AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR

La PCR o reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction), consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L’amplificazione mediante PCR consente di ottenere ”in vitro” molto rapidamente la quantit`a di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.

Tuttavia, a dispetto di uno schema intuitivo e semplice, si tratta di un processo particolarmente problematico dal punto di vista sperimentale, in quanto vi sono molti fattori capaci di comprometterne la resa. Gran parte di questo lavoro di tesi `e stato finalizzato alla definizione di tali parametri:

1) La temperatura di ”annealing” e il tempo 2) La struttura dei primers

3) La temperatura di elongation e il tempo 4) Le condizioni di reazione

5) Il numero di cicli

6) Eventuali additivi (DMSO).

Figura 3.18: Rappresentazione schematica di una RT-PCR

mazione di legami a idrogeno fra le basi complementari (G - C ed A - T o U) per la formazione di un doppio filamento antiparallelo stabile. La forza ionica della miscela di reazione influenza la Ta ( Temperatura di appaiamento o annealing): se tale forza `e inferiore a 150mM, la Tm (temperatura di melting o fusione) `e generalmente minore di 100◦

C. Infatti la PCR funziona con temperature di denaturazione comprese tra 91◦

C e 97◦

C. L’enzima Taq polimerasi ha una emivita di 30 minuti a 95◦

C, in tutti i protocolli `e pertanto sconsigliato fare pi `u di 30 cicli di PCR. Tempo e temperatura sono le principali cause di denaturazione o perdita di attivit`a della Taq, pertanto la minimizzazione di tali parametri consentir`a di aumentare il numero dei cicli possibili. Si dovrebbe scegliere una Ta di circa 5◦

C al di sotto del valore minimo di Tm relativo alla coppia di primers da utilizzare. Tuttavia, una Ta troppo bassa pu `o provocare il legame aspecifico dei primers a sequenze diverse dal vero bersaglio, effetto accettabile se si volessero ampli- ficare obiettivi simili o correlati ma che d’altra parte potrebbe portare ad un prodotto di amplificazione indesiderato, con la riduzione della resa di quello atteso. Una Ta troppo alta pu `o comportare un legame limitato dei primers determinando ugualmente una scarsa resa del prodotto. Una coppia di primer con Ta molto diverse non pu `o dare un apprezzabile rendimento di un unico prodotto, e pu `o comportare l’amplificazione ”asimmetrica” di una singola sequenza. La temperatura di appaiamento ottimale per

Figura 3.19: Rappresentazione schematica delle nostre reazioni.

i primers sintetizzati nel nostro laboratorio `e compresa tra 49◦

C e 72◦

C. Nelle reazioni di PCR, pertanto, abbiamo scelto temperature intermedie entro l’intervallo 57◦

C-62◦

C, ma i risultati migliori sono stati ottenuti a 58◦

C.

La lunghezza e la sequenza dei primers hanno un ruolo critico per la riuscita del- l’amplificazione (come `e stato detto in precedenza).

La temperatura di ”elongation” (fase di polimerizzazione) `e normalmente compre- sa tra 70◦

C e 72◦

C e si completa in tempi compresi tra 0.5 e 3 min. L’enzima Taq ha, in realt`a, un’attivit`a ottimale a 37◦

C, ma pu `o lavorare anche a temperature molto pi `u alte perch´e l’allungamento ha inizio dopo il processo di formazione del complesso enzima-DNA che ne aumenta considerevolmente la stabilit`a. A circa 70◦

C l’attivit`a `e ottimale e l’estensione ha una velocit`a di 100 basi/sec. `E necessario circa 1 minuto per l’amplificazione di sequenze da 2 kb (Innis e Gelfand, 1990). Tempi maggiori sono utili nei cicli successivi, quando la concentrazione del prodotto supera quella degli enzimi. Per ottimizzare le condizioni di amplificazione, abbiamo effettuato prove sistematiche

Figura 3.20: Variazione della concentrazione dei primers.

verificando:

a) le concentrazioni di stampo e primers b) la concentrazione di magnesio

c) l’utilizzo di additivi denaturanti

d) le variazioni delle condizioni di temperatura.

Sono state svolte delle prove modulando diversi parametri, in primo luogo le con- centrazioni di primer e di stampo. Le PCR di controllo, allestite senza stampo ma solo con i primers in diverse concentrazioni (figura 3.20), hanno evidenziato che la banda relativa al prodotto indesiderato si viene a formare nelle lane dove `e presente il cam- pione contenente entrambi i primers, mentre `e ben visibile dal gel che i primers da soli funzionano bene.

Come detto precedentemente, un altro fattore importante per la buona riuscita della PCR `e la concentrazione di MgCl2, che influenza l’attivit`a dell’enzima Taq polimerasi.

Per ottimizzare le condizioni che favoriscano la resa del nostro prodotto sono state fatte diverse prove con concentrazioni di Mg2+comprese tra 7,5 mM e 10 mM.

La miscela di reazione (100µl), preparata secondo lo schema precedentemente illustra- to, `e stata suddivisa in 2 aliquote da 50µl ciascuna. Una viene indicata come ”UL” ed `e la miscela che contiene Upper e Lower primers senza per `o avere lo stampo; l’altra `e indicata come ”N35” e contiene il template.

