3.3 PREPARAZIONE DELLA COLLEZIONE
3.3.3 SELEZIONE
La selezione rappresenta la fase pi `u delicata di tutto il procedimento, durante la quale si trattengono le sequenze oligonucleotidiche capaci di legare selettivamente il bersaglio desiderato.
Gli RNA precipitati dopo la trascrizione vengono solubilizzati nel tampone di selezione e poi messi a contatto con una soluzione del peptide MPO per favorirne il legame. I complessi formati tra RNA e peptide vengono catturati attraverso una resina di affinit`a contenente streptavidina stabilmente immobilizzata su una matrice solida polimerica. La streptavidina, infatti, `e una proteina che ha un’altissima affinit`a per la biotina e in virt `u di questa capacit`a di legame `e in grado di recuperare praticamente tutto il peptide MPO della soluzione di selezione, compreso quello che ha legato le specie oligonucleo- tidiche di nostro interesse. Ripetuti lavaggi successivi assicurano l’allontanamento dell’RNA non legato ancora presente in soluzione. Il recupero delle molecole selezio- nate viene infine effettuato con l’utilizzo di EDTA a caldo che, oltre a favorire l’apertura delle regioni a doppio filamento (denaturazione), chela il Mg2+, un agente importante per la strutturazione tridimensionale dell’RNA. Questo comporta la distruzione della geometria necessaria per l’interazione fra RNA e bersaglio e favorisce sia il distacco degli RNA selezionati dalla matrice sia il loro recupero.
Preparazione del campione da selezionare
Allo scopo di favorire un ripiegamento della molecola di RNA che renda possibile il legame con il bersaglio `e stata studiata la composizione di un tampone in grado di mantenere pH fisiologico, elevata forza ionica e alta concentrazione di magnesio. In particolare una forza ionica sufficientemente grande favorisce gli accoppiamenti a doppia elica intramolecolari (stem) ed il magnesio `e indispensabile per una corretta conformazione tridimensionale della molecola di RNA, contribuendo a stabilizzare strutture aperte e loops. `E stata preparata una soluzione madre di questo tampone 5 volte pi `u concentrata (5X) rispetto alla diluizione finale per favorire l’uso di piccoli volumi senza creare eccessive dispersioni dei campioni trascritti. Gli RNA precipitati dopo la trascrizione vengono solubilizzati e lasciati condizionare in questo tampone di selezione opportunamente scaldato, in modo da denaturare le molecole per poi permetterne una spontanea rinaturazione con il lento raffreddamento della soluzione.
Cicli di selezione
• Nei primi cicli del processo di selezione `e conveniente usare un largo eccesso del peptide biomimetico rispetto alle esigue quantit`a delle sequenze dotate di affinit`a per il bersaglio. In queste condizioni il legame degli RNA con il peptide `e favorito dall’elevata mobilit`a delle due specie in soluzione, ed il successivo
legame streptavidina-biotina per la cattura dei complessi formati `e favorito dalle alte concentrazioni di peptide e di resina adoperati.
• Nei cicli pi `u avanzati del processo di selezione, nei quali si presume che la miscela si sia arricchita delle specie pi `u affini al bersaglio, si devono usare condizioni pi `u selettive. Per questo motivo le quantit`a di peptide biomimetico devono essere ridotte tanto che la loro cattura, da parte della matrice contenente streptavidina, potrebbe divenire critica. Si preferisce quindi intrappolare preventivamente il peptide con la matrice e successivamente metterlo in contatto con l’RNA da catturare. In queste fasi, il legame `e pi `u difficile a causa dell’ingombro sterico della matrice e della ridotta mobilit`a della struttura peptidica intrappolata nel complesso con la streptavidina. Di conseguenza, il processo descritto risulta pi `u selettivo. Inoltre, accrescendo i volumi nei quali avviene il legame fra le specie affini di RNA e il complesso peptide mimetico-resina, la selettivit`a pu`o essere ulteriormente aumentata.
• Poich´e nel corso della selezione la collezione di RNA entra in contatto con altre strutture molecolari, oltre al bersaglio, che possono legare alcune delle specie contenute nella collezione, si rende necessario un semplice passaggio aggiunti- vo che permette di allontanare proprio quelle specie che si legano ad esempio alla resina ed alla streptavidina interferendo con la selezione desiderata. Que- sti cicli, detti di ”selezione negativa”, vengono effettuati per ridurre il legame di molecole aspecifiche e sono condotti nelle stesse condizioni degli altri, con la sola differenza che i trascritti non vengono incubati con il peptide, come in ogni ciclo, ma la collezione di RNA viene messa in contatto con un’aliquota della re- sina di streptavidina. L’eluato rappresenta, in questo caso, il campione di RNA pronto per la fase di legame con il bersaglio. Con questo stratagemma si ritiene di poter ridurre fortemente il numero di specie dotate di legame aspecifico e di favorire un considerevole arricchimento della miscela di molecole specifiche per il peptide-MPO.
