Stretegie di selezione e sintesi di aptameri finalizzati ad applicazioni analitiche e diagnostiche

Universit `a degli studi di Pisa

Facolt`a di Farmacia

Corso di Laurea Specialistica in

Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

Tesi di Laurea

Strategie di selezione e sintesi di aptameri finalizzati ad

applicazioni analitiche e diagnostiche

Relatori:

Dott. Lorenzo Citti

Prof.ssa Paola Nieri

Candidata:

Antonella Piperno

Matr. 252361

Indice

RIASSUNTO ANALITICO V

1 GLI APTAMERI 1

1.1 PROPRIET `A DEGLI APTAMERI . . . 4

1.1.1 PROPRIET `A CHIMICHE . . . 4

1.1.2 PROPRIET `A DI LEGAME . . . 7

1.1.3 PROPRIET `A FARMACOLOGICHE E TERAPEUTICHE . . . 8

1.1.4 PRODUZIONE DEGLI APTAMERI . . . 10

1.2 APPLICAZIONE DEGLI APTAMERI . . . 12

1.2.1 APTAMERI COME STRUMENTO TERAPEUTICO . . . 13

1.2.2 APTAMERI COME AGENTI DIAGNOSTICI . . . 14

2 SCOPO DELLA TESI 22 3 PARTE SPERIMENTALE 24 3.1 CARATTERISTICHE DEL BERSAGLIO MOLECOLARE . . . 26

3.2 GENERAZIONE DELLA COLLEZIONE COMBINATORIA . . . 28

3.2.1 STUDIO E PROGETTAZIONE DELLE SEQUENZE . . . 28

3.2.2 PROTOCOLLO DI SINTESI DEGLI OLIGONUCLEOTIDI . . . . 33

3.3 PREPARAZIONE DELLA COLLEZIONE COMBINATORIA DI RNA . . . 43

3.3.1 AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR . . . 43

3.3.2 AMPLIFICAZIONE MEDIANTE TRASCRIZIONE . . . 50

3.3.3 SELEZIONE . . . 52

3.3.4 RETRO-TRASCRIZIONE E AMPLIFICAZIONE DELLE SPECIE SELEZIONATE . . . 55

3.4 IDENTIFICAZIONE DEGLI APTAMERI DOTATI DI ALTA SPECIFI-CIT `A DI LEGAME . . . 57

3.4.1 PROGETTAZIONE DELLE SEQUENZE . . . 60

3.4.2 VALUTAZIONE DELLE TEMPERATURE DI DENATURAZIONE (Tm) DELLE SEQUENZE . . . 61

3.4.3 VALUTAZIONE DELLE CONDIZIONI OTTIMALI PER LA CAT-TURA DELL’OLIGONUCLEOTIDE BIOTINILATO . . . 65

3.4.4 DEFINIZIONE DEL PROTOCOLLO SPERIMENTALE DI ”SPLINT LIGATION” . . . 67

4 MATERIALI E METODI 68 4.1 SINTESI E PURIFICAZIONE DEI PRODOTTI . . . 68

4.1.1 SINTESI DELLA COLLEZIONE COMBINATORIA, DEI PRIMERS E DELLE SEQUENZE PER LA SPLINT LIGATION 68 4.1.2 DEPROTEZIONE . . . 69

4.1.3 PURIFICAZIONE . . . 69

4.2 PCR . . . 71

4.2.1 ESTENSIONE DEI PRIMERS . . . 71

4.2.2 RT-PCR . . . 71

4.2.3 PURIFICAZIONE . . . 71

4.3 TRASCRIZIONE . . . 72

4.3.1 PURIFICAZIONE . . . 72

4.4 SELEZIONE . . . 73

4.4.1 PRETRATTAMENTO DEL CAMPIONE E DELLA RESINA . . . 73

4.4.2 CONTROSELEZIONE VERSO LA MATRICE DELLA COLONNA DI AFFINIT `A . . . 74

4.4.3 SELEZIONE DELLE SPECIE AFFINI . . . 75

4.4.4 RECUPERO DELLE SPECIE AFFINI . . . 76

4.5 SPLINT LIGATION . . . 76

4.6 METODI DI CONTROLLO . . . 78

4.6.1 ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSIO . . . 78

4.6.2 ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE . . . 79

4.6.3 CROMATOGRAFIA LIQUIDA A SCAMBIO IONICO . . . 80

5 CONCLUSIONI 81

RINGRAZIAMENTI 83

Riassunto analitico

Negli ultimi anni l’impiego degli aptameri in alternativa agli anticorpi ha avuto un largo sviluppo, un’interessante applicazione `e costituita dal loro uso come biorecettori con finalit`a analitiche e diagnostiche e per la realizzazione di biosensori. Questo lavoro di tesi si inserisce nell’ambito di un progetto finanziato dalla Comunit`a Europea per lo sviluppo di un biosensore per applicazioni biomediche mirate al riconoscimento simultaneo di vari analiti. La scelta di selezionare aptameri in grado di riconoscere e legare la Mieloperossidasi (MPO) `e dovuta al grande valore diagnostico di questo enzima.

La MPO `e un’emoproteina espressa dai neutrofili polimorfonucleati che ha una si-gnificativa azione pro-infiammatoria e pu `o contribuire direttamente al danno tissutale; `e un enzima presente in tre isoforme di lunghezza simile (attorno a 700 amminoacidi) che derivano dallo splicing alternativo del gene che le codifica.

Si `e deciso di selezionare aptameri contro un bersaglio cos`ı complesso per via di due fattori principali:

• l’emergente importanza diagnostica della proteina nel settore infiammatorio e car-diovascolare, livelli plasmatici elevati di questa possono infatti predire precocemente il rischio di infarto miocardico e di avversi eventi cardiaci maggiori da 1 a 6 mesi dopo la loro rilevazione (secondo uno studio condotto alla Cleveland Clinic Foundation) • la volont`a di produrre un protocollo di evoluzione ”in vitro” delle specie che rap-presenti un modello generale applicabile a qualsiasi bersaglio proteico, prescindendo dalla reperibilit`a della proteina intera a livello commerciale.

La specifica applicazione dell’aptamero prevede la sua immobilizzazione su un sup-porto solido e, una volta immobilizzato, che questo debba essere in grado di riconoscere la molecola bersaglio. Parallelamente alla selezione di oligonucleotidi in grado di lega-re la proteina MPO `e stata quindi messa a punto anche una metodica per l’ottenimento, per via enzimatica, di sequenze oligonucleotidiche in grado di essere immobilizzate e coniugate con altre molecole. Per quanto concerne il processo di evoluzione/selezione ”in vitro” delle specie con maggiore affinit`a per la MPO, sono state messe a punto le fasi relative alla preparazione della collezione combinatoria: amplificazione e

trascri-zione delle sequenze di RNA da selezionare, separatrascri-zione tra le sequenze che legano la molecola bersaglio e quelle che non hanno affinit`a per essa. Particolare attenzione `e stata necessariamente rivolta alla messa a punto delle condizioni migliori per l’ampli-ficazione delle sequenze per la PCR. Sono stati ottimizzati infatti il numero di cicli, le temperature di appaiamento ed estensione, la concentrazione dei primers e quella degli ioni magnesio.

Contemporaneamente con i cicli di selezione ”in vitro”, `e stato messo a punto un metodo per ”ancorare” le sequenze di RNA, ottenute mediante trascrizione, ad un supporto solido tramite l’addizione di una porzione oligonucleotidica. Questa tecnica, denominata splint ligation, prevede la ligazione enzimatica tra la sequenza di RNA e la molecola definita linker che termina con un gruppo amminico alifatico primario, necessario per l’immobilizzazione o la marcatura. Per promuovere tale reazione le estremit`a delle due molecole sono poste in contatto grazie ad una terza molecola detta splint, la quale `e complementare per una parte all’estremit`a del trascritto e per l’altra al linker. Si forma cos`ı un complesso che porta le estremit`a nella posizione ottimale per la ligazione enzimatica. Questa metodica `e stata messa a punto facendo uso di un trascritto modello (TSH) e sono state studiate e sintetizzate le sequenze per l’applicazione del metodo alla collezione utilizzata per la selezione ”in vitro”.

Capitolo

1

GLI APTAMERI

Gli aptameri sono delle corte sequenze oligonucleotidiche a DNA o RNA, di lun-ghezza variabile generalmente fra 15 ed 80 nucleotidi, che legano con elevata affinit`a e specificit`a una vasta gamma di molecole bersaglio, quali proteine o altre molecole organiche e inorganiche. Sono generati da un processo di selezione in vitro chiamato SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Questa tecnica unisce i principi della chimica combinatoria a tecniche di biologia molecolare, e per-mette di identificare le specifiche molecole di RNA o DNA d’interesse partendo da una vasta popolazione di oligomeri a sequenza casuale.

La caratteristica fondamentale degli aptameri consiste nel fatto che, trattandosi di mo-lecole a singolo filamento, possono generare accoppiamenti intramolecolari tra le basi complementari o loro analoghi modificati (2’-Fluoro, 2’-O-Metil, 2’-Ammino, Fosforo-tioati, etc.), che determinano il ripiegamento della molecola in una struttura secondaria con porzioni a doppia elica (stem) raccordate da segmenti a singolo filamento (loop). L’insieme di svariati ripiegamenti secondari a carico di porzioni multiple della moleco-la dell’aptamero porta almoleco-la formazione di una struttura tridimensionale complessa che fornisce la corretta geometria utile per una salda interazione di legame con la superficie della specifica molecola bersaglio.