Da entrambi i campioni sono stati prelevati 5µl come controllo, prima dell’aggiunta dell’enzima. I 45µl rimasti sono stati divisi in 6 aliquote nelle quali sono stati aggiunti i differenti volumi di MgCl2 50 mM in modo da testare concentrazioni di 7,5 - 8 - 8,5 -

9 - 9,5 - 10 mM di Mg2+. Questi prodotti sono stati valutati anche a un diverso numero di cicli (7 e 15).

I risultati migliori si ottengono dopo 15 cicli di PCR e con concentrazioni di Mg2+ comprese tra 7,5 e 8,5 mM (figura 3.21).

Il profilo termico impostato `e caratterizzato dai seguenti stadi: - Denaturazione Iniziale: 95◦ C x 5’ - 4 Cicli ”freddi”: Denaturazione: 95◦ C x 30” Annealing: 57◦ C x 5’ Estensione: 67◦ C x 2’ - 7/15 Cicli ”caldi”: Denaturazione: 95◦ C x 30’ Annealing: 65◦ C x 2’ Estensione: 72◦ C x 30” - Conservazione: 4◦ C ∞

Figura 3.21: Gel d’agarosio relativo a una PCR in presenza di diverse concentrazioni di ioni Mg2+e con un diverso numero di cicli ”caldi”.

Nonostante vari esperimenti di PCR in cui, oltre ai fattori descritti precedentemente, sono stati variati gli intervalli di temperatura relativi sia ai cicli ”freddi” che ai cicli ”caldi”, la presenza, nei gel d’agarosio, di una permanente banda relativa all’UL, ci ha spinti ad utilizzare il dimetilsolfossido (DMSO). Questo agente denaturante `e stato usato per inibire, durante la PCR, la formazione di strutture secondarie nel DNA stampo o nei primers. `E stato aggiunto alla miscela di PCR prima della reazione, perch´e interferisse con la formazione di strutture di DNA complementari a loro stesse, cos`ı da minimizzare le reazioni indesiderate. Tuttavia l’uso del DMSO pu `o aumentare la frequenza delle mutazioni. Le concentrazioni saggiate variano tra l’1% e il 5% del volume di reazione, prove sperimentali (PCR+gel) hanno dimostrato che il DMSO

all‘1% dava una diversificazione tra la banda relativa all‘UL e all‘ N35 mentre con percentuali del 5% non si amplificava quasi nulla. Pertanto `e stata fatta una PCR con DMSO all’1% e diverse temperature dei cicli ”freddi” per ottimizzare la differenza tra UL e N35. La figura 3.22 dimostra che alla temperatura di 62o_{C si vede una buona}

differenza tra la lane relativa all’UL e quella dell’N35 mentre a 60o_{C la variazione `e}

meno evidente.

Figura 3.22: Gel d’agarosio relativo a una PCR con DMSO all’1% e diverse temperature dei cicli ”freddi”.

Tuttavia, successivi esperimenti fatti per confermare l’utilit`a dell’impiego del DMSO all’1% nella miscela di reazione e 62◦

C nei cicli ”freddi”, hanno dimostrato ancora una volta la presenza di un amplificato indesiderato relativo al UL (Upper+ Lower primers senza lo stampo).

Abbiamo svolto pertanto un altro esperimento di PCR, partendo da soluzioni molto pi `u diluite di stampo e primers (10µM anzich´e 100µM), secondo il protocollo indicato da Piasecki, Hall ed Ellington [20]. In queste condizioni di PCR l’UL non si amplifica mentre il nostro prodotto di interesse d`a origine a una banda ben visibile nel gel

d’agarosio. La miscela di reazione utilizzata `e indicata nello schema 3.24. Nel profilo

Figura 3.24: Miscela di reazione migliore.

termico la temperatura di annealing dei cicli freddi `e stata impostata a 58◦C e quella dei cicli caldi a 68◦C. La figura 3.25 illustra il risultato ottenuto.

Figura 3.25: Amplificazione del prodotto desiderato su gel d’agarosio.

Il profilo termico che alla fine abbiamo adottato per le nostre PCR `e indicato nella figura 3.26. Si pu `o, dunque, affermare che i migliori risultati di amplificazione sono stati ottenuti con:

• temperature di denaturazione di 94◦

C • temperature di appaiamento di 58◦

C per i cicli ”freddi” e 68◦

C per quelli ”caldi” • temperature di elongazione di 70◦

C per i cicli ”freddi” e 72◦

C per quelli ”caldi”.

Queste temperature, infatti, garantiscono una buona amplificazione del prodotto (in termini di una banda di amplificazione ben distinguibile su gel d’agarosio) mante- nendo una adeguata molteplicit`a.

Figura 3.26: Profilo termico delle nostre PCR.

Nella tabella 3.24 sono riportate le condizioni di reazione che alla fine sono state utiliz- zate e gli intervalli di concentrazione sperimentati, realizzati variando il quantitativo di acqua per mantenere un volume di reazione costante.

Da notare che l’uso di un additivo come il DMSO, un solvente polare aprotico che inibisce la formazione di strutture secondarie sia nel DNA stampo che nei primers, non ha prodotto vantaggi apprezzabili ed `e stato scartato.