CROMATOGRAFIA LIQUIDA A SCAMBIO IONICO

Tutte le analisi di cromatografia liquida ad alta risoluzione vengono effettuate mediante ”High Performance Liquid Cromatography” (HPLC) (Pompa serie 200 ”LC PUMP”- Perkin Elmer; Totalchrom chromatography software - Perkin Elmer) utilizzando una colonna preparativa a scambio anionico forte Source 15Q (1x16cm) (GE Healthcare ) la cui fase stazionaria `e costituta da sali di ammonio quaternario legati ad un supporto polimerico inerte (copolimero stirene-divinilbenzene). La colonna viene equilibrata al flusso di 1 ml/min con una miscela sterile acquoso-organica composta da:

• SOLUZIONE B (inerte): contiene TRIS (Fluka) 20 mM ed acetonitrile al 10% (V/V) di acetonitrile (Sigma) e rappresenta;

• SOLUZIONE A (eluente) contiene TRIS (Fluka) 20 mM, NaCl (Sigma) 1 M ed acetoni- trile al 10% (V/V) di acetonitrile (Sigma).

Entrambe le soluzioni devono essere preparate di fresco, filtrate con una membrana da microfiltrazione in nitrocellulosa Millipore (cut-off 0.22 µm). La corsa viene effettuata operando un gradiente salino lineare ottenuto variando la composizione relativa della miscela dal 15% al 85% di SOLUZIONE A in 30 minuti. Completato il gradiente salino, la corsa prosegue per altri 10 minuti in maniera isocratica al 75% di SOLUZIONE A. Al termine la colonna viene sottoposta a trattamento di spurgo facendo fluire il 100% di SOLUZIONE A per 5 minuti. Prima della corsa successiva si procede con 15 minuti di equilibratura nelle condizioni iniziali di miscelazione delle soluzioni A e B. La rivela- zione e quantificazione dei picchi avviene con un rivelatore spettrofotometrico tarato nella regione dell’UV alla lunghezza d’onda di 260 nm (Rivelatore Series 200 UV-VIS detector - Perkin Elmer).

Capitolo

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CONCLUSIONI

La presente Tesi di Laurea, accogliendo le istanze del progetto della Comunit`a Euro- pea per la produzione di aptameri in grado di riconoscere e legare in maniera specifica l’enzima MPO, ha realizzato un lavoro sistematico di razionalizzazione per tutte le tappe della selezione in vitro delle specie molecolari. L’attivit`a svolta ha fondato le sue radici su esperienze pregresse del gruppo ospitante raccogliendone le indicazioni e costruendo su queste le idee progettuali sperimentate. In particolare, nell’ambito della procedura SELEX, ogni tappa `e stata analizzata focalizzandone i principi teori- ci e progettandone le condizioni operative. Le successive prove sperimentali hanno consentito di ricavare conferme, smentite ed aggiustamenti delle ipotesi elaborate, co- me `e avvenuto per l’amplificazione mediante RT-PCR ove, oltre agli studi relativi alle temperature ottimali di annealing e di estensione, sono stati effettuati quelli riguardanti le concentrazioni di stampo, di primers e di magnesio e quelli riguardanti il numero ottimale dei cicli. I controlli analitici eseguiti hanno consentito di capire le cause che generavano, nel corso delle amplificazioni mediante PCR, delezioni consistenti o talo- ra multimerizzazioni delle sequenze recuperate. Le modifiche apportate al protocollo originario e l’attuazione di accorgimenti sperimentali specifici hanno portato al supera- mento di tali inconvenienti e rappresentano uno dei risultati pi `u promettenti di questa Tesi.

Analogamente uno studio sistematico `e stato effettuato sulla reazione di trascrizio- ne ”in vitro” e sugli stadi di selezione, cattura e recupero delle specie molecolari affini al bersaglio. Degno di nota `e il particolare tipo di protocollo che `e stato progettato e realizzato per convertire inizialmente lo stampo di DNA nella primitiva collezione com- binatoria degli RNA. Si tratta infatti di un punto molto delicato perch´e deve rispondere alla necessit`a di ottenere il massimo delle combinazioni possibili (teoricamente circa 1015 _{specie diverse), ognuna delle quali poco rappresentata, e allo stesso tempo deve}

fornire, per ciascuna, una rappresentativit`a assicurata in seguito da una amplificazione di PCR. La scelta di effettuare una semplice primer-extension, prima della trascrizione ”in vitro” con T7 RNA polimerasi, ha dimostrato di essere particolarmente efficace.

Infatti questa importante modifica della procedura sperimentale, evitando eccessive manipolazioni, limita le perdite molto rischiose in questa fase della selezione ed as- sicura una pur sempre consistente amplificazione dei trascritti rispetto alla collezione originaria, rappresentando un ulteriore risultato positivo.

