La combinazione delle tecniche di retrotrascrizione e real-time PCR consente di quantificare l'espressione di un particolare gene in una popolazione cellulare. A partire dall'mRNA estratto dal campione si ottiene un cDNA (retrotrascrizione) che successivamente viene amplificato e quantificato (real-time Reverse Transcriptase-PCR).
In questo lavoro di tesi, tale tipo di analisi è stata utilizzata per valutare come l’inibizione dei due recettori Aurora-A e PDK1 abbia influito sull’espressione di alcuni geni indicatori del grado di staminalità e di differenziamento delle cellule U87MG e delle U87MG-CSC. Come precedentemente detto, tali metodiche sono state utilizzate anche per confermare la correttezza del metodo di arricchimento in CSC nelle neurosfere.
2.3.1 Preparazione del pellet di cellule
Le U87MG-CSC sono state seminate in Petri di 7 cm di diametro e trattate con il composto SA16 (10 μM in prova) utilizzando cellule incubate con il DMSO, solvente del composto in esame, come controllo. Dopo incubazione a 37°C per 7 giorni, durante i quali la soluzione contenente il trattamento e il mezzo di coltura è stata rinnovata ogni 3 giorni, la sospensione di cellule è stata centrifugata per 6 minuti a 500g. Il sovranatante è stato aspirato per ottenere il pellet da cui si è proceduto poi all’estrazione e alla quantificazione dei geni d’interesse. Le cellule U87MG sono state seminate in Petri di 7 cm di diametro e quindi trattate con DMSO (cellule di controllo) e con SA16 10 μM in mezzo di crescita completo. Sono state quindi trasferite per 72 ore in incubatore a 37°C e 5% di CO2.Una volta terminato il
trattamento, per questo tipo di cellule si rende necessario eseguire la seguente procedura per portare in soluzione le cellule, le quali si trovano adese al fondo della piastra:
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- si aspira delicatamente il mezzo da ogni piastra
- si aggiunge circa 3 mL di tampone fosfato salino PBS (NaCl0,14 M; KCl 0,0027 M; tampone fosfato 0,01 M; pH: 7,4 a 25° C)
- con l’aiuto di uno scraper si staccano meccanicamente le cellule dal fondo della piastra e si raccolgono in una provetta (l’operazione viene ripetuta 3 volte)
- la sospensione viene centrifugata a 4°C per 5 minuti a 500 g
- si elimina il sovranatante
2.3.2 Estrazione RNA
Dal pellet così ottenuto è stato estratto l’RNA utilizzando il kit Rneasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Il kit fornisce delle colonne contenenti una membrana in gel di silice in grado di trattenere selettivamente l'RNA. Il protocollo seguito per l'estrazione è quello fornito dalla ditta:
- sospendere il pellet in 600 μL di buffer di lisi RTL e 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo
- vortexare la sospensione per 1 minuto
- aggiungere 600 μL di etanolo al 70%
- trasferire la sospensione nella colonnina fornita dal kit (per volumi maggiori di 700 μL l'operazione va eseguita in due volte)
- centrifugare per 30 secondi a 10000 g ed in seguito eliminare il contenuto dal tubo raccoglitore
- aggiungere 700 μL di RW1 (tampone di lavaggio) e centrifugare nuovamente a 10000 g per 15 secondi
- cambiare il tubo raccoglitore, aggiungere 500 μL di RPE (tampone di lavaggio) e centrifugare a 10000 g per 30 secondi
- aggiungere 500 μL di RPE (tampone di lavaggio) e centrifugare a 10000 g per 30 secondi
- scartare il residuo del tubo, centrifugare a 10000 g per 2 minuti
- per eluire l'RNA dalla colonnina, aggiungere 30 μL di acqua RNAsi free e centrifugare a 10000 g per 1 minuto.
Tutti i passaggi devono essere eseguiti con strumenti precedentemente sterilizzati con NaOH 0,1 M e indossando i guanti al fine di evitare la contaminazione dei campioni con le RNAsi presenti sulla cute, che potrebbero degradare l'RNA.
Per confermare l'integrità del campione, per ognuno di essi è stato eseguito un controllo tramite elettroforesi su gel di agarosio all' 1% aggiungendo ad 1 μL di campione (contenente
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l'RNA totale) 1 μL di colorante e 4 μL di acqua. Terminata la corsa, si verifica la presenza di due bande nitide corrispondenti alle subunità 18s (1900 pb) e 28s (4800 pb) dell'rRNA (figura 2.5). La loro assenza potrebbe indicare una degradazione avvenuta ad opera delle RNAsi, la presenza di bande di dimensioni maggiori invece è segno di contaminazione di DNA genomico.
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2.3.3 Quantificazione RNA
Al fine di procedere ad un confronto quantitativo tra i differenti campioni trattati, è stata misurata la quantità di RNA effettivamente estratta da ciascun analita. Ciò ha infatti permesso di retrotrascrivere ed amplificare i geni d’interesse a partire dalla stessa quantità di acido nucleico, rendendo fondata la valutazione quantitativa di questi per confronto.