Queste caratteristiche conferiscono agli aptameri propriet`a di riconoscimento molecola-re paragonabili a quelle delle biomolecole pi `u utilizzate a tale scopo, quali gli anticorpi, pertanto ha preso consistenza l’ipotesi di impiegarli come loro sostituti.

Gli aptameri possiedono, almeno in linea di principio, alcuni vantaggi rispetto agli anticorpi, primo fra tutti `e il loro processo di selezione in vitro, che prescinde dai meccanismi multipli di una risposta immunitaria dei sistemi biologici utilizzati nella produzione di anticorpi. Quest’ultima, infatti, pu `o discriminare proteine bersaglio che hanno una struttura simile a proteine endogene. Un altro svantaggio insito nell’uso degli anticorpi consiste nel fatto che questi funzionano solo in condizioni fisiologiche, una limitazione che ne restringe il campo di applicazione e la funzionalit`a.

Gli aptameri, d’altro canto, possono essere ottimizzati e manipolati a livello della regio-ne chiave d’interazioregio-ne con il bersaglio, inoltre sono molto stabili alle alte temperature e possono essere facilmente rigenerati dopo una denaturazione termica. Sono in ge-nerale pi `u resistenti degli anticorpi e quindi hanno, nei diversi ambienti biologici, una vita media pi `u lunga.

Una speciale prerogativa a vantaggio degli aptameri `e l’alto grado di purezza con cui possono essere ottenuti e l’elevata riproducibilit`a dei preparati che dipendono dal pro-cesso chimico di sintesi e di purificazione che sono finemente controllabili. Inoltre, degli aptameri `e possibile cambiare i parametri cinetici mentre ci `o non pu `o essere fatto con gli anticorpi.

Per quanto riguarda la scelta dell’acido nucleico, anche se il DNA a singolo filamen-to pu `o formare delle complesse strutture secondarie e terziarie, la gamma di strutture 3D realizzata da molecole di RNA `e senza dubbio pi `u diversificata rispetto a quella del DNA. Pertanto, le possibilit`a di impiego degli aptameri a RNA sono maggiori e rendono il processo di selezione pi `u semplice. Tuttavia bisogna riconoscere che, una volta selezionato, un aptamero a DNA ha tutte le caratteristiche di uno a RNA. `E solo durante il processo di selezione che il DNA presenta un numero ridotto di combina-zioni utili.

Uno degli svantaggi pi `u importanti degli aptameri a RNA `e la loro sensibilit`a alla degradazione enzimatica. Le ribonucleasi sono infatti enzimi ubiquitari molto rap-presentati nei fluidi biologici. Questo problema pu `o essere risolto modificando la posizione 2’ del ribosio. `E stato dimostrato che aptameri aventi una pirimidina mo-dificata con gruppi 2’-ammino o 2’-fluoro sono pi `u stabili e funzionali nel processo di SELEX. Un altra tecnica usata per aumentare la stabilit`a degli aptameri a RNA consiste nel sostituire lo zucchero D-ribosio con lo stereoisomero L-ribosio. La forma levogira infatti conserva la capacit`a di legare la molecola bersaglio e ha un’elevata stabilit`a nella cellula. Svantaggi che riguardano l’ottenimento e l’utilizzo degli aptameri sono i costi, ancora molto elevati per la produzione su larga scala, e le difficolt`a nella preparazione di sequenze lunghe. La chimica della sintesi in fase solida, difatti, presenta sensibili riduzioni di resa con l’aumentare dei cicli di accoppiamento (capitolo 3). Una ulteriore problematica riguarda l’uso come farmaco degli oligonucleotidi; trattandosi di mole-cole idrofile presentano una elevata affinit`a per il flusso sanguigno, un fatto che ne limita la biodisponibilit`a e ne aumenta l’escrezione. A questo si pu `o in parte ovviare coniugando l’aptamero ad un vettore come il polietilene glicole, o con formulazioni liposomiale che aumentano il peso molecolare e quindi il tempo di permanenza della molecola nel plasma.

Un esempio di aptamero a RNA utilizzato in terapia `e il Pegaptanib (Macugen-OSI Pharmaceuticals), impiegato per il trattamento della degenerazione maculare legata

all’et`a (AMD) e l’edema maculare diabetico (DME). Si tratta del primo farmaco a base di aptameri approvato dalla US Food and Drug Administration (FDA) [1]. Altri aptameri sono in fase di sviluppo per la prevenzione e il trattamento delle malattie croniche o acute: ARC1779, ad esempio, `e un aptamero che funge da potente antagonista selettivo del Fattore Von Willebrand (VWF) e viene valutato in pazienti con diagnosi di sindrome coronarica acuta (ACS) sottoposti a intervento coronarico percutaneo (PCI). Alla fine del 2007 l’aptamero `e stato sottoposto agli studi di fase 2.

Un’altra classe di aptameri, scoperti dopo quelli a RNA e a DNA, sono gli aptameri peptidici, piccoli e semplici peptidi che hanno una sola regione variabile combinatoria, in genere composta da 10 a 20 amminoacidi, collegata da entrambi i lati ad una impal-catura di proteine, con una buona solubilit`a e compatibilit`a.

In sintesi si pu `o riassumere come segue:

• La caratteristica pi `u importante degli aptameri `e la loro elevata specificit`a. • Uno dei principali vantaggi degli aptameri a RNA `e il processo di selezione

in vitro, poich´e consente un controllo molto pi `u selettivo di quello che si pu `o compiere in vivo.

• Gli aptameri a RNA possono formare diverse strutture secondarie e terziarie e ci `o contribuisce a produrre una geometria altamente specifica per la proteina bersaglio.

• La modifica a livello del ribosio, sia con sostituenti inusuali come OCH3, F, NH2,

che nel suo stereoisomero levogiro, ne aumenta notevolmente la stabilit`a.

• Gli aptameri a RNA possono essere manipolati in modo da migliorare la capacit`a di legare le loro molecole bersaglio in diverse condizioni.

• Sono un valido strumento per scopi terapeutici, diagnostici e di analisi, inol-tre risultano particolarmente adatti come biorecettori per la realizzazione di biosensori.

Le enormi aspettative di applicazione degli aptameri tuttavia, si sono dovute scon-trare con una serie di motivi che hanno contribuito ad impedirne la rapida diffusione prevista. Le procedure di selezione, infatti, soffrono di numerosi elementi di criticit`a che spesso rendono difficile il raggiungimento degli obiettivi sperati in tempi brevi (capitolo 3). Ad oggi infatti, la fase di ricerca degli aptameri `e ancora molto costosa, bisogna comunque sottolineare anche che, una volta ottimizzato, il processo di selezio-ne SELEX, richiede circa 8 settimaselezio-ne per lo sviluppo di un aptamero, mentre quello di produzione degli anticorpi pu `o durare fino a 6 mesi.

1.1

PROPRIET `

A DEGLI APTAMERI

1.1.1

PROPRIET `

A CHIMICHE

Gli aptameri sono molecole costituite da acidi nucleici a singolo filamento e pertanto mostrano, dal punto di vista chimico, tutti i pregi e i difetti di queste molecole. Presenta-no una duplice natura idrofobica (basi azotate) ed idrofila (scheletro zucchero-fosfato). Questa parte idrofila conferisce alla molecola una carica netta negativa, dovuta ai grup-pi fosforici. Gli aptameri, hanno, dunque un’elevata solubilit`a in acqua ed una grande predisposizione a formare legami ad idrogeno sia come donatori che come accettori. La resistenza chimica `e diversa a seconda che si tratti di sequenze di DNA o di RNA. Il primo, infatti, `e generalmente pi `u stabile a variazioni di pH mentre il secondo `e estremamente sensibile a condizioni alcaline. Entrambi temono l’ossidazione, i radicali liberi e gli aggressivi chimici, in particolare gli alchilanti, in grado di agire sulle basi azotate. Tuttavia se opportunamente stabilizzati con appropriati gruppi sostituenti, possono acquisire un’ottima resistenza agli agenti esterni ed agli enzimi nucleolitici. Da un punto di vista strutturale, gli aptameri sopravvivono a trattamenti denaturanti come quelli con la formammide o con variazioni di temperatura. Possono, infatti, es-sere sottoposti a cicli ripetuti di denaturazione e rinaturazione senza alcuna perdita di attivit`a perch´e sono in grado di riacquistare spontaneamente la loro naturale struttura tridimensionale una volta ripristinate le condizioni originarie di temperatura e forza ionica.

Grazie a queste propriet`a gli aptameri possono essere immagazzinati indefinitamente come polveri liofilizzate e, dopo la solubilizzazione, riacquistare la loro conformazione spaziale divenendo immediatamente attivi. Un grande vantaggio legato all’origine sin-tetica degli aptameri riguarda l’enorme possibilit`a di modifiche chimiche che possono essere introdotte nella sequenza allo scopo di ottimizzare le propriet`a della molecola o per inserire strutture utili agli usi specifici previsti.

Si distinguono:

a) modifiche stabilizzanti, per lo pi `u a carico dei gruppi fosforici e del ribosio, finaliz-zate alla protezione della sequenza dagli enzimi nucleolitici;

b) modifiche funzionali, per lo pi `u a carico delle basi azotate, rivolte all’adeguamento della molecola al tipo di applicazione (es. introduzione di marcatori label, di cross-linkers, etc.).

c) modifiche strutturali con l’introduzione di basi rare o di surrogati delle basi azotate in grado di conferire agli aptameri ulteriore plasticit`a, utile per aumentarne la specificit`a di legame.