Recupero delle specie selezionate
Indipendentemente da quale sia il ciclo di selezione (iniziale o avanzato), il recupero delle specie affini viene effettuato con la medesima procedura descritta precedentemen- te. Dapprima si eseguono accurati e ripetuti lavaggi della resina con lo stesso tampone usato per la selezione, per assicurare l’allontanamento delle sequenze aspecifiche. Suc- cessivamente, l’RNA legato alla matrice di selezione viene recuperato per denaturazio- ne mediante soluzione di EDTA 10 mM a caldo (∼70◦C): il calore destabilizza i legami a idrogeno e l’EDTA, in qulait`a di agente denaturante, chela il magnesio, che, come gi`a accennato, contribuisce alla strutturazione tridimensionale dell’RNA. In questo modo l’RNA, non avendo pi `u la geometria utile al legame, si distacca e pu `o essere eluito e
recuperato per filtrazione. Per minimizzare la perdita delle specie legate, sicuramente poco rappresentate, in particolare nei cicli iniziali, vengono eseguiti 5 lavaggi in EDTA a caldo. Un inconveniente di questo procedimento `e la generazione di grossi volumi finali in cui vengono a trovarsi gli oligoribonucleotidi. Questi ultimi, infatti, saranno sottoposti ai successivi processi di retrotrascrizione e amplificazione, le cui condizioni richiedono concentrazioni e tamponi rigidamente definiti.
Selezione e recupero dopo il trattamento con la proteina MPO intera
Nella selezione dell’aptamero contro MPO abbiamo sistematicamente usato il pep- tide mimetico. Tuttavia, per essere certi che la geometria del peptide sia conservata nella proteina intera ed esposta in posizione accessibile, abbiamo deciso di effettuare un ciclo di selezione intermedio utilizzando come bersaglio la proteina. Selezionando le specie col solo utilizzo del peptide mimetico potrebbe accadere che gli aptameri se- lezionati, sebbene leghino la struttura peptidica, non facciano lo stesso con la proteina intera, vanificando il processo di selezione.
Questo procedimento comporta ovviamente dei cambiamenti nelle condizioni di la- voro e necessita di una descrizione a parte. La struttura molecolare `e notevolmente diversa sia come dimensioni che geometria rispetto al materiale oligopeptidico. Inoltre, non essendo biotinilata, la proteina non pu `o essere catturata dalla resina di streptavi- dina, pertanto si `e pensato di aggirare questo problema utilizzando dei filtri a porosit`a controllata che permettono il passaggio di molecole a peso molecolare minore di 100 kDa ”cutoff molecolare” (Microcon YM-100). Questi filtri, poich´e impediscono il pas- saggio della proteina attraverso le loro maglie, trattengono di conseguenza anche gli RNA che si sono specificamente legati ad essa, mentre gli altri RNA privi di affinit`a possono passare indisturbati. In questo modo si riescono ad evitare ulteriori passaggi (biotinilazione della proteina e cattura con la streptavidina).
Il protocollo di selezione con la proteina prevede il contatto in soluzione della collezio- ne di RNA con la mieloperossidasi umana in una piastra termostatica, ”thermomixer”, per 4 ore a 37oC per mimare le condizioni fisiologiche. La miscela, come anticipato
precedentemente,viene poi fatta passare attraverso i filtri Microcon YM-100 e su que- sti vengono effettuati 3 lavaggi. A questo punto si procede all’eluizione delle specie affini con EDTA a caldo come visto per i cicli precedenti. Tuttavia, in questo caso, il recupero non `e soddisfacente: da un lato questo fatto `e interpretabile positivamen- te perch´e potrebbe sottintendere la presenza di specie gi`a spiccatamente affini per la proteina, dall’altro `e un dato fortemente critico perch´e rischia di determinare la per- dita a causa del mancato recupero delle specie migliori, in termini di capacit`a di legame.
Data la particolare forza del legame fra oligonucleotide e MPO, si `e deciso di pro- cede al recupero delle specie affini attraverso la digestione della proteina in condizioni denaturanti. Queste destrutturano l’RNA e contemporaneamente distruggono le strut-
Figura 3.28: Amplificazione del prodotto selezionato con MPO (lane 5)
ture peptidiche a cui esso si lega. La tecnica di denaturazione/digestione, comunque, dovr`a tener conto delle caratteristiche di stabilit`a dell’RNA che, come gi`a detto nella descrizione delle propriet`a chimiche (sottoparagrafo 1.1.1), `e resistente ai denaturanti ma labile ai pH alcalini. Il protocollo seguito, che `e stato progettato e sperimentato precedentemente nel nostro laboratorio, prevede un primo stadio di denaturazione a 90oC con SDS e βMercaptoEtanolo all’1% seguito da un lento raffreddamento e da
un secondo stadio in cui si digerisce la proteina con proteinasi K a 60oC. La verifica
dell’effettiva riuscita del processo `e stata svolta direttamente attraverso la fase di ampli- ficazione. L’RNA cos`ı recuperato `e stato sottoposto a precipitazione con EtOH/AcONa. Sul precipitato, opportunamente disciolto, `e stata effettuata la reazione di amplifica- zione mediante RT-PCR (20 cicli anzich´e i soliti 15) per verificare l’effettiva presenza di RNA. Il risultato finale, analizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio, `e indicato nella figura 3.28.