3.2 GENERAZIONE DELLA COLLEZIONE
3.2.1 STUDIO E PROGETTAZIONE DELLE SEQUENZE
La collezione combinatoria `e costituita, oltre che dalla regione centrale casuale, an- che da sequenze note conservate che servono per il legame dei primers necessari per la trascrizione e l’amplificazione. Le porzioni conservate sono state progettate con l’aiuto del programma RNA-Structure e sono state scelte dopo aver effettuato studi basati su tre principi fondamentali:
1) Specificit`a 2) Stabilit`a 3) Compatibilit`a.
1) La Specificit`a dei primers verso la sequenza complementare cui sono destina- ti evitando ibridazioni non specifiche `e un aspetto affrontato valutando i seguenti parametri:
• L’unicit`a: nello stampo deve esserci un solo sito per il legame dei primers.
• La lunghezza: `e stata scelta in modo da ottenere il miglior compromesso fra unicit`a e possibilit`a di avere temperature di denaturazione (Tm) e di appaiamento (Ta) opportune (vedere il paragrafo seguente). `E stato osservato che la lunghezza ideale `e compresa tra 15 e 25 nucleotidi.
• La composizione nucleotidica della sequenza: influenza sia la specificit`a del lega- me del primer che i parametri della termodinamica dell’appaiamento e favorisce l’ottenimento di Tm e Ta opportune, con segmenti oligonucleotidici pi `u corti.
2) La Stabilit`a `e la base della persistenza di un ”duplex” fra primer e stampo nelle condizioni di PCR fissate. Questa viene studiata scegliendo opportunamente:
• L’energia libera di formazione di un ”duplex”: calcolata in funzione dell’ener- gia dei nucleotidi vicini, tracciando un grafico delle ∆G di tutti i nucleotidi dei primers. Per minimizzare amplificazioni aspecifiche `e importante che la stabilit`a all’estremit`a 5’ sia alta e quella relativa all’estremit`a 3’ sia bassa in modo che la funzione di innesco per la DNA polimerasi sia attiva solo nel caso di appaiamento perfetto.
• La temperatura di denaturazione (Tm): definita come la temperatura alla quale met`a del DNA `e a singolo filamento e l’altra `e a doppio filamento. Una grande quantit`a di G+C comporta una Tm pi `u alta a causa dell’elevato numero di legami a idrogeno. Esistono diversi metodi per calcolare la Tm e sono rappresentati nella figura 3.3; ∆H e ∆S sono rispettivamente la variazione di entalpia e di entropia; C `e la concentrazione molare dei primers; R `e la costante dei gas.
Figura 3.3: Metodi per calcolare la Tm.
• La temperatura di appaiamento (Ta): `e la temperatura alla quale i primers si legano allo stampo. `E necessario che ci sia una differenza di circa 30◦
C tra la Tm del prodotto e la Ta per assicurare una elevata entit`a di legame dei primers allo stampo (template). La Ta viene calcolata a partire dalla Tm:
Ta = Tmprimer− 4◦C; oppure 0, 3 × Tmprimer+ 0, 7 × Tmproduct
3) La Compatibilit`a, che riguarda anche la condizione di esercizio di entrambi i primers. Questi, infatti, dovranno lavorare bene nelle stesse condizioni di PCR e avere una temperatura di denaturazione il pi `u possibile coincidente. A tale scopo sono stati fatti numerosi studi analizzando le sequenze dei primers. La strutturazione spontanea deve essere attentamente esaminata per valutare la formazione di eventuali ripiegamenti intramolecolari (sia come DNA che come RNA) e di appaiamenti bimolecolari ”omo” cio`e tra due Upper Primer (UP-UP), e due Lower Primer (LP-LP) o ”etero” (UP-LP).
Sulla base dei principi ispiratori precedentemente descritti, la progettazione dei primers ha dovuto tenere conto anche delle esigenze dei processi molecolari previsti nel
metodo SELEX: trascrizione, retro-trascrizione, primer-extension e amplificazione. La sequenza antisenso selezionata per la sintesi dello stampo di DNA lunga 72 nucleotidi `e rappresentata di seguito (sequenza 1-figura 3.4).
