In tutti gli esperimenti `e stato sempre utilizzato il kit AmpliScribe T7 High Yield Transcription Kit (Epicentre). Le quantit`a usate sono state calcolate per avere, oltre alla attesa reazione di trascrizione, anche un certo grado di amplificazione degli RNA trascritti. Per ogni reazione la miscela e le concentrazioni dei componenti sono:
La mix di trascrizione viene lasciata reagire per 4 ore a 37◦C in un bagno termo- statato o in stufa. Terminata la reazione di trascrizione, lo stampo a DNA deve essere rimosso dalla miscela per evitare sue interferenze con il processo di selezione e pertanto viene digerito aggiungendo ad ogni campione 1µl di DNAase I RNAase free (1unit`a/µL) compresa nel kit di trascrizione e facendo avvenire la digestione a 37oC per 30 min.
4.3.1
PURIFICAZIONE
Il prodotto di trascrizione viene purificato mediante precipitazione in soluzione di EtOH/AcONa. Questa miscela, leggermente diversa da quella per precipitare il DNA,
Figura 4.2: Schema di una miscela di amplificazione.
`e costituita da 0,1 volumi di NaOAc (Fluka) 3 M pH 5,2 e 3 volumi di EtOH (Carlo Erba); 3,4 volumi di questa mix vengono aggiunti alla soluzione di trascrizione e la sospensione risultante viene mantenuta a -20oC per 12 ore per la precipitazione del RNA. Al termine, il precipitato viene recuperato mediante centrifugazione a 4oC per 30 min ad una velocit`a di 13000 rpm (Centrifuge 5415 R -Eppendorf); come descritto in precedenza nel caso del DNA, si effettuano 2 lavaggi del precipitato con EtOH al 70%.
4.4
SELEZIONE
Le metodologie di selezione e recupero sono state progressivamente modificate per migliorare le rese, aumentare la ”stringenza” della selezione, minimizzare le possibili contaminazioni e ridurre i tempi. Le quantit`a e le concentrazioni di bersaglio utilizzate ad ogni ciclo sono illustrate di seguito nello schema 4.3:
4.4.1
PRETRATTAMENTO DEL CAMPIONE E DELLA RESINA
La collezione di RNA purificata viene ridisciolta in una soluzione di tampone, Selex Buffer, progettato per la selezione in grado di fornire gli ioni necessari alla stabilizza- zione e alla formazione del legame con il bersaglio.La composizione del Selex Buffer 1X pH =7,4 `e: 20mM Tris-(idrossimetil)-aminometano (Fluka)
Figura 4.3: Schema di una miscela di amplificazione.
150mM NaCl (Fluka) 5 mM KCl (Sigma) 1 mM MgCl2 (Sigma)
Acqua sterile RNAase free (Epicentre)
Per la selezione sono stati utilizzati 25µl di resina di streptavidina, una quantit`a in largo eccesso calcolando che gi`a 9µl di resina sono sufficienti a catturare 1,8 nmoli di peptide biotinilato (le specifiche parlano di una capacit`a di legame di 6 mg di biotina- BSA per ml che corrispondono a circa 88 nmoli di biot-BSA per ml).
La resina utilizzata per la selezione (Streptavidin Sepharose High Performance GE Health- care) deve essere lavata per allontanare i conservanti presenti: viene posta in un filtro Nanosept con pori da 45µm e si effettuano due lavaggi da 1 ml di acqua sterile, si me- scola e si lascia precipitare; si effettua uno spin in centrifuga e si allontana la soluzione di conservazione. Infine si condiziona la resina con 4 aliquote da 50µL ciascuna di Selex buffer 1x centrifugando dopo ogni aggiunta.
4.4.2
CONTROSELEZIONE VERSO LA MATRICE DELLA
COLONNA DI AFFINIT `A
La collezione di RNA precipitato dopo la trascrizione viene sciolto in: - 80µL acqua RNase free
- 40µL Selex buffer 5X - 20µL RNase Inhibitor
Questa soluzione viene messa a contatto con i 25µl della sospensione della resina di streptavidina condizionata si lascia per 30 min in un dispositivo termostatico a secco
(Thermomixer compact-Eppendorf ) regolato alla temperatura di 37◦
C e a una intensit`a di oscillazioni di 500 rpm, per favorire il legame. Al termine, la miscela viene filtrata per centrifugazione di 1 min a 10000 rpm (Centrifuge 5415 D-Eppendorf ) attraverso un filtro con porosit`a da 45µm (Centrifugal devices, nanosep MF GHP 45µm-PALL); il filtro viene successivamente lavato con 50µl di tampone di selezione recuperando in un’unica provetta filtrato e lavaggio. Il campione recuperato rappresenta tutta la popolazione degli oligonucleotidi che non legano la resina e servir`a quindi per la successiva selezione positiva.