Le modifiche stabilizzanti derivano principalmente da esperienze maturate con lo studio degli oligonucleotidi antisenso. Risultano di fondamentale importanza per le applicazioni in vivo: `e noto, infatti, che gli oligonucleotidi sintetici sono fortemente

Figura 1.1: Possibili modificazioni chimiche a carico di una catena oligonucleotidica. Le modificazioni indicate da frecce continue sono gi`a state utilizzate in processi di sele-zione: quelle indicate con frecce tratteggiate rappresentano alcune delle modificazioni che potrebbero essere usate.[2]

sensibili alle nucleasi che ne riducono l’emivita a minuti (DNA) e secondi (RNA). Il metodo SELEX consente di preparare opportune collezioni di oligonucleotidi anche modificati tali da mostrare maggiore resistenza enzimatica e maggiore affinit`a per il bersaglio, sempre che le modifiche introdotte siano tollerate dagli enzimi DNA-RNA polimerasi. Anche l’uso di fosfotioati, pur compatibile con il metodo di selezione, `e stato scartato a causa delle interazioni aspecifiche degli atomi di zolfo con proteine e costituenti cellulari.

Modificazioni nella posizione 2’ dell’anello del ribosio di un RNA, incrementano la resistenza agli enzimi. Poich´e le endo-ribonucleasi pi `u abbondanti in natura sono le nucleasi pirimidino-specifiche, l’introduzione di modificazioni al 2’ di citidina, e uracile (2’-Fluoro, 2’-Ammino, e 2’-O-metile pirimidine) proteggono gli oligonucleotidi dalla degradazione e ne aumentano l’emivita, fino a 18h-24h nel siero.

La stabilizzazione pu `o essere eseguita facendo incorporare dall’RNA polimerasi 2’-Amino e 2’-Fluoro CTP e UTP nel pool delle sequenze da sottoporre a selezione o alternativamente, pu `o essere effettuata a selezione avvenuta introducendo successiva-mente le modifiche. Spesso per `o, gli aptameri selezionati usando una collezione di RNA gi`a modificati hanno una affinit`a e una specificit`a molto ridotte per il proprio bersaglio [3].

Una strategia alternativa per inibire la degradazione `e quella di invertire tutti i centri chirali dell’acido nucleico utilizzando nucleotidi ”invertiti” durante la selezione

(”Tec-nologia Spiegelmers”, da Spiegel= specchio) in modo da creare molecole di geometria speculare resistenti alle nucleasi del sangue e a quelle tissutali che sono enantiospecifi-che. Le esonucleasi, che a differenza delle pi `u attive endo-, degradano le estremit`a 5’ e 3’ delle sequenze oligonucleotidiche, possono essere inibite mascherando le estremit`a dell’aptamero con sostituenti non naturali. Esempi molto usati sono l’introduzione di un legame 3’-3’ di timidina all’estremit`a 3’, e la coniugazione con PEG o addirittura il labelling con biotina o fluorocromi dell’estremit`a 5’, per ottenere efficaci capping delle estremit`a libere.

Le modificazioni introdotte per aumentarne la stabilit`a alle nucleasi, possono portare il peso molecolare degli oligonucleotidi oltre i 40 kDa e questo consente loro di rima-nere in circolazione per tempi maggiori. Inoltre il tempo di permanenza nel plasma pu `o essere prolungato aumentando il peso molecolare dell’aptamero anche tramite la coniugazione ad una macromolecola neutra e questo genere di modifica pu `o migliora-re significativamente la clearance plasmatica in misura variabile da omigliora-re a giorni. Per esempio, il pegaptanib `e coniugato ad una molecola di PEG da 40-kDa che ne riduce l’escrezione renale. La coniugazione con proteine, il legame al colesterolo ( come nel caso dell’aptamero REG-1 contro il fattore IX della cascata della coagulazione) o a lipidi ad alto peso molecolare che sono covalentemente legati agli aptameri senza modificar-ne la capacit`a di legare il bersaglio, sono modificazioni che hanno un profondo effetto sull’emivita, che pu `o aumentare da pochi minuti a molte ore. La farmacocinetica di un particolare aptamero pu `o essere finemente modulata, fatto che rende queste molecole molto pi `u appetibili dei rivali anticorpi.

Le modifiche funzionali a carico del C-5 delle pirimidine con gruppi come il ben-zoile che ha un ragionevole ingombro sterico, sono ben tollerati durante gli stadi di polimerizzazione della tecnologia SELEX. Oligonucleotidi contenenti 5-BromoUracile o 5-IodoUracile possono essere attivati dalla luce per generare gruppi reattivi capaci di formare legami covalenti con molecole vicine. In questo modo si sono prodotti aptameri detti photo-cross-linkable che, sottoposti a luce ultravioletta, generano legami crociati col bersaglio [4].

Le modifiche strutturalisono possibili con l’aumento della gamma di monomeri utili oltre ai quattro disponibili in natura. Utilizzando delle basi non canoniche si pu `o accre-scere la diversit`a molecolare ottenibile. Infatti, in virt `u di appaiamenti diversi da quelli canonici descritti dal modello di Watson e Crick, `e possibile aumentare l’assortimento di geometrie tridimensionali in quanto presentano una struttura primaria e secondaria completamente diversa da quelle derivate da collezioni costituite da basi naturali.

1.1.2

PROPRIET `

A DI LEGAME

Gli oligonucleotidi a singolo filamento hanno un’altissima propensione a formare strutture secondarie e terziarie che danno luogo a diversi motivi strutturali. Il nume-ro di queste strutture termodinamicamente stabili `e notevolmente pi `u alto rispetto a quello dei pi `u rigidi peptidi di uguale lunghezza. La formazione di queste strutture secondarie `e dovuta semplicemente ai canonici appaiamenti intramolecolari tra le ba-si. L’altissimo numero di combinazioni possibili all’interno di una sequenza random comporta la formazione di una miriade di figure strutturali totalmente diverse che rappresentano la base probabilistica su cui si fonda la possibilit`a di generare aptameri contro un’infinita gamma di bersagli.

Gli aptameri hanno alta specificit`a verso i loro bersagli (solitamente 10pM-10nM per bersagli proteici), dovuta alla loro elevata plasticit`a che consente, non solo di dar luogo a strutture geometriche compatibili con la superficie della molecola bersaglio, ma anche di adattarsi, con ulteriori ripiegamenti, su di essa. Gli aptameri selezionati si legano con alta affinit`a ai loro targets e possono discriminare tra composti particolarmente simili. Questo `e dovuto al riconoscimento adattativo: gli aptameri, diversamente strut-turati in origine, si ripiegano attraverso l’associazione con i loro ligandi in architetture molecolari in cui il ligando diviene una parte intrinseca della struttura del complesso finale. Il legame aptamero-target `e cos`ı finemente strutturato che anche la pi `u piccola modifica nella molecola bersaglio pu `o portare a considerevoli differenze di affinit`a e persino alla perdita totale del legame.

Figura 1.2: Struttura dell’aptamero per l’ATP. a) struttura secondaria. b) struttura tridimensionale determinata tramite NMR. In verde sono indicati i normali legami del tipo Watson-Crick, le G che formano l’accoppiamento di Hoogstein sono in rosa mentre i residui che formano il loop sono in blu. In rosso l’ATP.[5]

riconoscimen-to pi `u comuni, ed essendo spesso ricche in purine, danno luogo a geometrie del tutriconoscimen-to particolari dovute proprio agli appaiamenti non canonici purina-purina mentre la loro capacit`a di legare il bersaglio dipende dalla capacit`a di formare legami ad H o di impi-larsi (stacking) in virt `u di interazioni fra gruppi aromatici planari. Spesso le interazioni molecola-aptamero sono stabilizzate dalla formazione di complessi con ioni metallici come Mg2+o Mn2+e da legami che si formano tra porzioni non contigue della molecola che portano a ripiegamenti particolari dell’elica. Alcuni aptameri sono caratterizzati da strutture quadruplex, come ad esempio il TBA (aptamero per la trombina) e l’inibitore dell’integrasi del virus HIV.

Gli aptameri riescono dunque a discriminare fra analoghi strutturali, isoforme di una famiglia di proteine [6], differenti stati conformazionali o funzionali della stessa protei-na e isomeri della stessa molecola [7]. Un esempio notevole della specificit`a di queste molecole anche per le piccole strutture `e quello dell’aptamero per la teofillina (1,3-dimetilxantina) che si lega alla caffeina (1,3,7-trimetilxantina) con affinit`a 10000 volte pi `u bassa, nonostante le due strutture differiscano solo per un gruppo metilico [8]. E’ stato sintetizzato anche un aptamero per l’arginina capace di legare preferenzialmente l’isomero levogiro con affinit`a 12000 volte maggiore, rispetto al destrogiro.

1.1.3

PROPRIET `

A FARMACOLOGICHE E TERAPEUTICHE

Negli ultimi trent’anni gli anticorpi sono stati le molecole di elezione per lo svi-luppo di tecniche analitiche e diagnostiche ma quanto detto finora mette in evidenza come gli aptameri possano essere una classe emergente di molecole con promettenti applicazioni terapeutiche, diagnostiche e analitiche che presenta molteplici vantaggi rispetto agli antagonisti anticorpi.

La domanda di nuovi metodi, che aggirino i problemi legati agli anticorpi, sia per curare che per diagnosticare vecchie e nuove malattie `e in crescita e gli aptameri si presentano come uno dei principali candidati.

