3.2 GENERAZIONE DELLA COLLEZIONE
3.2.2 PROTOCOLLO DI SINTESI DEGLI OLIGONUCLEOTIDI
che abbiamo scelto nella sintesi delle sequenze impiegate per la splint ligation ed `e stata effettuata avvalendosi della chimica delle fosforoammiditi. Tale metodo prevede la rei- terazione di cicli di accoppiamento di monomeri ad una catena crescente di nucleotidi eseguiti in maniera automatica dal sintetizzatore per acidi nucleici 3400 DNA Synthe- sizer dell’Applied Biosystem. La sintesi avviene in fase solida, in condizioni anidre ed in atmosfera inerte di Argon. I monomeri utilizzati sono iβ-cianoetil fosforoammiditi. La strategia dell’accoppiamento consiste nella assoluta esclusivit`a della reazione che si viene a creare fra l’OH, al 5’ (nucleofilo) dell’ultimo residuo inserito nella catena ancorata al supporto solido, e un atomo di fosforo reso elettron-deficiente (elettrofilo) situato in posizione 3’ del monomero da aggiungere. Affinch´e queste condizioni siano possibili, `e necessario che tutti i gruppi funzionali presenti ovunque sulla catena e sui monomeri siano opportunamente protetti per il tempo necessario a impedire reazioni secondarie indesiderate.
Tali monomeri, nel caso del DNA, sono costituiti da un nucleo 2’-deossiribosidico con le seguenti caratteristiche:
• Al gruppo ossidrilico in posizione 1’ `e legata la base azotata mediante legame N- glicosidico. I gruppi amminici esociclici delle basi sono protetti da un gruppo benzoile (Bz) per la citosina e l’adenina e da un gruppo isobutirrilico (iBu) per la guanina. • Al gruppo ossidrilico in posizione 3’ `e legato un atomo di fosforo (stato di ossidazione +3) protetto da un gruppo β -cianoetile e da un gruppo N,N-diisopropilamminico. • L’ossidrile in posizione 5’ `e protetto con un gruppo dimetossitritile (DMT).
Il primo desossinucleotide al 3’ dell’acido nucleico `e ancorato, tramite uno spazia- tore con cui forma un legame estereo, al supporto solido, costituito da vetro a porosit`a controllata (CPG), di cui sono riempite le colonnine di sintesi utilizzate. Il sintetizza-
Figura 3.9: Schema del ciclo di sintesi chimica degli acidi nucleici.
tore immette i diversi reagenti nella colonnina regolando i flussi secondo le istruzioni del protocollo, che indica sia il numero di impulsi di reagente erogati (quantit`a) sia il tempo di permanenza di questo nella colonnina di reazione. Il ciclo di sintesi degli oligonucleotidi pu `o essere diviso in quattro fasi e schematizzato come nella figura 3.9.
1. Detritilazione (Deblock)
La prima fase (Figura 3.10) del processo prevede la rimozione del gruppo DMT dalla posizione 5’ del nucleoside legato al supporto o comunque dell’ultimo monomero della catena crescente. La deprotezione viene effettuata con acido tricloroacetico in soluzione anidra di diclorometano (TCA/DCM). Il gruppo protettore esce dalla reazione sotto forma di catione dimetossitritile, che oltre ad essere una specie carica positivamente possiede una colorazione arancio intenso. `E possibile monitorare quantitativamente per via conduttimetrica (sfruttando la carica dello ione) o per via spettrofotometrica (sfruttando la colorazione dello ione) l’entit`a della deprotezione del primo monomero ancorato al CPG ed in seguito, ad ogni ciclo, la resa della reazione di accoppiamento appena avvenuta. Dal momento che le basi della catene sono sensibili agli acidi, specialmente le purine, la tappa di detritilazione non deve essere troppo lunga.
Figura 3.10: Deprotezione.
