Equazione 7 Stechiometria complessiva per la sintesi dell’acido palmitico (9).
2.3.4 I METABOLITI SECONDAR
2.3.4.3 GLI ALCALOID
Gli alcaloidi sono una classe di composti, dalla composizione più svariata e disomogenea, costituiti da carbonio, idrogeno e azoto, talvolta anche ossigeno. Nella struttura è solitamente presente un gruppo con proprietà acide. Si pensa che la presenza di azoto nella struttura della molecola sia dovuta all’amminoacido da cui esso è stato prodotto, come per esempio l’acido nicotinico deriva dall’acido aspartico e dal triptofano.
Gli alcaloidi sono prodotti naturali delle piante ma anche di funghi, batteri o animali. Il ruolo degli alcaloidi negli organismi vegetali è principalmente quello di difesa: in molti casi infatti sono composti tossici per insetti e microrganismi. La loro varietà strutturale riflette la diversità dei loro effetti e delle proprietà che possiedono. Molti alcaloidi, date le loro proprietà bioattive, sono usati a scopo terapeutico come analgesici o antitumorali nell’industri farmaceutica (morfina), altri invece sono importanti stimolanti per l’industria alimentare e nutraceutica (caffeina e nicotina), altri infine droghe (cocaina), veleni (stricnina) o composti allucinogeni.
Una classificazione semplice degli alcaloidi sarebbe impossibile vista la vastità delle combinazioni chimiche strutturali con altre molecole in cui essi sono coinvolti, ma ci si può limitare a distinguere gli alcaloidi sulla base della struttura chimica di partenza, che può essere indolica, pirrolidinica (lobelina), pirazolica, tropanica (atropina), imidazoica (pilocarpina).
Il meccanismo biosintetico è molteplice: vi sono varie vie che portano alla formazione dei diversi alcaloidi e derivati.
- Sintesi alcaloidi indolici (dal triptofano)
Figura 33 Sintesi di alcaloidi con struttura base indolica (10).
- Sintesi alcaloidi con base tropano, piperidina e piridina (da lisina, arginina e prolina)
Figura 34 Sintesi di alcaloidi a partire da tropano, piperidina e piridina (10).
Questo meccanismo biosintetico è strettamente legato a quello di sintesi della nicotina e tutti i suoi derivati, anch’essi classificati come alcaloidi.
- Sintesi di alcaloidi dall’ornitina: ne derivano composti pirrolidinici, pirrolizidinici o derivati come putrescina o spermidina
- Sintesi di composti imidazolici: esiste una via che utilizza l’istidina ed una che utilizza la purina.
Figura 35 Sintesi alcaloidi da istidina e purina (10).
In questa via viene prodotta la caffeina.
Come spesso accade nei sistemi biologici, vi è la possibilità che gli alcaloidi si combinino con altre componenti presenti nella pianta: una classe particolare degli alcaloidi è quella dei glucoalcaloidi detti anche saponine. Le saponine sono composti da una o più unità glucosidiche idrofiliche legate ad un triterpenoide. La loro caratteristica, proprio come evidenzia il nome, è l’attività surfattante che si manifesta con la formazione di schiuma quando miscelati in acqua. Nelle piante hanno un ruolo fondamentale nella difesa da attacchi microbici o da erbivori. Nella dieta, abbassano il livello di colesterolo nel sangue e inibiscono la crescita di cellule tumorali. Alcune saponine però possono essere tossiche sia per l’uomo che per animali e insetti (11).Dalla combinazione con steroli, si possono identificare anche alcaloidi steroidei come la solanidina, un alcaloide caratteristico della famiglia delle Solanaceae.
2.3.4.4 I GLUCOSINOLATI
I glucosinolati sono un gruppo di composti derivati da amminoacidi contenenti atomi di zolfo, e un gruppo derivato dal glucosio o altri zuccheri (11). La loro struttura contiene inoltre uno o più atomi di azoto: risultano perciò una classe piuttosto limitata.
La loro struttura può essere alifatica, aromatica o indolica sulla base dell’amminoacido da cui derivano. Gli amminoacidi che presentano un atomo di zolfo sono la metionina e la cisteina, ma i composti glucosinolati derivano anche dalla fenilalanina, triptofano e tirosina.
Tra questi composti si cita la progoitrina e la sinigrina presente nei cavolfiori, glucoiberina e la gluconasturtiina, presente nei cavoli e nei broccoli.