Per questa operazione è stato utilizzato lo spettrofotometro NanoDrop Lite® (ThermoScientific), che valuta la concentrazione dell’acido nucleico nel campione misurandone l’assorbanza a 260nm. La contaminazione proteica è valutata misurandone il rapporto tra l’assorbanza a 260nm e a 280nm, che deve essere compreso tra 1,6-1,8. Per la correlazione tra concentrazione ed assorbanza si sfrutta la legge di Lambert-Beer:
𝐀𝛌 = 𝛆×𝐥×𝐂 dove
Aλ = assorbanza alla lunghezza d’onda λ (adimensionale)
ε
= coefficiente di estinzione molare della specie in esame alla lunghezza d’onda λ (cm2/mol)l = cammino ottico della luce (cm)
C= concentrazione della sostanza in esame (moli/L)
2.3.4 Retrotrascrizione
La retrotrascrizione è il procedimento tramite il quale viene ottenuto cDNA a partire da mRNA, grazie all’enzima virale della trascrittasi inversa. Questo cDNA sarà poi il materiale effettivamente esaminato e quantificato con la RT-PCR.
Il campione di partenza è costituito dall'RNA totale, ma quello che viene retrotrascritto è solo l'mRNA, grazie all'utilizzo di primers di innesco (necessari al funzionamento dell'enzima retrotrascrittasi che si lega a loro) complementari alla coda di poli-adenine presente all'estremità 3' degli RNA messaggeri.
Il cDNA è stato ottenuto utilizzando il kit i-Script cDNA synthesis (BioRad, Hercules, USA) aggiungendo:
4 μL del buffer 5x fornito dal kit e contenente MgCl2 e dNTP
1 μL di retrotrascrittasi (enzima derivato dal virus MMLV, Moloney Murine Leukemia Virus)
volume di campione contenente 500 ng di mRNA
volume di acqua (fornita dal kit, priva di RNasi) per arrivare a 20 μg
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25° C per 5 minuti
42° C per 30 minuti (tempo e temperatura necessari alla retrotrascrizione) 85° C per 5 minuti (per avere la disattivazione dell'enzima)
Il cDNA così ottenuto può essere subito amplificato o conservato a -20° C.
2.3.5 Real time RT-PCR
La PCR (Polymerase Chain Reaction, reazione a catena della polimerasi) è una tecnica di biologia molecolare che consente di amplificare un frammento specifico di DNA individuato tra due regioni a sequenza nota, a cui si legano due primer oligonucleotidici. È uno strumento fondamentale per l’analisi dell’espressione genica.
Il DNA è amplificato da reazioni a catena della DNA-polimerasi, il vantaggio della Real Time RT-PCR è quello di poter monitorare la quantità di amplificato prodotto ad ogni ciclo in “tempo reale”.
La misurazione in tempo reale è resa possibile dall'utilizzo di molecole fluorescenti che si intercalano nel DNA. Queste sostanze mostrano, quando legate, un’assorbanza ed una fluorescenza tipica, la cui intensità è proporzionale alla quantità di complesso formato. In questo caso è stato usato come intercalante fluorescente il SYBR Green I (figura 2.6), una molecola aromatica che, complessata al dsDNA, assorbe nel blu (488nm) ed emette fluorescenza nel verde (522 nm). La misura quantitativa della fluorescenza emessa è quindi direttamente proporzionale alla quantità di DNA a doppio filamento presente in ogni campione.
Figura 2.6: struttura del SYBR Green I.
La Real-Time RT-PCR è una procedura composta da varie fasi che si ripetono ciclicamente (per 30-40 cicli):
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1) Denaturazione o Melting: a 95°C per 15 minuti, è la fase in cui i due filamenti della doppia elica del cDNA vengono separati.
2) Appaiamento o Anneling: è la fase in cui i primers oligonucleotidici legano il proprio sito complementare sul filamento di DNA agendo da innesco per la sintesi del nuovo filamento di DNA. Data la presenza di due filamenti, 3'-5' e 5'-3', si fa uso di due primers che, in base al filamento a cui sono complementari, sono detti rispettivamente forward o reverse. Questi primers devono legarsi in modo specifico alla sequenza di interesse; avere lunghezza compresa tra le 20-30 pb per aumentare la specificità; essere inseriti tenendo conto del contenuto di C e G (che influenzano la temperatura di annealing) e della presenza di sequenze complementari o palindrome (per evitare la formazione di dimeri o di strutture a forcina). La temperatura di annealing è di solito compresa tra i 40 e i 60°C per garantire la corretta ibridazione dei primers e viene scelta 4-5° C al di sotto della temperatura di Melting, TM (temperatura a cui il 50% del DNA a doppia elica è
denaturato).
