saccarosio in ionizzazione positiva. IONIZZAZIONE POSITIVA

ione (m/z) identificazione picco base (m/z) tRbase picco differenza (Da) 617.27466 S4:14 455.22573 26.85 162.04893 631.29028 S4:15 469.24084 27.75 162.04944 659.28491 S4:17 455.22427 28.08 204.06064 659.32104 S4:17 497.27191 30.01 162.04913 673.30084 S4:18 469.24173 29.15 204.05911 687.35229 S4:19 525.30493 31.94 162.04736 701.33185 S4:20 497.271 31.68 204.06085 715.3479 S4:21 511.28723 32.47 204.06067 729.36304 S4:22 525.30438 33.67 204.05866 743.37872 S4:23 539.31879 34.69 204.05993 757.39429 S4:24 553.4349 35.44 203.95939 771.40912 S4:25 567.35004 36.96 204.05908 785.42456 S4:26 581.36505 37.21 204.05951

Dai dati mostrati nelle tabelle 6 e 7, si conferma la corretta identificazione dei composti indicati: con l’aumento del valore di m/z ricercato, si nota l’aumento del numero di atomi di carbonio totali presenti nelle catene aciliche. Inoltre, ordinando i dati per il valore di massa, tranne alcune eccezioni, si verifica la corrispondenza tra aumento di massa e tempo di eluizione maggiore: l’aumento della lunghezza delle catene aciliche, ossia l’aggiunta di gruppi idrocarburici apolari nella stessa, comporta l’eluizione del composto formato in una regione del cromatogramma via via sempre meno polare.

Studi di letteratura affermano che con la modalità di ionizzazione positiva sia possibile ottenere un numero maggiore di risultati e con maggior sensibilità nella misura rispetto ai dati in ionizzazione negativa (70). In questo lavoro di tesi, sono stati identificati 18 diversi acil saccarosio per la ionizzazione negativa e 12 per quella positiva: con quest’ultima sono stati identificati solo tetracil saccarosio (4 catene aciliche), mentre in negativo vi sono anche tri- e penta acil saccarosio. Tutti i tetra acil saccarosio identificati in negativo, sono presenti anche nei dati analizzati in positivo.

In negativo, i frammenti persi sono 88, 130 o 172: l’unica razionalizzazione possibile per questi dati è la perdita del frammento 172 per i triacil saccarosio con numero totale di atomi di carbonio pari.

Per i dati ottenuti dalla ionizzazione positiva, si può dedurre che la perdita del frammento maggiore (204) si abbia nel caso di tetracil saccarosio con numero complessivo di atomi di carbonio superiore a 20, salvo due eccezioni.

In ultima analisi, si possono considerare le variazioni in intensità di segnale di ciascuna molecola nelle suddivisioni per stress o modificazioni genetiche. Nonostante il numero limitato di acil saccarosio identificati in ciascuna suddivisione, escludendo i composti già identificati, si possono dedurre alcune considerazioni importanti su tali confronti, dei quali in letteratura non vi è alcun riferimento.

Confrontando le intensità di segnale degl’acil saccarosio identificati nei diversi campioni, si verifica una risposta differente tra la ionizzazione negativa e quella positiva: per quanto riguarda i differenti stress subiti

da piante di Nicotiana L. naturali o geneticamente modificate, in negativo lo stress termico e quello idrico mostrano livelli elevati di acil saccarosio, dei quali non si riesce però a fare ulteriori razionalizzazioni per numero o lunghezza di catene aciliche. Per la ionizzazione positiva, invece, gli acil saccarosio identificati nella suddivisione per stress manifestano una notevole riduzione in termine di intensità di segnale per i campioni stressati termicamente rispetto ai campioni non stressati. Lo stress chimico, che riduce notevolmente il segnale in ionizzazione negativa, determina livelli di concentrazione maggiori rispetto ai campioni sottoposti a stress termico in modalità positiva.

Con la suddivisione per modificazione genetica, in positivo, non emergono acil saccarosi diversi da quelli evidenziati con la suddivisione per stress. Mentre con la ionizzazione negativa, per tale suddivisione, sono presenti molti e differenti composti per i quali è possibile delineare un certo andamento: tra i tipi differenti di campione (wild, GR e rolC), i tri acil saccarosio hanno intensità di segnale maggiore per i campioni geneticamente modificati per il gene GR come i tetra acil saccarosio con numero totale di atomi di carbonio nelle catene aciliche superiore a 21. Per i tetra acil saccarosio con numero di atomi di carbonio pari o inferiore a 20, il segnale ha intensità maggiore nei campioni modificati rolC.

Tali considerazioni sono ricavabili dalla figura sottostante.

Figura 88 Acil saccarosio identificati nella suddivisione per modificazioni genetiche in modalità negativa.

Inoltre, verificando gli analiti estratti dall’analisi dei loadings sia in ionizzazione negativa che positiva, i campioni di Nicotiana L. stressati termicamente presentano intensità di segnale maggiori rispetto ai campioni non stressati. In particolare, con la ionizzazione positiva, si conferma l’andamento verificato e descritto in figura 88: con i tetra acil saccarosio con un numero di atomi di carbonio minore di 20, i campioni rolC (termico) hanno intensità maggiore, e per quelli con numero maggiore di carbonio, i campioni modificati per il gene GR (termico) hanno un livello di concentrazione maggiore.

La presenza di frammenti tipici e ripetuti, i tempi di ritenzione contenuti in un range di analiti poco polari, la corrispondenza di composti in entrambe le modalità di ionizzazione e la conferma ottenuta mediante il confronto con studi presenti in letteratura sono caratteristiche estremamente utili in fase di identificazione degli analiti selezionati.

0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000 60000000 70000000 S3:21 S3:22 S3:24 S4:15 S4:17 S4:17 S4:18 S4:19 S4:20 S4:21 S4:22 S4:23 S4:24 GR ROLC WT 119