Con il processo di SELEX, sono stati identificati aptameri contro numerosi tipi di obiet-tivi, compresi fattori di sviluppo, enzimi, immunoglobuline, recettori, proteine virali , tossine ed altri. Tutto questo fa presagire per questa classe di molecole un ruolo di rilievo in strategie terapeutiche innovative.

Le loro propriet`a farmacologiche e terapeutiche sono conseguenza delle caratteristiche chimiche e di legame descritte nei paragrafi precedenti:

• Gli aptameri generati contro le proteine hanno affinit`a nell’intervallo tra il pico-molare e il nanopico-molare e hanno dimostrato di avere una straordinaria specificit`a per i loro obiettivi molecolari, anche quando le proteine siano identiche fino al 96%. Questo garantisce un elevato effetto terapeutico, anche a concentrazioni basse.

• La biodisponibilit`a di un aptamero `e determinata dalla sua stabilit`a nei fluidi biologici e dalla clearance; queste possono essere aumentate introducendo le mo-difiche strutturali descritte in precedenza, ottenendo composti tipicamente stabili nel plasma con emivita di 15-24h.

• Gli aptameri possono essere dispensati utilizzando diverse vie di somministra-zione, compresa quella sottocutanea, aumentando cos`ı la compliance del paziente. • L’assoluta riproducibilit`a della sintesi chimica elimina ogni possibile variabilit`a

tra lotti di differenti preparazioni .

• La selezione in vitro garantisce che la specificit`a e l’affinit`a degli aptameri siano ben controllate. Al contrario degli anticorpi, `e possibile dirigere la selezione in breve tempo e anche contro obiettivi tossici o non immunogeni.

• Bench´e alcuni meccanismi di tossicit`a di base siano possibili in alcune modalit`a terapeutiche, gli aptameri non sembrano esibire tossicit`a intrinseca n´e avere alcun potenziale immunogeno a qualsiasi dose nelle condizioni di sperimentazione su modelli animali.

• Gli aptameri possono essere immagazzinati facilmente per lunghi periodi a tem-peratura ambiente sottoforma di polveri liofilizzate.

• In linea di principio si possono immaginare diversi scenari di impiego degli aptameri, sia considerandoli come principi attivi ad azione farmacologica mirata, sia come co-fattori di farmaci convenzionali.

• Gli aptameri hanno un eccellente potenziale come veicoli per il direzionamento di un principio attivo o di una tossina (per esempio un chemioterapico), sia attraver-so la coniugazione diretta sia tramite il suo incapsulamento in una vescicola quale un liposoma mirato aptamero-rivestito. Inoltre, la specificit`a di piccole molecole attive pu `o essere migliorata di parecchi ordini di grandezza coniugandole ad un aptamero obiettivo-specifico. Tali farmaci chimerici possono realizzare un’inibi-zione dell’obiettivo potente e selettiva in virt `u della sinergia fra le due parti della molecola.

• L’emivita in vivo degli aptameri pu `o essere prolungata, come descritto in prece-denza, introducendo numerose modifiche chimiche durante la fase di produzione, che limitano la predisposizione all’attacco da parte delle nucleasi e diminuiscono la clearance.

1.1.4

PRODUZIONE DEGLI APTAMERI

Negli anni novanta tre diversi laboratori erano contemporaneamente impegnati nello sviluppo di questa tecnologia per la selezione in vitro: Larry Gold e Craig Tuerk dell’universit`a del Colorado, Jack Szostak e di Andy Ellington dell’Ospedale Generale del Massachusetts e Gerald Joyce dell’istituto di Scripps di La Jolla, CA. Gold, nel 1991, ha brevettato la tecnologia SELEX ed ha lasciato l’universit`a per fondare una ditta chiamata NeXstar Pharmaceuticals Inc. (Boulder, Colorado). Il neologismo ”aptamero” invece nacque nel laboratorio di Szostak dalla fusione dell’aggettivo latino ”aptus”, che si adatta, con il suffisso ”mero” che deriva da ”polimero” (dal greco ”poly” molteplice e ”m´eros”, parte).

Gli aptameri possono essere isolati con numerose variazioni del procedimento SE-LEX, che pu `o essere descritto e schematizzato in modo del tutto generale in quattro stadi fondamentali:

1. preparazione di una collezione combinatoria di molecole

2. selezione e recupero degli esemplari pi `u affini al bersaglio scelto 3. amplificazione delle specie selezionate

4. isolamento dell’aptamero specifico

Figura 1.3: Schematizzazione del processo di selezione (Tratto da: www.molmed.uni-luebeck.de).

1.Preparazione di una collezione combinatoria di molecole Il processo di evoluzione in vitro ha inizio con la preparazione, tramite sintesi chimica, della collezione combina-toria che `e un insieme di sequenze generalmente organizzato in un segmento centrale degenerato di lunghezza definita, detto ”regione random” e due regioni fiancheggianti fisse, costituite da sequenze note, utili per il legame dei primers specifici necessari sia per l’amplificazione mediante PCR sia per la trascrizione nel caso di aptameri ad RNA. Ogni esemplare all’interno della collezione ottenuta (di solito rappresentativa di 1015

-1016 _{specie differenti) ha una sequenza unica che pu`o assumere una limitata serie di}

strutture tridimensionali interconvertibili. Una collezione con una sequenza casuale di 100 oligonucleotidi pu `o generare 4100 _{= 1,6.10}60 _{combinazioni di molecole diverse}

contro le circa 1,12.1015 _{di un pool con sequenza random di 25 nucleotidi. All’interno}

della collezione combinatoria le sequenze aventi la specifica struttura tridimensiona-le capace di riconoscere il bersaglio devono essere sufficientemente rappresentate per poter essere selezionate, pertanto devono avere una bassa complessit`a. Un motivo strutturale semplice pu `o, difatti, essere facilmente contenuto ovunque all’interno di una sequenza casuale, sia essa corta o lunga.

Le collezioni combinatorie utilizzate nella pratica rappresentano solo delle limitate sot-topopolazioni rispetto alla totalit`a delle combinazioni possibili. Quantit`a di molecole comprese fra 1014 _-1016 _{rappresentano un compromesso utile perch´e gestibile}

speri-mentalmente e dotato di un valore teorico di molteplicit`a sufficientemente ampio da fornire consistenti probabilit`a di selezione. Se invece calcolassimo la quantit`a teorica necessaria a rappresentare ogni singolo esemplare di tutte le combinazioni possibili di una collezione combinatoria N35 (dove N indica il numero di nucleotidi casuali), avremmo 435 _{= 1,18 x 10}21 _{molecole, che corrisponderebbero a 1,96 moli (molecole /}

numero di Avogadro 6.023 x 1023_{) pari a 61,643 kg (massa molecolare media= 30940).}

Per aumentare le probabilit`a di selezionare la sequenza necessaria al riconoscimento del bersaglio, la collezione oligonucleotidica viene poi convertita in DNA a doppio filamento tramite estensione e amplificazione per PCR. In questo modo infatti anche le specie meno rappresentate acquistano una relativa abbondanza all’interno della col-lezione. Successivamente, per ottenere aptameri a RNA, la collezione amplificata, o pi `u spesso una sua parte, viene trascritta per formare un pool di RNA che sar`a poi utilizzato per la selezione.

2.Selezione e recupero degli esemplari pi `u affini al bersaglio scelto In questa fase

vengono selezionate le molecole con la maggiore affinit`a per il bersaglio: la collezione casuale di sequenze nucleotidiche `e messa a contatto con il bersaglio (una proteina, una piccola molecola o una struttura macromolecolare) e, dopo un congruo periodo di incubazione, le molecole dotate di bassa o trascurabile affinit`a rimarranno libere in soluzione e saranno allontanate con i lavaggi, mentre quelle legate, in virt `u della affinit`a con il bersaglio, rimarranno associate alla matrice di selezione. Queste ultime saranno

successivamente recuperate sfruttando una delle tante tecniche possibili (competizione con il ligando libero, cambiamento delle condizioni di legame come tampone con diverso pH o diverso contenuto salino, l’uso di agenti denaturanti, riscaldamento etc.) e impiegate nei successivi cicli del processo di selezione, durante i quali le condizioni di associazione con il bersaglio saranno sempre pi `u selettive (stringenti).

Durante la procedura SELEX si usa alternare cicli di selezione positiva contro il bersaglio prescelto con cicli di selezione negativa, contro molecole correlate ma non uguali al bersaglio e/o contro il supporto a cui esso `e eventualmente legato. In questo modo si eliminano progressivamente tutti gli esemplari che hanno subito selezioni indesiderate (off target).

3.Amplificazione delle specie selezionate Le sequenze catturate e recuperate dopo la selezione vengono sottoposte ad amplificazione mediante PCR, allo scopo di pro-durre una congrua quantit`a della nuova collezione di molecole che, rispetto a quella iniziale, risulta sostanzialmente arricchita degli esemplari con maggiore affinit`a per il bersaglio. Questa nuova collezione `e il materiale di partenza per iniziare un nuovo ciclo di selezione. La reiterazione di questa successione di eventi (selezione, recupero e amplificazione), consente di ottenere collezioni nelle quali il rapporto fra le specie che si legano al bersaglio rispetto a quelle che non si legano si accresce ad ogni ciclo, grazie anche all’utilizzo di condizioni di selezione sempre pi `u selettive verso le molecole ad alta affinit`a per il bersaglio.