3) Allungamento: è la fase in cui avviene l'estensione del primer ad opera della polimerasi. L'enzima usato è la Taq Polimerasi, estratta dal batterio Thermophilus Aquaticus, poiché, a differenza di quella umana, è termostabile e non si degrada alle alte temperature. Per il suo corretto funzionamento è necessaria una temperatura di circa 65-72°C.
4) un ciclo di raffreddamento a 40 °C per 30 secondi.
Il processo di amplificazione si può seguire attraverso un grafico (figura 2.7) in cui si riporta la fluorescenza in funzione del numero di cicli. Il grafico presenta tre fasi: una fase iniziale, una fase di crescita esponenziale dell'amplificato ed una fase di plateau.
Durante i primi cicli di amplificazione, la fluorescenza emessa è esigua e risulta come un rumore di fondo (baseline o background) a causa del poco materiale amplificato presente. Intorno ai 20 cicli, l'amplificazione è tale da rendere il segnale rilevabile dando inizio alla fase di crescita esponenziale.
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S
i definisce “Ciclo Threshold” (Ct) il ciclo soglia a partire dal quale la fluorescenza comincia ad essere rilevabile e inizia ad aumentare velocemente. Il valore di Ct, ottenuto dal punto di intersezione di tale linea con il grafico, è inversamente proporzionale alla quantità di DNA stampo presente nel campione iniziale: se il campione contiene una grande quantità di acido nucleico, il valore di Ct sarà basso perché bastano pochi cicli per avere una fluorescenza apprezzabile e che aumenta rapidamente. Viceversa, quantità modeste di acido nucleico nel campione iniziale portano a valori di Ct alti. Questo valore è fondamentale per la quantificazione del cDNA presente nel campione.Nel presente lavoro è stata utilizzata una quantificazione relativa per valutare l’espressione dell’mRNA. Per ogni campione, i valori di Ct ottenuti sono stati normalizzati rispetto al valore di Ct della β-actina, un gene “housekeeping”, cioè presente sempre allo stesso livello nello stesso tipo di cellule. Quindi, ottenuti i dati, per la quantificazione è stato sufficiente mettere a confronto l’espressione del gene bersaglio con quello del gene di riferimento, sia per i campioni trattati che per il controllo (solo DMSO). Il risultato ottenuto rappresenta le volte di aumento (o diminuzione) del gene bersaglio rispetto a quello di controllo, al quale viene dato il valore 1.
Questo si realizza applicando il metodo comparativo dei Ct (metodo ΔΔCt) basato sulla formula:
ΔΔCt= (Ct target/trattato – Ct house/trattato) – (Ct target/non trattato – Ct house/non trattato).
Il rapporto tra l’espressione del gene bersaglio nella condizione di interesse e l’espressione dello stesso nella condizione di riferimento è ricavabile dalla seguente formula:
Rapporto espressione normalizzato = 2-ΔΔCt.
Esecuzione del saggio:
Delle cellule U87MG e U87MG-CSC trattate come descritto all’inizio del paragrafo, dopo i processi di estrazione, è stata valutata la quantità di RNA estratta dai campioni misurandone l’assorbanza a 260nm con lo spettrofotometro (NanoDrop Lite®, ThermoScientific), mentre per determinarne la purezza si è valutato il rapporto tra l’assorbanza a 260nm rispetto a quella a 280nm. Si è quindi proceduto alla retrotrascrizione ed infine alla RT-PCR.
Per la preparazione del saggio di RT-PCR sono necessari:
3 μL di cDNA contenenti la stessa quantità di acido nucleico, circa 75 ng di mRNA retrotrascritto a cDNA)
1,5 μL di primer forward 10 μM 1,5 μL di primer reverse 10 μM
25 μL Fluocycle® II SYBR® (Euroclone, Milan, Italy) 19 μL di H2O
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I campioni sono stati, in seguito, posti nel termociclatore utilizzando i primers riportati nella seguente tabella (tabella 3):
Gene Primer nucleotide sequences
Product size (base pairs) Annealing Temperature CD133 FOR: 5’-TCCACAGAAATTTACCTACATTGG -3’ REV: 5’-CAGCAGTTCAAGACGCAGATGACCA-3’ 251 55°C
NESTIN FOR: 5’-CAGCGTTGGAACAGAGGTTGG -3’ REV: 5’-TGGCACAGGTGTCTCAAGGG -3’ 282 61°C
GFAP REV: 5’-GACAACCGCCACTCAACTAGC-3’FOR: 5’-CCTCTCCCTGGCTCGAATG -3’ 287 52°C
MAP2 REV: 5’-GGTCATGCTGGCAGTGGTTGGA-3’ FOR: 5’-TTGGTGCCGAGTGAGAAGAA-3’ 280 55°C
Tabella 3: primers utilizzati e loro sequenze FOR e REV, dimensioni e temperature di annealing.