2. Accoppiamento (Coupling)
In questa fase, nella colonna di reazione viene inviata una soluzione in acetonitrile anidro della fosforoammidite successiva (Figura 3.11). Quest’ultima viene miscelata in loco con una soluzione di tetrazolo in acetonitrile anidro. Il tetrazolo `e utilizzato per attivare la fosforoammidite, infatti, essendo un acido debole `e in grado di protonare il gruppo diisopropilaminico in modo tale da renderlo un buon gruppo uscente. At- traverso un attacco nucleofilo, il 5’-OH del monomero ancorato al supporto solido e, nelle fasi successive l’ultimo monomero della catena crescente, reagisce con l’atomo di fosforo elettron-deficiente legato all’idrossile al 3’ del monomero attivato. Per questo motivo `e importante avere un ambiente completamente privo di gruppi idrossilici in colonna. Tale condizione `e mantenuta usando acetonitrile anidro come solvente per tutti reagenti e mantenendo le bottiglie pressurizzate con argon purificato.
Figura 3.11: Accoppiamento.
3. Ossidazione (Oxidation)
Questa fase prevede l’ossidazione del fosfito triestere formatosi a fosfato triestere inviando in colonna una soluzione di iodio in soluzione acquosa, in modo da ottenere il canonico fosfato triestere del DNA. Il fosfito sarebbe altrimenti sensibile agli acidi usati per la rimozione del tritile ed alle basi usate per la deprotezione finale. Questo `e l’unico passaggio del ciclo che non avviene in ambiente anidro.(Figura 3.12)
4. Blocco delle sequenze non accoppiate (Capping)
In questa fase tutte i gruppi 5’-OH che non hanno reagito con l’ultimo monomero aggiunto vengono bloccati in modo permanente. Questa fase risulta molto importante perch´e impedisce la formazione di sequenze sbagliate, minimizza la lunghezza delle impurit`a e semplifica il processo di purificazione. A questo scopo una soluzione di ani- dride acetica e N-metilimidazolo in THF viene inviata in colonna: la reazione produce l’estere acetico degli ossidrili al 5’ della catena oligonucleotidica che risultano ancora liberi (Figura 3.13).
Figura 3.13: Capping.
• Cicli: dopo il capping pu `o essere iniziato un nuovo ciclo, partendo dallo stadio di deblock del DMT della posizione 5’ dell’ultimo monomero appaiato e dall’attivazione del nucleotide successivo. Questa serie di cicli viene automaticamente ripetuta finch´e la sequenza programmata dell’oligonucleotide non sia stata completata.
• Detritilazione finale: dopo l’accoppiamento dell’ultimo nucleotide della sequenza si pu `o scegliere se rimuovere o meno il dimetossitritile terminale. Spesso, il gruppo tritilico viene mantenuto per facilitare stadi successivi di purificazione del prodotto finale specie quando si faccia uso di cromatografia liquida in fase inversa. In questo lavoro, abbiamo scelto, invece, la rimozione del gruppo tritilico al 5’ terminale perch´e la strategia di purificazione adottata prevede l’uso di una cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC) a scambio ionico.
• Recupero della sintesi: al termine della sintesi, l’oligonucleotide deve essere recupe- rato dalla colonnina di supporto e tutti i gruppi protettori devono essere eliminati per poter ottenere un DNA ”nativo” con i vari gruppi funzionali liberi di interagire tra loro e consentire l’azione dei primers e della RNA polimerasi. La colonnina contenente la fase solida deve essere manualmente rimossa dal sintetizzatore ed il contenuto solido viene recuperato in una provetta sterile. La mistura viene, quindi, trattata con ammo- niaca concentrata (al 33% in H2O) che scinde il legame che lega il 3’ dell’oligonucleotide al supporto solido e rimuove tutti i gruppi protettori permanenti ancora presenti sul fosfato e sulle basi azotate. Il prodotto risultante `e una miscela di oligonucleotidi di
lunghezza diversa ove il prodotto principale `e la sequenza programmata mentre le altre sono le sequenze bloccate dal capping nel corso del procedimento di sintesi. La soluzione risultante, contenente l’oligonucleotide, viene quindi liofilizzata.