4.4.3
SELEZIONE DELLE SPECIE AFFINI
Condizioni di bassa selettivit`a
Al filtrato ottenuto dopo la fase di selezione negativa viene aggiunta una quantit`a nota di peptide mimetico e la soluzione viene lasciata a reagire per 1 ora a 37oC nel
dispositivo termostatico a secco a una intensit`a di oscillazioni di 500 rpm. Alla soluzione di selezione vengono aggiunti 25 µl della sospensione della resina di streptavidina lasciando reagire per ulteriori 2 ore a 37◦
C nel dispositivo termostatico a secco a 500 rpm. Al termine, la sospensione viene trasferita in un filtro da centrifuga con porosit`a da 45µm e centrifugata a 10000 rpm per 1 minuto; si effettuano 3 lavaggi col tampone di selezione: nel filtrato sono presenti gli oligonucleotidi non affini al bersaglio mentre quelli dotati di affinit`a rimangono trattenuti sul filtro.
Condizioni di alta selettivit`a
Nelle fasi pi `u avanzate della selezione, alla streptavidina condizionata (25µl) ven- gono aggiunti volumi variabili della soluzione di peptide mimetico in tampone di selezione e la miscela viene incubata nel thermomixer a 37oC alla frequenza di 700
rpm, per far avvenire il legame streptavidina-biotina. Dopo 1 ora si aggiunge l’eluato ottenuto dalla selezione negativa e la nuova miscela viene fatta reagire nel thermomixer per altre 2 ore nelle stesse condizioni. Al termine, la miscela di reazione viene trasferita in un filtro da centrifuga con porosit`a da 45µm e centrifugata a 10000 rpm per 1 minuto; si effettuano 3 lavaggi con tampone di selezione: il filtrato contiene gli oligonucleotidi non affini al bersaglio mentre la frazione affine `e recuperata sul filtro.
Selezione con la proteina intera
Alla soluzione di RNA in tampone di selezione si aggiunge un’aliquota da 0,5 nmoli di proteina MPO commerciale (Myeloperoxidase from human leukocytes 192units/mg- Fluka) e si lascia reagire in thermomixer a 37oC a 500rpm per 4 ore. Al termine, la soluzione
viene caricata su di un filtro da ultrafiltrazione in grado di trattenere proteine di taglia ≥ a 100 kDa (Microcon centrifugal filter devices YM-100-Millipore) e centrifugata a 4oC per
10 min a 12000 rpm; anche in questo caso si effettuano 3 lavaggi da 50 µl di tampone di selezione.
4.4.4
RECUPERO DELLE SPECIE AFFINI
Il materiale trattenuto dal filtro dopo i 3 cicli di lavaggi rappresenta il complesso RNA-peptide biotinilato-resina di streptavidina. Per recuperare le specie legate ab- biamo utilizzato una soluzione di EDTA (Sigma) 10 mM opportunamente preriscaldata fino alla temperatura di 70oC. Si effettuano 5 cicli di trattamenti di recupero usando 50µl di soluzione calda di EDTA per ognuno. Il trattamento di recupero viene effettuato a caldo nel thermomixer per qualche minuto e, alla fine, la soluzione contenente le specie di RNA affini viene raccolta mediante centrifugazione a 10000 rpm per 1 minuto. La soluzione finale di questi RNA sar`a di 250µl in EDTA.
Recupero dopo la selezione con la proteina intera MPO
Il materiale trattenuto su filtro dopo la fase di selezione fra collezione combinatoria e proteina intera MPO viene recuperato mediante risospensione e centrifugazione inver- sa, quindi analizzato. Alla fine, dopo l’analisi spettrofotometrica all’UV, si recuperano 1,8 ml della soluzione di RNA-proteina.
Si procede in due fasi: denaturazione e digestione.
1) Denaturazione: si aggiungono alla soluzione da digerire 180µl di SDS al 10% per ottenere SDS (conc. Finale 1%) e 180µl di β-mercaptoetanolo al 10% (conc. finale 1%). La miscela `e lasciata reagire 5min a 95oC e poi raffreddata lentamente fino a tempera- tura ambiente.
2) Digestione: si aggiungono, alla soluzione denaturata, 9µl di Proteinasi K 100 µg/ml (Promega V 302 B) e si lascia digerire per 3 ore e 30 minuti a 60oC.