con Cs e Cm rispettivamente la concentrazione dell’analita nella fase stazionaria e nella fase mobile.
Un valore elevato del coefficiente di ripartizione indica che l’analita ha notevole affinità con la fase stazionaria.
Un rivelatore collegato ad un computer, misura la concentrazione del soluto nella fase mobile e, dopo l’elaborazione dei dati, riporta il segnale in funzione del tempo: si ottiene così un cromatogramma (figura 37), un grafico costituito da una serie di picchi, rappresentanti l’eluizione dei singoli analiti.
Il cromatogramma è un tracciato del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente, dall’istante in cui la miscela è introdotta nella colonna fino al momento in cui raggiunge il rivelatore (49). Gli analiti, uscendo dalla colonna in tempi differenti (diversi tempi di ritenzione), possono così esser distinti sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo, in quanto l’area sottesa da un picco cromatografico è proporzionale alla quantità di soluto eluito.
Figura 37 Tipico cromatogramma.
In questo lavoro di tesi lo strumento impiegato è un UHPLC (Ultra High Performance Liquid Cromatography) UltiMate 3000 della ditta Dionex (figura 38).
Lo strumento è dotato di due pompe: la fase mobile può essere pompata sia dalla pompa analitica sia da una nano pompa (RSLC nano system): ciò permette di operare una separazione cromatografica anche a flussi molto bassi (alcuni nL/min, con le opportune regolazioni strumentali) e di collegare a questo strumento un analizzatore di massa.
Figura 38 HPLC e spettrometro di massa utilizzati.
Le componenti fondamentali sono evidenziate in figura 38:
1. Il degaser, sistema di eliminazione delle eventuali bolle presenti nel solvente, che potrebbero compromettere l’efficienza cromatografica ed eventualmente il funzionamento dei rivelatori. Sopra il degaser è posto il vano porta bottiglie dei solventi;
2. Alloggiamento della pompa analitica e della nano pompa; 3. Vano termostatato in cui è posta la colonna analitica;
4. Autocampionatore, che permette massima automazione nella fase di prelievo del campione. Parte fondamentale dello sviluppo di una metodica analitica strumentale è sicuramente la scelta della colonna: numerose sono le tipologie di colonne nel mercato, diverse per il tipo di fase stazionaria, per la lunghezza e diametro, per le diverse dimensioni dei pori della fase stazionaria.
Come suggerito dal protocollo per le analisi metabolomiche (36), viste le caratteristiche di polarità delle molecole solitamente presenti, la colonna utilizzata è una C18-reverse phase ossia costituita da una fase stazionaria apolare e fase mobile polare, adatta alla separazione ottimale di sostanze semi/poco-polari.
In questo lavoro di tesi è stata utilizzata una colonna Zorbax SB-Aq (Stable Bond), colonna resistente a pH molto bassi per la stabilità chimica di legame, a temperature elevate (T massima 80°C) e caratterizzata da un’elevata riproducibilità in diverse fasi mobili acide. La fase stazionaria è costituita da silani a elevata purezza con catene laterali diisopropiliche che proteggono stericamente il legame silossanico sulla superficie della silice da attacchi idrolitici (figura 39).
I gruppi alchilici R sono coperti da brevetto.
Gli eluenti della fase mobile utilizzati sono acqua (solvente A) e acetonitrile (solvente B): il primo permette di separare nei primi minuti della corsa cromatografica le componenti più polari del campione, mentre l’acetonitrile è adatto alla separazione di molti composti semi-polari e gli isomeri.
Seguono i parametri utilizzati: - Fasi mobili
A= H2O 0.01% AF
B= ACN 0.01% AF
- Corsa cromatografica (gradiente di volume degli eluenti) in figura 40.
Figura 40 Corsa cromatografica.
- Velocità di flusso 200 µL/min
- Volume d’iniezione 5 µL
- Temperatura della colonna 30°C
La corsa cromatografica è relativamente lunga: prevede una fase iniziale di isocratica in solvente polare (H2O) in cui vengono separati i composti più polari presenti nei campioni, poiché non sono trattenuti dalla
fase stazionaria non polare, seguita da una lenta variazione della percentuale di volume di solvente B (ACN) fino al 45° minuto, in cui si ha l’eluizione solo di acetonitrile.
Arrivati a questo punto del gradiente di volume %, la totalità dei composti è stata eluita e separata.
0 20 40 60 80 100 0 5 45 60 63 78 % B T (min)
CORSA CROMATOGRAFICA
Figura 39 Rappresentazione della fase stazionaria della colonna cromatograficaZorbax SB-Aq.
Ridurre il tempo della corsa cromatografica comporterebbe il rischio di perdere parte dell’informazione utile (alcuni analiti potrebbero co-eluire), ridurre la risoluzione di isomeri, aumentare la soppressione del segnale e favorire la formazione di addotti nella sorgente di ionizzazione (36).
Nel protocollo si ritengono sufficienti 60 minuti (36).
Per verificare la pulizia della colonna e controllare la riproducibilità dell’analisi, in termini di composizione e/o concentrazione degli analiti, all’inizio, al centro e alla fine della sequenza di analisi sono stati introdotti lavaggi con acqua, con la medesima corsa cromatografica. Inoltre all’inizio della sequenza sono state effettuate almeno 3 analisi a vuoto, iniettando 5 µL di un campione di mix, in modo da permettere alla matrice di entrare in equilibrio con la fase stazionaria.
Nella Cromatografia liquida i rivelatori più utilizzati sono:
-Rivelatori che rispondono alle proprietà fisiche globali della fase mobile come l’indice di rifrazione, la costante dielettrica, la densità ecc.
-Rivelatori delle proprietà del soluto come assorbanza, fluorescenza, intensità di corrente ecc. I rivelatori più utilizzati sono detector UV-visibile o IR, ma sempre maggiore diffusione acquistano gli spettrometri di massa (49).
3.2.4.2 SPETTROMETRIA DI MASSA
La spettrometria di massa è una tecnica che permette la separazione, sulla base del diverso rapporto massa/carica (m/z), di ioni, presenti in miscele complesse, generati mediante ionizzazione degli analiti in esame.
Dapprima il composto viene ionizzato, gli ioni prodotti vengono separati nell’analizzatore secondo il loro rapporto m/z e raggiungono il rivelatore, dove, attraverso l’emissione secondaria di elettroni, si genera il segnale elettrico opportunamente ampliato per produrre lo spettro di massa.
La tecnica permette inoltre di dare una misura dell’abbondanza relativa dei singoli ioni. Lo schema a blocchi in figura 41 rappresenta i costituenti fondamentali dello strumento.
Figura 41 Schema a blocchi spettrometro di massa.
Come riportato in figura 41, la parte successiva alla sorgente ionica, in cui gli ioni sono sottoposti ad analisi spettrometrica, è realizzata in condizioni di vuoto spinto, circa tra 10-5 e 10-8 Torr.