Dai glucosinati si ricavano pesticidi e sostanze di difesa da attacco di erbivori.
Questi composti vengono facilmente idrolizzati in oli dall’enzima mirosilasi per dare isocianati e derivati che agiscono come protettori da agenti esterni. Inoltre i glucosinolati sono precursori di composti responsabili dell’aroma, soprattutto amaro e pungente di molte verdure (11).
L’enzima mirosilasi è situato negli idioblasti, cellule completamente diverse dal resto dei tessuti che fungono da sacca di riserva per oli, resine e gomme (31).
La biosintesi di questi composti consiste in una prima elongazione dell’amminoacido di partenza, lo sviluppo del cuore della struttura con reazione di ossidazione, solfonazione o glucosilazione che portano ad una struttura di natura basica e infine la modifica delle catene secondarie (31).
Il meccanismo proposto è riassunto in figura 36.
Figura 36 Sintesi composti glucosinolati per azione di agenti patogeni o stress (32).
In figura 36, si evidenzia come la formazione di questi composti possa essere dovuta a condizioni di stress esterni, come agenti patogeni o insetti (32).
2.3.5 METABOLOMICA
La metabolomica è lo studio sistematico delle uniche impronte chimiche lasciate da specifici processi
cellulari; essa riguarda tutti i processi chimici che coinvolgono i metaboliti presenti in un sistema biologico
come una cellula, un tessuto o un organismo nella sua interezza. La metabolomica, nella sua forma più ambiziosa, ha come obbiettivo la caratterizzazione completa di tutti i metaboliti, conosciuti e sconosciuti,
presenti in un certo sistema biologico. Essa trova applicazione in diversi ambiti di ricerca, dal controllo di qualità di prodotti alimentari, alla caratterizzazione strutturale di nuove molecole, all’identificazione di molecole bioattive di interesse farmaceutico, allo studio delle interazioni tra i diversi livelli funzionali di un
organismo biologico (genomico, trascrizionale, metabolico) (33). Ampio sviluppo negli ultimi anni sta
avendo l’applicazione della metabolomica allo studio delle piante, sia nella ricerca di base per approfondire la conoscenza dei meccanismi metabolici, sia per diretta applicazione alimentare o farmaceutica. Uno degli ambiti di interesse è lo studio dei meccanismi di difesa e risposta delle piante, sottoposte a stress ambientali o a modificazioni genetiche, al fine di identificare potenziali applicazioni in ambito agricolo, in un contesto sempre più vicino al cambiamento climatico, per far fronte all’incremento della richiesta alimentare e alla necessità di selezionare organismi resistenti alle più comuni condizioni ambientali sfavorevoli. In questo caso la metabolomica si sta rivelando uno strumento importante per rilevare gli effetti di modifiche genetiche a livello metabolico, identificare gli organismi con determinate caratteristiche di interesse nonché confrontare i profili metabolici di organismi di diverse specie o cresciuti in differenti condizioni ambientali (34).
Mediante l’utilizzo di diverse tecniche analitiche, la metabolomica permette di caratterizzare in modo completo un sistema biologico, identificando le relazioni tra metaboliti e vie biosintetiche e le relazioni causa-effetto tra metabolismo e fattori esterni.
Ogni organismo, qualunque esso sia, ha un proprio pattern di metaboliti primari e secondari che lo identifica e soprattutto diversifica da altre specie. Individuare le componenti chimiche di un sistema, anche in condizioni non usuali, permette di ricostruire i meccanismi metabolici della pianta dalla sua nascita fino alla morte, spontanei o causati da agenti esterni.
Vista la vastità delle matrici ambientali esistenti, la varietà di strumenti analitici che è possibile utilizzare, la numerosità delle tecniche preparative dei campioni impiegate, non esiste a tutt’oggi un metodo univoco di analisi metabolomica, valido per ogni matrice; è stato però possibile negli anni verificare una procedura pre-analitica e strumentale il più adatta possibile ai diversi sistemi biologici.
La nascita del gruppo “Chemical Analysis Working Group” (CAWG) permise la stesura di dati standard minimi riguardanti gli aspetti chimici di un’analisi metabolomica tra cui la preparazione del campione, l’analisi sperimentale, il controllo qualità, l’identificazione dei metaboliti e l’elaborazione dei dati in modo tale da garantire la riproducibilità delle analisi e confrontabilità del dato ottenuto (35).