4.Isolamento dell’aptamero specifico Dopo un numero variabile di cicli, di solito tra i 8 e i 15, la collezione delle sequenze riduce drasticamente la propria molteplicit`a da un numero elevato 1035_{, ad un piccolo numero di molecole, capaci di legare fortemente il}

bersaglio scelto. Queste molecole vengono quindi isolate, clonate e infine sequenziate. La sintesi successiva delle sequenze cos`ı ottenute consentir`a di misurare e paragonare le loro propriet`a in termini di affinit`a e specificit`a. In molti casi, gli aptameri isolati possono essere ulteriormente migliorati inducendo mutazioni casuali mediante PCR. Una conseguente reiterazione della selezione viene fatta per identificare i mutanti che mostrano un aumento delle propriet`a di legame e mappare le posizioni oligonucleoti-diche responsabili del miglioramento, cos`ı da eliminare quei nucleotidi che non sono strettamente necessari n´e al legame con il bersaglio, n´e alla struttura dell’aptamero.

1.2

APPLICAZIONE DEGLI APTAMERI

Gli aptameri offrono parecchi vantaggi rispetto alle proteine o alle piccole molecole farmacologiche, grazie alla loro versatilit`a d’impiego descritta in precedenza.

Pertanto hanno potenziale applicazione in numerosi campi della ricerca e della tecno-logia sia come elementi attivi, in grado di interferire con il macchinario biologico di

cellule e tessuti, sia come elementi di ”etichettatura” per agenti di vario interesse ana-litico e diagnostico in quanto, se dotati di appropriati linker, possono essere facilmente immobilizzati sulle superfici dei biosensori o di bio-chip con una densit`a ed una preci-sione molto alte. Di seguito si riportano degli esempi di applicazione degli aptameri, raggruppandoli per tipo di impiego.

1.2.1

APTAMERI COME STRUMENTO TERAPEUTICO

Le terapie con gli aptameri si distinguono dalle altre che utilizzano acidi nucleici perch´e non intervengono su fasi come trascrizione, splicing, maturazione dell’RNA e traduzione ma modulano direttamente la funzione delle loro proteine bersaglio come gli anticorpi, ovvero legando e regolando l’obiettivo. Non ci sono limiti teorici alla creazione di aptameri contro qualsiasi proteina, (compresi i fattori di coagulazione, recettori, fattori della trascrizione) e possono essere usati per scoprire l’interazione di piccole molecole con tali proteine semplicemente attraverso saggi di legame competi-tivo. Questo metodo di studio dei farmaci non richiede la marcatura n´e del bersaglio n´e dell’aptamero.

Molti aptameri sono entrati in uso per il trattamento di malattie come la degenerazione maculare, per le operazioni chirurgiche di bypass coronario, per le coronopatie acute, malattie infettive e per vari tipi di cancro. Alcuni aptameri entrati nella fase clinica o che dimostrano l’eccezionale potenziale terapeutico dopo gli studi preclinici sono riportati in tabella 1.4:

1.2.2

APTAMERI COME AGENTI DIAGNOSTICI

Oltre ad avere un eccellente potenziale nel campo terapeutico, gli aptameri hanno molteplici applicazioni scientifiche, tra cui lo sviluppo di sistemi diagnostici, la com-prensione dei meccanismi d’azione di alcuni farmaci e la scoperta di nuove molecole terapeutiche. Per esempio, la selezione in vitro di aptameri a RNA leganti antibiotici, come la Neomicina B o la Viomicina, `e stata utilizzata per capire i principi che determi-nano il legame di queste molecole all’RNA ribosomiale [9]. Le strutture tridimensionali di molti tra questi complessi aptamero-anti-antibiotico, sono state determinate tramite spettrometria NMR. La comparazione tra il motivo strutturale dell’aptamero per la Viomicina e quello dell’RNA bersaglio, ha mostrato che entrambi sono costituiti da segmenti di acido nucleico che formano un uguale ripiegamento nel sito di attacco dell’antibiotico. Questi studi hanno permesso di compiere molti progressi nella com-prensione delle modalit`a di riconoscimento dell’RNA da parte di queste molecole e potrebbero fornire nuovi elementi per capire meglio anche il funzionamento dei ribo-somi stessi.

Aptameri come elementi di separazione e affinit`a

• La citometria a flusso `e una tecnica utilizzata nella ricerca di base e nei sistemi diagnostici per quantificare ed esaminare particelle microscopiche come antige-ni intracellulari e cromosomi mediante la loro sospensione in un fluido che le trasporti ed allinei in modo da attraversare singolarmente un raggio luminoso (sono usate lampade al mercurio o allo xenon). In seguito un’apparecchiatura elettronica effettua la rilevazione utilizzando un sistema lineare o logaritmico. Con questa tecnica le particelle sono distinte sulla base delle loro dimensioni e delle propriet`a di assorbimento o di emissione di una radiazione elettromagne-tica, inoltre si analizzano, simultaneamente, le caratteristiche fisico/chimiche di migliaia di particelle al secondo. Microsfere colorate rivestite con ligandi quali anticorpi o aptameri possono fornire un interessante metodo di multi-rilevazione di un campione. Aptameri a DNA marcati con fluoresceina sono stati usati per evidenziare cellule che esponevano sulla loro superficie la L-Selectina. I risultati ottenuti sono stati migliori di quelli ottenuti con gli anticorpi [2]. La citometria di flusso viene utilizzata per diagnosticare disturbi cardiaci o leucemie, ma sono in fase di ricerca molte altre applicazioni nel campo della patologia, della biologia molecolare, vegetale e marina [10].

• L’elettroforesi capillare (CE) separa le sostanze in base alla loro dimensione e/o carica. In questa applicazione tecnica, gli aptameri sono stati covalentemente legati ai capillari utilizzando diversi schemi di immobilizzazione. I capillari cos`ı ”derivatizzati” sono stati usati per separare miscele di aminoacidi, enantiomeri

o composti aromatici policiclici. Capillari rivestiti di aptameri permettono una separazione pi `u blanda e meno denaturante rispetto alle comuni fasi stazionarie. Ci `o pu `o essere molto importante nella separazione di proteine e peptidi. Con questa tecnologia `e stato possibile ottenere la separazione e la quantificazione di IgE e trombina con un limite di rilevamento di concentrazione dell’ordine di 50 pM [11]. L’elettroforesi capillare `e stata usata recentemente anche come metodo alternativo alla tecnologia SELEX ordinaria. Con questo sistema si possono, infatti, ottenere aptameri ad alta selettivit`a con pochissimi cicli (2-4) come nel caso dell’aptamero per la ricina [12] e per la retrotrascrittasi di HIV (HIVRT) [13]. • Aptameri fissati ad un supporto solido costituiscono una fase stazionaria che per-mette la messa in opera di una cromatografia di affinit`a. Il vantaggio gi`a menzionato delle numerose funzionalizzazioni possibili offre, inoltre, una ampia gamma di opportunit`a per la diretta immobilizzazione degli aptameri su matrici chimica-mente diverse quali destrano, agarosio, vetro, polimeri inerti, etc. Aptameri specifici nei confronti di diverse proteine recanti la biotina al 5’ sono stati gi`a usati con successo in cromatografia con resine attivate con la streptavidina.

Aptameri come elementi di rivelazione

• Gli aptameri possono essere utilizzati anche come sostituti degli anticorpi nelle analisi di immunoistochimica o nei saggi ELISA per analizzare campioni di san-gue e tessuto in Western blot, Microarray, microscopia a fluorescenza, confocale e a raggi X. Possono essere utilizzati anche come strumenti negli studi ai raggi X e di NMR per mappare il loro sito di legame e risolvere la geometria, per studiare l’interazione fra acidi nucleici e proteine e caratterizzare, ad esempio, i mecca-nismi di regolazione dell’espressione genica. Esami basati sugli aptameri sono utilizzati per il metodo detto ”mix and measure” capace di rivelare in maniera semplice e senza dover ricorrere a lavaggi e separazioni, quantit`a molto piccole di analita. Combinando le specifiche propriet`a di legame degli aptameri con la sensibilit`a della ”real time PCR” quantitativa `e possibile rilevare concentrazioni di analita di 4.1010−20_{, che corrisponde ad una sensibilit`a mille volte maggiore}

rispetto ai normali saggi ELISA.

• Altri esempi di applicazione analitica per il riconoscimento molecolare sono gli ELONA (Enzyme Linked OligoNucleotide Assay) che prevedono la realizzazione di kit analoghi a quelli usati per la tecnologia ELISA, [11]. Con questi metodi l’ana-lita viene legato da due ligandi, uno necessario per la cattura, l’altro che funge da rilevatore. Sono stati realizzati diversi tipi di saggi utilizzando un aptamero co-me primo ligando e un anticorpo coco-me secondo e viceversa, oppure impiegando aptameri sia per catturare che per rilevare il bersaglio. In quest’ultimo approccio

il bersaglio `e catturato da un aptamero primario immobilizzato su un suppor-to solido; il complesso aptamero-bersaglio `e poi riconosciusuppor-to specificatamente dall’aptamero secondario, coniugato con un enzima o con una molecola fluore-scente che permette di misurare la quantit`a di bersaglio presente. Il procedimento ELONA `e stato brevettato dalla NexStar di Larry Gold.

Figura 1.5: Aptamero basato sull’uso di un secondo aptamero che riconosca specificamente il complesso target-aptamero primario.