Figura 3.4: Schema della struttura dell’upper primer e della sequenza antisenso
Il passaggio dalla sequenza 1 alla sequenza 2 si attua, infatti, con una reazione di ”primer extension” mediante l’utilizzo di un PCR Upper Primer (in figura). Il suddetto primer `e costituito da due segmenti contigui: il primo, complementare alla struttura del DNA a singolo filamento (regione in verde della sequenza 1), `e necessario per l’am- plificazione mediante PCR mentre il secondo, all’estremit`a 5’, riproduce la sequenza di legame per l’enzima T7 RNA polimerasi, indispensabile per la successiva trascrizione. L’amplificazione pu `o essere effettuata utilizzando il secondo primer progettato (Lower Primer) complementare all’estremit`a 3’ dello stampo combinatorio.
La reazione di estensione, illustrata nella figura 3.5, restituisce la sequenza di DNA a doppio filamento di 91 coppie di basi originariamente progettata su cui pu `o essere realizzata l’amplificazione mediante PCR.
Figura 3.6: Comparazione delle Tm di Upper e Lower Primer.
La figura 3.6 mostra i dati ottenuti dall’analisi effettuata sui primers prescelti sul- la base dei parametri precedentemente descritti. Si pu `o osservare una sostanziale coincidenza delle temperature di denaturazione dei due primers (75◦
C e 74,7◦
C rispetti- vamente). La minima differenza stimata tra le Tm di UP e LP (di 0,3◦
C), garantisce una denaturazione di entrambi i primers alla stessa temperatura, rendendo pi `u agevole il loro impiego in PCR. Al contrario, una differenza sostanziale tra le loro Ta assicura, una volta abbassata la temperatura della PCR, l’esclusivit`a del legame dell’UP allo stampo. Le propriet`a delle due sequenze relative alle condizioni di PCR, alla formazione di dimeri e di forcine sono riportate negli schemi delle figure 3.7 e 3.8. Questi dati rivelano una sola possibile formazione di dimeri degna di nota, relativa all’appaiamento della porzione ”T7 binding site” con se stessa, per una lunghezza di 6 coppie di basi. Questo dimero, comunque, risulta avere energia relativamente bassa (solo -6,7 kcal/mol), quin- di facilmente disgregabile con un riscaldamento iniziale della miscela di PCR. Questo `e un fatto estremamente positivo perch´e il T7 binding site non `e modificabile e rappresen- ta un elemento irrinunciabile nella strategia di SELEX che `e stata disegnata. Si osserva anche una struttura a forcina geometricamente possibile ma, poich´e caratterizzata da una energia libera di formazione positiva (+1,60 kcal/mol), pu`o essere considerata un evento trascurabile.
Come ultima fase della progettazione, abbiamo cercato di ridurre la lunghezza della sequenza combinatoria, in modo da limitare la perdita di rendimento nel corso del- la sintesi chimica. A questo scopo, dovendo produrre l’aptamero ad RNA con una reazione enzimatica di trascrizione in vitro, `e stato omesso, nello stampo sintetico, l’in- serimento della porzione relativa al sito di legame per l’enzima T7.
Figura 3.7: Analisi delle interazioni bimolecolari omo.
quenza relativa al suo innesco. Tale innesco dovr`a essere ogni volta ricostruito dopo la trascrizione inversa, nel corso dell’amplificazione di PCR ad opera dell’Upper-Primer (UP) che contiene come estensione al 5’ la sequenza ”consensus” per la T7 RNA poli- merasi. Questa strategia offre il vantaggio di richiedere la preparazione di un segmento pi `u corto di DNA riducendo i problemi di efficienza della sintesi chimica automatica, che aumentano proporzionalmente alla lunghezza del prodotto di sintesi.
La bont`a della strategia progettata, le cui condizioni sono descritte nel capitolo 4, `e stata convalidata indirettamente dai risultati sperimentali dell’amplificazione mediante PCR e dalla trascrizione ”in vitro” illustrati di seguito.