Dopo una considerevole mole di lavoro, si pu `o affermare di avere messo in piedi un metodo sicuramente molto controllato e non pi `u aleatorio per la selezione ”in vitro” di aptameri. Inoltre, anche se il numero di cicli completi che abbiamo potuto realizzare in questo breve lasso di tempo non `e ancora sufficiente per l’isolamento della frazione dotata di elevata selettivit`a per il bersaglio, questo traguardo `e a portata di mano entro un breve periodo. Una considerazione a parte va riservata alla metodologia messa in atto per la splint-ligation. Questa tecnica, nonostante le complicazioni teoriche neces- sarie alla progettazione di splint e linker, `e certamente un approccio vantaggioso per velocizzare l’identificazione delle specie dotate di una pi `u alta affinit`a per il bersaglio. Pertanto, si pu `o prevedere che tale metodo consenta la riduzione del numero di cicli di selezione. Infatti pu `o rendere possibile una valutazione dell’affinit`a per il bersaglio gi`a a partire da stadi intermedi della selezione usando molti trascritti di specie clonate che non devono essere necessariamente ridotti ai pochi esemplari derivanti da procedure spinte di selezione.

Questa Tesi di Laurea costituisce, pertanto, un solido punto di partenza per l’impie- go di un protocollo finemente controllato applicabile universalmente per la selezione di aptameri verso bersagli di qualsiasi natura.

Ringraziamenti

Vorrei ringraziare il dottor Lorenzo Citti che mi ha dato la possibilit`a di svolgere que- sto lavoro di tesi, permettendomi di avvicinarmi a un mondo difficile e appassionante come quello della ricerca, che mi ha trasmesso il grande entusiasmo per tutto ci `o che fa e che avuto parole di conforto nei miei momenti pi `u difficili.

Ringrazio infinitamente tutte le ragazze del laboratorio, Claudia per il bel sorriso con cui mi ha accolta e la sua dolcezza, Antonella per le attenzioni e le delicatezze, Silvia per la disponibilit`a e il tatto ma soprattutto Lorena e Caterina, che mi hanno guidata in questo ultimo anno con grande competenza e disponibilit`a e con le quali si `e subito creata quella sintonia che per me `e fondamentale.

Un ringraziamento speciale ai miei amici (prima che colleghi) Maria, Konsta, Manuel e Claudia con i quali ho condiviso tutte le mie esperienze da quando sono a Pisa, grazie per le risate, per i consigli, per le vostre spalle e le vostre mani, per le finestre che abbiamo aperto insieme sul mondo, per avere elaborato la nostra ”speciale”-chimica, per le nottate in piazza Cavalieri e gli abbigliamenti ”a tema”, per le pizze e le cene cinesi la sera prima degli esami, per la vita da pubblicit`a dei ”pocket coffee”, per i gelati da Coppelia, meritati o meno :-)...senza di voi non avrei mai potuto fare un percorso di vita cos`ı ricco...

Grazie a Silvia e a Valeria, punti di riferimento sempre presenti in questi anni nono- stante le distanze (pi `u o meno prolungate), che mi hanno sostenuta nei momenti pi `u duri aiutandomi a guardare avanti con forza ed ottimismo.

Grazie a Domenico per l’affetto e la partecipazione discreta a tutte le mie vicessitu- dini, grazie per le torte di Rosa e le focacce, per i consigli da ”consulente di immagine” e non solo, per le risate e i lavori di casa.

Gran parte del merito va a mia sorella...mio punto di riferimento, mia colonna por- tante e spesso mia parte complementare, grazie per avere scelto Pisa, per essermi stata

vicina e per aver capito senza palare, per esserti arrabbiata quando ne valeva la pena, per avermi trascinato all’esame di biologia molecolare (...), per avermi sopportata ripe- tere nonostante il mio tono soporifero e le mie manie dittatoriali, per aver ”partorito” insieme a me i miei esami e condiviso le mie ansie, per avermi protetta, per le telefo- nate da Pungilupo e le fughe all’ormai ”nostro numero 11”, per i regalini di ritorno da Empoli ogni volta che me li aspettavo...Se non ci fossi stata tu io oggi non sarei qui, grazie.

Un ringraziamento speciale, ma `e dire davvero troppo poco, a Roberto, la mia ancora di salvezza, che mi `e stato sempre accanto in questi ultimi anni con grande amore e pazienza, diventando, al bisogno, anche il mio personale tecnico infomatico e revisore stilistico, senza di te non sarei potuta andare da nessuna parte, grazie per tutto quello che hai fatto per me e per quello che abbiamo condiviso :-*.

Infine vorrei ringraziare i miei genitori, che mi hanno permesso tutto questo...Grazie per avermi incoraggiata e per aver creduto in me, per la vostra fiducia e la partecipa- zione, per essermi stati vicini nei momenti pi `u neri, improvvisandovi in dei ruoli poco facili per voi :-) , grazie per avermi sempre spinta ad andare avanti e per aver sopportato le mie telefonate ”a raffica” in prossimit`a degli esami. Vi voglio bene.

Con Affetto,

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