Sulla base di prove sperimentali e presupposti teorici, il CAWG ha proposto le condizioni operative ritenute migliori per l’analisi metabolomica “untargeted” di campioni biologici, cioè volta all’identificazione non mirata di tutti i metaboliti presenti nel campione (36).
In esso si descrivono i diversi metodi di estrazione del campione, la necessità di avere almeno tre repliche indipendenti di un campione (35), il tipo di conservazione del campione, la tipologia di colonna cromatografica da utilizzare per diversi tessuti, gli strumenti di analisi e relativi parametri, i software di supporto per l’identificazione dei metaboliti.
Le tecniche analitiche più utilizzate in metabolomica sono la spettrometria di massa e l’analisi NMR, che permettono di effettuare misure ad elevata risoluzione, identificando spesso in maniera univoca le molecole, garantendo l’assegnazione di un nome IUPAC a partire da spettri di frammentazione di massa e in relazione alle sue caratteristiche strutturali (risonanza tra atomi attivi).
Ad oggi si utilizzano tecniche via via sempre più sofisticate come la separazione cromatografica con uno strumento UHPLC, accoppiato ad uno spettrometro ad alta risoluzione e accuratezza, l’uso di tecniche ifenate MS-NMR o ancora lo sviluppo di sistemi automatizzati per l’analisi dei dati con il supporto di banche dati sempre aggiornate (33).
La cromatografia permette di definire proprietà come la polarità e idrofobicità delle molecole separate: tempi di ritenzione differenti ne determinano le caratteristiche (33).
La spettrometria di massa, invece, per l’identificazione e la caratterizzazione dei metaboliti, sfrutta la misura accurata del rapporto massa/carica delle molecole, ioni e frammenti, la determinazione dell’abbondanza isotopica relativa degli ioni e infine la frammentazione di alcuni ioni genitori (37).
È possibile stabilire 4 livelli d’identificazione dei metaboliti. I livelli sono i seguenti:
1. Confidently identified compounds 2. Putatively annotated compounds 3. Putatively annotated compounds classes 4. Unknown compounds.
Il primo livello, in cui la probabilità di un’accurata identificazione è alta, si ha confrontando due o più proprietà con uno standard dell’analita, analizzato nelle medesime condizioni di analisi. Nonostante ciò, anche con l’utilizzo di uno standard non è possibile distinguere diversi isomeri con le medesime caratteristiche cromatografiche o di massa, specialmente se stereoisomeri (37).
Si può assegnare un nome a una molecola con livello di confidenza 2 nel caso in cui non si sia in possesso di standard di confronto e si valutino caratteristiche chimico-fisiche e/o spettri di massa presenti in letteratura (35): questo è il livello massimo di accuratezza assegnabile nell’identificazione di analiti in assenza di uno o più standard.
In LC-MS e UHPLC-MS la precisione nella misura del rapporto m/z fa si che siano sufficienti spettri di frammentazione e tempi di ritenzione per confrontare un analita con una molecola a cui è stato precedentemente assegnato nome e struttura (37).
Quando invece sono solo le proprietà chimico-fisiche caratteristiche di una classe di composti ad esser confrontabili con i dati ottenuti, si può assegnare un livello di identificazione 3 (35).
Infine nel livello 4 rientrano tutti i metaboliti a cui non si è assegnato una formula bruta o di struttura oppure quando, pur non avendo conferma da dati di letteratura o database, è possibile ipotizzare una formula bruta nuova.
Per effettuare una corretta identificazione delle molecole nell’analisi untargeted è necessario avere informazioni pregresse riguardo alle molecole che possono essere presenti nel sistema in studio, al fine di poter discriminare tra i composti più o meno probabili all’interno delle librerie o perlomeno delle classi di metaboliti di interesse.
L’identificazione richiede l’utilizzo della formula bruta, il confronto con gli spettri di massa e di frammentazione presenti nelle librerie, che devono essere noti e corrispondere con quelli della molecola ignota. È utile inoltre la conoscenza delle vie biosintetiche e la verifica di una possibile relazione con altre molecole precedentemente identificate.
Sulla base delle conoscenze pregresse dell’utente sul sistema biologico in esame e il suo metabolismo, è possibile infine caratterizzare le componenti chimiche del sistema e verificare gli effetti delle modificazioni genetiche e/o stress subiti.