• La Somalogic Inc. (Boulder, USA.) di Gold ha annunciato lo sviluppo di un chip ad aptameri che pu `o saggiare circa 50 diverse molecole [14]. L’uso di aptameri contenenti 5’-Alo-Uracile (5’Bromo o 5’ iodio), detti fotoaptameri [4], permette il cross-linking dell’aptamero immobilizzato sul chip con la proteina bersaglio usan-do l’irradiazione con raggi ultravioletti, determinanusan-do la formazione di legami covalenti tra l’aptamero e la proteina. Tale metodo permette lavaggi estensivi del chip, che consentono di eliminare legami aspecifici cos`ı da aumentare notevol-mente i livelli di riconoscimento delle molecole e diminuire il rumore di fondo. Inoltre la diversa natura chimica (acido nucleico/proteina) di legato e legante, permette di evidenziare l’avvenuto riconoscimento impiegando dei comuni co-loranti specifici per le proteine. Un altro campo di applicazione `e rappresentato dalla tecnica microarray, che presenta diversi vantaggi:

- La produzione `e un processo veloce e pu `o essere eseguito con tecniche automa-tizzate.

- Gli aptameri possono essere immobilizzati con densit`a definita e in posizioni ben precise su una superficie solida.

- Grazie alla sintesi chimica sono facilmente disponibili preparazioni omogenee di aptameri.

- I microarrays basati sugli aptameri sono resistenti e si ritiene che abbiano lunghi tempi di conservazione.

viene ulteriormente rafforzata dall’affinit`a cos`ı da eliminare l’esigenza di ligandi secondari differenti per ogni proteina rivelata. Quindi, `e immaginabile che le pro-teine bloccate su un microarray reticolato con aptameri potrebbero essere rivelate da un reagente specifico per le proteine che non interagisce con l’acido nucleico. Nel futuro prossimo ci si aspetta che i microarrays basati sugli aptameri giochino un ruolo importante in proteomica, cos`ı da facilitare non solo il monitoraggio delle patologie fornendo un’ ”impronta digitale” proteica dei pazienti, ma anche lo sviluppo di nuovi farmaci. [2]

• Dal momento che gli aptameri possono essere facilmente legati ad una ampissi-ma variet`a di ampissi-marcatori (piccoli radioattivi, enzimi,ect.) possono essere progettate molteplici applicazioni analitiche. Oltre ai classici biosensori, creati con gli anti-corpi, ne sono stati sviluppati dei nuovi congegnati con diversi tipi di aptameri. I biosensori pi `u promettenti si basano sulle fibre ottiche e su aptameri leganti fluorofori quenchati detti aptamer beacons [15]. Questi sono una nuova classe di sonde fluorescenti recentemente introdotte per il rilevamento di sequenze di DNA. I beacons sono semplici aptameri a forcina in cui il 3’ `e legato a un fluoroforo mentre il 5’ `e legato a un quencher ovvero un cromoforo capace di assorbire l’e-nergia elettromagnetica della fluorescenza emessa dopo eccitazione del floroforo al 3’ in accordo col fenomeno fisico denominato FRET (Fluorescence Resonan-ce Energy Transfer). Proprio per via della loro struttura, quando l’aptamero si lega al bersaglio, il conseguente riarrangiamento conformazionale dell’acido nu-cleico allontana il quencher dal fluoroforo annullando la possibilit`a che si attui il FRET, di conseguenza l’eccitazione del fluoroforo induce un segnale di emissione facilmente rivelabile. La figura1.6 illustra questo sistema.

Figura 1.6: Rappresentazione schematica della generazione del segnale luminoso da parte di un Aptamer Beacon. [11]

• Gli aptameri possono essere utilizzati anche per l’imaging in vivo grazie al loro basso peso molecolare (10 o 15 kDa contro i 150 degli anticorpi), alla relativa facilit`a di rilascio tissutale e alla rapida ”clearance” sanguigna. Il primo studio effettuato al riguardo riusc`ı a visualizzare la reazione infiammatoria grazie ad un aptamero anti-elastasi e dimostr `o che l’immagine ottenuta presentava un miglior rapporto segnale/rumore di fondo rispetto a quello che si aveva utilizzando il relativo anticorpo [16]. Lo sviluppo di robusti metodi di marcatura degli oligo-nucleotidi con 18F, direttamente applicabile alla PET imaging (Positron emission tomography), ha aperto la strada all’applicazione degli aptameri anche in questo settore tecnologico.

• Gli aptameri mostrano, oltre all’affinit`a, una attivit`a di inibizione verso la pro-teina bersaglio, che pu `o regolare l’attivit`a biologico-metabolica di tale propro-teina nella cellula. In questi casi il problema `e l’impossibilit`a di un controllo preciso dell’inibizione stessa nel corso del tempo. Una soluzione `e stata sperimentata aggiungendo al complesso, nel momento in cui si voglia revertire l’inibizione, un ammino glicoside quale la neomicina. Questo, grazie alla sua propriet`a di legarsi all’RNA, `e in grado di indurre la dissociazione dell’aptamero dal suo bersaglio [16].

• Gli aptameri, grazie alla loro alta specificit`a e flessibilit`a, hanno un eccellente potenziale come veicoli per il direzionamento di un principio attivo o di una tossina (per esempio un chemioterapico), sia tramite la coniugazione diretta, sia mediante l’incapsulamento in una vescicola, come un liposoma, che espone l’aptamero sulla superficie. `E la cosiddetta Drug Delivery.

Applicazione di aptameri come biosensori Tra i metodi di rivelazione meritano par-ticolare attenzione i biosensori, dispositivi analitici che utilizzano mediatori biologici per rivelare selettivamente e con alta specificit`a composti biologici o chimici senza la necessit`a di un complesso pretrattamento del campione. I biosensori utilizzano sistemi costituiti da supporti sottili inseriti in dispositivi per l’iniezione del campione (flow injection devices) provvisti di sistemi automatizzati per l’analisi di composti biomedici, per il monitoraggio ambientale, ad esempio per la determinazione del glucosio emati-co o dell’urea e per la presenza di pesticidi nell’ambiente. I biosensori sono emati-costituiti da un mediatore biologico (detto componente recettore come ad esempio un enzima, un anticorpo, una cellula o un microrganismo) sensibile ad un opportuno sistema di trasduzione che invia il segnale prodotto ad un sistema capace di convertire la rispo-sta biochimica in un segnale fisico quantificabile e processabile: l’interazione tra il materiale biologico ed il campione sottoposto ad esame modifica uno o pi `u parametri chimico-fisici, il trasduttore capta la variazione nel sistema e produce un segnale elettri-co che pu `o essere opportunamente amplificato, elaborato e quindi letto dall’operatore.

Nella figura 1.7 sono indicati i diversi analiti, biorecettori, trasduttori e le relative tipo-logie di segnale utilizzate per la preparazione di biosensori [17]. I biosensori possono

Figura 1.7: Un biosensore `e formato da un biorecettore per il legame specifico del rispettivo analita, da un trasduttore per la conversione dei segnali e da un sistema di elaborazione dei segnali [17].

essere classificati in base al mediatore in: - biocatalitici o sensori enzimatici

- chemorecettoriali o sensori a recettore - immunologici o immunosensori Oppure in base al trasduttore in: - biosensori elettrochimici

- biosensori ottici o bio-optrodi

- biosensori calorimetrici o biotermistori - biosensori acustici

Uno dei fattori che maggiormente ha accelerato lo sviluppo dei sensori `e stata l’e-voluzione dell’elaborazione dati: lo sviluppo di microprocessori e circuiti integrati specificamente dedicati ha reso possibile ottenere un’elaborazione a basso costo, accu-rata ed affidabile, aumentando dunque l’intelligenza del sistema. La ricerca in questo campo `e sempre pi `u diretta alla miniaturizzazione del trasduttore, alla produzione su larga scala, e alla creazione di biosensori multiparametrici per il controllo della qualit`a dei prodotti, dell’ambiente e della salute, allo scopo di determinare un generale

miglio-Figura 1.8: Sintetico confronto Aptameri/Anticorpi.

ramento della qualit`a della vita.

Le applicazioni biosensoristiche spaziano in campi molto diversi: dal settore ambien-tale (biosensori in grado di monitorare inquinamenti ambientali) [18], al settore agro-alimentare (per la valutazione della qualit`a dei cibi, o per la ricerca di OGM), al settore industriale (biosensori, all’interno delle linee di produzione, in grado di valutare il raggiungimento di obiettivi specifici), al settore bio-medicale (biosensori diagnostici in grado di evidenziare malattie e/o predisposizioni genetiche in tempi brevi e a basso costo).

I biosensori stanno assumendo negli ultimi anni un sempre crescente interesse di mercato, grazie ad alcuni aspetti caratterizzanti quali:

-la facilit`a di utilizzo: generalmente i campioni non necessitano di particolari prepa-razioni prima delle analisi e ci `o rende possibile le misuprepa-razioni direttamente su cibo, sangue, acqua inquinata, etc.

-i tempi di risposta sono ridotti e le dimensioni degli strumenti sono compatte, la sicu-rezza dell’operatore `e garantita, in quanto non necessitano di radioisotopi o marcatori -i costi, rispetto ai metodi di analisi tradizionali, sono molto pi `u contenuti

-non necessitano di personale tecnico specializzato -possibilit`a di seguire i processi in continuo.

I biosensori per l’analisi delle proteine coinvolgono principalmente gli anticorpi, ma gli ultimi sviluppi della ricerca hanno dimostrato che gli aptameri possono rivaleggiare con gli anticorpi in molte applicazioni in quanto garantiscono metodi di identificazione e di purificazione semplici, una sintesi chimica riproducibile, tecniche di immobiliz-zazione ad alta densit`a e stabilit`a anche in condizioni non fisiologiche. Grazie alle loro piccole dimensioni `e possibile effettuare una immobilizzazione efficiente e ad alta densit`a, di conseguenza, la produzione, la miniaturizzazione, l’integrazione e l’auto-mazione dei biosensori possono essere compiute molto pi `u facilmente con gli aptameri. Infatti gli aptameri possono potenzialmente sostituire gli anticorpi anche nelle appli-cazioni biosensoristiche, ma `e necessario sintetizzarne molti altri prima che si possa arrivare alla creazione di una vera e propria libreria di aptasensori. Nella tabella 1.8 `e stato riportato un breve confronto tra aptameri e anticorpi [19].