• Purificazione della sintesi: al fine di purificare il prodotto di interesse dalla miscela contenente sequenze abortive (cortameri) e sottoprodotti della deprotezione, `e stata ef- fettuata una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) a scambio ionico. `E stata utilizzata una colonna di livello preparativo in grado effettuare separazioni su quantit`a elevate di campione. La fase stazionaria utilizzata `e una resina a scambio anionico forte costituita da particelle con diametro medio di 15µm che espongono gruppi funzionali di ammonio quaternario inseriti su una matrice stirenica-divinilbenzenica. L’eluizione `e avvenuta applicando un gradiente lineare di NaCl. Lo ione Cl−
, la cui concentrazione viene incrementata nel tempo, compete con le molecole di DNA cariche negativamente. Le sequenze pi `u brevi sono ritenute per tempi pi `u brevi a causa della loro carica pi `u bassa. Al contrario le sequenze pi `u lunghe vengono eluite con tempi di ritenzione pi `u elevati. Il rivelatore utilizzato `e di tipo spettrofotometrico ed `e regolato per la misura dell’assorbanza a 260 nm. Prima di procedere con la separazione vera e propria `e stata effettuata una corsa di prova (analitica) iniettando un piccolo volume della miscela ottenuta in seguito a deprotezione. Tale corsa consente di valutare la qualit`a del pro- dotto sintetizzato, la presenza di cortameri ed altre impurezze e di individuare il tempo di ritenzione del prodotto di interesse da isolare. La successiva corsa ”preparativa” prevede il caricamento di tutte le miscele di sintesi ed il recupero della sola frazione di eluato contenente il prodotto di interesse. La stessa procedura `e stata utilizzata per la purificazione dei primers.
La soluzione ottenuta contiene una notevole quantit`a di sali derivanti dai tamponi usati nella corsa cromatografica. Per questo motivo `e necessaria una desalificazione del prodotto attraverso una cromatografia di esclusione applicando la frazione, raccolta dall’HPLC ed opportunamente concentrata, ad una colonna di gel di Sephadex G50, che consente una buona separazione tra l’oligonucleotide ed i sali. Anche in questo caso l’uscita dell’oligonucleotide `e evidenziata da un rivelatore fotometrico a flusso, collegato ad un registratore. L’oligonucleotide cos`ı purificato viene tarato in soluzione a volume noto e quantificato con una lettura allo spettrofotometro. Al termine del processo, il prodotto puro viene concentrato, liofilizzato e conservato a -20◦
C fino al suo utilizzo.
I risultati ottenuti nella preparazione dello stampo a DNA della collezione combi- natoria e delle diverse specie oligonucleotidiche, sono indicati nella tabella 3.14, dove sono riportate le rese delle sintesi in relazione al valore teorico (31,2% per lo stampo, 41,1% per l’ upper e 69,2% per il lower) e i relativi pesi molecolari. Gli istogrammi nelle figure 3.15(a) - 3.16(a) e 3.17(a), hanno in ascissa il tipo di nucleotide legato durante la sintesi e in ordinata la corrente generata dal tritile (inµA). Gli stessi campioni e quelli relativi alla splint ligation, sono stati analizzati anche mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione, i cui risultati sono illustrati nelle figure 3.15(b) - 3.16(b) - 3.17(b) (relative al selex).
(a)
(b)
Figura 3.15: (a) Istogramma relativo alla sintesi dello stampo per il selex. In ascissa sono riportate le sequenze dei nucleotidi, in ordinata iµAmp`ere ; (b) resa della sintesi dello stampo per il selex .
(a)
(b)
Figura 3.16: (a) Istogramma relativo alla sintesi del primer upper per il selex. In ascissa sono riportate le sequenze dei nucleotidi, in ordinata iµAmp`ere ; (b) resa della sintesi del primer upper per il selex .
(a)
(b)
Figura 3.17: (a) Istogramma relativo alla sintesi del primer Lower per il selex. In ascissa sono riportate le sequenze dei nucleotidi, in ordinata iµAmp`ere ; (b) resa della sintesi del primer lower per il selex .