Considerazioni general

In questo lavoro di tesi sono stati analizzati 12 campioni di Nicotiana Langsdorffii, le cui misure sono state replicate tre volte, tre campioni di controllo (mix) e tre bianchi.

Dalla fase di elaborazione dei dati sono state ottenute complessivamente 335 molecole rilevate attraverso l’analisi in modalità di ionizzazione negativa e 361 dall’analisi in polarità positiva, per un totale di 696 molecole.

Nonostante non sia stato possibile identificarle tutte, per mancanza di informazioni sullo spettro di frammentazione o per assenza di sufficiente letteratura, tutti i metaboliti sono stati utilizzati per l’ analisi statistica; per ridurre la dimensionalità dei dati, estrarre l’informazione più significativa e meglio visualizzare i risultati, sono state effettuate l’analisi delle componenti principali e la cluster analysis, sia per la polarità positiva che negativa; i dati sono stati poi raggruppati per ottenere un’analisi complessiva. Per quanto riguarda le PCA effettuate, sono state valutate le prime tre componenti principali ossia quelle con maggior varianza spiegata, che sono risultate sufficienti a evidenziare le correlazioni tra i dati.

Dai loading plot e dalla verifica manuale dei costituenti più abbondanti nelle diverse tipologie di campioni, sono stati ricavati i metaboliti più caratterizzanti per ciascun tipo di stress applicato e per ciascuna modificazione genetica.

Il processamento dei cromatogrammi è stato effettuato in due fasi separate: in prima battuta si è proceduto all’identificazione dei metaboliti a media/bassa polarità, presenti nella parte centrale e finale del cromatogramma. Successivamente si è deciso di identificare anche i metaboliti presenti nei primi minuti dell’analisi cromatografica, per la maggior parte metaboliti primari o molecole a basso peso molecolare. Le tabelle riassuntive, comprendenti le masse identificate, il tempo di ritenzione, la formula molecolare, la frammentazione della molecola e il livello di identificazione sono riportate in appendice I.

In questo capitolo, invece, i risultati ottenuti sono presentati sotto forma di istogrammi in cui è possibile verificare le variazioni di intensità dei diversi composti, identificati a seconda degli stress o delle modificazioni subite.

È necessario ricordare inoltre che, dall’analisi dei dati estratti mediante PCA per lo stress idrico, per la ionizzazione positiva, non si è potuto ottenere alcun dato significativo: la presenza di polietilen glicole (PEG6000), utilizzato per simulare lo stress idrico nella pianta, non ha permesso l’identificazione di nessun altro analita durante la separazione cromatografica in un ampio intervallo di tempo.

È stata inoltre effettuata una ricerca di fitormoni e molecole considerate di rilievo in risposta agli stress subiti dalle piante. Anche in questo caso, grafici e discussioni sono presentati nei capitoli seguenti, mentre i dati di intensità di segnale raccolti in ciascun campione, sono raggruppati in appendice II.

4.3 Analisi statistica

Osservando i grafici ottenuti dalle analisi statistiche effettuate, si possono fare alcune considerazioni. Innanzitutto la PCA dei dati ottenuti da ionizzazione negativa e positiva insieme, mostra come i campioni di controllo Mix si collochino pressoché al centro dei quadranti: da ciò si può dedurre che tali campioni siano rappresentativi della complessa varietà di analiti presenti in tutti i tipi di campioni.

Figura 69 PCA dati negativi e positivi (prima e seconda componente principale).

In figura 69, è rappresentato lo score plot ottenuto tra le prime due componenti principali: in esso, identificati da differenti colori, si vedono molto ben distinti i campioni soggetti a stress differenti.

Il campione GR idrico si discosta dagli altri campioni sottoposti a stress idrico: la diversità degli analiti e, nel caso di questo tipo di analisi, dei centrotipi individuati, dimostra una netta differenza tra i campioni di Nicotiana wild e geneticamente modificati per il gene rol C rispetto a quelli geneticamente modificati per il gene GR.

Ciò può essere spiegato dal fatto che le piante modificate per il gene GR reagiscono in modo diverso agli stress rispetto agli altri campioni e da ciò derivano anche analiti differenti. Questo non si verifica unicamente con lo stress idrico.

La combinazione tra questa modificazione genetica e lo stress termico comporta una notevole distanza dai campioni con la medesima modificazione non stressati termicamente.

I campioni stressati termicamente inoltre mostrano un elevato peso lungo la prima componente principale piuttosto che sulla seconda.

Come previsto in linea teorica, attraverso l’analisi dei loadings, è possibile verificare le variabili (metaboliti) più significative per uno specifico campione in risposta al relativo stress.

I campioni mix, in rosso, si posizionano al centro, non mostrando importanza per alcuna componente principale, piuttosto vicini ai campioni sottoposti a stress chimico.

Dai dati ottenuti la varianza spiegata con la prima componente principale è il 34.67%, mentre per la seconda il 18.10% per un totale di 52.77%.

La terza componente principale spiega una minore percentuale di varianza (10.83%) ma è in grado di separare più nettamente i campioni GR rispetto alla seconda, confermando una netta diversità delle piante modificate geneticamente per il gene GR. Questa analisi è presente in figura 70.