Nella tabella 1.9 sono invece riportati alcuni bioaptameri per varie proteine target, il tipo di acido nucleico che costituisce l’aptamero (DNA/RNA), il tipo di sensore e il range di misura.

Capitolo

2

SCOPO DELLA TESI

Le enormi prospettive di applicazione degli aptameri, che spaziano dalla ricerca in-vestigativa di base a quella della analisi diagnostica, dall’impiego terapeutico a quello produttivo-industriale, dal settore delle biotecnologie a quello della ricerca farmacolo-gica, hanno generato una grande aspettativa nella comunit`a scientifica e tecnologica. Nonostante il numero delle applicazioni degli aptameri come alternativa agli anticor-pi cresca di anno in anno, svariati motivi hanno impedito una loro raanticor-pida diffusione rispetto a quanto sembrava previsto. In effetti, in tutto il mondo solo pochi gruppi di ricercatori si dedicano allo sviluppo degli aptameri e generalmente si tratta di ´equipe numerose e fortemente specializzate, sempre pi `u spesso legate a compagnie industriali. Una spiegazione di questa scarsa diffusione e del ritardo con cui gli aptameri entrano nelle tecnologie di avanguardia `e certamente legata alle difficolt`a con le quali queste molecole vengono selezionate. Le procedure di selezione, infatti, soffrono di numerosi elementi di criticit`a che spesso rendono difficile attuare l’insieme delle operazioni. Il laboratorio ospitante opera da alcuni anni in questo settore ed ha accumulato una discreta esperienza che ha consentito di razionalizzare e rendere meno aleatorie le tappe della procedura di selezione degli aptameri. Il presente lavoro si inserisce in questa attivit`a e si prefigge di applicare le esperienze acquisite, relative alle procedure di selezione di aptameri, ad un progetto finanziato dalla Comunit`a Europea, finalizzato alla realizzazione di un biosensore multiplo per il riconoscimento simultaneo di diversi analiti d’interesse biomedico. Si tratta, pertanto, di selezionare aptameri da utilizzare come elementi di ricognizione del biosensore.

La presente Tesi sperimentale di Laurea si propone, in particolare, di realizzare uno o pi `u aptameri in grado di riconoscere l’emoproteina umana mieloperossidasi (MPO), dotata di un grande valore diagnostico, che `e espressa dai neutrofili polimorfonucleati, possiede una significativa azione pro-infiammatoria e pu `o contribuire direttamente al danno tissutale.

Per la realizzazione di questi aptameri abbiamo dovuto affrontare problemi metodo-logici di progettazione di sequenze e di termodinamica degli appaiamenti, problemi

sperimentali di trascrizione ”in vitro” e di amplificazione di quantit`a di materiale al di fuori dei canoni convenzionali, problemi di tipo analitico per poter monitorare in maniera affidabile i risultati della procedura.

Infine, poich´e l’aptamero verr`a impiegato per la realizzazione del biosensore, dovr`a essere immobilizzato su un supporto solido. Pertanto il lavoro di Tesi ha tenuto conto anche di questo aspetto affrontando il tema dell’immobilizzazione tramite la progettazione e la sperimentazione di un metodo utile a tale scopo.

Capitolo

3

PARTE SPERIMENTALE

Lo sviluppo di una metodologia per la selezione di aptameri contro bersagli proteici per applicazioni analitiche e diagnostiche risponde a due interessi convergenti:

a) la disponibilit`a di un protocollo di selezione che sia rapido, economico, universale verso qualsiasi bersaglio proteico da utilizzare nei diversi metodi analitico-diagnostici e che soprattutto sia compatibile con le potenzialit`a di un comune laboratorio di biolo-gia molecolare;

b) la richiesta crescente di molecole altamente specifiche verso nuovi marcatori diagno-stici emergenti (come l’enzima mieloperossidasi, MPO).

Gli stadi del lavoro da noi effettuato sono riconducibili agli elementi cardine del metodo SELEX (illustrato nella figura 3.1) e a quelli relativi alla creazione di aptameri dotati di elementi funzionali utili per applicazioni diagnostiche e sensoristiche. La metodologia SELEX pu `o essere divisa in varie tappe: l’inizio prevede un DNA stampo a singolo filamento dal quale si ottiene il filamento doppio. La trascrizione viene effet-tuata in vitro ad opera dell’enzima T7 RNA polimerasi, il quale deve convertire in RNA la collezione combinatoria. In seguito si ha la selezione delle molecole di RNA che si legano al bersaglio e, come ultima tappa, la trascrizione inversa o retrotrascrizione che riconverte in DNA le molecole recuperate prima della loro amplificazione mediante PCR.

I punti critici del processo sono:

- la preparazione di una collezione combinatoria di molecole; - la selezione e il recupero delle molecole affini al bersaglio;

- l’arricchimento di queste ultime con cicli reiterati di amplificazione e selezione; - l’isolamento, il sequenziamento e la caratterizzazione degli aptameri selezionati; - la necessit`a della messa a punto di un metodo universale rapido che sia in grado di identificare, fra le sequenze selezionate, quelle dotate di un pi `u elevato grado di affinit`a per il bersaglio (applicazione dell’approccio splint ligation per un rapido ”screening” delle specie clonate e sequenziate).

Figura 3.1: Rappresentazione schematica del Selex

Dopo un’attenta analisi delle tecniche richieste per la realizzazione dei punti sopra indicati (come sintesi e purificazione di oligonucleotidi, trascrizione in vitro, PCR, marcatura delle molecole per il loro rilevamento, etc.) si `e cercato di delineare le mi-gliori condizioni operative per il superamento dei ”fattori di criticit`a” e di procedere nel lavoro di tesi.

I punti individuati sono:

1) Semplificazione del processo di selezione mediante la scelta di un peptide sinte-tico, facilmente reperibile su larga scala e riproducibile per sintesi chimica, che possa mimare la proteina bersaglio. Tale peptide mimetico sar`a l’elemento contro cui selezio-nare le molecole di acido nucleico.

2) Scelta del grado di molteplicit`a della collezione combinatoria (N35 =4.1035

com-binazioni) e progettazione di un metodo di sintesi in grado di evitare incorporazioni preferenziali e garantire una effettiva parit`a nella distribuzione dei nucleotidi.

3) Messa a punto di una metodologia inedita per la reazione RT-PCR specifica per i primi stadi di amplificazione. In questa delicata fase si deve infatti trovare una conciliazione tra la quantit`a di stampo (molto bassa) richiesta per l’amplificazione di PCR e quella (molto alta) necessaria per assicurare una congrua rappresentativit`a della

molteplicit`a molecolare della specie (congruit`a combinatoria). Il protocollo per l’RT-PCR, seguito nei precedenti lavori prevedeva l’uso di una quantit`a di stampo intorno ai 150 − 160µg tale da assicurare la consistente molteplicit`a di specie necessaria alla reazione. In questo lavoro di tesi, invece, le quantit`a di stampo utilizzate nei primi cicli di amplificazione, si aggirano intorno ad 1µg di stampo.

4) Messa a punto di un protocollo di trascrizione speciale per i primi stadi di sinte-si della collezione combinatoria di RNA, adatto alla ridotta concentrazione di stampo (vedere il punto precedente). Dato l’impiego di quantit`a ignote di stampo per ogni amplificazione, `e presumibile che il recupero, dopo la selezione, riguardi quantit`a estremamente piccole. Inoltre, se il processo di selezione porter`a all’arricchimento sperato nelle specie affini al bersaglio, le quantit`a di stampo aumenteranno progressi-vamente con l’avanzare dei cicli di selezione.

5) Messa a punto di metodi analitici, compatibili con le potenzialit`a del laboratorio, in grado di monitorare l’andamento della selezione.

3.1

CARATTERISTICHE DEL BERSAGLIO

MOLECOLARE

L’enzima mieloperossidasi (MPO) appartiene alla famiglia delle perossidasi, preci-samente alla sottofamiglia delle ossidoreduttasi, ed `e localizzato a livello dei lisosomi. Si tratta di un complesso tetramerico di 140 kDa costituito da due catene leggere (15 kDa) e due pesanti (53 kDa). Lega uno ione Ca2+ e forma un legame covalente con il gruppo EME B (ferro-protoporfirina IX) per ciascun eterodimero. `E un’emoproteina espressa nel sangue dai monociti come conseguenza di uno stato infiammatorio e pu `o contribuire al danno tissutale. Interviene in processi red-ox cellulari, distruggendo l’H2O2e altri cataboliti tossici con struttura di perossidi.

Ha attivit`a catalitica:

Donatore+ H2O2 = donatore ossidato + 2 H2O Es. Cl -+ H2O2 = HOCl + 2 H2O

La MPO `e un enzima presente in tre isoforme (H17, H14, H7) di lunghezza simile, nate come prodotti alternativi dello splicing del gene che le codifica. Poich´e tutte le isoforme risultano presenti nel sangue di pazienti affetti da patologie infiammatorie, si `e scelto di usare una strategia di selezione in grado di produrre aptameri che leghino indi-stintamente ciascuna delle tre proteine. L’allineamento delle sequenze relative alle tre isoforme umane dell’enzima, ottenuto con il programma Clustal W-multiple alignment,

ha consentito di evidenziare come le differenze risiedano tutte nella regione ammino-terminale entro i primi 200-220 amminoacidi; la parte successiva fino all’estremit`a carbossi-terminale risulta conservata con un’identit`a del 100%. Pertanto, nella scelta del bersaglio per la selezione, `e stata presa in considerazione la regione conservata evitando quella variabile.

