Un’importante differenza tra i vari spettrometri di massa in commercio è la sorgente di ionizzazione. 65
Le tipologie di ionizzazione sono molte e dipendono fondamentalmente dallo stato fisico del campione da analizzare: esse sono state ideate e progettate per ovviare alla differenza di pressione esistente tra il cromatografo liquido e lo spettrometro di massa in quanto il primo fornisce, in uscita dalla colonna, un campione liquido mentre lo spettrometro lavora su un gas a pressioni molto basse. L’accoppiamento HPLC/MS prevede perciò la ionizzazione degli analiti a cui segue la rimozione completa dell’eluente e infine l’inserimento di un’interfaccia in grado di trasmettere gli ioni all’analizzatore senza perturbare il vuoto creato.
I sistemi di ionizzazione più diffusi nell’accoppiamento HPLC/MS sono le sorgenti ESI (Electrospray Ionization) e APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization).
Queste sorgenti di ionizzazione sono classificate come sorgenti “soft”: provocano una scarsa
frammentazione del campione per cui lo spettro di massa è formato dai picchi cromatografici degli ioni molecolari protonati [M + H]+ , deprotonati [M- H]- o tuttal’più di qualche semplice addotto.
L’ESI è una tecnica di ionizzazione per elettronebulizzazione, adatta a molecole ad alto peso molecolare, composti ionici quali acidi o basi organiche, ma anche proteine o composti organometallici. È preferibile, invece, evitare la presenza di sali in sorgente, per non abbatterne le prestazioni.
La ionizzazione elettrospray avviene a temperatura e pressione atmosferica. Si descrivono in breve i passaggi fondamentali della ionizzazione ESI.
La soluzione contenente gli analiti, proveniente dalla separazione cromatografica in colonna, viene
introdotta nella sorgente attraverso un capillare metallico, a cui è applicato un elevato potenziale elettrico (negativo o positivo in base all’analita) e nebulizzata all’interno della camera di ionizzazione.
In tal modo si forma uno spray di gocce cariche, di diametro di qualche micron (1-60 µm), che vengono indirizzate verso l’apertura posta sul controelettrodo costituita da un capillare e da uno skimmer (struttura a cono aperto).
La desolvatazione, favorita dalla temperatura della sorgente e dal flusso di gas ausiliario, permette la progressiva diminuzione del volume della goccia e il conseguente aumento di densità di carica superficiale. Questo processo prosegue fino al raggiungimento del “limite di Rayleigh”, in cui la tensione superficiale della goccia non è più in grado di sopportare la repulsione coulombiana generata tra le cariche. Essa causa un’esplosione “coulombiana”: le gocce si disgregano in goccioline di dimensioni inferiori, come
schematizzato in Figura 42.
Questo meccanismo si ripete a cascata fino a quando tutto il solvente è evaporato, portando alla formazione di ioni desolvatati di analita in fase gas, i quali possono avere carica unitaria o multipla,
determinato dalla struttura degli analiti ma anche dai solventi utilizzati. Solitamente molecole ad alto peso molecolare portano alla formazione di ioni multicarica e miscele di H2O e solventi organici migliorano
l’eluizione delle molecole polari analizzate (metanolo, acetonitrile, isopropil alcol/ acqua).
Un altro importante accorgimento è l’ottimizzazione del pH dei solventi utilizzati, in quanto il contatto con analiti in soluzione potrebbe per esempio portare alla formazione di addotti.
La modalità di ionizzazione può essere sia negativa che positiva: molecole acide, in soluzione, formano ioni negativi in soluzione mentre molecole basiche formano ioni positivi. La formazione degli ioni dalle gocce è facilitata se la carica ionica e la carica sulla superfice delle gocce è la stessa: si usa la polarità positiva per analizzare ioni positivi e negativa per ioni carichi negativamente (50).
Figura 42 Schema ionizzazione sorgente ESI.
La sorgente ESI utilizzata per il presente lavoro è la Ion Max, prodotta dalla Thermo Scientific, costituita da una parte completamente rimovibile, a sinistra in figura 43, la cui vera parte di collegamento con
l’analizzatore di massa è fissata alla struttura dello spettrometro e permette unicamente la rimozione, per pulizia, del cono del gas “sweep”, evidenziato in figura 43 (51).
Figura 43 Visione della camera di ionizzazione del campione e dello sweep cone.
La ionizzazione è supportata dalla presenza di una serie di gas: oltre all’ingresso del campione, vi sono, infatti, appositi ingressi, nel probe, per lo “sheat gas” e l’“auxiliary gas”, entrambi convogliati nella camera di ionizzazione in modo coassiale all’ingresso del campione (figura 44).
Figura 44 Schema ingresso flusso gas.
Lo “sheat gas” è costituito da azoto molecolare fatto fluire in modo coassiale alla direzione d’iniezione del campione, internamente ad esso, che favorisce la nebulizzazione della soluzione in una nebbia fine. Valori tipici, con flussi di eluizione sotto ai 10 μL/min, sono tra le 10 e le 30 unità, mentre tra 30 e 60 unità con flussi maggiori ai 400 μL/min.
In figura 44 si mostra una sezione delle linee di flusso dei gas.
Il gas ausiliario invece, è un flusso di azoto coassiale ma esterno alla linea di iniezione del campione: questo gas è di supporto allo “sheat gas” nella nebulizzazione ed evaporazione del campione: valori tipici di flusso del gas ausiliario sono tra le 10 e 20 unità, ma nel caso in cui il flusso del campione sia inferiore a 50 μL/min, il gas non viene utilizzato (50).
In LC/MS il gas ausiliario è molto utilizzato perché contribuisce all’aumento del rapporto segnale/rumore di fondo, soprattutto con flussi elevati.
L’inclinazione del probe rispetto alla linea del campione è solitamente 60°, ma si possono fare piccole modifiche per migliorare la stabilità dello spray.
Un ultimo flusso di gas che può essere utilizzato è il cosiddetto “sweep gas”, gas introdotto dal retro dello sweep cone, mostrato nella parte destra della figura 44, che procede in senso opposto al flusso di
ionizzazione del campione. L’azoto, eventualmente introdotto in questo modo, determina una maggiore declusterizzazione del solvente dagli analiti e riduce la formazione di addotti in sorgente: il sweep gas risulta necessario in campioni complessi o con matrici pesanti come per esempio il plasma o campioni ricchi di sali (52).
La sorgente APCI è invece adatta per la ionizzazione di composti a bassa o media polarità, di piccole dimensioni, polari e non, ma termicamente stabili.
I parametri strumentali applicati alla sorgente ESI per il presente lavoro sono riportati in tabella 2.
Tabella 2 Parametri strumentali sorgente ESI.
Temperatura del capillare (°C) 275 negativo positivo Temperatura di
vaporizzazione (°C) 300
Voltaggio alla
sorgente (kV) 3.5 4.5 Flusso “sheat gas” (µL/min) 35 Corrente alla
sorgente (µA) 100 100 Flusso gas ausiliario (µL/min) 5 Voltaggio al
capillare (V) -40 24 Flusso “sweep gas” (µL/min) 0 Tube lens (V) -100 100