Figura 70 PCA dati negativi e positivi (prima e terza componente principale).

Gli altri tipi di campioni non vengono ben distinti per la modificazione genetica ma per stress: nella figura, infatti, in basso a destra sono raggruppati i campioni stressati termicamente, a sinistra i campioni non stressati e al centro, separatamente, idrici e stressati chimicamente.

Analizzando gli stessi dati attraverso la cluster analysis, in figura 71, si possono trarre le medesime conclusioni: i campioni stressati termicamente sono raggruppati in modo nettamente distinto da tutti gli altri campioni e con una distanza di collegamento molto piccola; i campioni mix sono molto simili ai campioni stressati chimicamente e le repliche del campione GR Idrico si discostano dai restanti campioni con il medesimo stress ma risultano maggiormente simili ai campioni non stressati.

Figura 71 Analisi dei cluster, dati negativi e positivi, metodo Complete Linkage.

Dall’analisi fatta si evidenzia la presenza di un outlier: il campione NlGR1 si scosta nettamente dalle repliche dello stesso campione. Tale conclusione non era evidente dall’analisi delle componenti principali sopra descritte.

Se si analizzano i dati con ionizzazione negativa separatamente da quella positiva, si possono effettuare ulteriori osservazioni.

Analizzando i dati ricavati in modalità di ionizzazione negativa (figura 72) si possono distinguere nettamente diversi gruppi di campioni.

Figura 72 PCA dati negativi, prima e seconda componente (score plot).

Come visto nei dati precedentemente analizzati, i campioni stressati termicamente sono nettamente distanziati dal resto dei campioni: in questo caso è stato possibile estrarre i loading delle variabili (> 0.5 in prima e seconda componente) e identificare i metaboliti maggiormente significativi per lo stress termico, operazione descritta nel paragrafo 3.4.2.

Anche in questa analisi, come per la ionizzazione negativa e positiva insieme, i campioni non stressati risultano molto simili e ben raggruppati (si riveda la figura 69), come pure quelli stressati chimicamente. In questa PCA si mostra in maniera evidente la presenza del campione NlGR1 come estraneo alle repliche dello stesso campione e i campioni GRidr raggruppati ma separati dai restanti campioni sottoposti a stress idrico.

Inoltre è possibile ottenere una varianza spiegata maggiore rispetto ai dati insieme e in questo caso si raggiunge una percentuale di 56.7%.

Anche per quest’analisi dati, osservando la PCA ottenuta tra la prima e la terza componente principale si verifica una netta separazione dei campioni di Nicotiana L. modificati per il gene GR.

Le altre componenti principali non aggiungono informazione utile agli scopi di questo lavoro di tesi.

In tutte le analisi e discussioni successive per la ionizzazione negativa, per i motivi già enunciati, il campione NlGR1 non è presente.

Segue il grafico dell’analisi dei cluster ottenuta dai dati negativi, in cui è escluso il campione NlGR1, con il metodo di clustering Complete linkage.

Figura 73 Cluster analysis, dati negativi (senza NlGR1), metodo Complete Linkage.

Con entrambi i metodi, risulta evidente la separazione dei campioni GRCR e GRIdrico rispetto ai corrispondenti gruppi formati dalle suddivisioni per stress: stress idrico e chimico formano cluster ben distinti. Tutti i campioni sottoposti a stress termico si raggruppano e si scostano nettamente dagli altri campioni (anche per la modificazione per il gene GR).

Le medesime analisi statistiche sono state realizzate per i dati ottenuti da ionizzazione positiva, ottenendo risultati simili e comparabili: con la prima e seconda componente principale si distinguono in modo netto gli stress subiti dalle piante wild e geneticamente modificate (figura 74), mentre con la prima e terza, come evidenziato dai colori, si possono isolare i tratti tipici delle piante modificate per il gene GR (figura 75).

Figura 74 PCA, dati positivi, prima e seconda componente principale.

Figura 75 PCA dati positivi, prima e terza componente.

La varianza totale spiegata con le prime due componenti è 52.95%, minore rispetto è quella spiegata con l’analisi dei dati in ionizzazione negativa.

Nelle figure 76 e 77, sono rappresentate le analisi dei cluster ottenuti con due metodi statistici differenti. Con il metodo Complete linkage (figura 76), vi sono nette suddivisioni per stress, senza alcuna eccezione e non si evidenzia la distanza tra i campioni NLGR e NLGR1, escluso dalle elaborazioni in ionizzazione negativa.

Figura 76 Cluster analysis, dati positivi, metodo Complete Linkage.

Figura 77 Cluster analysis, dati positivi, metodo di Ward.

L’analisi con il metodo di Ward, invece, mostra come campioni di piante naturali e modificate rol C siano molto più simili rispetto ai campioni modificati per il gene GR, in particolare quello stressato idricamente che si allontana molto dai campioni sottoposti al medesimo stress.

In quest’ultima analisi si nota anche come la distanza di legame sia lievemente maggiore rispetto a quella registrata nelle analisi precedenti con lo stesso metodo. Ricorrendo alle basi teoriche, la distanza è un parametro inverso rispetto alla similarità e per questo, i campioni analizzati con ionizzazione positiva dovrebbero essere maggiormente differenti tra loro rispetto a quella negativa.