Figura 3.2: Sequenze conservate delle 3 isoforme della proteina MPO.

L’analisi strutturale `e stata fatta utilizzando il database ExPAsY Proteomic Server1 dello ”Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)”. La ricerca dei domini pi `u accessibili esposti sulla superficie della proteina MPO `e stata eseguita con la collaborazione del Prof. Paolo Rovero dell’Istituto di Farmacologia dell’Universit`a di Firenze. Da questa indagine `e stata selezionata una porzione di sequenza (indicata dal riquadro in rosso nell’allineamento riportato nella figura 3.2) situata nella regione costante della MPO, strutturata inα-elica, bene esposta sulla superficie della molecola e resa stabile da un ponte disolfuro intramolecolare che ne collega le estremit`a. Questa porzione di pro-teina `e stata riprodotta sintetizzando chimicamente un frammento di 15 amminoacidi, con l’aggiunta, all’estremit`a NH2 terminale, di una biotina legata tramite uno

spa-ziatore (Alanina), utile per favorirne il recupero una volta che abbia legato eventuali

aptameri. Dopo lo stadio di selezione, gli oligonucleotidi legati al bersaglio possono essere infatti raccolti catturandolo con una matrice di affinit`a a base di streptavidina e successivamente recuperati dalla matrice con agenti caotropici.

SCHEMA DEL FRAMMENTO PEPTIDICO GENERATO: Biotin-b-Ala-RNLKLARKLMEQYGT

3.2

GENERAZIONE DELLA COLLEZIONE

COMBINATORIA

Il peptide mimetico `e lungo 15 nucleotidi, quindi si pu `o ipotizzare che i motivi di riconoscimento necessari al legame con l’aptamero non siano particolarmente comples-si. Per questo motivo si `e scelto di generare una collezione combinatoria con sequenza casuale di 35 nucleotidi, una lunghezza che garantisce una molteplicit`a teorica di 4.1035

specie e assicura una consistente probabilit`a di contenere motivi nucleotidici capaci di riconoscere il bersaglio.

3.2.1

STUDIO E PROGETTAZIONE DELLE SEQUENZE

La collezione combinatoria `e costituita, oltre che dalla regione centrale casuale, an-che da sequenze note conservate an-che servono per il legame dei primers necessari per la trascrizione e l’amplificazione. Le porzioni conservate sono state progettate con l’aiuto del programma RNA-Structure e sono state scelte dopo aver effettuato studi basati su tre principi fondamentali:

1) Specificit`a 2) Stabilit`a 3) Compatibilit`a.

1) La Specificit`a dei primers verso la sequenza complementare cui sono destina-ti evitando ibridazioni non specifiche `e un aspetto affrontato valutando i seguendestina-ti parametri:

• L’unicit`a: nello stampo deve esserci un solo sito per il legame dei primers.

• La lunghezza: `e stata scelta in modo da ottenere il miglior compromesso fra unicit`a e possibilit`a di avere temperature di denaturazione (Tm) e di appaiamento (Ta) opportune (vedere il paragrafo seguente). `E stato osservato che la lunghezza ideale `e compresa tra 15 e 25 nucleotidi.

• La composizione nucleotidica della sequenza: influenza sia la specificit`a del lega-me del prilega-mer che i paralega-metri della termodinamica dell’appaialega-mento e favorisce l’ottenimento di Tm e Ta opportune, con segmenti oligonucleotidici pi `u corti.

2) La Stabilit`a `e la base della persistenza di un ”duplex” fra primer e stampo nelle condizioni di PCR fissate. Questa viene studiata scegliendo opportunamente:

• L’energia libera di formazione di un ”duplex”: calcolata in funzione dell’ener-gia dei nucleotidi vicini, tracciando un grafico delle ∆G di tutti i nucleotidi dei primers. Per minimizzare amplificazioni aspecifiche `e importante che la stabilit`a all’estremit`a 5’ sia alta e quella relativa all’estremit`a 3’ sia bassa in modo che la funzione di innesco per la DNA polimerasi sia attiva solo nel caso di appaiamento perfetto.

• La temperatura di denaturazione (Tm): definita come la temperatura alla quale met`a del DNA `e a singolo filamento e l’altra `e a doppio filamento. Una grande quantit`a di G+C comporta una Tm pi `u alta a causa dell’elevato numero di legami a idrogeno. Esistono diversi metodi per calcolare la Tm e sono rappresentati nella figura 3.3; ∆H e ∆S sono rispettivamente la variazione di entalpia e di entropia; C `e la concentrazione molare dei primers; R `e la costante dei gas.

Figura 3.3: Metodi per calcolare la Tm.

• La temperatura di appaiamento (Ta): `e la temperatura alla quale i primers si legano allo stampo. `E necessario che ci sia una differenza di circa 30◦

C tra la Tm del prodotto e la Ta per assicurare una elevata entit`a di legame dei primers allo stampo (template). La Ta viene calcolata a partire dalla Tm:

Ta = Tmprimer− 4◦C; oppure 0, 3 × Tmprimer+ 0, 7 × Tmproduct

3) La Compatibilit`a, che riguarda anche la condizione di esercizio di entrambi i primers. Questi, infatti, dovranno lavorare bene nelle stesse condizioni di PCR e avere una temperatura di denaturazione il pi `u possibile coincidente. A tale scopo sono stati fatti numerosi studi analizzando le sequenze dei primers. La strutturazione spontanea deve essere attentamente esaminata per valutare la formazione di eventuali ripiegamenti intramolecolari (sia come DNA che come RNA) e di appaiamenti bimolecolari ”omo” cio`e tra due Upper Primer (UP-UP), e due Lower Primer (LP-LP) o ”etero” (UP-LP).

Sulla base dei principi ispiratori precedentemente descritti, la progettazione dei primers ha dovuto tenere conto anche delle esigenze dei processi molecolari previsti nel

metodo SELEX: trascrizione, retro-trascrizione, primer-extension e amplificazione. La sequenza antisenso selezionata per la sintesi dello stampo di DNA lunga 72 nucleotidi `e rappresentata di seguito (sequenza 1-figura 3.4).

Figura 3.4: Schema della struttura dell’upper primer e della sequenza antisenso

Il passaggio dalla sequenza 1 alla sequenza 2 si attua, infatti, con una reazione di ”primer extension” mediante l’utilizzo di un PCR Upper Primer (in figura). Il suddetto primer `e costituito da due segmenti contigui: il primo, complementare alla struttura del DNA a singolo filamento (regione in verde della sequenza 1), `e necessario per l’am-plificazione mediante PCR mentre il secondo, all’estremit`a 5’, riproduce la sequenza di legame per l’enzima T7 RNA polimerasi, indispensabile per la successiva trascrizione. L’amplificazione pu `o essere effettuata utilizzando il secondo primer progettato (Lower Primer) complementare all’estremit`a 3’ dello stampo combinatorio.

La reazione di estensione, illustrata nella figura 3.5, restituisce la sequenza di DNA a doppio filamento di 91 coppie di basi originariamente progettata su cui pu `o essere realizzata l’amplificazione mediante PCR.

Figura 3.6: Comparazione delle Tm di Upper e Lower Primer.

La figura 3.6 mostra i dati ottenuti dall’analisi effettuata sui primers prescelti sul-la base dei parametri precedentemente descritti. Si pu `o osservare una sostanziale coincidenza delle temperature di denaturazione dei due primers (75◦

C e 74,7◦

C rispetti-vamente). La minima differenza stimata tra le Tm di UP e LP (di 0,3◦

C), garantisce una denaturazione di entrambi i primers alla stessa temperatura, rendendo pi `u agevole il loro impiego in PCR. Al contrario, una differenza sostanziale tra le loro Ta assicura, una volta abbassata la temperatura della PCR, l’esclusivit`a del legame dell’UP allo stampo. Le propriet`a delle due sequenze relative alle condizioni di PCR, alla formazione di dimeri e di forcine sono riportate negli schemi delle figure 3.7 e 3.8. Questi dati rivelano una sola possibile formazione di dimeri degna di nota, relativa all’appaiamento della porzione ”T7 binding site” con se stessa, per una lunghezza di 6 coppie di basi. Questo dimero, comunque, risulta avere energia relativamente bassa (solo -6,7 kcal/mol), quin-di facilmente quin-disgregabile con un riscaldamento iniziale della miscela quin-di PCR. Questo `e un fatto estremamente positivo perch´e il T7 binding site non `e modificabile e rappresen-ta un elemento irrinunciabile nella strategia di SELEX che `e srappresen-tarappresen-ta disegnarappresen-ta. Si osserva anche una struttura a forcina geometricamente possibile ma, poich´e caratterizzata da una energia libera di formazione positiva (+1,60 kcal/mol), pu`o essere considerata un evento trascurabile.

Come ultima fase della progettazione, abbiamo cercato di ridurre la lunghezza della sequenza combinatoria, in modo da limitare la perdita di rendimento nel corso del-la sintesi chimica. A questo scopo, dovendo produrre l’aptamero ad RNA con una reazione enzimatica di trascrizione in vitro, `e stato omesso, nello stampo sintetico, l’in-serimento della porzione relativa al sito di legame per l’enzima T7.