Materiali e metod

3.1 I campioni: piante di Nicotiana Langsdorffii

La Nicotiana L. è un genere di piante appartenente alla divisione delle Magnoliophyta e alla famiglia delle Solanaceae. È una pianta proveniente dal Nord e Sud America, dall’Australia, dal Sud Africa occidentale e dal Pacifico meridionale. Si contano circa 57 specie conosciute di Nicotiana, dai vari utilizzi (38).

Di tutte le specie, la più conosciuta è Nicotiana Tabacum, sfruttata per la produzione di foglie di tabacco: il nome deriva dal francese Jean Nicot, ambasciatore francese in Portogallo, che nel 1561 la presentò alla corte reale francese come farmaco per eliminare alcuni tipi di vermi o parassiti dell’intestino;

successivamente venne utilizzata nel continente americano come pianta ornamentale e per la produzione di tabacco.

La Nicotiana è una delle piante più intensamente studiate, non solo per l’importanza economica ma anche per quanto riguarda i problemi legati alla salute dell’uomo (38).

Numerosi studi riguardano la sua evoluzione, diffusione, le caratteristiche fisiologiche e molecolari. È stata inoltre utilizzata lungamente come pianta modello per lo studio degli effetti dovuti all’applicazione di modificazioni genetiche, in particolare a Nicotiana Langsdorffii Weinmann e Nicotiana Glauca.

Nel presente lavoro di tesi la specie utilizzata è Nicotiana Langsdorffi Weinmann sia di tipo Wild, ossia senza alcuna modificazione, sia soggetta a mutazione genetica e/o sottoposta a stress ambientali. La modificazione genetica, ossia l’inserimento nella pianta di un contenuto genetico non proprio, produce uno sbilanciamento nell’equilibrio dei fitormoni presenti e un significativo cambiamento nella risposta di difesa agli agenti esterni (39).

Le piante, prodotte in vitro come cloni e cresciute in condizioni controllate, sono state sottoposte a stress biotici (modificazione genetica) e abiotici (stress termico, idrico e chimico (CrVI_{)) per verificare la risposta}

chimica e metabolica della pianta e gli eventuali effetti dovuti alla combinazione di stress diversi sul medesimo organismo.

Le piante analizzate sono state trasformate con il gene per il recettore dei glucocorticoidi di ratto (recettore GR) e con il gene ROL C, proveniente da Agrobacterium rhizogenes: per entrambe le modificazioni

genetiche, la moltiplicazione di ciascun genotipo è stata ottenuta prelevando porzioni dello stelo comprendenti gli internodi (40) e inserite nella pianta wild di Nicotiana.

Il recettore GR è il recettore a cui il cortisolo e altri glucocorticoidi si legano: essi appartengono alla classe degli ormoni steroidei presenti in molte cellule di animali vertebrati, funghi e piante.

Il nome glucocorticoidi (glucose + cortex + steroid) deriva dalle seguenti caratteristiche: regolazione della produzione del glucosio, estrazione dalla corteccia surrenale e struttura steroidea. Fin tanto che il recettore non è legato al suo ormone, esso si trova nel citosol della cellula.

Per quanto riguarda la relazione con il glucosio, essi ne regolano la quantità nel sangue, aumentandone la concentrazione o mantenendola costante mediante meccanismi di accumulo o d’inibizione dei meccanismi che lo producono, come l’idrolisi dei grassi.

La loro eccessiva presenza però può causare vari effetti negativi tra cui lo scorretto assorbimento del calcio o l’aumento del rischio d’infezioni.

Regolano inoltre i geni che controllano lo sviluppo, il metabolismo e la risposta immunitaria.

Una volta legati, il recettore e l’ormone formano un complesso che viene trasferito, attraversando la membrana plasmatica, nel nucleo della cellula, dove si lega ai cosiddetti GRE (elementi di risposta dei glucocorticoidi) nella regione del promotore dei geni, attivando il processo di trascrizione genica.

Questo processo è detto transattivazione, mentre quello inverso transrepressione. Un esempio di GRE è il DNA-elemento di risposta che attiva il gene di trascrizione dei geni (41).

In base al tipo di cellula si avrà una risposta differente: le proteine codificate nella trasattivazione hanno numerosi effetti come l’azione antiinfiammatoria, determina l’aumento della glucogenesi e l’attività dell’enzima tirosina ammino-transferasi. La proteina ottenuta dalla trascrizione e traduzione di un

frammento di DNA ricombinante (ossia ottenuto dalla combinazione di materiale genetico proveniente da specie diverse, come per un plasmide con il gene d’interesse inserito in un organismo ospite) è detta proteina ricombinante e il prodotto è un organismo geneticamente modificato.

L’Agrobacterium rhizogenes è un batterio Gram-negativo del suolo che produce nelle piante dicotiledoni la malattia definita come radici pelose: induce cioè la formazione di radici laterali da quelle secondarie, condizionando lo sviluppo della pianta (42).

Il plasmide contenuto nell’Agrobacterium rhizogenes è il Ri-plasmide (root inducing).

Nelle piante del genere Nicotiana, i geni dell’Agrobacterium più utilizzati sono rolA, rolB e rolC: il loro effetto è un aumento della capacità delle auxine di modificare la differenza di potenziale elettrico inter- membrana delle cellule modificate. Il gene rolC inoltre aumenta la velocità di formazione di gibberelline e citochinine (43), oltre che di alcaloidi del tropano, dell’indolo e antrachinonici (44).

L’oncogene rolA si è verificato determini un aumento di produzione di nicotina e di antrachinoni nelle piante, il rolB invece nella produzione di resveratolo, un importante stilbene che rallenta la formazione e lo sviluppo di carcinomi (44).

Oltre alla modificazione genetica, le piante utilizzate sono state sottoposte ad alcuni stress abiotici (stress idrico, stress termico, stress chimico).

Le condizioni di stress possono causare cambiamenti nel sistema genetico, fisiologico o ormonale della pianta (45).

Per indurre le condizioni di stress idrico è stato utilizzato, mediante aggiunta nel terreno di coltura, del polietilen glicol 6000 (PEG6000), un polimero in grado di simulare la carenza di acqua nelle piante, il cui numero indica il peso molecolare medio del polimero sintetizzato.

Questo si comporta come un agente osmotico di non-penetrazione dell’acqua dal sistema radicale della pianta, causando un notevole aumento del potenziale osmotico del soluto ΨS (46).

Il potenziale osmotico, dovuto alla presenza di ioni che trattengono l’acqua diminuendone la concentrazione, è solo uno delle tre componenti del potenziale idrico 𝛹𝐼.

Il potenziale idrico è comprensivo di potenziale osmotico ΨS, potenziale di pressione Ψp e potenziale di

matrice ΨT (equazione [8]).

𝛹𝐼= 𝛹𝑝− 𝛹𝑆− 𝛹𝑇

Equazione 8 Potenziale idrico espresso come funzione del potenziale osmotico, del potenziale di pressione e del potenziale di